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UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANAIztapalapa.
CIENCIAS BIOLOGICAS Y DE LA SALUD.
Protocolo:Prevalencia del Síndrome DiGeorge/Velocardifacial enniños con defectos Conotroncales.
Alumna:Mata Esquiviaz María Florencia.
Asesor interno:Dr. Miguel Betancourt Rule.
Asesores externos:M. en Biol. Exp. David Cruz Robles.M. en C. Sandra Ramos Ángeles.
Lugar de realización:Lab. De Inmunohisto-química, Depto.de Patología, del Instituto Nacional deCardiología.Lab. De Citogenética, del InstitutoNacional de Pediatría.
México, D.F. Abril del 2004.
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INTRODUCCIÓN:
Durante el desarrollo embrionario, el corazón pasa a ser de una estructura
tubular sencilla, a convertirse en un órgano multicameral, con una organización
muy compleja. Este proceso embrionario, requiere de la diferenciación,
crecimiento y migración de distintas estructuras embrionarias y además puede
dividirse en seis etapas que a continuación se describen:
1. Las células mesenquimatosas destinadas a la formación del tubo cardiaco se
disponen simétricamente en dos crestas precardiacas, en donde reciben
señales del ectodermo y del endodermo para constituir los cardiocitos.
2. Las crestas cardiacas se unen en la línea media embrionaria dando lugar al
tubo cardiaco inicial. En éste, el corazón está formado por dos capas celulares,
miocardio y endocardio, separadas por una matriz acelular (gelatina cardiaca).
3. El tubo cardiaco sufre una torsión hacia la derecha constituyendo así el primer
signo morfológico. Esta torsión culmina con la formación de un corazón
embrionario, en la cual se comienzan a distinguir diferentes regiones
miocardicas.
4. El corazón embrionario está formado por el tracto de entrada, el atrio
embrionario, el canal atrioventricular, el ventrículo embrionario y el tracto de
salida. Cada una de estas regiones miocardiacas presenta un patrón de
expresión diferencial, así como características funcionales distintas. El tracto
de entrada, el canal atrioventricular y el tracto de salida presentan, en su
superficie inferior, cojines endocárdiacos, mientras que las cámaras atriales y
ventriculares están trabeculadas y carecen de estructuras mesenquimáticas.
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5. Durante el estadio fetal, estas 5 estructuras se tabican para obtener un corazón
con doble circuito: el sistemático (sangre oxigenada) y el pulmonar (sangre
venosa). La septación del ventrículo primitivo genera los ventrículos derecho e
izquierdo mediante la formación del complejo de los septos interatriales
primario y secundario. Es importante destacar que la separación de los tractos
de entrada y salida, así como los del canal atrioventricular, se producen por la
fusión de los cojines endocárdiacos y su posterior reemplazamiento por
miocardiocitos.
6. A su vez, se produce una reestructuración de las distintas regiones
embrionarias para dar lugar, en el corazón adulto, a dos cámaras atriales y dos
ventriculares, todas con el tracto de entrada y de salida propios. Básicamente
esta es la misma conformación del corazón adulto, y únicamente destaca que
las separaciones de las cuatro cámaras se completan (Franco et al., 2002;
Matsumura et al., 1996).
Una vez formado el corazón adulto es una doble bomba, ya que, está
formado por dos estructuras musculares (los ventrículos izquierdo y derecho),
con sus propios depósitos (las aurículas izquierda y derecha). Cada una de las
bombas sirve a una circulación distinta: el ventrículo derecho es la bomba de la
circulación pulmonar, donde la sangre es bombeada a los pulmones y donde
toma oxígeno y se desprende del bióxido de carbono y luego vuelve a la
aurícula izquierda del corazón. Esta sangre penetra entonces en el ventrículo
izquierdo.
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El ventrículo izquierdo es la bomba de la circulación sistemática. La sangre
es bombeada desde él al resto del organismo por medio del sistema
circulatorio. Este último esta formado por arterias, venas y vasos linfáticos
(Espino., 1997).
· Las arterias transportan la sangre desde el corazón hasta los tejidos del
organismo.
· Los capilares son el lugar donde se produce la difusión de los nutrieres y los
productos de desecho.
· Las venas devuelven la sangre desde los tejidos al corazón.
· Los vasos linfáticos devuelven cualquier exceso de agua y nutrientes que se
haya difundido fuera de los capilares (Horton- Szar et al., 1999).
El desarrollo embrionario del corazón requiere de la precisa migración
celular con un control genético adecuado. Sin embargo, cualquier alteración en el
proceso embrionario de una estructura normal crea defectos anatómicos que
influyen en el desarrollo estructural y funcional del resto de la circulación (Braun-
Wald 1997). A esto se le llama Cardiopatías Congénitas y se presentan al
nacimiento, aun cuando se descubran mucho después (Braun-Wald 1997) Una
cuarta parte de estos defectos se acompaña de alteraciones en otros órganos
(Buendía et al. 2000).
Entre las cardiopatías congénitas se encuentran los defectos conotroncales los
cuales involucran:
· Comunicación interventricular (CIV): Consiste en tener una o más
comunicaciones entre los ventrículos.
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· Comunicación interaricular (CIA): Se caracteriza por tener una o más
comunicaciones entre las aurículas.
· Tetralogía de Fallot (TF): Esta consiste en tener cuatro defectos: CIV, aorta
predominante, estenosis pulmonar (EP) (malformación de la válvula pulmonar)
e hipertrofia del ventrículo derecho.
· Ductus arteriosus persistente (DAP): Se presenta cuando hay comunicación
entre la aorta descendente y la bifurcación de la arteria pulmonar.
· Coartación de la aorta (CA): Es la constricción de la aorta descendente cerca
del ductus arteriosus (es una abertura entre la aorta y la arteria pulmonar).
· Transposición de los grandes vasos (TGV): Se presenta cuando la aorta sale
del ventrículo derecho y la arteria pulmonar sale del ventrículo izquierdo. Entre
otras (Bowers et al., 1989).
Estos defectos conotroncales se presentan cuando hay una incorrecta
migración de las células de la cresta neural, ya que, estas células contribuyen al
Desarrollo cardiaco (Goldmuntz et al., 1993; Lindsay et al., 1999; Merscher et al.,
2001; Herther et al., 2002).
En condiciones normales estas células se encuentran en la cresta dorsal
del tubo neural en desarrollo, sufren una transición epitelial a mesenquimal y
participan en la formación de los arcos faringeos y sus derivados (Herther et al.,
2002) para posteriormente migrar al resto del organismo donde se diferencian en
formas celulares diferentes. Estas células se denominan células de la cresta
neural y llegan a formar nervios periféricos, células pigmentarias de la piel, células
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musculares lisas, y contribuyen también a la formación del timo y la glándula
paratiroides (Ruiz et al., 2001).
Cada año nacen en México por lo menos 5,000 niños con cardiopatías
congénitas y más de la mitad de ellos requieren estudio y tratamiento que puede
ser medico, intervencionista y/o quirúrgico (Buendía et al., 2000). Aunque cabe
resaltar que los que presentan cardiopatías congénitas severas mueren.
Actualmente se pueden tratar quirúrgicamente casi todas las cardiopatías
congénitas obteniendo resultados satisfactorios, ya que, los pacientes tratados
alcanzan una edad adulta y tienen capacidad de procreación (Buendía et al., 2000;
Wilson et al 1992). El riesgo de que su progenie herede las enfermedades del
corazón se estima entre el 3 y 16% dependiendo del tipo de lesión y
probablemente del origen parental (Wilson et al., 1992).
Así pues, la presencia de estas cardiopatías congénitas, junto con
malformaciones faciales e inmunodeficiencia variable en algunos pacientes, nos
muestran el fenotipo exacto del Síndrome DiGeorge /Velocardiofacial (DG/VFCS).
El Síndrome DiGeorge se caracteriza por una alteración parcial o total en la
formación de las células T, asociada con hipoplasia del timo. Esta alteración se
debe a la falta de desarrollo de la tercera y cuarta bolsa faríngea, por lo que se
presenta hipoplasia paratiroidea, causante de hipocalcemia (Wilson et al., 1992;
Stevens y Lowe., 2001; Pierdominici et al., 2003), diversas alteraciones cardiacas
que afectan al tracto de salida y ligeras anomalías faciales sobre todo paladar
hendido, mandíbula pequeña y orejas de baja implantación.
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Los rasgos clínicos del Síndrome Velocardiofacial, consisten en dismorfia
facial evidente: nariz prominente, retrognatia, grietas en la submucosas del
paladar, disrupción hipernasal, fisura palatina, orejas de implantación baja,
anomalías cardiovasculares, dificultades para el aprendizaje y retraso mental
(Stevens y Lowe., 2001; Wilson et al., 1992; Carlson et al., 1997a). Con menos
frecuencia, estos pacientes tienen también inmunodeficiencia. (Burn et al. 1993;
Goldmuntz et al. 1993). Estos dos síndromes se asocian debido a una
microdeleción intersticial heterocigota en el brazo largo del cromosoma 22 cerca
del centromero, en la región 22q11.2 que involucra de 1.5 a 3.0 megabases (Mb)
en un rango de 4000kb de ADN (Emanuel et al., 2001; Cohen et al., 1999; Funke
et al., 1999; Lindsay et al., 1999; Mozziconacci et al., 1997 y McQuade et al.,
1999), y se produce por un error en la recombinación meiotica. Lo que sugiere una
haploinsuficiencia de uno o más genes del cromosoma 22 (Merscher et al., 2001).
La frecuencia estimada para estos síndromes es de 1 en 4000 nacidos vivos
en Londres Inglaterra (Heather et al., 2002; Emanuel, et al. 2001 Scambler et al.,
2000), y ocurre esporádicamente, aunque se sabe que puede heredarse en una
forma aurtosomica dominante. (Carey et al. 1992).
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ANTECEDENTES:
Angelo DiGeorge junto con James Arey estudiaron en 1965 a un grupo de
infantes que presentaban ausencia del timo y la glándula paratiroides. Por lo que
DiGeorge mencionó que la ausencia coexistente de ambas estructuras se derivan
de un primordial común. Así mismo identifico que esto defectos estaban asociados
a un Síndrome, y fue hasta 1968 cuando se publico por primera vez por Robert
una publicación de artículos británicos, acerca de este Síndrome definiéndolo
como un desorden congénito que presentaba características inmunologicas y
cardiacas.
Después de varios informes Harold Lischner considero el Síndrome de
DiGeorge como el Síndrome de los defectos de la tercera y cuarta bolsa faríngea
definiéndolo como la malformación congénita en donde se observaba la
hipoplasia o ausencia de la glándula del timo y/o paratiroidea incluyendo los
defectos en otros órganos localizados en el cuello y la región conotroncal
mostrando así, atresia pulmonar, transposición de los grandes vaso, defectos en
las almohadas cardiacas y características fenotípicas como micrognatia, defectos
en las orejas, nariz impactada.
Un estudio presentado por Conley señalo la asociación de este síndrome con
los defectos conotroncales sobre todo el arco aórtico interrumpido tipo B (el cual
apareció en el 50% de los casos), arco aórtico derecho adyacente y truncus
arterioso persistente. La asociación de estos defectos cardiacos específicos fue
probada por Moerman y después por Mierop y Kutsche. En ambos informes se
agrego la tetralogía de Fallot (Greenberg 1993).
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En 1988-1989 Mueller y colegas enfatizaron en la distinción entre DGS
completo y DGS parcial mencionando la gran diferencia entre ambos debido a que
en el DGS completo presentaba mayor mortalidad y por lo tanto defectos
cardiacos más prominentes que el DGS parcial, mostrando así una gran
heterogeneidad de la etiología de este Síndrome. También ellos propusieron
puntos de señales clínicas para el DGS como los es: el dismorfismo facial, la
ausencia del timo y/o la paratiroidea y las enfermedades del corazón así como los
estudios inmunologicos que involucran los niveles bajos de los linfocitos T,
ausencia de células CD4 y CD8, el bajo restablecimiento de las células B y la
ausencia de IgG, IgA, IgM, IgD, IgE.
Desde el punto de vista de la patogenésis y la etiología, John Carey menciono
la heterogeneidad del DGS y sugirió que realmente no era un Síndrome por lo que
comenzaron a aparecer varía etiologías. Lammer y Opitz discutieron esta
heterogeneidad de las etiologías y sugirieron que el síndrome de DiGeorge debe
de ser la anomalía de DiGeorge (DGA) como un campo de desarrollo que
involucra los defectos de las bolsas faringeas, la presencia de la uvula bífida o
hendidura de la submucosa. Etimológicamente DGA puede ocurrir debido a las
anomalías cromosomales, desordenes mendelianos, exposición teratologica y
otras(Greenberg et al. 1993).
Posteriormente se considero que esta anomalía se encontraba dentro de los
Síndromes de deleciones de genes continuos por lo que se le asociaron
anomalías genéticas, (que más abajo se describen).
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El Síndrome Valocardiofacial o Síndrome Shprintzen fue definido por
Shprintzen (1978) como un desorden genético que presenta características
cardiacas, faciales más prominentes y otras 30 manifestaciones clínicas (Lindsay
et al., 1995).
Ambos Síndromes fueron definidos como desordenes genéticos caracterizado
por un número de manifestaciones clínicas que incluyen anomalías cardiacas.
Estos presentan defectos conotroncales. Reconocidos por primera vez por Kirby
en 1983 (Ruiz et al., 2001), los cuales resultan de la migración impropia de las
células neurales (Merscher et al., 2001). De tal manera que los pacientes
presentan hipoplasia de la glándula del timo con inmunodeficiencia de las células
T con intensidad variable (Stevens y Lowe., 2001), hipoplasia de la glándula
paratiroidea asociada a hipocalcemia (Merscher et al., 2001; Mozziconacci et al.,
1997; Driscoll et al., 1992), y anomalías faciales como paladar hendido, dismorfia
facial, retraso del desarrollo, y en algunos casos en adolescentes y adultos se
presentan retraso mental o esquizofrenia (Cohen et al., 1999).
Como estos síndromes comparten una etiología genética común, se
incluyeron a un grupo de síndromes que presentan la misma etiología pero
diferente intervalo de la deleción. Por lo que para definirlos se les acuñó el
acrónimo CATCH22 (Cardiac abnormality/Abnormality facies, T Cell deficit due to
thymic hipoplasia, cleft palate, hypocalcemia due to hypopatathyroidism resulting
from 22q11 deletion) (Hall., 1993; Greenberg.,1993). Anteriormente se pensaba
que estas manifestaciones clínicas correspondían a dos procesos diferentes.
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Recientemente, debido a los avances de la citogenética molecular, se sabe
que están asociados, no solo por algún aspecto fenotípico, si no porque ambos
presentan una microdeleción interticial en el cromosoma 22 (Emanuel et al.,2001).
Por lo que Chapell sugirió que estos síndromes deben su variabilidad en la
etiología a la haploinsuficiencia de genes de la banda 22q11.2 (Greenberg., 1993;
Driscoll et al., 1992). Debido a que esta haploinsuficiencia ha involucrado hasta
más de 20 genes, que son candidatos para jugar un papel importante en el
Síndrome (Lindsay et al., 1999). Entre los más estudiados están COMT (Catechol-
O-metiltransferasa) involucrado en el metabolismo de los neurotrasmisores
(McQuade et al., 1999), GSCL, codifica para un factor de transcripción, y está
involucrado en las anormalidades más frecuentes del Síndrome como anomalías
conotroncales y anormalidades de las bolsas faringeas (Gottlieb et al., 1997),
HIRA, es un regulador transcripcional involucrado en los defectos conotroncales
(Carlson et al., 1997b), UFD1L, está involucrado en la degradación de la proteína
que está atada a la ubiquinona y que también esta involucrado en los defectos
conotroncales (Emanuel et al., 2001), CRKL, miembro de la familia de las
proteínas Tirosina-Kinasa, el cual está asociado a las anomalías craniofaciales,
defectos del tracto de salida, anormalidades en las glándulas del timo y/o
paratiroides y anormalidades en los nervios craniales (Herther et al., 2002) y muy
recientemente se ha venido estudiado el papel del TBX1, un regulador expresado
en la embriogénesis (McQuade et al., 1999; Packhan y Brook., 2003), se cree es
el responsable de las anomalías cardiovasculares y muestra una marcada
incidencia en la anomalía del tracto de salida en DG/VCFS, sugiriendo una gran
participación en la patogénesis de los defectos conotroncales (Conti et al., 2003;
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Merscher et al., 2001; Herther et al., 2002; Packhan y Brook., 2003; Ryan y Chin.,
2003). Aunque aun se desconoce el mecanismo de acción embriológica de este
gen en la formación del corazón (Ruiz et al., 2001).
Gracias al desarrollo de la citogenética se ha ampliando más la información de
estos desordenes, debido a que la utilización de la técnica de Hibridación In Situ
con Fluorescencia (FISH por sus siglas en inglés), la cuál fue descrita por primera
vez por Pardue y Gall en 1969 (Boehringer et al 1992). Esta se utiliza para
detectar microareglos en los cromosomas, aporta valiosa información acerca de la
región exacta que se deleta y de la oportunidad de investigar dicha región a nivel
molecular, con la cuál se puede ahondar más en el conocimiento básico de la
enfermedad y tal vez extrapolar dicho conocimiento al papel que juegan los genes
dentro de la embriogenesis cardiaca.
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OBJETIVO GENERAL:
Determinar la prevalencia del síndrome de DGS /VCF en niños que
presentan defectos conotroncales, por medio de la técnica de hibridación In Situ
con fluorescencia (FISH).
OBJETIVOS PARTICULARES:
· Realizar ensayo citogenético por medio del FISH, en pacientes pediátricos
con defectos conotroncales.
· Determinar la frecuencia de la deleción 22q11 en pacientes que tienen
defectos conotroncales.
HIPÓTESÍS:
Sí la embriogenesis cardiaca se ve alterada por la ausencia de genes
ubicados en la región 22q11.2, entonces los pacientes con defectos conotroncales
tendrán deletada dicha región.
JUSTIFICACIÓN:
El departamento de Cardiopediatría del INCCH ha atendido una gran
cantidad de pacientes con cardiopatías congénitas del tipo conotroncal. Hasta
hace un par de años, dichos pacientes eran subdiagnosticados y aun que su
problema cardiaco fue corregido quirúrgicamente, el conocimiento de su problema
así como su pronostico de vida eran incierto.
El advenimiento de las técnicas diagnosticas del ADN recombinante, abrió
nuevas perspectivas en el conocimiento de la etiología de muchas enfermedades
sindromáticas. Así pues, la hibridación In Situ con fluorescencia ha sido una
herramienta citogenetica de gran ayuda en la definición exacta del diagnostico
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clínico, con la cual se puede llegar a definir mejor un cuadro clínico para dar un
manejo adecuado, directo y planeado a los pacientes con DG/VCFS.
Por tal motivo, es importante definir cual es la frecuencia de dicho Síndrome
en los pacientes con defectos cardiacos conotroncales.
MATERIAL Y METODO.
1. DISEÑO DEL ESTUDIO
Este estudio fue un trabajo de investigación transversal y descriptivo.
2. DISEÑO EXPERIMENTAL.
Cultivo de linfocitosa) Siembrab) Cosecha
c) Preparación deLaminillas.
Hibridación In Situ con Fluorescencia (FISH)
Observación
Diagnóstico
Elección del Paciente
Toma de muestra sanguínea
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3. ESTUDIO CLINICO
3.1 Captación de pacientes
Se captaron al menos 15 pacientes que presentaron cardiopatías
congénitas de tipo conotroncales, características faciales del Síndrome
DG/VCFS y que acudieron a la consulta de Cardiopediatría del INCICH en el
periodo que comprendió Marzo del 2003 a Marzo del 2004.
3.2 Criterios de inclusión:
§ Pacientes con cardiopatías congénitas conotroncales (AP, CIV, CIA, TF,
PCA, CA, TGV entre otras) y que presentaron al menos una de las
siguientes características: insuficiencia velofaringea, dismorfia facial,
ausencia o hipoplasia de la glándula paratiroides, hipocalcemia,
hipoplasia de la glándula del timo, dismorfia facial, paladar hendido,
mandíbula pequeña, anormalidades auditivas, lento aprendizaje y
estatura baja.
§ Que los padres de familia estuvieran de acuerdo en que sus hijos
formaran parte de este estudio por medio de una carta de
consentimiento.
3.3 Criterios de exclusión
§ Pacientes transfundidos antes de la toma de muestra o con algún tipo de
químio o radioterapia.
§ Pacientes que no presentaron ninguna cardiopatía congénita de tipo
conotroncal y característica del Síndrome de DG/VCFS
§ Pacientes cuyos padres no aceptaban formar parte del estudio clínico.
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3.4 Criterios de eliminación:
§ Pacientes cuyas células no obtuvieron un crecimiento adecuado.
§ Pacientes cuyas células se contaminaron durante el procedimiento de
siembra y cosecha.
4. ESTUDIO CITOGENETICO
4.1 TOMA DE LA MUESTRA:
Se tomaron 3 ml de sangre venosa de cada paciente.
Por medio de jeringas estériles y previamente heparinizadas con Heparina sódica
(1,000 u/ml).
4.2. CULTIVO DE LINFOCITOS
A) Siembra
Se utilizo campana de flujo laminar previamente desinfectada para sembrar
las muestras sanguíneas.
Se utilizaron tubos de 15ml estériles en los cuales se colocaron 5ml de
medio de cultivo McCoy suplementado con 0.1ml de fitohematoglutinina y
antibiótico (penicilina-estreptomicina). Se agregaron aproximadamente 1ml de
sangre periférica de cada paciente, se etiqueto el tubo y se incubó a 37°C durante
72 horas.
B) Cosecha
Una hora antes de iniciarse la cosecha se añadieron 20ml de solución de
colchicina (0.01 mg/ml, concentración final) a los tubos cultivados y se incubaron a
37°C nuevamente.
Transcurrido ese tiempo se centrifugó a 1500 rpm durante 10 minutos y se
descarto el sobrenadante.
Se agregaron 5ml de sal de lisis de células rojas (KCl 0.075M) con agitación
constante y se incubaron los tubos a 37°C por 30 minutos.
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Se homogeneizaron los cultivos y se centrifugaron a 1500rpm por 10
minutos, nuevamente se descarto el sobrenadante y se agrego 5ml de solución
Carnoy a 20°C (metanol-ácido acético, 3:1).
Se repitieron nuevamente los lavados con fijador hasta que el sobrenadante quedó
transparente (Moorehead et al., 1960, pero fue modificado por el laboratorio de
citogenetica en el Instituto Nacional de Pediatría).
C) Preparación de laminillas
Se utilizaron portaobjetos (24x55mm) previamente lavados y almacenados
en agua destilada y etanol (4:1).
Después del último lavado de las células se tomo una gota del paquete
celular limpio y se dejo caer sobre él, posteriormente se dejó secar y se le
agregaron 2-3 gotas de ácido acético concentrado sobre la zona en la que se tiene
la muestra.
Posteriormente se revisó la laminilla en el microscopio de contraste de
fases para comprobar que la calidad y cantidad de metafases fueron las
adecuadas.
De preferencia las laminillas se realizaba el mismo día en el que se
procesaban para el FISH.
4.3 Procedimiento para FISH
Una vez preparadas las laminillas se sometieron a una serie de pasos:
I. Eliminación de citoplasma.
Las laminillas ya preparadas con células metafasicas, se colocaron en una
solución de ácido acético al 70% en metanol por 5 minutos y se observo en el
microscopio en contrastes de fases. Posteriormente se escurren y se colocan en
un vaso Coplin con amortiguador SSC2X (solución salina citratos) o SSPE
(solución salina fosfatos) por 2 minutos. De la misma forma se quita el exceso de
la solución anterior y se deshidratan por 2 minutos en vasos Coplin con etanoles al
70%, 85% y absoluto.
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II. Maduración
Se dejó madurar la laminilla durante 30 minutos en SSC2X o SSPE (pH 7.0)
a 37°C. Transcurrido este tiempo, se deshidrataron por 2 minutos en etanoles
graduales al 70%, 85% y absoluto.
III Desnaturalización.
Coloca, en un vaso Coplin, formamida al 70%, pH=7. Calentar esta solución
a 70°C en baño María y asegurarse de que el pH no cambie (regularlo en dado
caso a pH=7.0) colocar la laminilla en esta solución por 2 minutos.
IV. Deshidratación.
Preparar etanoles graduales (70%, 85%, y absoluto) fríos a
-20°C y colocarlos en vasos Coplin. Una vez desnaturalizada la muestra,
deshidratarla en estas soluciones. Escurrir el exceso de alcohol absoluto y colocar
la laminilla en un plato termino a 45°C.
V. Sonda.
Se utilizo la sonda locus especifica TUPLE I, (HIRA) red que hídrida en los
locus D22S55, D22S609 y D22S942 junto con la sonda ARSA green que híbrida
en 22q13 como control interno. La cual se preparo de la siguiente manera:
En un vial se puso 1ml de las sondas Vysis teñidas directamente, 2ml de
agua destilada y 7ml de amortiguador de hibridación.
Hecha la mezcla anterior, se coloca en un baño María a 73°C por 5
minutos. Posteriormente se colocó en hielo.
VI. Hibridación.
En el portaobjeto que esta a 45°C se colocan 2ml de la sonda sobre las
células metafasicas de cada laminilla. Se cubre la laminilla con un cubreobjetos
(22x22mm) y se seña para evitar evaporaciones de la mezcla con la sonda.
Posteriormente se incuban la laminilla en cámara húmeda que no permita que
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penetre la luz, durante 12 horas o más tiempo dependiendo de la eficiencia de la
hibridación y de la calidad de fluoroforos.
VII. Post-hibridación.
Terminada la incubación, separar el cubreobjetos y lavar las laminillas en
una solución con SSC 0.4X o SSPE/ NP-40 0.3% a 73°C durante 2 minutos.
Posteriormente se colocó la laminilla en SSC2X o SSPE/ NP-40 0.1%durante 30
segundos.
VIII Contraste.
Finalmente, se coloca un par de gotas de DAPI diluido con medio de
montaje para fluorescencia vectashield (1:20ml) y se cubre la laminilla con un
cubreobjetos.
Las laminillas pueden almacenarse en un portalaminillas a 4°C hasta su
observación (no más de 5 días).(La metodología del FISH se basó en las
recomendaciones de la casa comercial que provee las sondas Vysis 2001; Pinkel,
et al 1986a-b; Boehringer 1992 y modificado por el laboratorio de citogenetica en
el Instituto Nacional de Pediatría).
4.4. Análisis celular.
Las laminillas fueron observadas en un microscopio de epifluorescencia,
con filtro de 3 bandas (green, red y DAPI) equipado con una cámara digital.
5. Análisis de resultados.
La sonda ARSA green híbrida en el loci del gen Arisulfatasa A(22q13) y
emite una señal de color verde por estar marcada con isotiocinato de fluoresceína
(FITC), de tal forma que funciona como control interno al darnos información de la
presencia o ausencia del cromosoma 22 e indica si el proceso de hibridación se
realizó.
La sonda TUPLE I (HIRA) híbrida en una región de 110Kb, que corresponde
a los locus D22S55, D22S609 y D22S942, en la región crítica (500kb) identificada
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para DG/VCF. Dicha sonda esta marcada con rojo texas y emite una luz de color
rojo. Por lo tanto, la ausencia de estas 2 marcas en el cromosoma 22 nos indica
ausencia de esta región del cromosoma y por lo tanto, DG/VCFS.
RESULTADOS:
Se captaron 65 pacientes con diagnostico clínico de Cardiopatía congénita
del tipo conotroncal en el departamento de Cardiopediatría en el Instituto Nacional
de Cardiología Ignacio Chávez (INCICH), durante el periodo comprendido del
mes de Marzo del 2003 a Marzo del 2004.
Todas las muestras se cultivaron para la obtención de células metafasicas.
7 de ellas fueron eliminadas por problemas de crecimiento adecuado y/o
contaminación excesiva de la muestra.
La distribución de la muestra por sexo fue de 21 mujeres (36%) y 37
hombres (64%). La edad promedio en mujeres fue de tres meses a 16 años y en
hombre fue de tres meses a 25 años.
Por medio de la técnica de FISH se observo que el 52% de los pacientes
(30/58) fueron positivos para la deleción 22q11.2.ish(22)(q11.2 q11.2) (TUPLE
1)(figura 1), y el 48% (28/58) fueron negativos para dicha deleción (figura 2).
En los pacientes positivos las cardiopatías más frecuentes fueron: atresia
pulmonar (AP) con comunicación interventricular (CIV) en 11/30 (36%) pacientes,
tetralogía de fallot (TF) en 9/30 (30%) pacientes y CIV encontrada en 3/30 (10%)
de pacientes (cuadros 1 y 2).
Las cardiopatías más frecuentes que se encontraron en los pacientes
negativos para la deleción 22q11.2 fueron: CIV encontrada en 6/28 (21%)
pacientes, comunicación interauricular (CIA) y persistencia del conducto arterioso
(PCA) ambas encontradas en 5/28 (17%) pacientes, cardiopatía congénita
acianógena (CC) con PCA, cardiopatía congénita cianógena (CCC), CCC
levoisomerismo, CCC tipo PCA, CIV perimembranosa, transposición de grandes
arterias (TGA), arco aórtico derecho (AAoD) cada una de estas estuvo presentes
en al menos 2/28 (7%) pacientes (cuadro 3 y 4).
21
Las cardiopatías menos frecuentes, en solo un paciente, que presentaron
tanto los pacientes positivos como negativos muestran una gran diversidad y se
describen en los cuadros 2 y 4.
También se encontraron una gran variedad de aspectos fenotípicos agregados, en
ambos tipos de pacientes, las más frecuentes fueron: Paladar alto, malposiciones
dentarias, filtrum ancho, pulgar trifalángico, dedos afilados, imbricación de los
dedos del pie, hélix plegado, implantación baja de los pabellones auriculares,
puente nasal deprimido, retraso psicomotor, retraso del lenguaje y alteraciones
plaquetarias.
La prevalencia del síndrome de DG/VCFS (deleción 22q11.2) que se mostró
en este estudio fue de casi la mitad de los pacientes estudiados (52%).Entre ellos
los defectos conotroncales más comunes fueron AP con CIV y TF.
En los pacientes negativos (48%), los defectos conotroncales mas
frecuentes fueron CIV, CIA, PCA, CC con PCA, CCC levoisomerismo, CCC tipo
PCA, CIV perimembranosa, TGA, y AAoD.
22
Figura 1.Hibridación In Situ con fluorescencia (FISH) en una metafase donde semuestran las dos señales (verdes y rojas) de ambos cromosomas 22 normal en unpaciente negativo a la deleción 22q11.2.
Figura 2. Metafase de un paciente positivo con (FISH) mostrando la deleciónish(22)(q11.2q11.2) (TUPLE I-) donde se muestra las señales verde y una roja delcromosoma 22.
23
Cuadro 1. Diagnósticos clínicos de las cardiopatías que presentaron los pacientes positivos para ladeleción 22q11.2
Pacientes Edad Sexo Cardiopatías1 15 años M CC de sigmoideas pulmonares, hipertrofia del ventrículo derecho e insuficiencia cardiaca compensada y T F.2 3 meses F AP con CIV y falla pulmonar3 16 años M AT, EP e insuficiencia y CIV e CIA infundibular.4 N/D M TF.5 7 años M TF.6 5 años M TF.7 3 años F TA común y conexión anómala de vena pulmonar.8 3 meses M AP e hipoplasia de ramas pulmonares y CIV.9 16 años F Aficula perinatal, CCC completa, AP CIV amplia, aorta cavalgada, aorta estenosis balbular, y EA.10 3 años F AP con CIV11 3 años F AP con CIV12 2 años M AP con CIV13 5 años F AP con CIV14 19 años M CCC tipo AP con CIV amplia15 2 años M CCC tipo AP con CIV.16 2 años M AP con CIV17 11 años M TF.18 25 años M AP con CIV y con colaterales aortopulmonares19 8 años F TF20 5 años M Estenosis de válvula pulmonar con CIV, AAoD y doble tronco braquicefalico21 10 años M AP con CIV22 2 años M AP con CIV y AAoD con CIA.23 6 años F AP con CIV24 2 años F AP con CIV25 8 años F AP con CIV26 1 año M CCC y TF.27 2 años M AAI tipo B28 2 años M TF.29 4 años F Ausencia de simoideas pulmonares, CIV y origen anómalo de la arteria sincurfleja.30 8 años F TF
Abreviaturas: DGS =Síndrome de DiGeorge, VCFS =Síndrome de Velocardiofacial, AP= Atresia Pulmonar, AT = Atresia Tricuspídea, AAI =Arco AorticoInterrumpido, AAoD = Arco Artico Derecho, CC= Cardiopatía Congénita aciogena, CCC= Cardiopatía congénita cianogena, CIV = Comunicacióninterventricular, CIA =Comunicación interauricular, EP= Estenosis Piulmonar, EA = Estenosis Auricular, TA = Tronco Arteriosos, TF= Tetralogía de Fallot,N/D= no determinado.
25
Cuadro 2. Frecuencia con la que se presentaron las cardiopatías enpacientes positivos para la deleción 22q11.2
Cardiopatías de pacientes positivosCardiopatia No. De Pacientes
- AP con CIV- TF.- CIV.- AP- AP con CIV amplia.- AP con CIV con colaterales aortopulmonares.- CC de sigmoideas pulmonares.- CCC.- CCC tipo AP con CIV amplia- CCC tipo AP con CIV- Arteria Pulmonar- Hipetrofia del ventriculo derecho- Insuficiencia cardiaca compensada- Falla pulmonar- AT- EP.- Insuficiencia pulmonar- CIA infundibular- TA común- Conexión anómala de vena pulmonar.- Hipoplasia de las ramas pulmonares- Aficula perinatal- Cardiopatia congénita completa- Aorta cavalgada- Aorta estenosis balbular- EA- Estenosis de la valvula pulmonar con CIV- AaoD- AAoD con CIA- AAI tipo B- Doble tronco braquicefalico- Ausencia de simoideas pulmonares.- Anomalía de la arteria cincurfleja.
11/30 (36%)9/30 (30%)3/30 (10%)1/30 (3%)1/30 (3%)1/30 (3%)1/30 (3%)1/30 (3%)1/30 (3%)1/30 (3%)1/30 (3%)1/30 (3%)1/30 (3%)1/30 (3%)1/30 (3%)1/30 (3%)1/30 (3%)1/30 (3%)1/30 (3%)1/30 (3%)1/30 (3%)1/30 (3%)1/30 (3%)1/30 (3%)1/30 (3%)1/30 (3%)1/30 (3%)1/30 (3%)1/30 (3%)1/30 (3%)1/30 (3%)1/30 (3%)1/30 (3%)
Abreviaturas: AP= Atresia Pulmonar, AT = Atresia Tricuspídea, AAI =Arco Aortico Interrumpido,AAoD = Arco Artico Derecho, CC= Cardiopatia Congénita aciogena, CCC= Cardiopatia congénitacianogena, CIV = Comunicación interventricular, CIA =Comunicación interauricular, EP= EstenosisPiulmonar, EA = Estenosis Auricular, TA = Tronco Arteriosos, TF= Tetralogía de Fallot.
26
Cuadro 3. Diagnósticos clínicos de las cardiopatías que presentaron los pacientes negativos para la delecion22q11.2
Pacientes Edad Sexo Cardiopatías1 3 años M CC tipo CIV y CIA2 8 años F CC con PCA.3 2 años M CCC tipo AP con CIV amplia.4 24 años M CCC tipo AP con CIV.5 5 años M CCC tipo AT con EP.6 4 años M CCC tipo PCA, AP con CIV.7 2 años F CCC tipo TA tipo I.8 8 años M CCC tipo AT, CIV y CIA.9 7 años M CCC compleja. Conexión anómala de venas pulmonares mixta.10 9 años F CC tipo DCSVD con CIV subaórtica.11 7 años F CCC tipoTF y PCA.12 7 años M CCC, TGA, AP, CIV perimembranosa, PCA, DCSVD con AP.13 2 años F CCC compleja, tipo AP, CIA.14 3 años M CCC Levoisomerismo, Aurícula común, Ventrículo íntegro con probable morfología izquierda. Atresia Pulmonar (AP) con ramas
pulmonares confluentes.15 5 años F CC, CIV, PCA, EA y aorta bivalva16 14 años M CC tipo Atresia del AAAo, y PCA.17 8 años F CCC, TF con DCSVD y EP severa.18 2 años M CCC, TA tipo I y AAoD.19 4 años M CCC tipo AP con séptum íntegro y PCA.20 2 años M CCC tipo TA común y AaoD.21 4 años M CC tipo coartación de la aorta22 14 años M CCC, TGA, CIV perimembranosa, y PCA.23 7 años F CCC Levoisomerismo, DCSVD, EP, CIV y CIA.24 3 años M EP y CIA25 12 años M CC tipo TF.26 5 años M CCC, TF.27 8 años F CC tipo PCA e Insuficiencia aortica.28 1 año M CCC tipo DCSVD y CIV subpulmonar.
Abreviaturas: AP= Atresia Pulmonar, AT = Atresia Tricuspídea, AAI =Arco Aortico Interrumpido, AAoD = Arco Artico Derecho, AAAo = Atresia del arcoaórtico, CC= Cardiopatia Congénita aciogena, CCC= Cardiopatia congénita cianogena, CIV = Comunicación interventricular, CIA =Comunicacióninterauricular, DCSVD = Doble cámara de salida del Ventrículo derecho, EA = Estenosis Auricular, EP= Estenosis Pulmonar, PCA=Persistencia delconducto arterioso, TA = Tronco Arteriosos, TF= Tetralogía de Fallot, TGA =Transposición de grandes arterias.
27
Cuadro 4. Frecuencia con la que se presentaron las cardiopatías enpacientes negativos para la deleción 22q11.2
cardiopatías de pacientes negativosCardiopatia No. De paciente
- CIV.- CIA.- PCA- CCC- CC con PCA- EP- CCC Levoisomerismo.- CCC tipo TA tipo I.- CIV perimembranosa- TGA- CCC compleja tipo AP.- AAoD.- AP con CIV.- CC.- CC tipo CIV.- CC tipo DCSVD- CC tipo coartación de la aorta- CC tipo TF- CC tipo AAAo- CCC compleja- CCC tipo AP con CIV amplia- CCC tipo AP con CIV- CCC tipo AT- CCC tipo AT con EP.- CCC tipo PCA.- CCC tipo TA común- CCC tipo TF- CCC tipo TF DCSVD- EP severa.- CCC tipo DCSVD.- CIV subpulmonar- AP- AP con ramas pulmonares confluentes.- Conexión anómala de venas pulmonares mixta- DCSVD- DCSVD con AP.- Ventrículo íntegro con probable morfología
izquierda.- EA- Aorta bivalva- AAAo- Insuficiencia aortica.- Aurícula común- Ventrículo íntegro con probable morfología
izquierda.
6/28 (21%)5/28 (17%)5/28 (17%)2/28 (7%)2/28 (7%)2/28 (7%)2/28 (7%)2/28 (7%)2/28 (7%)2/28 (7%)
1/28 (3.5%)1/28 (3.5%)1/28 (3.5%)1/28 (3.5%)1/28 (3.5%)1/28 (3.5%)1/28 (3.5%)1/28 (3.5%)1/28 (3.5%)1/28 (3.5%)1/28 (3.5%)1/28 (3.5%)1/28 (3.5%)1/28 (3.5%)1/28 (3.5%)1/28 (3.5%)1/28 (3.5%)1/28 (3.5%)1/28 (3.5%)1/28 (3.5%)1/28 (3.5%)1/28 (3.5%)1/28 (3.5%)1/28 (3.5%)1/28 (3.5%)1/28 (3.5%)
1/28 (3.5%)1/28 (3.5%)1/28 (3.5%)1/28 (3.5%)1/28 (3.5%)1/28 (3.5%)
1/28 (3.5%)Abreviaturas: AP= Atresia Pulmonar, AT = Atresia Tricuspídea, AAI =Arco Aortico Interrumpido, AAoD
= Arco Artico Derecho, AAAo = Atresia del arco aórtico, CC= Cardiopatia Congénita aciogena, CCC=Cardiopatia congénita cianogena, CIV = Comunicación interventricular, CIA =Comunicación interauricular,DCSVD = Doble cámara de salida del Ventrículo derecho, EA = Estenosis Auricular, EP= Estenosis Pulmonar,PCA=Persistencia del conducto arterioso, TA = Tronco Arteriosos, TF= Tetralogía de Fallot, TGA=Transposición de grandes arterias.
28
DISCUSIÓN Y CONCLUSIÓN.
Muchos tejidos y estructuras afectadas en pacientes que presentan el
Síndrome DiGeorge/Velocardiofacial derivan de los arcos faríngeos durante su
desarrollo embrionario. En este proceso, las células de la cresta neural migran
dentro de las bolsas faríngeas y participan en la formación de la región
craniofacial, el cuello y la región conotroncal del corazón, por lo que defectos
genéticos que afectan la migración de estas células son responsables del cuadro
clínico en pacientes con DG/VCFS.
No todos los resultados clínicos que están asociados a DG/VCFS pueden
ser atribuidos a la migración incorrecta de las crestas neurales pero también se
atribuyen a la haploinsuficiencia de genes que presentan (Carlson et al 1997b).
Como se muestra en la literatura el fenotipo de DG/VCFS presentan una
gran variedad de aspectos clínicos que pueden ser causados por la migración
incorrecta de las células de la cresta neural y la haploinsuficiencia(Carey et al
1992). Debido a esto la mayoría de los pacientes que presentan la deleción
22q11.2 muestran una diversidad variada de aspectos fenotípicos y de defectos
conotroncales los cuales son frecuentes en este Síndrome y ocurren en
aproximadamente 8 en 1000 nacidos vivos y es una de las más comunes
anomalías congénitas.(Goldmuntz et al 1993).
En este estudio los 58 pacientes que mostraron uno o más defectos
conotroncales y que se trataron en el Instituto Nacional de Cardiología Ignacio
Chavez , se encontró que el 52% de ellos tuvieron la deleción 22q11.2. Entre
estos se presentaron 18 pacientes de sexo masculino de los cuales 12 son niños
de tres meses a 10 años, cuatro son adolescentes de 11 a 19 años de edad, un
adulto de 25 años y uno que no tiene determinada la edad debido a que no se
tiene el expediente completo.
Entre las cardiopatías más frecuentes que se encontraron entre los niños y
los adolescentes fueron AP con CIV y TF, mientras que el adulto presentó AP con
CIV y colaterales aorto pulmonares, el cual posiblemente tuvo una cirugía
temprana por que aumentó la posibilidad de sobrevida, modificando su historia
natural y su calidad de vida permitiéndole llegar a la edad adulta (Buendía et al
29
2001). Este individuo se presento al instituto Nacional de Cardiología posiblemente
por que presentaba alguna molestia y fue aquí donde se le diagnostico que la
presencia de la deleción 22q11.2.
Doce pacientes del sexo femenino presentaron la deleción 22q11.2, 11
fueron niñas de tres meses a ocho años de edad. La niña de tres meses de edad
falleció después del estudio por causas desconocidas y solamente se presentó un
adolescente de 16 años.
Las cardiopatías más frecuentes que presentaron los pacientes positivos
fueron AP con CIV y TF. En un estudio que se hizo recientemente se encontró que
en una serie de pacientes Japoneses que presentaban TF la frecuencia en la que
se presentaba en los pacientes con la deleción 22q11.2 fue calculada en un 13%,
este valor fue comparado con varios estudios sugiriendo que no hay diferencia
significativa en la prevalencia. La frecuencia general estimada fue 18 veces mayor
que la de los niños con Síndrome de Down (Trisomía 21). También se encontró
que en paciente con la deleción fue significativamente mayor la TF con AP que en
los pacientes que presentaban AP más ductus arterioso persistente (DAP) o
Estenosis pulmonar. Lo cual indica que TF es la más frecuente de los defectos
conotroncales ocurriendo en aproximadamente 10% de infantes con defectos
congénitos del corazón (Mneda et al., 2000; Goldmuntz et al., 1993).
Dentro de los pacientes negativos para la deleción se incluyeron 28
(48%)de estos, los cuales 19 fueron hombres, 15 fueron niños de tres y ocho años
de edad, tres adolescentes de 12 a 14 años de edad y un adulto de 24 años de
edad. Entre las cardiopatías más frecuentes encontradas en estos fueron CIV,
CIA, y PCA. En mujeres se encontraron que había nueve mujeres las cuales
fueron todas niñas de entre dos a nueve años de edad y mostraron las mismas
cardiopatías que en los varones.
En nuestro estudio la prevalencia del Síndrome de DG/VCFS (deleción
22q11.2), fue del 52% en pacientes que presentaron defectos conotroncales más
comúnmente relevantes, como AP con CIV y TF, mientras que en los pacientes
que no presentaron la deleción 22q11.2 (48%) también presentaban defectos
conotroncales, como CIV, CIA, PCA, CC con PCA, CCC levoisomerismo, CCC tipo
30
PCA, CIV perimembranosa, TGA, es uno de los defectos conotroncales menos
comunes en la deleción 22q11.2. Este cuenta solo con el 5% de los reportes en
los defectos congénitos del corazón y en ningún desórden genético se encuentra
como el más común (Marble et al., 1998). Así lo muestran estudios colaborativos
europeos donde los pacientes con la deleción 22q11.2 mostraron que menos de
1% de ellos tuvieron TGA, por lo que se considera muy raro en este síndrome
(Ryan et al 1997). y AAoD. Estos pacientes en ocasiones se pueden considerar
como falsos positivos, debido a que a veces pueden ocasionarse por que la
deleción es más grande que la sonda y no abarca toda la zona que es afectada
por lo cual no se marca con el fluoroforo la región y se diagnostica como negativo
para la deleción.
Estudios recientes muestran que el estudio de las cardiopatías congénitas
que se hacen en etapas fetales, sobretodo en poblaciones de riesgo, o en
presencia de antecedentes familiares, ya sea mediante un ultrasonido o estudio
genético, favorece las condiciones para el nacimiento y se puede programar un
tratamiento para dichos pacientes (Mozziconacci et al., 1997), ya que, al tratar las
cardiopatías tempranamente, se mejora la calidad de vida y aumenta la posibilidad
de sobre vivir para llegar a la etapa adulta. Mientras que si se hace una cirugía
tardía se aumenta la morbilidad y la mortalidad posquirúrgica (Buendía et al 2000).
Los conocimientos acerca de las cardiopatías congénitas y su desarrollo
son escasos, al conocer más acerca de los aspectos embriológicos del corazón y
su relación con las alteraciones genéticas se reconocerán aquellas cardiopatías
que comparten un patrón etiológico y podrían prevenir dando asesoría genética a
la familia. Un logro importante en estos últimos años ha consistido en poder llegar
a un diagnóstico mediante el empleo de las técnicas como la hibridación In Situ
con fluorescencia (FISH) que ha permitido determinar la deleción 22q11.2 en los
pacientes que presentan defectos conotroncales, pero también se han encontrado
que hay pacientes con la deleción pero no presentan las cardiopatías asociadas a
este síndrome este es un campo que seria importante de investigar
31
El estudio y el tratamiento de las cardiopatías congénitas han mostrado en
los últimos 50 años un proceso acelerado. Las cirugías cardiacas cada vez son
màs tempranas y con intenciones correctivas, dando así una mayor posibilidad de
sobrevida a estos pacientes los cuales pueden alcanzar una edad adulta y por
razones naturales procrear (Buendía et al 2000).
Consideró que es importante conocer la etiología de las cardiopatías congénitas y
las alteraciones que ocurren en la cardiogénesis, ya que, éstos son esenciales
para la prevención.
Por el alto porcentaje de individuos que presentan cardiopatías de tipo conotroncal
que acuden a la consulta de Cardiopediatría del INC. Es importante que se
aumente la información entre los médicos y la población para poder proporcionar
un buen tratamiento para que el paciente llegue a una vida plena.
Propongo que en todo individuo que presente alguna o varias de las cardiopatías
de tipo conotroncal se les haga un estudio de citogenetica molecular para
determinar si presentan la deleciòn 22q11.2 (DG/VCFS) y así proporcionarles
asesoramiento y orientación sobre el síndrome de DiGeorge y Velocardiofacial y
las cardiopatías involucradas las cuales pueden ser susceptibles a un tratamiento.
32
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