Universidad de Colima

Facultad de Medicina

Centro Universitario de Investigaciones Biomédicas

EFECTOS FARMACOLOGICOS Y TOXICOLOGICOS DE EXTRACTOS HIDRO-ALCOHOLICOS DE ZOAPATLE (Montanoa tomentosa) EN RATA.

BIODISPONIBILIDAD DESPUES DE ADMINISTRACIÓN INTRAVAGINAL.

TESIS Que para obtener el grado de

Maestría en Ciencias Fisiológicas con especialidad en Farmacología

presenta

Q.F.B. NORMA ANGELICA MOY LOPEZ

ASESORA

D. en C. LISBETH ENITH GOMEZ MARTINEZ.

COLIMA, COL., MAYO DE 1998.

LA FASE EXPERIMENTAL DE ESTE TRABAJO DE TESIS FUE REALIZADA EN EL CENTRO DE INVESTIGACIONES EN REPRODUCCIÓN ANIMAL (CIRA), CINVESTAV-IPN-UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE TLAXCALA. LA FASE ANALÍTICA SE REALIZO EN EL LABORATORIO DE QUÍMICA AVANZADA DEL CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN CIENCIAS BIOLÓGICAS (CICB) DE LA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE TLAXCALA. LOS RESULTADOS OBTENIDOS DURANTE EL DESARROLLO EXPERIMENTAL DE ESTA INVESTIGACIÓN HAN SIDO PRESENTADOS EN CONGRESOS CIENTÍFICOSY SEMINARIOS DE INVESTIGACIÓN, LOS CUALES SE ENUMERAN A CONTINUACIÓN:

CONGRESOS: 1997 Asociación Mexicana de Farmacología. XX Congreso Nacional de

Farmacología. Oaxaca, Oax. 1997 Sociedad Mexicana de Ciencias Fisiológicas. XL Congreso Nacional de

Ciencias Fisiológicas. Morelia, Mich,

TRABAJOS PRESENTADOS EN CONGRESOS E INSTITUCIONES 1997 Moy, N.A. “Efectos farmacológicos de algunos productos naturales a nivel

de reproducción”. Memorias de Seminarios de Investigación del CICB, UAT. Ixtacuixtla, Tlaxcala.

1997 Moy, N.A., Gómez, L.E. y Angulo, L. “Efectos de extractos hidro-alcohó-licos de zoapatle (Montanoa tomentosa) en ratas en diferentes etapas de gestación”. Memorias del XX Congreso Nacional de Farmacología. Asociación Mexicana de Farmacología. Oaxaca, Oax.

1997 Moy, N.A. “Efecto de extractos hidro-alcohólicos de zoapatle (Montanoa tomentosa) sobre diferentes etapas de la gestación”. Memorias de Seminarios de Investigación del CICB, UAT. Ixtacuixtla, Tlaxcala.

1997 Moy-López, N., (avalado por Cueva-Rolón, R.) Gómez-Martínez, L. y Angulo, L.A. “Efectos anovulatorio y luteolítico de extractos de zoapatle (Montanoa tomentosa) en ratas”. XL Congreso Nacional de Ciencias Fisiológicas. Sociedad Mexicana de Ciencias Fisiológicas. Morelia, Mich.

RESUMEN

EFECTOS FARMACOLÓGICOS Y TOXICOLÓGICOS D E EXTRACTOS HIDRO- ALCOHÓLICOS DE ZOAPATLE(Montanoa Tomentosa)EN RATAS EN DIFERENTES ESTADOS REPRODUCTIVOS

Los extractos de zoapatle (EZ) son usados en la medicina tradicional mexicana para el tratamiento de diferentes padecimientos reproductivos. Se usan con fines abortivos, anti- implantorios, control de natalidad, inductor del sangrado menstrual y oxitócico. La actividad oxitócica ha sido objeto de la mayoría de los estudios sobre esta planta. Sin embargo, este efecto presenta diferencias inter- especies, lo que genera mucha controversia en la literatura. Además del efecto oxitócico, el zoapatle tiene un efecto luteolítico que ha sido poco estudiado. Al respecto solo existen dos estudios en humanos que presentan resultados contradictorios.

Con respecto a la toxicidad de estos extractos, se ha determinado que carecen de efectos toxicológicos. Para algunos autores, el uso indiscriminado de estos extractos puede producir graves accidentes en la madre y mortalidad fetal. A pesar de estas consideraciones, no existen estudios sistemáticos sobre toxicidad del EHAZ en diferentes etapas reproductivas (ciclo reproductivo normal, gestación y pseudo gestación).

La disposición de un xenobiótico tanto en madre como en feto puede ser determinante .de toxicidad. En la gestación .se producen cambios fisiológicos que pueden alterar la absorción, distribución, enlace a proteínas, biotransformación y excreción de una sustancia. igualmente el feto va cambiando sus patrones de disposición de acuerdo al grado de desarrollo, en consecuencia, cuando se administra un xenobiótico durante la gestación es necesario consi derar que los efectos no solo son

dependientes de dosis, sino también del período en que se administra.

Dado el amplio uso de zoapatle, el objetivo de este trabajo fue el de evaluar sistemáticamente los efectos de extractos hidro-alcohólicos de zoapatle (EHAZ administrados por vía intravaginal a ratas en diferentes estados reproductivos y determinar la toxicidad de diferentes dosis del extracto en diferentes etapas de la gestación.

La recolección de la planta y la preparación de los extractos se realizaron tanto en época de floración como de no floración. El extracto hidro- etanólico se preparó por maceración (10 g de peso seco de la hoja en 100 ml de una mezcla alcohol: agua 70:30).

Se utilizaron ratas Wistar hembras de 200 a 300 g de peso. Los animales fueron mantenidos en ciclo luz-obscuridad normal 14: 10 h, con agua y alimentación ad libitum, Sólo se utilizaron ratas que presentaran tres ciclos estrales consecutivos de 4 ó 5 días de duración. También se emplearon ratas Wistar hembras prepúberes de 27 días de edad.

Se emplearon diferentes protocolos experimentales para evaluar los efectos del EHAZ en: 1. E/ ciclo estral normal de la rata. 2. El desarrollo folicular. 3. La ovulación inducida en ratas prépuberes. 4. La pseudo gestación y 5. La gestación.

El ciclo estral de las ratas tratadas con los EHAZ presentó un acortamiento dependiente del día del ciclo estral en que se inicie el

tratamiento, el cual fue siempre seguido de proestro y estro persistente.

También se observó acortamiento del ciclo en los animales tratados para observar el desarrollo folicular, presentándose una mayor proporción de folículos maduros y menor cantidad de cuerpos lúteos. La etapa del metaestro, es donde el cuerpo lúteo empieza a ser funcional, secreta progesterona solamente en esta etapa, declinando la concentración de progesterona al día siguiente, por lo tanto, dicho efecto podría ser debido a la inducción de luteólisis por el EHAZ.

En los animales tratados en los que se indujo la ovulación se encontró una disminución significativa (P<0.05, prueba t-student) en el numero de cuerpos lúteos y un aumento significativo en los folículos maduros dependiente de dosis. Se ha establecido que en ratas cíclicas de 4 días la secreción de P en el diestro aumenta la retroalimentación negativa del estradiol sobre la secreción de LH y cuando los niveles de P caen, aumentan los de E y LH facilitando la ovulación. Por lo tanto, el efecto de los EHAZ de inhibición de la ovulación, podría ser comparado con el que producen los fármacos antiprogestágenos.

La pseudo gestación fue interrumpida por el tratamiento con el EHAZ. Nuestros resultados indican que ta administración del EHAZ produce interrupción de la psg dependiente de dosis, lo cual nos habla de una involución del cuerpo lúteo (luteólisis), indicando que el modelo de psg en la rata es adecuado para demostrar el efecto Meolítico de los EHAZ.

El efecto de los extractos de zoapatle sobre la gestación (G) es dependiente de la’ etapa de la gestación en la cual se inicie el tratamiento. En animales tratados del día 1-21 de G se observó una

disminución significativa en la ganancia de peso de la madre entre los días 6 y 14 con respecto al control (Prueba de Duncan P<0.05). En los animales tratados del 14 al 21, la ganancia de peso fue significativamente superior al control y fue dependiente de dosis. La administración de los EHAZ durante este período produce mortalidad fetal y morbilidad materna dependiente de dosis. Con la dosis de 25 mg se presentó un 20% de mortalidad fetal, 20% de mortalidad y 60% de morbilidad materna. Las ratas tratadas con la dosis de 50 mg presentaron hemorragias al día 19 de gestación, dando como resultado un 100% de mortalidad fetal y materna.

Al administrarse los EHAZ en la última etapa del embarazo, los efectos toxicológicos en los fetos pueden ser producidos Por una fuerte vasoconstricción, lo cual disminuye el aporte sanguíneo y de nutrientes, generando isquemia, la cual podría ser la causa de la muerte fetal. En el caso de la madre, el estado de descomposición de los productos podría haberle generado una septisemia ó al no haber la señal embrionaria para que se desencadene el proceso de parto, las ratas presentan retardo y dilatación cervical inadecuada con la consecuente mortalidad. La muerte fetal que se presentó en nuestros resultados también podría ser explicada por un potente efecto oxitócico, y este podría dar lugar a una fuerte contracción uterina y por lo tanto promover la asfixia fetal con la consecuente mortalidad fetal.

Nuestros resultados muestran que el zoapatle tiene un efecto anovulatorio y confirman el efecto luteolítico, así como la toxicidad del extracto al ser administrado en diferentes etapas de la gestación.

INDICE GENERAL CONTENIDO

PAGINA

CAPITULO I: INTRODUCCIÓN 1

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN. 2

2. OBJETIVOS. 4

3. ANTECEDENTES Y MARCO TEÓRICO. 5

3.1. INVESTIGAClÓN FARMACOLÓGICA DE UNA PLANTA. 5

3.2. ZOAPATLE (Montanoa tomentosa). 8

3.2.1. CONSIDERACIONES BOTANICAS. 8

3.2.2. ANTECEDENTES FARMACOLOGICOS. 9

3.2.3. PRINCIPIOS ACTIVOS DEL ZOAPATLE. 11

32.4. EFECTOS FARMACOLOGICOS DEL ZOAPATLE. 13

3.3. FISIOLOGÍA REPRODUCTIVA. 16

3.3.1. INTRODUCCIÓN. 16

3.3.2. CICLO REPRODUCTIVO DE LA MUJER. 17

3.3.3. CICLO ESTRAL DE LA RATA. 21

3.3.3.1. CICLOS ESTRALES DE 4 Y 5 DÍAS DE DURACIÓN, 22

3.3.4. HORMONAS EN EL CICLO REPRODUCTIVO, 24

3.3.5. CUERPO LÚTEO Y LUTEÓLISIS. 26

3.3.6. GESTAClÓN. 28

3.3.6.1. FISIOLOGÍA DE LA GESTACIÓN. 28

3.3.6.2. HOMEOSTASIS EN LA GESTAClÓN. 29

3.3.6.3. CAMBIOS EN EL SISTEMA RESPIRATORIO. 29

3.3.6.4. IMPORTANCIA DE LA OXITOCINA EN LA

GESTAClÓN

30

3.3.6.5. ADMINISTRAClÓN DE XENOBlÓTlCOS EN LA

GESTACIÓN.

30

3.3.7. PSEUDOGESTACIÓN.

31

CAPITULO II : METODOLOGÍA 33

1. SUJETOS EXPERIMENTALES. 34

2 . EXTRACTO DE ZOAPATLE (Montanoa tomentosa). 34

2.1. OBTENCIÓN DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO DE

ZOAPATLE (EHAZ).

34

CONTENIDO

PAGINA

3. MATERIAL Y SOLVENTES. 35

3.1. SOLVENTES. 35

3.2. REACTIVOS. 35

3.3. EQUIPO. 35

4. PROTOCOLOS EXPERIMENTALES. 35

4.1. EFECTOS DE LOS EHAZ SOBRE DIFERENTES ETAPAS DE LA

GESTACIÓN.

35

4.2. EFECTOS DEL EHAZ SOBRE EL CICLO ESTRAL DE IA RATA. 36

4.3. DESARROLLO FOLlCULAR. 36

4.4. INDUCCIÓN DE LA OVULACIÓN. 36

4.5. EFECTOS DEL EHAZ EN RATAS EN PSEUDOGESTAClÓN. 37

4.6. ANALISIS ESTADISTlCO. 37

CAPÍTULO III: RESULTADOS

38

1. EFECTOS DEL ZOAPATLE EN DIFERENTES ETAPAS DE GESTACIÓN. 39

1.1. EFECTOS DEL EHAZ SOBRE PARAMETROS MATERNO-FETALES. 39

1.1.1, Administración del EHAZ del día l-21. 39

1.1.2. Administración del EHAZ del día 7-21, 39

1.1.3. Administración del EHAZ del día 14-21. 39

1.1.4. Efecto del EHAZ sobre hipófisis, ovario y glándulas adrenales. 41

1.1.5. El EHAZ produce resorciones y cambios en el tamaño y peso

de los fetos.

41

1.2. EFECTOS TOXlCOLOGlCOS DE DIFERENTES DOSIS DEL EHAZ

EN DIFERENTES ETAPAS DE LA GESTACIÓN.

42

2. EFECTOS DEL EHAZ SOBRE EL CICLO ESTRAL DE LA RATA. 43

3. EFECTOS DEL EHAZ EN EL DESARROLLO FOLICULAR. 43

4. EFECTO DE DIFERENTES DOSIS DEL EHAZ DESPUÉS DE

ADMINISTRACIÓN A RATAS PREPÚBERES CON INDUCCIÓN

DE LA OVULAClÓN.

45

5. EFECTOS DEL EHAZ RATAS EN PSEUDOGESTACION. 45

CONTENIDO

PAGINA

CAPITULO IV: DlSCUSlÓN 50

1. EFECTOS FARMACOLÓGICOS Y TOXlCOLÓGlCOS DEL ZOAPATLE

EN LA GESTACIÓN.

52

1.1. Efecto anti-implantatorio. 52

1.2. Efecto del EHAZ en diferentes etapas de gestación. 53

2. EFECTO LUTEOLITICO. 55

3. EFECTO DEL EHAZ EN RATAS PREPÚBERES A LAS QUE SE HA

INDUCIDO OWLACIÓN.

57

4. VIABILIDAD DE LA VÍA INTRAVAGINAL PARA LA ADMINISTRACI6N

DEL EHAZ.

58

CAPÍTULO V: CONCLUSIONES

60

BIBLIOGRAFIA

62

INDICE DE CUADROS.

NÚMERO CONTENIDO

PAGINA

1 Consideraciones botánicas del zoapatle: Montanoa tomentosa, subs. tomentosa.

8

2 Primeras aportaciones científicas en el estudio del zoapatle. 10 3 Contenido de Ácido grandiflorénico (AG) en extractos de

Montanoa tomentosa.

11 4 Ciclos y fases del ciclo reproductivo de la mujer. 17-19 5 Duración del ciclo reproductivo y sus etapas folicular y luteal en

diferentes mamíferos estrales

20 6 Características fisiol6gicas, morfológicas y citológicas del ciclo estral de

la rata.

21 7 Pérdida de fetos post-implantación con la administraci6n del EHAZ en

diferentes periodos de gestación.

42 8 Datos de mortalidad y morbilidad fetal y materna cuando se

administra el EHAZ en diferentes etapas de gestación.

43

INDICE DE FIGURAS

NÚMERO CONTENIDO PAGINA

1 Interrelación de productos metabólicos primarios y secundarios. 6 2 zoapatle (Montanoa tomentosa, Subs. tomentosa). 9 3 Algunos de Los compuestos aislados de Montanoa tomentosa y

especies afines.

12 4 Diferentes etapas del ciclo ovárico de la rata: desarrollo folicular,

ovulación, formación y regresión del cuerpo lúteo.

19 5 Ciclo uterino b menstrual humano. 20 6 Tipos de células que aparecen en el exudado vaginal de rata

durante las diferentes etapas del ciclo estral.

22 7 Cambios cíclicos observados en la concentración de hormonas

durante el ciclo reproductor de la mujer.

26 8 Efecto del EHAZ sobre la ganancia de peso de las ratas gestantes, 40 9 Efectos del EHAZ sobre la implantación y tamaño de los fetos más

cercanos a la vagina

41 10 Efectos de la administración i.vag. del EHAZ en diferentes etapas

del ciclo estral.

44 11 Efectos del EHAZ (25 mg de peso seco de la hoja de zoapatle) ,

sobre el desarrollo folicular en ratas con ciclo estral normal, cuando la administración (vía i.vag.) inicia en la etapa de metaestro

46

12 Efectos del EHAZ (50 mg de peso seco de la hoja de zoapatle) sobre el desarrollo folicular en ratas con ciclo estral normal, cuando la administración (vía i.vag.) inicia en la etapa de metaestro.

47

13 Efecto anovulatorio de los EHAZ (administración vía subcutánea) en ratas prepúberes a las cuales se les indujo la ovulación con la administración de gonadotropinas coriónicas equina y humana.

48

14 Interrupción de la pseudogestación producida por la administración i.vag. de diferentes dosis del EHAZ.

49

CAPITULO 1

INTRODUCCIÓN

2

1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN.

En la medicina tradicional mexicana, existen gran variedad de plantas de gran

utilidad en el tratamiento de diferentes padecimientos de la mujer, en aspectos

relacionados con el sistema reproductivo. Los agentes reguladores de la fertilidad

obtenidos de plantas utilizadas por los indígenas, han sido de gran beneficio tanto para

nuestros antepasados, como para aquellas comunidades alejadas de la civilización, en

donde el acceso a fármacos anticonceptivos esta fuera de sus posibilidades

(Goonasekera y cols., 1995). Es igualmente reconocido el uso de plantas medicinales

como abortivos, inductores del parto y del sangrado menstrual.

Desde hace más de 400 años, los extractos de zoapatle (EZ) han sido utilizados

en la medicina tradicional por sus propiedades interceptivas* y como agente oxitócico

(Ponce-Monter y cols., 1983).

Aunque se han realizado un gran número de investigaciones sobre la actividad

farmacológica de los EZ, en muchos casos la información resulta contradictoria, ya que

se ha comprobado que el tipo de extracto, tiempo de recolección de la planta, especies y

estado hormonal, son algunas de las variables que condicionan los efectos de esta

planta a nivel reproductivo.

La actividad oxitócica ha sido objelo de la mayoría de los estudios realizados

sobre esta planta. El efecto uterotónico del zoapatle ha sido comprobado en cobayos

(Waller y cols., 1987), pero se han observado efectos útero-relajantes en ratas, conejos y

humanos (Losoya y cols., 1983).

Aunque se ha sugerido en algunos estudios, el efecto luteolítico no ha sido

sistemáticamente estudiado. Dos estudios realizados en humanos muestran resultados

contradictorios (Gallegos y cols., 1977; Landgren y cols., 1979).

*Término utilizado para describir agentes abortifacientes, inductores del sangrado menstrual, anticonceptivos, útero-evacuantes y antiímpantatorios (Phillipson, 1979).

3

Recientemente Ortiz y cols., (1995) administraron un extracto hidro-alcohólico de

zoapatle (EHAZ) a vacas con retención del loquios postparto e infección uterina. Esto es

un problema muy común en la ganadería de nuestro país. La administración intrauterina

del EHAZ produjo involución uterina y recuperación del cuadro infeccioso.

Adicionalmente, encontró que las vacas tratadas con zoapatle entran en “calor“ corto

tiempo después del tratamiento, lo cual es ventajoso para la inseminación artificial, ya

que es posible sincronizarlas sin necesidad del uso de prostaglandina (PGF 2α y

antibióticos y en menor tiempo después del parto. El examen clínico de estos animales

reveló que el zoapatle produce involución del cuerpo lúteo, lo cual sugiere que el efecto

de sincronización puede ser debido a luteólísis.

Considerando que en rata existen muchos reportes contradictorios sobre los

efectos de zoapatle y no se ha comprobado en forma fehaciente el efecto luteolítico del

mismo, el propósito de este trabajo fue el de estudiar sistemáticamente los efectos del

EHAZ en diferentes estados reproductivos.

Con respecto a la toxicidad de los EZ, también existe controversia en la literatura.

Aunque se ha promulgado carencia de toxicidad (Landgren y cols., 1979; Gallegos y

cols., 1983; Southam y cols., 1983), algunos autores también consideran que el uso

indiscriminado de esta planta puede producir graves accidentes a la madre y mortalidad

infantil (Nieto, 1953; Cervantes, 1790). A pesar de estas consideraciones, no existen

estudios sistemáticos sobre la toxicidad del EZ en diferentes etapas de la gestación.

Cuando se administra un xenobiótico al organismo durante la gestación es

necesario considerar que los efectos no sólo son dependientes de dosis, sino también

del período en que se administra. Igualmente, la disposición de un xenobíótico tanto en

madre como en feto puede ser determinante de toxicidad, ya que en la gestación se

producen cambios fisiológicos que pueden alterar la absorción, distribución, enlace a

proteínas, biotransformación y excreción de esa sustancia.

Por lo tanto, considerando el amplio uso del zoapatle en la medicina tradicional,

es importante evaluar el efecto toxicológico del EHAZ en las diferentes etapas de la

gestación, lo cual es el segundo propósito de este trabajo..

4

2. OBJETIVOS 2.1. Evaluar en forma sistemática los efectos de Extractos Hidro-alcohólicos de

Zoapatle (EHAZ) en ratas en diferentes estados reproductivos:

a). Ciclo estral normal.

b). Embarazo.

c). Pseudoembarazo.

2.2. Determinar si la administración intravaginal (i.vag.) de los EHAZ produce efectos

sistémicos.

2.3. Determinar la toxicidad de diferentes dosis del EHAZ en diferentes etapas de la

gestación.

5

3. ANTECEDENTES Y MARCO TEÓRICO.

3.1. INVESTIGACIÓN FARMACOLÓGICA DE UNA PLANTA.

La vida del hombre está íntimamente unida a su medio ambiente, en particular a

las plantas, ya que de ellas obtiene compuestos químicos necesarios para sus funciones

vitales, materiales que le protegen de las adversidades del medio y que hacen su

estancia en el planeta más recomfortable.

Todos los pueblos primitivos han adquirido información sobre las propiedades

medicinales de un gran número de plantas propias de su medio ambiente. Estos

conocimientos, generalmente los han acumulado determinados individuos, sacerdotes,

hechiceros, curanderos, etc., quienes los han transmitido de generación en generación, a

determinados aprendices y a sus descendientes (Domínguez, 1988).

No todos los componentes químicos elaborados por las plantas poseen igual

interés para el farmacólogo. En este caso, los principios activos aislados de las plantas

que puedan ser usados para la prevención, el diagnóstico y tratamiento de enfermedades

son a los que se les da mayor importancia (Fig. 1).

Existen otros compuestos químicos como los glúcidos, grasas y proteínas, los

cuales tienen importancia dietética y muchos, como los almidones y las gomas, se

emplean en técnica farmacéutica. Otras sustancias, como el oxalato cálcico, sílice,

lignina y materias colorantes, pueden ser coadyuvantes en la identificación de fármacos

y detección de adulteraciones (Evans y cols. 1991).

Toda la materia prima utilizada, procedente de una planta, ha de ser

adecuadamente identificada, ya que puede desperdiciarse mucho tiempo y dinero en el

examen de material de origen dudoso. La elección depende de la naturaleza de la

materia prima vegetal y de los componentes que han de ser aislados de ella. Las

plantas desecadas suelen pulverizarse antes de la extracción, mientras que las plantas

frescas (hojas, flores, etc.), pueden ser homogeneizadas o bien, maceradas con un

disolvente como el alcohol.

6

BIOSÍNTESIS DE MELABOLITOS VEGELALES

Figura No. 1. Interrelación de productos metabólicos primarios y secundarios (Domínguez, 1988).

7

En la investigación de plantas utilizadas en la medicina tradicional, escoger el

solvente adecuado para la extracción es muy importante. Generalmente son usados

solventes orgánicos polares o moderadamente polares (Samuelsson y cols, 1985).

Para propósitos de investigación los extractos acuosos generalmente son poco

utilizados debido a la complejidad y dificultad que se tiene al usarlos, aunque debe

considerarse que los curanderos tradicionales siempre preparan sus remedios en agua,

ya sea en forma de té, o impregnando de agua fría por un determinado período de

tiempo, las partes de la planta a utilizar (Samuelsson y cols., 1985). En algunos otros

casos se adiciona la planta molida a los alimentos (Hedberg y cols, 1982, 1983a,b).

Por lo tanto, debe asumirse que si la planta contiene compuestos

farmacológicamente activos, estos deben ser extraídos por el agua y que el uso de otro

tipo de solventes podría disminuir su actividad farmacológica (Samuelsson y cols., 1985).

8

3.2. ZOAPATLE (Montanoa tomentosa).

3.2.1, CONSIDERACIONES BOTÁNICAS.

Zoapatle es el nombre común de la Montanoa tomentosa, la cual es una planta

originaria de México. Vicente Cervantes le dió este nombre en honor al eminente médico

mexicano Luis Montaña (Gallegos, 1983).

En la antigüedad, se le conocía como “cihuapatli” en lengua náhuatl (término que

refleja el sistema de clasificación botánica usado por los mexicas), ya que sintetiza dos

vocablos: cihuatl-mujer y patli-medicina. Se vende en los mercados de la Ciudad de

México y zonas aledañas con otros nombres tales como: Achina, cihuapatli, guapiojo,

hierba de la parida, hierba de la mujer, too y zoapatle (Bejar, 1985).

En el cuadro 1 se presenta la clasificación botánica y características biológicas y

físicas del zoapatle (fig. 2).

Cuadro No. 1. Consideraciones botánicas del zoapatle: Montanoa tomentosa, subs. tomentosa

*Subsp. en donde se han encontrado mas propiedades medicinales (Estrada y cols., 1983).

9

3.2.2. ANTECEDENTES GENERALES.

El zoapatle o cihuapatli es una planta utilizada en forma de extracto acuoso (en

forma de té, hirviendo las hojas de la planta de 10-20 minutos) desde hace más de 500

años con fines curativos (Gallegos, 1983).

El uso medicinal que daban a esta planta los mexica era para aliviar los

padecimientos de la mujer al término del embarazo, induciendo la labor de parto al

incrementar las contracciones uterinas y también para disminuir el tiempo de

“cuarentena” postparto (Del Pozo, 1966; Ortiz de Monte Llano, 1975). El uso del

zoapatle para inducir el sangrado menstrual fue descrito por Alfaro en 1866.

Figura No. 2. Zoapatle (Montanoa tomentosa, Subs.. tomentosa).

La primera clasificación taxonómíca sistemática fue realizada por Cervantes en

1790 en su obra: “Ensayo a la Materia Médica del Reino Vegetal de la Nueva España”.

en la cual se describe por primera vez, tanto el efecto terapéutico como el efecto

10

toxicológico del zoapatle, ya que advierte que la planta solo debe usarse en los “partos

perezosos” cuando estos no dependen de una mala posición de la criatura (Bejar, 1985).

El siguiente cuadro se presenta una síntesis de las primeros estudios realizados

con la planta del zoapatle en diferentes estados reproductivos.

Cuadro No. 2. Primeras aportaciones científicas en el estudio del zoapatle (1866-1979).

INVESTIGADOR(ES)

APORTACIONES

Alfaro, R. (1866) Usó el extracto acuoso de zoapatle (EAcZ) para inducir el sangrado menstrual.

Cota, F (1883) Utilizó por primera vez animales de laboratorio para investigar el efecto del zoapatle (dosis: 1-2 g) en perras preñadas de dos y medio meses de gestación, observando un efecto similar al de la ergotina ,(aumento de la contractilidad uterina).

Reza, A. (1887) Observó tetanización del músculo uterino al administrar oralmente el extracto acuoso de zoapatle a mujeres embarazadas, concluyendo que el uso de la planta es beneficioso sólo después del parto, ya que se impide la hemorragia evitando complicaciones funestas.

Rodríguez, J. M (1869) Después de 15 minutos de haber administrado un extracto hidro-alcohólico de zoapatle (EHAZ) a sus pacientes, se presentaron fuertes contracciones en l a matriz.

Derbez y cols. (1945) Aumento en la contractilidad uterina de animales gestantes y no gestantes (cobayos y gatos) después de la administración de un EAcZ

De Alvarez, R. (1960) Proclamó un rechazo general hacia la planta, debido a que la tetanización del músculo uterino podría tener como consecuencia la muerte materna ó fetal.

Gallegos y cols. (1974) La administración oral de zoapatle (15 g) en los días 18-20 del ciclo menstrual en mujeres con menstruación normal, produce una rápida y transitoria reducción de los niveles de progesterona circulante (posible efecto luteolítico). 2. La administración frecuente del extracto (9 días), dio como resultado un ligero acortamiento del ciclo menstrual y en algunos casos, sangrado intermenstrual a los 30-45 minutos después de la administración oral del EAcZ. 3. Observaciones toxicológicas preclínicas (aguda y subaguda) en ratas y perros, los EAcZ no presentaron toxicidad. 4. La evaluación del efecto anti-implantatorio de la decocción de zoapatle en ratas preñadas (50 mg/día por 8 días) dio como resultado una inhibición del 70% en el número de implantes en ratas tratadas con el preparado fresco, observándose disminución de la potencia farmacológica cuando el preparado tenía más de 10 días.

Landgren y cols. (1979) La administración del EAcZ en la primera etapa del embarazo en mujeres (1.1 g/kg.), provocó fuertes contracciones del útero con presencia de dilatación cervical sin alterar los niveles plasmáticos de progesterona y estradiol. Sin embargo, no lograron demostrar los efectos anti-implantatorio y luteolítico en mujeres y roedores.

11

3.2.3. PRINCIPIOS ACTIVOS DEL ZOAPATLE.

Se han aislado más de 40 compuestos químicos de la Montanoa tomentosa y

especies afines. De todos estos compuestos químicos, solamente se ha probado la

acción farmacológica de algunos, entre los cuales se encuentran: el Montanol (M),

Zoapatanol (Z), tomentol (T), tomexantina (TX), Ácido kauradíenoíco o grandiflorénico

(AG), Ácido monoginoíco (AM) y Ácido kaurenoíco (AK) (fig. 3).

En estudios en animales in vivo e in vitro se ha determinado que el extracto

hexánico de las hojas del zoapatle, posee efectos uterotónicos. En éste tipo de extracto

se encuentran el AG, AM y el AK, los cuales después de ser aislados han mostrado que

poseen efectos uterotrópícos (Enríquez y cols., 1983; Lozoya y cols., 1983). De estos

tres compuestos, el que se encuentra en mayor proporción en la planta es el AG (cuadro

3), el cual se extrae tanto en agua como en solventes orgánicos (Enríquez y cols., 1983).

Cuadro No. 3 Contenido de Ácido grandiflorénico (AG) en extractos de Montanoa tomentosa MATERIAL DE LA

PLANTA SOLVENTE CONTENIDO DE AG

Raíces Dielil éter 71.9±3.81 mg/g Tallos Dielil éter 52.1±2.76 mg/g Hojas Dielil éter 43.6±2.31 mgg Hojas Agua 0.19±0.01 mg/g

El Z y M son compuestos biológicamente activos aislados principalmente de las

hojas del zoapatle, y representan un tipo de estructura díterpenoide oxepano inusual

(Cotter, 1981). De la mezcla díterpenoíde se ha encontrado que T y Z se encuentran en

mayor proporción que M (Quijano y cols., 1985a). Otro compuesto con este tipo de

estructura es la TX (Seaman y cols., 1984) que junto con el T han sido evaluados en

ensayos biológicos por su actividad uterotónica (Quijano y cols., 1985a y b).

El extracto acuoso de la planta presentó mayor potencia farmacológica para

producir actividad uterotóníca que los extractos orgánicos (extractos en cloroformo,

alcohol, éter, etc.) (Gallegos, 1983).

La Montanoa frutescens presenta efectos similares a los producidos por

Montanoa tomentosa, y el aislamiento de las fracciones solubles en agua es vanas veces

más potente que el extracto crudo acuoso de zoapatle. El Z, M y los compuestos

kaurenicos son compuestos de bajo peso molecular e insolubles en agua, por lo tanto,

estos compuestos podrían ser originados por la hidrólisis de compuestos de mayor peso

molecular solubles en agua (Guzmán y cols., 1988).

12

Figura No. 3. Algunos de los compuestos aislados de Montanoa tomentosa y especies afines seleccionados del cuadro publicado por Bejar (1985).

13

3.2.4. EFECTOS FARMACOLÓGICOS DEL ZOAPATLE.

Los extractos de zoapatle (EZ) han sido utilizados en la medicina tradicional por

sus propiedades interceptivas (término utilizado para describir agentes abortifacientes,

inductores del sangrado menstrual, anticonceptivos, útero-evacuantes y

antiímplantatorios. Phillipson, 1979) y como agente oxitócico (Ponce-Monter y cols.,

1983).

Los efectos del zoapatle son dependientes de: estado hormonal del individuo al

que se administre, especie, tipo de extracto, tiempo de recolección de la planta, tipo de

planta y subespecie, entre algunos otros factores.

La administración intrauterina del EAcZ de Montanoa frutescens en el cuarto día

de pseudogestación de la rata (concentraciones equivalentes a 50 mg y 5 mg del peso

seco de la hoja) produce un efecto anti-implantatorio del 100%. Sin embargo, al

administrar el EAcZ de Montanoa tomentosa (dosis equivalentes a 50 y 100 mg en peso

seco de la hoja) no se inhibió el número de implantes hasta el día 11 de gestación,

observándose en la mayoría de los implantes características anormales (coloración azul,

mala orientación de los productos y espaciamiento, etc.), considerando estos cambios

morfológicos como probables sitios de reabsorción (Pedrón y cols., 1985).

Al administrar por vía intrauterina el EAcZ de Montanoa tomentosa en el día 4 de

gestación de la rata, no se altera la morfología uterina en los siguientes días (5-8 de

gestación), pero al administrar el extracto de Montanoa frutescens se presenta una

profunda alteración de las estructuras uterinas (pérdida de epitelio, disminución de la luz

de los vasos sanguíneos y alteración de las células del estroma del endometrio de la

rata). Estas alteraciones morfológicas se correlacionan con el efecto anti-implantatorio

asociado con la vía de administración (Angulo y cols., 1985).

No hay efecto del EAcZ de Montanoa tomentosa sobre la motilidad o viabilidad de

espermatozoides de humano y conejo, en un amplio rango de concentraciones. Sin

embargo el EAcZ de Montanoa frutescens tiene un efecto inmediato e inhibitorio sobre la

motilidad y disminuye la viabilidad de las células, presentando lisis de eritrocitos, lo cual

no sucede con Montanoa tomentosa (Wens y cols., 1985).

14

El zoapatanol obtenido por síntesis fue probado in vitro en diferentes tejidos

animales, observándose los siguientes efectos: constricción aguda de la arteria coronaria

de gato y contracción del íleon de gato. No se observaron efectos sobre el músculo

uterino (Smith y cols. 1981).

Estudios posteriores demostraron que el zoapatanol y el montanol no producen

cambio en la motilidad uterina pero si afectan al músculo liso vascular produciendo

constricción (Wani y cols., 1983).

En estudios realizados in vitro en útero de cobayo, se encontró que los kaurenos

son sustancias útero-activas varias veces más potentes que el Montanoal y Zoapatanol

(Gallegos, 1985).

El AG obtenido de las hojas del zoapatle, produce efectos de relajación del

músculo uterino de rata y perro (inhibe la actividad contractil espontánea del útero)

mimelizando los efectos del EAcZ tanto in vivo como in vitro. Por otro lado, en cobayo se

observaron fuertes contracciones del músculo uterino (Lozoya y cols., 1983; Waller y

cols., 1987), lo cual nos sugiera que este efecto puede ser dependiente de especie.

Además de que se ha observado que dicho efecto inhibitorio sobra las contracciones

espontáneas del miométrio de la rata in vitro, también es ejercido cuando se administra

junto con otras sustancias uteroconstrictoras (oxitocina, prostaglandina Fan y

acelilcolina), lo cual hace suponer que los productos del zoapatle no son antagonistas

específicos de los receptores de estas sustancias, y que actúan por medio de un

mecanismo de acción diferente (Bejar y cols., 1984).

También se ha demostrado la absorción gástrica del AG (Neidlein & Stumpf,

1977a), presentando un 100% de absorción por vía intraperitoneal y 83% por vía oral,

con excreción total por vía biliar. Después de la administración de 20 mg/kg. del 14C-AG

a la rata, se eliminó más del 80’% de la radioactividad por las heces en un periodo de

tiempo de 98 h (Neidlein & Stumpf, 1977b). Y además, se demostró que el AG se

transforma en tres derivados oxidados por medio de enzimas mícrosomales hepáticas in

vitro (Neidlein & Stumpf, 1977c)

Se han observado diferencias en la actividad uterotónica entre las plantas de

zoapatle que crecen en su hábitat natural y ias que son cultivadas en campos agrícolas

experimentales, observándose mayor potencia farmacológica en las plantas silvestres

(Ponce-Monter y cols., 1983).

15

Recientemente fue aislado el ácido 16α-Hidroxi-en-kauren-19-oíco de la Montanoa

hibiscifolia, el cual, al igual que su metil éster, tienen efecto sobre la actividad contráctil

de las astas uterinas de cobayo y rata (inhibiendo la actividad contráctil espontánea, la

inducida por oxitocina y la inducida por potasio). El metil éster fue de 2-5 veces más

potente que el ácido sobre las contracciones espontáneas y las inducidas por potasio, y

de 11-15 veces más potente sobre la actividad contráctil del músculo liso uterino inducida

por oxitocina (Ponce-Monter y cols., 1988).

También en 1988, se encontró que la administración oral del EAcZ tanto de

Montanoa tomentosa como de Montanoa frutescens a conejas (5 mg/día del día 3-17 de

gestación), no modifica los niveles plasmáticos normales de progesterona, las

concentraciones de hormona fueron muy similares en las conejas control y las tratadas

con el extracto (Pedrón y cols., 1988).

Un problema muy común en la ganadería bovina de nuestro país, es la retención del

loquios postparto con la consiguiente infección uterina. Ortiz y cols. (1995) en estudios

recientes, han comprobado que la administración intrauterina del EHAZ es eficaz en este

padecimiento. Se logra inducir la involución uterina y la recuperación del cuadro

infeccioso, sin necesidad de usar PGF2α, y antibióticos. También se ha encontrado que

los animales tratados con zoapatle entran en “calor” una semana después del

tratamiento, y pueden ser sincronizadas para la inseminación artificial sin el uso de la

PGF2α,. El examen clínico de estos animales muestra involución del cuerpo lúteo. Esto

sugiere que tanto la involución uterina y la consiguiente presentación del estro podrían

ser explicadas por un efecto luteolítico (Ortíz y cols., 1995).

16

3.3. FISIOLOGíA REPRODUCTIVA.

3.3.1. INTRODUCCIÓN.

Para mejorar su nivel de vida, el hombre puede regular la fertilidad de mamíferos

estrales de los cuales depende para alimentarse y vestirse, o de aquellos que compiten

con él por recursos en común. Muchos de los estudios que se han realizado sobre el

control del ciclo ovárico de mamíferos estrales de ovulación espontánea y no

estacionales, están basados en la información obtenida del ciclo estral de la rata

(Freeman, 1994).

El ciclo estral se define como un fenómeno rítmico, con períodos regulares pero

limitados de receptividad sexual, asociado, en la mayoría de los casos, con la liberación

de óvulos capaces de ser fertilizados. De acuerdo con la presentación de ciclos estrales,

las especies se clasifican en:

a).Monoéstricas: presentan un solo ciclo estral al año, ejemplo; algunas razas de perros.

b).Poliéstricas continuas: presentan ciclos estrales durante todo el año, ejemplo;

humano, vaca, cerda, etc.

c).Poliéstrìcas estacionales: presentan muchos ciclos estrales durante el año pero

confinados a una estación, ejemplo; oveja, yegua, etc.

De acuerdo con la espontaneidad de la ovulación, las especies se clasifican en :

1. Especies de ovulación espontánea con formación de cuerpo lúteo (CL): humano, vaca,

yegua, oveja, perra, cerda.

2. Especies de ovulación espontánea sin actividad reproductiva del CL cuando no hay

estimulación cervical (estímulo de coito o algo semejante que estimule el cervix): rata,

ratona.

3. Ovulación inducida (requieren estimulación cervical para ovular): coneja, gata (Tortora

y cols.,1984).

No obstante, a diferencia del ciclo ovárico de otros mamíferos de ovulación

espontánea (oveja y mono), la rata es la única en la que el ciclo está caracterizado por

una breve fase luteal. Sin embargo, los eventos del ciclo son más largos bajo control

fotoperiódico. Esto es, que la periodicidad de iluminación juega un papel delerminante

en la incidencia y duración del ciclo ovárico (Freeman, 1994).

17

3.3.2. CICLO REPRODUCTIVO DE LA MUJER.

Normalmente, desde el inicio de la pubertad y a través del período reproductivo

de la mujer, se presentan con una regularidad de 28 a 30 días ciclos reproductivos o

sexuales en los cuales se capacita al sistema reproductor femenino para recibir el

producto de la concepción y mantenerlo en condiciones óptimas durante el tiempo que

dura la gestación. El ciclo reproductivo comprende básicamente un ciclo ovárico y un

ciclo uterino o menstrual (cuadro No. 4), (Tortora y cols.,1984).

Cuadro No. 4. Ciclos y fases del ciclo reproductivo de la mujer (Fuentes: Tortora y cols.,1984; Espey, 1975; Freeman, 1994).

CICLO REPRODUCTIVO DE LA MUJER

CICLO OVÁRICO ( fig. 4 ) .

CICLO UTERINO O MENSTRUAL ( fig. 5 )

Fase folicular

1.Crecimiento y diferen-ciación del ovocito prima- rio. Folículo primario. 2.Proliferación de las células foliculares. 3.Formación de la zona pelúcida. 4.Desarrollo de la teca folicular (cápsula de tejido conectivo originada del estroma y secreción del licor folicular en los espacios intersticiales. 5. Formación del antro folicular (cavidad en medio de las células foliculares. 6. Folículo secundario: El ovocito primario se en-cuentra desplazado hacia uno de los lados del folículo, rodeado por una acumulación de células foliculares que toma el nombre de cúmulo oóforo.

Fase menstrual Fase folicular

1. Duración:3-5 días. El 1er Día de la mens- truación, es el inicio del ciclo menstrual. 2. El endometrio se des-prende y se expulsa de la cavidad uterina unto con sangre producida por la ruptura de vasos endometriales. 1.Duración: del día 6-14 del ciclo menstrual. 2.Coincide con el crecimiento y maduración de los folículos del ovario. 3.Aumento en espesor del endometrio en res- puesta a estrógenos pro- ducidos en la teca interna que rodea los folículos. 4.Las glándulas endome- triales aumentan en nú- mero y tamaño y se pro- duce elogenación de las arterias espirales

18

Ovulación

Cuerpo lúteo

7. Las células situadas en contacto con el ovocito, forman una cubierta continua llamada corona radiada 1. El ovocito primario completó su primera divi - sión meiótica y se trans-Forma en ovocito secun- dario. 2. El ovocito secundario Inicia rápidamente su se-gunda meiosis y se detie- ne en metafase. 3. El crecimiento del folí- culo produce presión so- bre el ovario creando una superficie isquémica, la cual facilita la ruptura de la túnica albuginea. 4. El ovocito secundario es expulsado junto con el licor folicular, rodeado por la zona pelúcida y la capa de células foliculares que conforman la corona ra-diada. 1. Después de la ovula- ción se colapsan las pare- des del folículo y la teca folicular que lo rodean. 2. Bajo la influencia de la hormona luteínizante (LH) este tejido se convierte en el cuerpo lúteo ó cuerpo amarillo, el cual secreta progesterona (principal-mente) y estrógenos. 3. Si ocurre fertilización, el CL aumenta su tamaño para constituir el cuerpo lúteo de la gestación.

Fase luteal

Fase isquémica

1, Duración: del día 15 al 26 del ciclo menstrual. 2. Coincide con la forma- ción y crecimiento del cuerpo lúteo. 3. La progesterona secre- tada por el CL produce: a). Cambios en tamaño y forma de las glándulas endometriales. b). Estimula una secre- ción rica en glucógeno. c). Aumenta el espesor del endometrio (gran acu-mulación de líquido en el estroma y crecimiento del mismo). 4. Las arterias espirales alcanzan la capa más su- perficial del endometrio y se hacen más tortuosas. 5. En caso de ocurrir fertilización, el huevo fecundado se implanta en el endometrio hacia el día 20 de esta fase. 1 Si no ocurre fertiliza- ción, el CL degenera y disminuye su secreción hormonal. 2. En consecuencia se produce una isquemia del endometrio que se ex- tiende del día 27 al 28 del ciclo menstrual. 3. El endometrio toma una apariencia pálida, de- bido a la contracción in-termitente de las arterias espirales. 4. Las glándulas endome-

19

continuación… 4.En caso de no ocurrir

fertilización, el CL degenera y toma el nombre de cuerpo lúteo cíclico o de la menstruación 5.El CL se tramsforma finalmente en una ciactriz blanquecina que se deno- mina cuerpo albicans ó blanco

Triales disminuyen su se- creción, presentándose Una notable contracción del endometrio. 5.Al final de la fase isquémica , las arterias es- pirales se contraén por periodos de tiempo mas prolongados.

INICIO DEL CICLO

Figura No. 4. Diferentes etapas del ciclo ovárico de la rata: desarrollo folicular, ovulación,

formación y regresión del cuerpo lúteo (Freeman, 1994).

20

Figura No. 5. Ciclo uterino ó menstrual humano (Tortora y cols.,1984).

Sin embargo, la duración de las diferentes etapas, las características

conductuales y morfológicas de las etapas, podría variar entre mamíferos estrales

(cuadro 5).

CUADRO No. 5. Duración del ciclo reproductivo y sus etapas folicular y luteal en diferentes mamíferos estrales

ESPECIES DURACIÓN TOTAL

( días )

FASE FOLICULAR ( días )

FASE LUTEAL

( días )

Humano Ratón y Rata 1

Ratón y Rata 2 Conejo 3

Cerdo Oveja

24-32 13-14 4-5

14-15 19-21 16-17

10-14 2 2

1-2 5-6 1-2

12-15 11-12 2-3 13

15-17 14-15

1: Pseudogestación (estímulo coítal) 2: Ciclo estral normal 3. Inducción de la ovulación

21

3.3.3. CICLO ESTRAL DE LA RATA.

La palabra estro es una adaptación latina de la palabra griega “oistros” que

significa frenesí o deseo desenfrenado. Este término fue usado por primera vez por

Heape (Heape, 1900) para describir el “período especial de deseo sexual de la hembra”

y distinguirlo del “celo” en el macho (Freeman, 1994).

La rata de laboratorio es un mamífero no estacional, de ovulación espontánea y

poliéstrica, es decir, que el ciclo ovárico se continúa a través de todo el año. La

ovulación no es dependiente de la sobre-estimulación nerviosa y ocurre cada 4 ó 5 días

a través de todo el año. Heape posteriormente describió distintas etapas del ciclo

(cuadro 6, fig. 6), todo esto aplicado a mamíferos durante la época de reproducción.

CUADRO No. 6. Características fisiológicas, morfológicas y citológicas del ciclo estral de la rata

(Heape, 1900; Freeman, 1994).

ETAPA

CARACTERÍSTICAS

FISIOLOGICAS

CITOLOGÍA VAGINAL

Diestro

Las secreciones del ovario preparan al tracto reproductivo para recibir al óvulo fertilizado.

Caracterizada por la presen- cia de una gran cantidad de pequeños leucocitos.

Proestro

Período en el cual la rata está entrando en calor.

Predominan células epite- liales nucleadas. Ocasional-mente aparecen algunas cé- lulas cornificadas.

Estro

Etapa de receptibilidad sexual

Ampliamente caracterizada por un gran número de células epiteliales escamosas cornificadas. No presentan núcleo visible y tienen forma irregular. Ausencia de leuco- citos, algunas células nuclea- das se encuentran presentes.

Metaestro

Corto período de recuperación (si no hay fertilización), durante el cual el tracto reproductivo recupera su morfología

Caracterizada por la presen- cia de pequeños leucocitos y unas pocas células nucleadas o cornificadas.

Anestro

Período del ciclo no reproductivo en la hembra. Los ovarios y órganos reproductivos acceso- rios están relativamente en reposo y no hay receptibilidad sexual.

22

Figura No. 6.Tipos de células que aparecen en el exudado vaginal de rata durante las diferentes etapas del ciclo estral (x100). (A) Proestro: (B) Estro: (C) Metaestro y Diestro (Freeman, 1994). 3.3.3.1. CICLOS ESTRALES DE 4 Y 5 DíAS DE DURACIÓN.

Se ha establecido que durante el ciclo estral de la rata, ya sea de 4 ó 5 días de

duración, se observan dos incrementos transientes en la secreción de progesterona (P);

uno en la tarde del proestro (incremento preovulatorio), y otro denominado incremento

post-ovulatorio ,durante el metaestro (Elo y cols., 1962; Hashimoto y cols., 1968;

Goldman y cols., 1969; Uchida y cols., 1969a; Barraclough y cols., 1971; Piacsek y cols.,

1971; Hashimoto y cols., 1987; Tébar y cols., 1995). El incremento preovulatorio es

consecuencia de la acción de la hormona luteinizante (LH) liberada durante la tarde del

proestro de los folículos maduros (HaNshimoto & Wiest, 1969a; Uchida y cols., 1969a,b;

Barraclough y cols., 1971; Hamberger y cols., 1978; Hashimoto y cols., 1987; Tébar y

23

cols., 1995), mientras que el incremento post-ovulatorio es debido a un incremento en la

secreción de P del grupo de nuevos cuerpos lúteos formados durante el ciclo (Hashimoto

& Wiest, 1969a,b; Furudate y cols., 1975). Las ratas con ciclos de 5 días pueden ser

diferenciadas de las de 4 días determinando la secreción de P post-ovulatoria, la cual

permanece significativamente más alta durante el diestro en las ratas de 5 días que en

las de 4 días (Roser & Block, 1969; Furudate y cols., 1975; van der Schoot & de Greef,

1976; Nequin y cols., 1979; Kaneko y cols., 1986). Por lo tanto, es evidente que la

prolongación en la secreción de P post-ovulatoria (la retención de cuerpos lúteos

prolonga por más tiempo la función progestacional) es responsable de los ciclos de 5

días (Kaneko y cols., 1986). Existe evidencia de que el pico de liberación de LH

ovulatoria es 1 hora más temprano en ratas con ciclos de 5 días que en las de 4

(Hoffman & Schwartz, 1965; Schwartz, 1969; van Rees, 1972) y que hay diferencias

significativas preovulatorias en la cantidad liberada de P, LH y prolactina (Pr) entre las

ratas de ciclos de 5 días y las de 4, en donde las ratas de ciclos de 5 días se diferencian

de las de 4 por sus bajos niveles preovulatorios de P y LH acompañados por altos

niveles de Pr (Hashimoto y cols., 1987). Las ratas con ciclos de 5 días ovulan entre las

1:30 y 9:30 h de la etapa del estro (Hashimoto y cols., 1987; Gay y cols., 1970; Nequin y

cols., 1979). En contraste, las ratas con ciclos de 4 días empiezan a ovular alrededor de

las 1:30 h del estro, pero la incidencia estimada de ovulación en estos animales es más

baja entre las 3:30 y 11:30 h del estro comparado con las ratas de ciclos de 5 días

(Hashimoto y cols., 1987). Los ciclos de 5 días pueden ser convertidos a 4

administrando estrógenos ya sea en el metaestro o en el primer día de diestro (Everett,

1948; Brown-Grant, 1969).

En ratas cíclicas de 4 días se ha establecido que la secreción de P durante el

diestro intensifica la retroalimentación negativa del estradiol sobre la secreción basal de

LH (Beattie y cols., 1975; Kaneko y cols., 1986) y que cuando los niveles de P decaen

(regresión luteal), la secreción de estradiol y LH incrementan y la ovulación ocurre en las

siguientes 6:00-8:00 h (Smith y cols., 1975). Además, la reducción de secreción de P

luteal por la administración de bromocriptina (van der Schoot & Uilenbroek, 1983;

Sánchez-Criado y cols., 1988) o el bloqueo de la acción de la P luteal con un suero

antiprogesterona (Keneko y cols., 1986) o con el antiprogestágeno RU486 (Uilenbroek,

1991) en ratas cíclicas de 5 días, da como resultado acortamiento del ciclo estral en 1 día

(Tébar y cols., 1995).

24

Sin embargo, los mecanismos que regulan la magnitud y el tiempo de liberación

de LH y P en ratas con ciclos de 4 y ratas de 5 días de duración no han sido

complelamente determinados (Hashimoto y cols., 1987).

3.3.4. HORMONAS EN EL CICLO REPRODUCTIVO.

Los estrógenos (E) se mantienen en niveles bajos al inicio de la fase folicular y

van incrementando su concentración paulatinamente hasta alcanzar su pico máximo

justo antes de la ovulación, en donde la alta concentración de E da como resultado el

disparo de los picos de hormonas luteínizante y folículo estimulante (LH y FSH). La

ovulación en mamíferos es un fenómeno biológico distintivo, el cual requiere de la

ruptura de tejido sano de la superficie del ovario. La ovulación se presenta a la mitad del

ciclo reproductor (en el caso de la mujer al día 14), mediante la influencia de las

hormonas gonadotróficas (FSH y LH) producidas por la adenohipófisis (Espey, 1994).

La concentración de E disminuye gradualmente durante la fase luteal. Durante

esta fase los niveles de E se mantienen constantes en los primeros días debido a que el

cuerpo lúteo también produce una cierta concentración de E, y una vez que el CL deja

de ser activo, las concentraciones de E regresan a su nivel basal (fig. 7). El desarrollo

inicial de los folículos es estimulado por la FSH, sin embargo, también se requiere LH

para la maduración final de los mismos. Por otra parte, los folículos en desarrollo

producen E a nivel de la capa interna de la teca folicular (Espey, 1975).

La regulación de la producción de E por lo ovarios es uno de los eventos

fisiológicos más importantes que marcan la espontaneidad e inducción del ciclo estral

(Shoham & Schachter, 1996).

Los E ejercen sus acciones biológicas sobre órganos blanco a través de la unión

a un receptor de E específico (RE), el cual es miembro de la superfamilia de receptores

esteroideos (Beato, 1989; Carson-Jurica y cols., 1990). El equilibrio de los niveles

circulantes de E y la expresión normal en los órganos blanco es de vital importancia para

la homeostasis de varios tejidos; ejemplo: útero (Korach, 1979; Quarmby & Korach,

1984). Así mismo, el desbalance y/o incremento de los niveles circulantes de este

esteroide es crucial en el desarrollo de hiperplasia/hipertrofia de los órganos blanco,

25

como el útero (Herbst, 1981). Los efectos de los E dependen del tiempo de exposición y

de la edad del individuo al que se les administre (McLachlan y cols., 1980).

La hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH), los esteroides gonadales y la

inhibina se encargan de la regulación de la LH y FSH. La inhibina suprime la síntesis y

liberación de FHS, siendo su papel principal el de regulación de secreción de FSH (De

Jong, 1880). La inmunización pasiva contra la inhibina produce un incremento en la

concentración de FSH plasmática (Rivier y cols., 1988; Culler y cols., 1988) y el la

velocidad de ovulación en la rata (Rivier y cols., 1989). Por lo tanto, si se presentan

grandes cambios en la secreción de inhibina durante el periodo preovulatorio se presenta

un pico secundario de FSH, lo cual resulta en diferencias en los patrones de secreción

de LH y FSH en éste periodo. Sin embargo, aún no esta claro cual es la contribución

relativa de E e Inhibina en la regulación de secreción de gonadotrofinas (Arai y cols.,

1996).

La progesterona (P) se mantiene en concentraciones bajas durante la fase

folicular y presenta su pico máximo en la fase luteal, debido a que el CL secreta

principalmente P (fig. 7). La P tiene como función principal estimular la secreción de las

glándulas endometriales, y de esta manera preparar al endometrio para la implantación

del huevo fecundado.. El CL aumenta su secreción hormonal, para continuar con la

estimulación sobre el endometrio y mantener el desarrollo normal del huevo fecundado.

La degeneración del cuerpo amarillo se impide por la gonadotrofina coriónica, una

hormona secretada por el trofoblasto muy tempranamente, después de la implantación

del blastocito (Tortora y cols., 1984).

Además de la acción de la P sobra el tracto genital, también tiene funciones

reguladoras del desarrollo folicular, de la liberación de gonadotrofinas preovulatorias y

sobre la ovulación (Buffler & Roser, 1974; Caligaris y cols., 1971; Mori y cols., 1977).

Dichas acciones son ejercidas a través de su interacción con receptoras de P en el

hipotálamo (Garris y cols., 1981), glándula pituitaria (Kato & Onouchi, 1977) y ovarios

(Schreibar & Hsueh, 1979; Sanchez-Criado y cols., 1990).

26

Figura No. 7. Cambios cíclicos observados en la concentración de hormonas durante el ciclo

reproductor de la mujer.

3.3.5. CUERPO LÚTEO Y LUTEÓLISIS.

El cuerpo lúteo (CL) es la estructura dominante en los primates después de la

ovulación. Secreta hormonas para el control del ciclo estral y promueve la diferenciación

del tracto reproductivo requerido en la gestación intrauterina (Stouffer & Duffy, 1995). El

producto principal del tejido luteal es el esteroide progesterona, pero no es el único,

también secreta E, péptidos derivados de la inhibina y relaxina (Stouffer, 1990).

La esteroidogénesìs en el CL de la rata depende del colesterol exógeno, el cual

es obtenido de lipoproteínas y de la movilización de moléculas lipídicas por la enzima

neutral colesteril éster hidrolasa (Strauss y cols., 1981; Strauss y cols., 1991; Aten y

cols., 1995).

27

Los radicales libres a altas concentraciones producen daño y pérdida de función

celular. El radical superóxido (SOR) induce la formación de peróxidos lipídicos, los

cuales estimulan la actividad de la fosfolipasa A2 (Sevanian y cols., 1988) y ciclo-

oxigenasa (Egan y cols., 1976). La producción y metabolismo de ácido araquidónico

produce una gran cantidad de ácidos grasos oxidados, dentro de los cuales se

encuentran las prostaglandinas (Sawada & Carlson, 1996). En estudios recientes se ha

observado que la producción del SOR está ligada a la regulación y función del CL. El

tratamiento con PGF2α, in vitro, estimula una corta descarga del SOR antes de que

disminuya la secreción de P (Sawada & Carlson, 1991). De igual manera, al inhibir la

esteroidogénesis, también se ha visto que en la estimulación de secreción de P por LH,

hay un pequeño aumento en la producción de SOR (Sawada & Carlson, 1994). Por lo

tanto, se presume que este radical podría estar involucrado en la regulación del CL

(Sawada & Carlson, 1996).

La administración exógena de PGF2α produce luteólisis en vacas y yeguas

(Hansel y cols., 1973; Inskeep, 1973). El aumento en la concentración de 17β-Estradiol

durante la última parte del diestro aparentemente incrementa la síntesis y liberación

uterina de PGF2∝, (Barcikowski y cols., 1974; Fogwell y cols., 1985) contribuyendo a que

se lleve a cabo la luteólisis. Adicionalmente, 17β-Estradiol y PGF2∝, podrían ejercer

efectos sinérgicos sobre la función luteal, independientemente de los efectos de 17β-

Estradiol sobre la secreción uterina de PGF2∝, (Gengenbach y cols., 1977; Hixon y cols.,

1983; Hughes y cols., 1987).

La actividad y permanencia del CL parece estar regulada por factores

luteotróficos y luteolíticos (Bourne y cols., 1996).

28

3.3.6. GESTACIÓN.

La gestación (G) es un proceso integrativo en donde la resultante es el desarrollo

y nacimiento de uno o más miembros de la misma especie (Stock & Metcatfe, 1994).

Para que se lleve a cabo el proceso de gestación deben ocurrir cuatro eventos

esenciales:

1). Ovulación. 2). Introducción del esperma de manera natural o artificial (para ta fertitización de tos

óvulos). 3). Implantación de btastocitos. 4). Formación del CL para mantener el estado progestacional, con lo cual se inicia ta

gestación (Terkel, 1988). 3.3.6.1. FISIOLOGíA DE LA GESTACIÓN.

En el primer tercio de la G en la rata, la activación y el mantenimiento del CL es

regulada por la PRL, denominada como la principal hormona luteotrófica (Aslwood, 1941;

Macdonald & Greep, 1968; Rothchild, 1981; Gunnel & Freeman, 1983). Sin embargo, la

regulación neuroendócitna de la función del CL presenta gran variabilidad en las

diferentes especies de mamíferos, en donde dicha regulación depende de más

sustancias luteotróficas, ejemplo: PRL, LH, E y factores placentarios (Smith, 1980).

En el inicio de ta G y pseudogestación (psg) en la rata, la activación del estado

progestacional es identica, ya que el patrón de secreción de PRL en ta psg (Freeman &

Neill, 1972) es el mismo que ocurre durante la primera mitad de la G (Butcher y cots.,

1972). También se ha reportado que la LH juega un papel luteotrófico importante a la

mitad de la G (Madhwa Raj & Moudgat, 1970) y que tos requerimientos luteotróficos del

CL cambian continuamente durante la G. Por lo tanto, los primeros 7 días son

totalmente dependientes de PRL. Despues el tejido decidual empieza a ser parcialmente

dependiente de LH y dicho cambio esta correlacionado con la perdida relativa de

dependencia de PRL (Lam & Rothchild, 1977). Del día 12 de G en adelante, los

requerimientos luteotróficos cambian debido a que la glándula pituitaria no es capaz de

mantener por mucho tiempo la secreción de P, por lo tanto, el CL comienza a ser

dependiente de lactógenos placentarios de la rata (Lpr) y E (Gibori & Richards, 1978).

29

3.3.6.2. HOMEOSTASIS EN LA GESTACIÓN.

En la mayoría de los mamíferos, es indispensable que la madre proporcione las

sustancias esenciales para el crecimiento del feto y que el medio intrauterino sea el ideal

para el desarrollo y mantenimiento del mismo. Por lo tanto deben establecerse

mecanismos de transferencia de sustancias, tales como nutrientes y oxígeno de la madre

al feto, y la eliminación de productos metabólicos tales como el calor, bióxido de carbono

y sustancias nitrogenadas, para la regulación homeostática de madre y feto (Stock &

Metcalfe, 1994).

Cuando la gestación está a término, la madre requiere mayor consumo de agua

debido a que el feto requiere mayor cantidad de oxígeno (Barcroft, 1947). El volumen

plasmático empieza a incrementar en el primer tercio de la gestación, incrementa más

rápidamente en el segundo tercio y sigue incrementando ligeramente hacia el final de la

G (Chesley, 1972). En la rata, el volumen plasmático incrementa un 4% hasta el sexto

día, 2% hasta el día 12 de 21 días de gestación (Baylis, 1980). Debido a que la

retención de agua es proporcionalmente más grande en magnitud que la de sodio, la

concentración de sodio plasmático disminuye conforme progresa la G (Gray y cols.,

1964; Plentl y cols., 1959). Varios estudios han demostrado disminución significativa en

la osmolaridad plasmática en ratas y humanos (Davison y cols., 1981; Barron y cols.,

1988).

Aunque no está bien determinado el mecanismo homeostático en la gestación,

parece ser que la placenta juega un papel muy importante en la relención de sodio y el

incremento del volumen total de agua (Lindheimer y cols., 1989).

3.3.6.3. CAMBIOS EN EL SISTEMA RESPIRATORIO.

Durante la fase progestacional, ocurre una relativa hìperventílación en cada ciclo

menstrual causando tensión alveolar y arterial de CO2, para después regresar a los

niveles básales observados en la fase preovulatoría (Goodland y cols., 1952). Existe

hiperventilación en vacas preñadas durante la gestación (Gahlenbeck y cols., 1968). La

administración de P exógena produce una disminución de la presión de CO2 arterial en

cobayos y humanos (Hosenpud y cols., 1983;Lyons y cols., 1959). El mecanismo por el

cual la P causa hiperventilación no esta claro todavía(Stock & Metcalfe,1994).Seha

30

encontrado que después de la administración de estradiol, el número de receptores a P

aumenta en el útero de rata, pero no se ve hiperventiiación en ratas no gestantes

(Brodeur y cols, 1986) por lo tanto, esto demuestra que los receptores en el citosol del

útero y los del hipotálamo responden de manera diferente en las ratas gestantes (Al-

Khouri & Greenstein, 1985).

3.3.6.4. IMPORTANCIA DE LA OXITOCINA EN LA GESTACIÓN.

La concentración plasmática de oxitocina (OT) en mujeres embarazadas es

mayor que en mujeres no embarazadas (Kumaresan y cols., 1974; Mizutani y cols.,

1982) dicha concentración es más grande en el cordón arterial sanguíneo que en el

cordón venoso del feto y en la sangre materna (Dawood y cols., 1978), lo cual sugiere

que la OT es generada por el feto perse y es destruida en la placenta y/o suero de la

madre (Naruki y cols., 1996).

Los fetos humanos y animales secretan activamente OT cuando se inicia el

proceso de gestación (Dawood y cols., 1978; Oosterbaan y cols., 1989). La

administración de agonistas de OT es usada para inducir la labor de parto (Bossmar y

cols., 1994). Por lo tanto es muy importante fisiológicamente para el control de la

actividad uterina en la G, ya que se ha encontrado un aumento en el número de

receptores a OT en el útero en el último período de G (Kímura y cols., 1992). También

se ha reportado que los receptores miometriales a OT están presentes en el segundo y

tercer trimestre de G (Fuchs y cols., 1992). En consecuencia, es lógico el aumento de

OT tanto en madre como en feto conforme avanza la G. Esto sugiere que la oxitocinasa

regula la concentración de OT y previene la labor de parto durante la G (Mizutani y cols.,

1988).

3.3.6.6. ADMINISTRACIÓN DE XENOBlÓTlCOS EN LA GESTACIÓN.

La administración de xenobióticos en el período de organogenesis, entre los días

6-15 de G en rata (período más sensible en la G), da lugar a la inducción de

malformaciones estructurales y anatómicas. Dicho efecto no solamente depende del

período de administración, sino también del tipo de xenobiótico administrado (Hansen &

Meyer, 1994).

31

El tiempo de exposición a un fármaco no sólo determina la severidad de la

reaccibn, sino también el tipo de toxicidad a desarrollar, ejemplo: muerte, malformación,

relardo del crecimiento o deficiencia funcional. Durante el período embrionario, en

donde la proliferación y diferenciación de tejidos y órganos es predominante, el efecto

tóxico producido por un xenobiótico está representado con malformaciones o muerte

embrionaria (a dosis adecuadas). En el período fetal, el crecimiento generalizado y la

maduración funcional están en progreso, las influencias adversas dan como resultado

retardo en el crecimiento o deficiencia funcional, aunque altas dosis podrían llegar a

producir histogénesis anormal ó muerte fetal (Wilson, 1974).

El período de tiempo en el cual es administrado el xenobiótico puede influir sobre

la embriotoxicídad bajo dos condiciones:

a). Cuando la sustancia es capaz de inducir o inhibir su propio metabolismo

enzimátíco, y

b). Cuando el uso continuo de la sustancia puede interferir con la función del hígado o

riñon materno o de otros órganos esenciales para la homeostásís, incluyendo la

eliminación de otras sustancias potencialmente embriotóxícas (Wilson, 1974).

3.3.7. PSEUDOOESTACIÓN.

El término pseudogestación (psg) se refiere comúnmente a un estado en el cual

el útero sufre una reacción desídual en respuesta a un trauma uterino (De Feo, 1987).

Esto ocurre cuando los factores luteotróficos activan al cuerpo lúteo, el cual secreta

progesterona (Lu y cols., 1978). La inducción del estado progestacíonal es un requisito

para que se den los cambios estructurales en el útero necesarias para la implantación

del huevo fertilizado (Terkel, 1988).

La inducción de psg en rata ya sea por estimulación eléctrica o mecánica del

cervix uterino da como resultado dos picos diarios de secreción de PRL; uno nocturno

(500 h) y otro diurno (19:00 h) (Butcher y cols., 1972; Smith y cols., 1975; Gunnel y

Freeman, 1983). Como consecuencia de estos picos de PRL semícircadíanos, el cuerpo

lúteo recientemente formado permanece viable y secreta progesterona en los dia 1-8 de

psg. En los días 9-14 de psg se presenta regresión del CL y los niveles de P disminuyen

(Bartosik y cols., 1975); Murakamí y cols., 1979). El ritmo circadiano es mantenido hasta

32

la terminación de la psg por luteólisis (Gorospe y Freeman, í981), mientras que durante

el embarazo, los picos cesan a la mitad de la gestación, al tiempo correspondiente al

desarrollo de la placenta (Yogev y Terkel, 1978; Voogt y cols., 1982).

La psg puede ser inducida coitalmente pero también una gran variedad de

factores no coitales pueden inducir la psg. El estímulo específico copulatorio del macho,

inicia un sistema mnemónico (sistema que asiste en el relenimiento y expresión de la

memoria en algunas ocasiones), el cual es esencial para la secreción circadiana

repetitiva de PRL (Yoshinaga, 1977).

La psg puede ser determinada observando la presencia de diestro permanente

por examìnación del exudado vaginal durante 13-14 días después de la estimulación

cervical, o por la presencia de picos nocturnos de PRL, ya que estos picos parecen ser

esenciales en la iniciación y mantenimiento de la G y psg (Terkel, 1988).

En base a muestreo una vez al día, se encontró que los niveles de PRL eran

bajos durante todo el embarazo con excepción de dos elevaciones significativas. El

primero ocurre al cuarto día de embarazo y esta relacionado con la implantación,

mientras que el segundo ocurre justo antes del parto y esta asociado con la preparación

para la lactación (Amenomori y cols., 1970; Butcher y cols., 1972; Freeman y Nell, 1972).

Las prostaglandinas (PGs) regulan diversas respuestas ováricas asociadas con la

función folicular y luteal (Lindner y cols., 1980; Rothchild, 1981). En rata se ha

observado que el aumento de PGE2 aumenta la secreción de progesterona, cuando es

adicionada la PG a células luteales aisladas al día 6 de psg (Horvath y cols., 1988).

Se ha demostrado que la administración de E durante la psg da como resultado

ovulación,48 h después de la administración, por lo tanto, la ausencia de ovulación en la

psg podría ser debida a la ausencia de altos niveles de E requeridos para la inducción

del pico ovulatorio de LH (Everett, 1947; Welschen y cols., 1975).

33

CAPíTULO II METODOLOGíA.

34

1. SUJELOS EXPERIMENTALES.

Se utilizaron ratas Wìstar hembras de 200 a 300 g de peso.Previo a cualquier estudio,

se determinó mediante una toma diaria de exudado vaginal, a la misma hora (8-9 am), que las

ratas presentaran tres ciclos estrales consecutivos de 465 días de duración.Los animales

fueron mantenidos en ciclo luz-obscuridad normal 14:10 h (luz: 7:00 am-9 pm) en grupos de 4

ratas por jaula, a una temperatura entre 23 y 24°C, con agua y alimentación ad libitum.

Tambien se emplearon ratas Wistar hembras prepúberes de 27 días de edad (45-60 g),

con el orificio vaginal cerrado y mantenidas en las mismas condiciones que las ratas adultas,

para el protocolo de inducción de ovulación.

Las ratas Wistar macho utilizadas presentaron entre 300 y 350 g de peso, con una

conducta sexual normal para inducir el apareamiento con la hembra. Fueron agrupados de la

misma manera que las hembras y bajo las mismas condiciones ambientales y alimenticias. Un

grupo de ratas macho fue castrado y se les administró 5 mg de testosterona en un vehículo

oleoso por vía subcutanea diariamente para mantener la conducta sexual e inducir la

pseudogestación por cópula infertil.

2. EXTRACTO DE ZOAPATLE (Montanoa tomentosa).

2.1. OBTENCIÓN DEL EXTRACTO HIDROALCOLICO DE ZOAPATLE (EHAZ).

La planta de zoapatle fue recolectada en el Estado de Tlaxcala, ya que en estudios

preliminares (Ortiz y cols., 1995) han encontrado que el zoapatle de esta región presenta

adecuada potencia farmacológica. Se recolectó en cantidad suficiente y se cultivó para tener

un solo tipo de planta y un solo lote de extracto en todo el estudio. La recolección de la planta

y la preparación de los extractos se realizaron tanto en época de floración como de no

ftoración, con el fin de comparar la potencia farmacológica.

El extracto de zoapatle (EZ) se obtuvo de las hojas de la planta, las cuales se secaron

a temperatura ambiente. La concentración final del EZ fue de 10 g de peso seco de la hoja en

100 ml de una mezcla alcohol:agua (70:30%), almacenándose en frascos ámbar durante 21

días. Al término de este plazo, se filtró el extracto y se almacenó nuevamente en frascos

ámbar.

35

3. MATERIAL Y SOLVENTES.

3.1. SOLVENTES Alcohol etílico absoluto (Baker) y Agua desmineralizada.

3.2. REACTIVOS. Hormonas, Testosterona (Sigma). Gonadotrofina coriónica humana (hCG), Gonakor. Gonadotrofina

coriónica equina (PMCG), Folligon.

Reactivos químicos. Cloruro de sodio (Baker). Heparina (Sigma). Aceite vegelal comercial.

3.3. EQUIPO Microscopio de contraste de fases.

Microscopio estereoscópico.

4. PROTOCOLOS EXPERIMENTALES.

4.1. EFECTOS DE LOS EHAZ SOBRE DIFERENTES ETAPAS DE LA GESTACIÓN.

Se administraron dos dosis del EHAZ (25 mg, 50 mg de peso seco de la hoja de

zoapatle en solución hidra-alcohólica 30:70) por vía i.vag. a grupos de 5 ratas en tres

diferentes períodos de gestación: 1-21, 7-21 y 14-21. Las ratas fueron sacrificadas al dia 21

por decapitacíón. Para cada grupo se formó un grupo control al cual se le administró el

vehículo.

Se registraron los siguientes parámetros para cada grupo:

a). Ganancia de peso de la madre durante la gestación.

b). Peso de ovarios y características microscópicas.

c). Peso de hipótesis.

d). Peso de adrenal izquierda.

e). Número de implantaciones.

fj. Número de fetos resorbidos.

g). Hemorragias intrauterinas.

h). Número de fetos logrados, peso y características físicas.

i). Peso de placentas y úteros (características macroscópicas).

36

4.2. EFECTOS DEL EHAZ SOBRE EL CICLO ESTRAL DE LA RATA.

Se formaron 3 grupos de 5 ratas a los que se le administró por vía í.vag. entre tas 9-10

am: 1. 0.25 ml del EHAZ equivalente a 25 mg de la hoja seca de zoapatte.

2. 0.25 ml del vehículo (solución alcohol/agua, 70:30).

3. 0.25 ml de solución satina fisíológica (ssf).

La administración fue en diferentes etapas del ciclo estral (Diestro, Proestro y Estro) y

se evaluaron los cambios en el ciclo estral mediante frotis vaginal diario.

4.3. DESARROLLO FOLICULAR.

A dos grupos de ratas en Metaestro se les administró por vía i.vag. 0.25 ml del EHAZ

(25 y 50 mg respectivamente). Se formaron dos grupos control para cada dosis, a los cuales

se les administro el vehículo y ssf. A todos los animales se les determinó la etapa del ciclo

diariamente por frotis vaginal y de cada grupo se satcrificaron 5 animales diariamente por 4

días. Se observaron características macro y microscópicas del tracto genital y mediante

observación estereoscópica se determinó el número de cuerpos lúteos y el grado de

maduración folicular. También se registraron los pesos de: glanduta adrenal izquierda,

ovarios, glándula pituitaria y peso corporal.

4.4. INDUCClÓN DE LA OVULACIÓN.

El día primero de tratamiento se administró a ratas prepúberes (50-60 g) 60 UI de

gonadotrofina equina (PMSG) por vía intramuscular (i.m.), la cual se repitió durante los dos

días subsecuentes.Se administraron a diferentes grupos de ratas(n=7) dos veces al día por

vía subcutánea 5 dosis del EHAZ equivalentes a:25,50,100,200 y 400 mg del polvo seco en

un deposito de aceite (0.25 ml). Al tercer día se administro por vía i.m. 60 U.I. de

gonadotrofina coriónica humana (hCG). Al cuarto día los animales fueron sacrificados

evaluándose la madurez folicular y el número de cuerpos lúteos.

Al grupo control se le indujo la ovulación en la misma forma, pero solo se le aplico el

depósito de aceite vegetal.

37

46. EFECTOS DEL EHAZ EN RATAS EN PSEUDOGESTACIÓN.

La pseudogestación (psg)se indujo por copula infértil de las ratas con machos castrados

(cohabitación con el macho desde la tarde del proestro hasta el día siguiente). La presencia del

tapón vaginal a la mañana siguiente fue considerada como día 1 de psg. A partir de este día se

administro por vía i.vag. a tres grupos de ratas (n=7), 0.25 ml del EHAZ correspondiente a 12.5,

25 y 50 mg de hojas de zoapatle en peso seco. Al grupo control se le administro el vehículo

(Alcohol/Agua 70:30).

El frotis vaginal de ratas en psg se caracteriza por la presencia de leucocitos (diestro).

La interrupción del psg se determinó por la presencia de frotis característicos de proestro yestro

(células nucleadas y cornificadas).

4.6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO.

En el protocolo de los efectos de los EHAZ en diferentes etapas de gestacion, las

diferencias en peso de los distintos parámetros reproductivos fueron analizadas mediante la

prueba estadística de Duncan (P<0.05).

Para los demás protocolos, en todos los casos se consideraron las diferencias entre los

animales controles con respecto a los animales tratados utilizando la prueba t de Student a un

nivel de significancia de P<0.05.

38

CAPÍTULO III

RESULTADOS.

39

1. EFECTOS DEL ZOAPATLE EN DIFERENTES ETAPAS DE GESTACIÓN.

1.1. EFECTOS DEL EHAZ SOBRE PARÁMETROS MATERNO-FETALES. 1.1.1. Administración del EHAZ del día 1-21.

En los primeros 5 días de administración del EHAZ (25 y 50 mg) se registra un

aumento significativo (Prueba de Duncan, P<0.05) en la ganancia de peso en las ratas

tratadas con el EHAZ (dependiente de dosis) en comparación con el control (fig. 8, panel

A). Del dia 6 al 14 hay una disminución significativa en la ganancia de peso en los

grupos tratados con el EHAZ, mientras que en el grupo control el aumento de peso es

continuo. En el último tercio del embarazo el grupo tratado con 25 mg gana más peso

que el grupo control. El grupo tratado con 50 mg, tambien gana peso pero por debajo

del control y no hay diferencias significativas.

1.1.2. Administración del EHAZ del día 7-21.

En el primer tercio del embarazo (1-6 días) se registra una ganancia de peso igual

para los tres grupos, La administración de 25 mg del EHAZ al día 7 promueve un

aumento mayor en la ganancia de peso que el grupo control y con 50 mg también

aumenta de peso pero por debajo del control. Al día 19 se invierte la relación, es decir;

al término del embarazo las ratas tratadas con 50 mg quedan por arriba del control y las

tratadas con 25 mg por debajo (fig. 8, panel 8).

1.1.3. Admínístracíón del EHAZ del día 14-21.

La ganancia de peso registrada en los dos primeros tercios de la gestación (1-13)

no presentó diferencias significativas. La administración del EHAZ al día 14 produjo un

aumento en la ganancia de peso dependiente de dosis con respecto al control (fig. 8,

panel C).

40

Figura No. 8. Efecto del EHAZ sobre la ganancia de peso de las ratas gestantes, cuando se administra en diferentes periodos de la gestación (g). (A) Administración aguda de los EHAZ y del vehículo (Acohol/Agua 70:30) en el período 1-21, (B) 7-21 y (C) del 14-21. *Prueba de Duncan P<0.05

41

1.1.4. Efecto del EHAZ sobre hipófisis, ovarios y glandulas adrenales.

La administración del EHAZ no produce cambios significativos en el peso de

hipófisis, ovarios y glándulas adrenales con respecto al control en ninguna etapa de

gestación.

1.1.5. El EHAZ produce resorciones y cambios en el tamaño y peso de los fetos.

La administración del EHAZ en el período del día 1-21 de gestación, produce

pérdida post-implantación de los fetos más proximales a la vagina (fig. 9), esta pérdida

coíncide con una hemorragia densa (presencia de tejido y moco cervical) observada

durante los días 6 y 7 de gestación en todas las ratas tratadas con el extracto. Dichos

efectos son dependientes de dosis como se muestra en el cuadro 7.

Figura No. 9. Efectos del EHAZ sobre la implantación y tamaño de los fetos más cercanos a la vagina.

42

También se presenta una disminución en tamaño y por consiguiente en peso, de

los fetos más cercanos a la vagina.

En el periodo de administración del día 7-21 no se observan cambios

significativos (Prueba de Duncan, P<0.05) en cuanto al tamaño de los fetos más

cercanos a la vagina y no se presentan resorciones. Al administrar el EHAZ en el último

período de gestación no se presentaron resorciones, pero se presentaron problemas

toxicológicos dependientes de dosis, los cuales se resenaran en el siguiente punto.

Cuadro No.7.Pérdida de fetos post-implantación con la administración del EHAZ en diferentes

periodos de gestación.

1.2. EFECTOS TOXICOLÓGICOS DE DIFERENTES DOSIS DEL EHAZ EN DIFERENTES ETAPAS DE LA GESTACIÓN.

La administración del EHAZ en la última fase del embarazo produce mortalidad

fetal y morbilidad materna dependiente de dosis. Las ratas tratadas en éste período

presentan hemorragias al día 19 de gestación, pero su estado de salud en general es

bueno. Al día 21 de gestación se presentan problemas para parir: pelo erizado,

inmovilidad, tremor, hemorragias con presencia de tejido y moco cervical y dificultad para

respirar, muriendo en la noche del día 21. Al realizar la autopsia se encontró a los fetos

en estado de descomposición. El grado de descomposición indica que los fetos

fallecieron entre el día 19 y 20 de gestación. El efecto toxicológico fue dependiente de

dosis y de periodo de administración (cuadro 8)

PERIODO DE ADMINISTRACIÓN ( días )

1-21 7-21 14-21

PORCENTAJE DE PERDIDA

TRATAMIENTO

EHAZ 25 mg 12.50 0 0 EHAZ 50 mg 20.83 0 0

Control Alcohol / agua 70:30

0 0 0

43

.Cuadro No. 8. Datos de mortalidad y morbilidad fetal y materna cuando se administra el EHAZ en

diferentes etapas de gestación.

Porcentaje de Morbilidad y Mortalidad

Tratamiento Control alcohol / agua

EHAZ 25 mg

EHAZ 50 mg

Periodo de admón. 1-21 7-21 14-21 1-21 7-21 14-21 1-21 7-21 14-21

Morbilidad Fetal 0 0 0 0 0 0 0 0 * Mortalidad Fetal 0 0 0 0 0 20 0 0 100 Morbilidad materna 0 0 0 0 0 60 0 0 100 Mortalidad materna 0 0 0 0 0 20 0 0 100

* No se verificó la morbilidad fetal, ya que todos los animales se sacrificaron hasta el dia 21 de G 2. EFECTOS DEL EHAZ SOBRE EL CICLO ESTRAL DE LA RATA.

La administración aguda del EHAZ modifica el ciclo estral normal de la rata

dependiendo de la etapa del ciclo en que el extracto es administrado (estado hormonal).

Cuando se inicia la administración del EZ en la fase del diestro (fig. 10, panel A), se

presentan dos ciclos normales seguidos de un proestro persistente. Al administrar el

extracto en el proestro (fig. 10, panel B), se termina el ciclo en el cual se administró y

después se presenta un proestro persistente al igual que el anterior, pero cuando la

administración se hace en el día del estro, este se mantiene durante 8 días consecutivos

(fig. 10, panel C). En todos los casos, cundo se deja de administrar el extracto, las ratas

regresan a su ciclo estral normal.

3. EFECTOS DEL EHAZ EN EL DESARROLLO FOLICULAR.

El EHAZ fue administrado en la fase de metaestro. La administración de 25 mg

produjo acortamiento del ciclo estral, pasando de metaestro a proestro, manteniéndose

en ésta etapa 2 días para después pasar a estro. Los grupos controles (s.s.f. y de

solución alcohol/agua 70:30) siguieron un ciclo estral normal, sin brincarse etapas del

ciclo como con el EHAZ (fig. 11)

44

Figura No.10.Efectos de la administración í.vag. del EHAZ en diferentes etapas del ciclo estral.

A: Administración del EHAZ en la fase de diestro. B: Administración en proestro C: Administración en el estro.

45

La administración de 50 mg también produjo acortamiento del ciclo estral,

pasando de metaestro a proestro, cambiando al día siguiente a estro y manteniendose

en esta etapa por 3 días. Al igual que con 25 mg no hubo cambios significativos en los

grupos controles (fig. 12).

El efecto fue dependiente de dosis.

4. EFECTO DE DIFERENTES DOSIS DEL EHAZ DESPUÉS DE ADMINISTRACIÓN A RATAS PREPÚBERES CON INDUCCIÓN DE LA OVULACIÓN.

La administración s.c. del EHAZ produce efectos anovulatorios dependientes de

dosis (fig. 13). Conforme se va aumentando la dosis del EHAZ se va disminuyendo

significativamente (Prueba t Students P<0.05) la cantidad de cuerpos Iúteos presentes

en los ovarios de las ratas tratadas y aumentan los folículos maduros. Con las tres

primeras dosis se muestra este patrón de respuesta, pero con la dosis de 200 mg se

observa aumento en el número de folículos maduros, pero el número de cuerpos lúteos

no cambia con respecto a la dosis de 100 mg. Con la dosis de 400 mg todos los

animales mostraron morbilidad a partir del segundo día de administración y murieron

unas horas antes de la hora correspondiente al sacrifício.

El análisis posmorten de los ovarios, mostró un elevado porcentaje de folículos

maduros y una muy pequena proporción de cuerpos lúteos.

Estos datos son indicativos de toxicidad sistémica a altas dosis del extracto.

No se observaron cambios macroscópicos significativos en el tracto reproductivo

con respecto al control.

5. EFECTOS DEL EHAZ RATAS EN PSEUDOGESTACION.

El tiempo normal de pseudogestación en ratas es de aproximadamente 14 días.

La pseudogestación en las ratas tratadas con el vehiculo alcohol/agua 70:30, presentó

una duración normal, mientras que en las ratas tratadas con el EHAZ, la psg se

interrumpió antes de 14 días. La duración de la psg fue dependiente de la dosis

administrada (fig. 14).

46

Figura No. 11. Efectos del EHAZ (25 mg de peso seco de la hoja de zoapatle) , sobre el desarrollo folicular en ratas con ciclo estral normal, cuando la administracibn (vía i.vag.) inicia en la etapa de metaestro. (A) Administración aguda del EHAZ, (B) de solución salina fisiológica (s.s.f.) y (C) del vehiculo (Alcohol/Agua 70:30) .

47

Figura No. 12. Efectos del EHAZ (50 mg de peso seco de la hoja de zoapatle) sobre el desarrollo folicular en ratas con ciclo estral normal, cuando la administración (vía i.vag.) inicia en la etapa de metaestro,. (A) Administración aguda del EHAZ, (B) de solución salina fisiológica (s.s.f.) y (C) del vehiculo (Alcohol/Agua 70:30) .

48

Figura No. 13. Efecto anovulatorio de los EHAZ (administración vía subcutánea) en ratas prepúberes a las cuales se les indujo la ovulación con la administración de gonadotropinas coriónicas equina y humana. Control: administración de aceite vegelal (vehículo). *Prueba t- Student, P<0.05.

49

Figura No. 14. Interrupción de la pseudogestación producida por la administración i.vag. de

diferentes dosis del EHAZ.

50

CAPITULO IV

DISCUSIÓN

51

En la investigación de plantas usadas en la medicina tradicional, la elección del

solvente adecuado para la extracción es muy importante. Usualmente son utilizados

solventes orgánicos, polares o moderadamente polares. Los extractos acuosos ofrecen

mayor dificultad ya que solo se extraen un número limitado de compuestos y es difícil

homogeneizar el procedimiento. Sin embargo, en la medicina tradicional la extracción

acuosa es la más usada, ya sea hirviendo las partes de la planta burdamente

pulverizada o macerándolas con agua fría por corto o largo tiempo. Por lo tanto, si

fueran efectos farmacológicos de interés, los principios activos deberán ser extraídos por

el agua en forma adecuada (Samuelsson y cols., 1985).

Uno de los problemas que presenta el estudio de efectos farmacológicos en

extractos acuosos, es la rápida descomposición y en consecuencia, la pérdida de las

acciones farmacológicas. Una de las alternativas es hacer los extractos en mezclas

hidro-alcohólicas, los cuales preservan por más tiempo el producto y además por poseer

una polaridad intermedia, se garantiza una mayor extracción de los principios activos.

Considerando que el alcohol etílico puede enmascarar los efectos de los

principios activos extraídos, es necesario el uso de controles adecuados. En el caso del

EHAZ empleado en este estudio se utilizó una proporción de alcohol etílico

absoluto/agua 70:30. La administración de éste producto no produjo alteraciones del

tejido vaginal tales como ulceraciones, irritaciones, molestias para el animal, ni se

observaron efectos diferentes a los de los controles acuosos.

En consecuencia, podemos afirmar que todos los efectos observados se

relacionan con los principios activos presentes en los EHAZ administrados.

En este estudio se demuestra que la rata es un modelo animal adecuado para

observar los efectos del EHAZ en diferentes estados hormonales. Se evaluaron también

los efectos del EHAZ en ratas en diferentes condiciones reproductivas, debido a que la

rata es la especie donde se han observado mayores diferencias en cuanto a efectos de

los EZ (Gallegos y cols., 1977; Landgren y cols., 1979). Por ello, en nuestros estudios

con el EHAZ, se utilizó esta especie tratando de eliminar la mayor cantidad de variables

posibles.

Otras variables que se han comprobado que influyen en los efectos de los EHAZ,

es la época del año en la que se colecta la planta (Estrada y cols., 1983) y la subespecie

52

de planta que se utiliza (Estrada y cols, 1983, 1985; Angulo y cols, 1985; Valencia y

cols., 1985).

Para este estudio de utilizaron plantas de zoapatle (Montanoa tomentosa)

colectadas en el Estado de Tlaxcala en los meses de Noviembre-Diciembre en la época

de floración, debido a que se ha comprobado que los efectos del zoapatle a nivel

reproductivo, se observan a su potencia máxima durante esta etapa (Estrada y cols.,

1983).

1. EFECTOS FARMACOLÓGICOS Y TOXICOLÓGICOS DEL ZOAPATLE EN LA GESTACIÓN.

1.1. Efecto anti-implantatorio.

Los resultados de éste trabajo muestran una pérdida post-implantación de los

fetos más proximales a la vagina la cual es dependiente de dosis y de la vía de

administración empleada (i. vag.). Este efecto pudiera considerarse local (difusión del

extracto de la vagina al útero), ya que se afectan en mayor proporción los fetos más

cercanos al sitio de administración. Sin embargo, esta pérdida también coincide con la

hemorragia observada durante los días 6 y 7 de gestación en todas las ratas tratadas

con el EHAZ y con la disminución del peso corporal de la madre entre los días 6-14 de

gestación, por lo que el efecto también puede tener un componente sistémico.

Además del efecto de pérdida postimplantación, también se observa disminución

en tamaño y peso de los fetos más proximales al sitio de la pérdida post-implantación.

Esto también puede estar relacionado con el efecto local, pero el componente sistémìco

también podría estar relacionado con la pérdida de peso de la madre.

En este caso, el efecto del EHAZ podría ser como el de un agente

antiprogestágeno, ya que se sabe que las antiprogestinas interfieren con la

transformación del endometrio en una estructura apta para la implantación del producto

(Spitz y cols., 1996). Las dosis administradas en este estudio, solo produjeron el efecto

anti-implantatorio en los fetos más proximales a la vagina, probablemente porque las

concentraciones que se alcanzaron localmente en estos sitios en esa etapa crítica fué

mayor. A dosis mayores se observan efectos toxicológicos generalizados tanto en

madre como en fetos.

53

La acción de la P antes de la implantación es la de:

1. Facilitar y reforzar la retroalimentación positiva de los E sobre la LH cerca del final de

la fase folicular.

2. Sinergizarse con el E durante la fase luteal para mantener el control de la

retroalimentación negativa sobre la secreción de gonadotrofinas.

3. Transformación del endometrio de un estado proliferativo a uno secretor para el

mantenimiento del producto.

4. Mantenimiento de la integridad miometrial (Spitz y cols., 1996).

Si la P no se mantiene en niveles adecuados para que se lleven a cabo estos 4

pasos, se presenta el efecto de anti-implantación.

Nuestros resultados confirman el efecto anti-implantatorio de las EZ reportado

previamente por Gallegos y Cortes (1974).

1.2. Efecto del EHAZ en diferentes etapas de gestación.

Existen tres períodos críticos en la G:

1). La implantación de los productos (día 7 de gestación).

2). El período embrionario, en donde la proliferación y diferenciación de tejídos y órganos es

predominante.

3). El período fetal: el crecimiento generalizado y la maduración funcional están en

progreso (Wilson, 1974).

Cuando el EHAZ se administró durante todo el período de gestación (1-21) no se

presentaron problemas en ningún período de la gestación. Probablemente algunos de

los principios activos del extracto estén induciendo su propio metabolismo enzimático, ya

que un fármaco es capaz de inducir o inhibir su propio metabolismo enzimático y el uso

contínuo puede interferir con la función del hígado o riñón materno o en otros órganos

esenciales para la homeostásis, incluyendo la eliminación de otras sustancias

potencialmente embriotóxicas (Wilson, 1974).

La administración del EHAZ en el segundo tercio del embarazo no interfiere con

el desarrollo de la gestación.

54

El período de exposición al fármaco en la gestación determina el tipo de efectos

toxicológicos a presentarse, ejemplo: muerte, malformación, retardo del crecimiento o

deficiencia funcional. En el periodo embrionario dichos efectos se manifiestan en

malformaciones o muerte embrionaria. En el periodo fetal dan como resultado retardo en

el crecimiento o deficiencia funcional y altas dosis podrían llegar a producir histogénesis

anormal ó muerte fetal (Wilson, 1974).

Al administrarse los EHAZ en la última etapa del embarazo, los efectos

toxicológicos en los fetos pueden ser producidos por una fuerte vasoconstricción, lo cual

disminuye el aporte sanguíneo y de nutrientes, generando isquemia, la cual podría ser la

causa de la muerte fetal. En el caso de la madre, el estado de descomposición de los

productos podría haberle generado una septisemia ó al no haber la señal embrionaria

para que se desencadene el proceso de parto, las ratas presentan retardo y dilatación

cervical inadecuada con la consecuente mortalidad.

En el último periodo de la G, el feto requiere de un mayor cantidad de oxígeno

para poder subsistir, en consecuencia, la madre aumenta su consumo de agua (Stock &

Metcalfe, 1994). Por lo tanto, si disminuye el aporte de oxígeno en esta etapa, el feto

muere. Un agente antiprogestágeno podría disminuir la hiperventilación que produce la

progesterona per se. La disminución en la concentración de P, puede producir un

aumento en la presión de dióxido de carbono arterial, lo cual podría provocar efectos

toxicológicos a los fetos (Hosenpud y cols., 1983; Lyons y cols., 1959). El mecanismo

por el cual la P produce hiperventilación en la G aún no esta bien determinado (Stock &

Metcalfe, 1994).

Se ha encontrado que en el tercer tercio de la G hay un aumento significativo en

el número de receptores a OT en el útero (Kimura y cols., 1992). Varios investigadores

han encontrado efectos oxitócicos en el zoapatle, aunque este efecto ha sido

cuestionado por otros grupos. La muerte fetal que se presentó en nuestros resultados

también podría ser explicada por un potente efecto oxitócico, y este podría dar lugar a

una fuerte contracción uterina y por lo tanto promover la asfixia fetal con la consecuente

mortalidad fetal (Bejar y cols., 1985).

55

2. EFECTO LUTEOLÍTICO.

En el modelo de pseudogestación, el cuerpo lúteo se mantiene generalmente

durante 11-12 días y el estado de psg tiene una duración de 13-14 días. Nuestros

resultados indican que la administración del EHAZ produce interrupción de la psg

dependiente de dosis, lo cual nos habla de una involución del cuerpo lúteo (luteólisis).

Se ha determinado que la inducción de psg en rata da como resultado dos picos

diarios de secreción de PRL (nocturno y diurno) (Butcher y cols., 1972; Smith y cols.,

1975; Gunnel y Freeman, 1983) y que la secreción de P en el primer tercio de la psg y la

G dependen de la PRL. En los días 9-14 hay regresión del CL y en consecuencia

disminuyen los niveles de P (Bartosik y cols., 1975); Murakami y cols., 1979). Por lo

tanto, si no se mantiene la secreción de PRL en el primer tercio de la psg, el cuerpo lúteo

pierde su actividad secretora, los niveles de P bajan y en consecuencia, el proceso de

psg termina al no haber aporte suficiente de P para que el tracto reproductivo se

mantenga viable, ya que el SNC detecta falta de producto en el útero.

Se ha visto que la administración del antiprogestágeno RU486 en ratas en psg

produce un efecto luteolítico y antiluteolítico, el cual depende del período en que se inicie

la administración del fármaco, ya que si se administra en el segundo periodo de psg

induce luteólisis, y si se administra el la primera etapa no se afecta la actividad luteal

(Uilenbroek y cols., 1995). En nuestros estudios, el extracto fue administrado durante

todo el periodo de psg, observándose acortamiento de la psg dependiente de dosis, lo

cual nos indica que el modelo de psg en la rata es adecuado para demostrar el efecto

luteolítico de los EHAZ.

Al administrar el EHAZ en ratas cíclicas para Determinar los efectos del extracto

sobre el desarrollo folicular, se presentó el mismo efecto que en la psg: luteólisis.

La administración del EHAZ en el metaestro produjo acortamiento del ciclo estral

dependiente de dosis. La etapa del metaestro, es donde el cuerpo lúteo empieza a ser

funcional, es decir, el nuevo cuerpo lúteo formado en las ratas cíclicas, secreta

progesterona solamente en esta etapa, declinando la concentración de progesterona al

día siguiente (Smith y cols., 1976), por lo tanto, dicho efecto podría ser debido a la

inducción de luteólisis por el EHAZ, lo cual se refleja en acortamiento del ciclo estral.

56

Al administrar el EHAZ en la etapa del proestro, no hay cambio a la siguiente

etapa (estro) como en las ratas control. Este efecto podría ser inducido por un agente

antiprogestageno, o del tipo estrogénico, causando un desequilibrio endógeno en la

proporción estrógeno-progesterona, alterando la retroalimentación de esteroides a nivel

de hipotálamo ó hipófisis. Gómez y cols., (comunicación personal), encontraron que la

administración del EHAZ por vía oral en ratas ovariectomizadas, no produce

estrogeniración, por lo tanto se descarta el efecto estrogénico. En la tarde del proestro

el cuerpo lúteo degenera y la secreción de progesterona disminuye (Smith y cols., 1976).

En estudios recientes se ha determinado que el radical superóxido regula la

funcioón del cuerpo lúteo (Sawada & Carson, 1991). Este radical produce una pérdida

inmediata de la producción de AMPc LH-dependíente y de la secreción de P (Gatzuli y

cols., 1991) por lo tanto, si existe un desbalance en la producción del radical superóxido,

se rompe la cadena metabólica, ya que no se forman los peróxidos de lípidos

responsables de la estimulación de fosfolipasa A2 (Sevanian y cols., 1988) y

cicloxigenasa (Egan y cols., 1976) necesarias para la producción de ácido araquidónico y

para la síntesis de prostaglandinas, la cuales desencadenan el proceso de luteolísis

(Sawada & Carson, 1996).

La administración de PGF2α, produce luteólisís en vacas y yeguas (Hansel y cols.,

1973; lnskeep, 1973). Se ha demostrado que un aumento en la concentración de

estradiol en la última etapa del diestro incrementa la síntesis y liberación de PGF2α

uterina induciendo la luteólisis, con el consecuente acortamiento del ciclo reproductivo

(Gengenbach y cols., 1977; Hixon y cols., 1983; Hughes y cols., 1987).

Al ser administrado el EHAZ en vacas por vía intrauterina, se observó el mismo

efecto producido por la administración de las prostaglandinas, por lo cual, no se descarta

que el efecto luteolítico se deba a una estimulación de la sintesís de prostaglandinas, la

cual podría estar ligada a la OT, ya que se ha determinado también que los farmacos

agonístas de OT ejercen parte de sus efectos estimulantes del útero por medio de la

estimulación de PGF2α. Al adicionar OT al útero de rata en el último período de

gestación se observa un marcado incremento en la liberación de prostaglandinas

(Williams & Tahir, 1980).

57

3. EFECTO DEL EHAZ EN RATAS PREPÚBERES A LAS QUE SE HA INDUCIDO OVULAClÓN.

En el protocolo de inducción de ovulación en ratas prepúberes, se observa que el

EHAZ produce efectos anovulatorios (aumento de folículos maduros y disminución de

cuerpos lúteos), los cuales podrían deberse a una inhibición del pico de LH causado ya

sea por una alta concentración de estrógenos persistente o por una baja concentración

de estrógenos, la cual no es suficiente para disparar los picos de LH y FSH. Al igual que

en el efecto luteolítico, esto podría ser debido al desequilibrio esteroidal con la

consecuente anovulación.

Los niveles de estrógenos se mantienen bajos al inicio de la fase folicular,

despues van aumentando hasta alcanzar su pico máximo y decaer paulatinamente justo

antes de la ovulación, este cambio estimula el disparo de los picos de LH y FSH, los

cuales promueven la ovulación (Tortora y cols., 1984).

Se ha establecido que en ratas cíclicas de 4 días la secreción de P en el diestro

aumenta la retroalimentación negativa del estradiol sobre la secreción de LH y cuando

los niveles de P caen, aumentan los de E y LH facilitando la ovulación (Beattie y cols.,

1975; Kaneko y cols., 1988; Smith y cols., 1975).

Aunque parece que el estradiol es el único que inicia la liberación del pico de LH,

también debe ocurrir un incremento en la concentración de P, es cual es esencial para

mantener la duración normal de la liberación de LH (Liu & Yen, 1983).

La P tiene efecto positivo sobre la amplitud del pulso de LH (Hoff y cols., 1983),

pero no tiene efecto significativo sobre la frecuencia del pulso de LH (Couzinet &

Schaison, 1993), lo cual sugiere que la P potencia los efectos del estradiol sobre la

liberación de LH de la glándula pítuitatia (Byme y cols., 1998).

Por lo tanto, el efecto de los EHAZ de inhibición de la ovulación, podría ser

comparado con el que producen los fármacos antiprogestágenos.

Los antíprogestágenos inhiben la ovulación por dos mecanismos:

1. Interfieren con el crecimiento de los folículos dominantes (Efecto antifoliculotrófico ó

folículoestático).

2. Inhibiendo el pico de LH.

58

La administración del antiprogestágeno RU486 (potente antagonista de

progesterona) en ratas cíclicas, mostro una inhibición de la ovulación del 100%. Los

mecanismos de acción de éste fármaco son de carácter dual, es decir; parece estar

actuando como inhibidores del crecimiento folicular y de la liberación de la LH (Sánchez-

Criado y cols, 1990).

Por lo tanto, si existe un desbalance entre estas hormonas, se presentaran

efectos anovulatorios.

4. VIABILlDAD DE LA VÍA INTRAVAGINAL PARA LA ADMINlSTRACIÓN DEL EHAZ.

La vía intravaginal (i. vag.) es utilizada generalmente en el tratamiento de

procesos infecciosos locales, para administrar sustancias o preparados anticonceptivos

(espermatizidas, inhibidores de la motilidad del espermatozoide, etc.) y para tratamientos

del tracto reproductivo.

En este estudio se utilizó la vía i. vag. debido a que los estudios realizados por

Ortiz y cols. (1995) utilizando el EHAZ en vacas, mostraron efectos luteolíticos y que

estos podrían ser debidos a un efecto local sobre el CL de la vaca.

Otra de las razones por la cual se uso esta vía de administración, fue debido a

que en estudios realizados con el extracto acuoso de Montanoa Frutescens sobre la

motilidad y viabilidad de los espermatozoides humanos, se observó una inhibición de la

motilidad espermática dependiente de dosis, Negando hasta un 100% de inhibición. En

cuanto a la viabilidad, con Montanoa tomentosa a las dosis utilizadas no se observó una

inhibición total, pero si se presentó una inhibición significativa dependiente de dosis

(Gúzman-Durán y cols., 1988).

En el miometrio existen una gran densidad de receptores β-adrenérgicos los

cuales podrían ser modulados por hormonas esteroideas, dicho efecto es dependiente

de especie (Maltier y cols., 1989). En ratas cíclicas sin tratamiento hormonal, el

contenido miometrial de receptores β-adrenérgicos ha mostrado ser más elevada durante

el proestro (Krall y cols., 1978), cuando los niveles plasmaticos de P y 17β-Estradiol

están más elevados (Butcher y cols., 1974).

59

Varios autores han encontrado que el efecto relajante de los EHAZ sobre el

músculo uterino, ha sido explicado por acción sobre receptores β2 adrenérgicos y por

accion antagónica a nivel de canales de calcio, tipo verapamil. Recientemente ha sido

encontrado que bloqueadores adrenérgicos β2 poseen efecto antifertilidad, por inhibicion

de la motilidad de espermatozoos y se están realizando estudios sobre formulaciones por

vía vaginal de estos compuestos con el fin de evitar, en parte, los efectos sistémicos.

Considerando que varios de los mecanismos antifertílidad del zoapatle han sido

comprobados y que es una planta que se sigue usando con estos fines, es interesante

conocer los efectos de estos extractos utilizando vías de administración alternativas.

Nuestros estudios nos permiten confirmar que la administración i.vag. es viable para

producir efectos sistémicos de los principios activos de los EHAZ, que se manifiestan

tanto como efectos anovulatorios y luteolíticos, como por efectos toxicos asociados con

la dosis.

Los principios activos son absorbidos, liberados a la circulación sistemica y

alcanzan los sitios activos en concentraciones adecuadas para ejercer esos efectos.

60

CAPÍTULO V

CONCLUSIONES.

61

1.La administración del EHAZ por vía i.vag. a ratas en diferentes etapas de gestación produce: a). Pérdida post-implantación con reabsorción de los fetos más cercanos

a la vagina cuando se administra desde el día 1 de gestación y disminución de tamaño y peso de los fetos más cercanos a los fetos reabsorbidos.

b) Efectos toxicológicos (Mortalidad y Morbilidad felal y materna)

dependientes de dosis al administrarse en el último período de gestación.

2. Los efectos del EHAZ en el ciclo estral de la rata(vía i.vag.)dependen de

la dosis y de la etapa del ciclo estral de la rata en que es administrado. 3. La administración de diferentes dosis del EHAZ en ratas prepúberes en

las que se ha inducido la ovulación produce efectos anovulatorios dependientes de dosis. La dosis más alta(400 mg)fue letal para el 100% de los animales tratados (vía subcutánea).

4.En el modelo de pseudogestación(psg),el EHAZ produce interrupción del

psg dependiente de dosis (efecto luteolítico). 5. Todos los efectos del EHAZ obtenidos después de la administración

intravaginal confirman que esta vía permite la liberación de los principios activos tanto a nivel local como sistémico, ya que se observan estos dos tipos de efectos.

62

BIBLIOGRAFIA.

63

- Alfaro, R. (1866). “Cihopatli o Zoapatle”. Gacela Médica de México, 3: 47-48.

- Al-khouri, H., Greenstein, D.B. (1985). “Progesterone receptors in rat brain and uterus: dependence on the hormonal milieu”. J Endocrinol 107: 159-162.

- Amenomori, Y., Chen, C.L. & Meites, J. (1970). “Serum prolactin levels in rats during different reproductive stages”. Endocrinology. 90: 508-510.

- Angulo, A., Ruiz, l., Estrada, A.V., Pedrón, N. & Gallegos, A. J. (1985). “The zoapatle VIII. Ultrastructural changes in endometrium of rats”. Contraception 31: 509-521.

- Arai, K., Watanabe, K., Taya, K. & Sasamoto, S. (1998). “Roles of inhibin and estradíol ìn the regulation of follicle-stimulating hormone and luteinizing hormone secretion during the estrous cycle of the rat”. Biology of reproduction 55: 127-I 33.

- Astwood, E.D. (1941). “The regulation of corpus luteum function by hypophyseal luteotrophin”. Endocrinology. 28: 309-320.

- Aten, R-F., Kolodecik, T.R., Macdonald, G.J. & Behrman, H.R. (1995). “Modulation of cholesteryl ester hydrolase messenger ribonucleic acid levels, protein levels, and activity in the rat corpus luteum”. Biology of reproduction 53: 1110-1117.

- Barcikowski, B., Carison, J.C., Wilson, L., McCracken, J.A. (1974). “The effect of endogenous and exogenous estradiol-17β on the release of prostaglandin F2α from the ovine uterus”. Endocrinology 95: 1340-l 349.

- Barcroft, J. (1947). “Researches on prenatal life”. Springfield, IL: Charles C. Thomas.

- Barraclough, C.A., Collu, R., Massa, R., Martini, L. (1971). “Temporal interrelationships between plasma LH, Ovarian secretion rates and peripheral plasma progestin concentrations in the rat: effects of nembutal and exogenous gonadotropins”. Endocrínology 88: 1437-1447.

- Bartosik, D., Szarowski, D.H. (1973). “Progravid phase of the rat reproductive cycle: day to day changes in peripheral progestin concentration”. Endocrinology 92: 949.

- Beato, M. (1989). “Gene regulation by steroid hormones”, Cell 58: 335-344.

- Beattie, C.W. & Corbin, A. (1975). “The differential effects of diestrous progesterone administration on proestrous gonadotropin levels”. Endocrinology 97: 885-980.

- Bejar, E., Lozoya, X., Enríquez, R. & Escobar, L. (1984). “Efecto comparativo de los productos de zoapatle (Montanoa tomentosa) y del verapamil sobre la contractilidad uterina de la rata in vítro”. Arch. Invest. Méd. 15: 223-235.

- Bejar, E. (1985). “El efecto de la decocción de Montanoa tomentosa ssp. tomentosa (zoapatle) y de su constituyente áctivo el ácido grandiflorénico, sobre la contractilidad uterina”. Tesis para obtener el grado de Maestría en Biología experimental. Universidad Autónoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa. México, D.F.

64

- Bossmar, T., Akerlund, M., Fantomi, G., Szamatowicz, J., Melin, P., Maggi, M. (1994). “Receptors for and miometrial responses to oxytocin and vasopressin in preterm and term human pregnancy: effects of the oxytocin antagonits atosiban”. Am J Obstet Gynecol 171: 1634-1642.

- Bourne, T.H., Hagström, H., Hahlin, M., Josefsson, B., Granberg, S., Hellberg, P., Hamberger, L., Collins, W. (1996). “Ultrasound studies of vascular and morphological changes in the human corpus luteum during the menstrual cycle”. Fertility and sterility 65: 753-750.

- Brodeur, P., Mockus, M., MacCullough, R., Moore, L.G. (1986). “Progesterone receptors and ventilatory stimulation by progestin”. J Appl Physiol 60: 590-595.

- Brown-Grant, K. (1969). “Effects of progesterone and of pentobarbitone administered at the dioestrous stage on the ovarian cycle of the rat. J Endocrinol 43: 539-552.

- Buffler, G., Roser, S. (1974). “New data concerning the role played by progesterone in the control of follicular growth in the rat”. Acta Endocrinol (Copenh) 75: 569-578.

Butcher, R.L., Fugo, N.W. & Collins, W.E. (1972). “Semicircadian rhythm in plasma levels of prolactin during early gestation in the rat”. Endocrinology 90: 1125-1 127.

Butcher, R.L., Collins, W.E. & Fugo, N.W. (1974). “Plasma concentration of LH, FSH, PRL, progesterone and estradiol-17β throughout the 4-day estrous cycle in the rat”. Endocrinology 94: 1704-I 708.

- Bylis, C. (1980). “Glomerular filtration rate in plasma volumen in the pregnant rat”. J Physiol (Lond) 305: 49P-50P.

- Byme, B., Fowler, P.A. & Templeton, A. (1996). “Role of progesterone and nonsteroidal ovarian factors in regulating gonadotrophin-releasing hormone self- priming in vitro”. J of Clin Endocrinology and Metabolism 81: 1454-1459.

- Caligaris, L., Astrada, J.J., Taleisnik, S. (1971). “Bíphasic effect of progesterone on the release of gonadotrophín in rats”. Endocrinology 89: 331-337.

- Carson-Jurica, M.A., Schrader, W.T., O’Malley, B.W. (1990). “Steroid receptor family: structure and functions”. Endocr Rev 11: 201-220.

- Cervantes, V. (1790). “Ensayo para la materia médica mexicana”. Ed. de El estudio, Ed. of. Tip. de la Sec. de Fomento, México, 1889, pp 50.

- Chesley, L.C. (1972). “Plasma and red cell volumens during pregnancy”. Am J Obstet Gynecol 112:440-450.

- Cota, F. (1883). “Algo sobre el zíhuatlpatl”. An. Inst. Med. Nac. Mex. 2: 43-60 (1897).

- Cotter, M.L. (1981). “13C NMR spectral studies of zoapatanol and montanol, novel diterpenes from Montanoa tomentosa (zoapatle), and their chemical derivatives”.

65

Organic magnefic resonance 17: 14-17.

- Couzinel, B., Schaison, G. (1993). “The control of gonadotrophin secrelion by ovarian steroids”. Hum Reprod 8: (Suppl2): 97-101.

- Culler, M.D., Negro-Vilar, A. (1988). “Passive immunoneutralization of endogenous inhibin: sex-related differences in the role of inhibin during development“. Mol Ce// Endocrinol 58: 263-273.

- Davison, J.M., Vallotton, M.B., Lindheimer, M.D. (1981). “Plasma osmolarity and urinaty concentration in the luteum during and after pregnancy: evidence date lateral recumbency inhibits maximal urinary concentrating ability”. Br J Obstet Gynecol 88: 472-479.

- Dawood, M.Y., Wang, C.F., Gupta, R., Fuchus, F. (1978). “Felal contribution of oxytocin in human parturition”. Obstet Gynecol 52: 205-208.

- De Alvarez, R. (1960). “Synthetic melhylergonovine and ergonovine. A comparative evaluation of effect on the post-partum uterus”. Obstet. Gynec. 15: 80-85.

- De Feo, V.J. (1967). “Decidualization”. En: Cellular Biology of fhe Uterus. Wynn, R.M. Ed: 252. Applelon Century Crofls. New York, N.Y.

- De Jong, F.H. (1988). “Inhibin”. Physiol Rev 68: 5554307.

- Del Pozo, E. (1966). “Aztec Pharmacology”. Ann. Rev. Pharm 6: 9-18.

- Derbez, J., Pardo, E., del Pozo, E.C. (1945). “El cihuapahtli, activador de la motilidad uterina”. Bol. Insf, Med. Biol. 3: 127-139.

- Domínguez, X.A. (1988). “Prólogo: Fitoquímica”. En: Métodos de investigación Fitoquímica. Editorial LIMUSA. 4a. Edición. México, D.F. págs:7-9.

- Egan, R.W., Paxton, J., Kuehl, Jr. F.A. (1976). “Mechanism for irreversible self- deactivation of prostaglandin synthase”. J. Biol Chem 251: 7329-7335.

- Enríquez, R.G., Escobar, L.I., Romero, ML., Chávez, M.A. & Lozoya, X. (1983). “Determination of grandiflorenic acid in organìc and aqueous extracts of Montanoa tomentosa (zoapatle) by reversed-phase high-performance liquid chromatography”. Journal of chromatography, 258: 297-301.

- Espey, L.L. (1975). “Evaluation of proteolytic activity in mammalian ovulation”. En: Proteases and Biological control. Reich, E., Rifkin, D.B. & Shaw, E. eds. Cold Spring Harbor, N.Y.: 767-776.

- Espey, L.L. (1994). “Ovulation”. En: The physiology of reproduction. Second edition, edited by Knobil, E. & Nell, J.D., Raven press, Ltd. New York. Capítulo 13: 725-745.

66

- Estrada, A.V., Enríquez, R.G., Lozoya, X., Bejar, E., Girón, H., Ponce-Monter, H. & Gallegos, A. (1983). “The zoapatle II. Botanical and ecological determinants”. Contraception, 27: 227-237.

- Eto, T., Masuda, H., Suzuki, Y., Hosi, T. (1962). “Progesterone and pregn-4-ene-20a- ol-3-one in rat ovarian venous blood at different stages in reproductive cycle”. Jpn J Anim Reprod 8: 34-40.

- Evans, W. Ch. (1991). “Fitoquímica: Introducción y métodos generales”. En: Trease y Evans. Farmacognosia. Ediforial interamericana.McGraw-Hill. 13a. Edición. México, D.F. Parte quinta, 20: 261-287.

- Everett, J.W. (1947). “Hormonal factors responsible for deposition in the corpus luteum of the rat. Endocrinology 41: 364-377.

- Everelt, J.W. (1948). “Progesterone and estrogen in the experimental control of ovulation time and other features of the estrous cycle in the rat”. Encfocrinology 43: 389-405.

- Fogwell, R.L., Cowley, J.L., Wortman, J.A., Ames, N.K., Ireland, J. J. (1985). “Luteal function in cows following destruction of ovarian follicles at mid-cycle”. Theriogenology 23: 389-398.

- Freeman, M.E. & Neill, J.D. (1972). “The pattem of prolactin secrelion during pseudopregnancy in the rat: a daily nocturnal surge”. Endocrínology 90: 1292-1294.

- Freeman, M.E. (1994). “The neuroendocrine control of the ovarian cycle of the rat”. En: The physiology of reproduction. Second edition, edited by Knobil, E. & Nell, J.D., Raven press, Ltd. New York. Capítulo 46: 613-660.

- Fuchs, A.R., Helmer, H., Behrens, O. (1992). “Oxytocin and bovine parturition: a steep rise ìn endomelrial oxytocin receptors at onsel of labour”. Biol Reprod 47: 937-944.

- Furudate, S., Hashimoto, l., Hosi, T. (1975). “Secretion of ovarian progestins in the 5- day cyclic rat”. Jpn J Anim Reprod 20: 144-148.

- Gahlenbeck, H., Frerking, H., Rathschlag-Schefer, A.M., Bartels, H. (1968). “Oxygen and carbon dioxide exchange across the cow placent during the second part of pregnancy”. Respir Physiol 4: 119-131.

- Gallegos, A.J. & Cortés-Gallegos, V. (1974). “Composition and methods for fertility control”. U.S. Patent 4006227, 1977.

- Gallegos, A.J. (1983). “The zoapatle I. A traditional remedy from Mexico emerges to modem times”. Contraception, 27: 21 l-225.

- Gallegos, A.J. (1985). “The zoapatle. VI. Revisited”. Contraception 31: 487-497.

67

- Garrls, D.R., Billiar, R.B., Taboaka, Y., White, R.S., Little, B. (1981). “In situ estradiol and progestin (R5020) localization in the vascularity separated and isolated hypothalamus on the rhesus monkey”. Neuroendocrinology 32: 202-208.

- Gatzuli, E., Aten, R.F., Behrman, H.R. (1991). “inhibition of gonatrotrophin action and progesterone synthesis by xanthine oxidase in rat luteal cells”. Endocrinology 128: 2253-2258.

- Gay, V.L., Midgley, A.R. Jr, Niswender, G.D. (1970). “Pattem of gonadotrophin secretion associated with ovulation”. Fed Proc 29: 1880-1887.

- Gengenbach, D.R., Hixon, J.E., Hansel, W. (1977). ‘A luteolytic interaction between estradiol and protaglandin F2α, in hysterectomized ewes”. Biol. Reprod. 18: 571-579.

- Gibori, G. & Richards, J.S. (1978). “Dissociation of two distinct luteotrophic effects of prolactin regulation of luteinizing hormone-receptor content and progesterone secretion during pregnancy”. Endocrinology 102: 767-774.

- Goodland, R.L., Pommerenke, W.T. (1952). “Cyclic fluctuations of the alveolar carbon dioxide tension during the normal menstrual cycling”. Fertil Steril 3: 294-401.

- Goldman, B.D., Kamberi, I.A., Siiteri, P.K., Porter, J.C. (1969). “Temporal relationship of progestin secretion, LH release and ovulation in rats”. Endocrinology 85: 1137- 1143.

- Goonasekera, M.M., Gunawardana, V.K., Jayasena, K., Mohammed, S.G. & Balasubramaniam, S. (1995). “Pregnancy terminating effect of Jatropha curcas in rats”. Journal of Ethophamracology, 47: 117-123.

- Gorospe, W.C. & Freeman, M.E. (1981). “An ovarian role in prolonging and terminating the two surges of prolactin in pseudopregnant rats”. Endocrinoogy 108: 1293-1298.

- Gray, M. J., Munro, A. P., Sims, E.A.H., Neeker, C.I., Solomon, S., Watanabe, N. (1964). “Regulation of sodium an total body water metabolism in pregnancy”. Am J Obstet Gynecol 89 : 760-765.

Gunnet, J.W. & Freeman, M.E. (1983). “The maiting-induced relese of prolactin: a unique neuroendocrine response. Endocr, Rev. 4: 4.461.

- Guzman, A., Gallegos, A.J., García, G., Flores, J.M. (1985). “Separación de la triada de zoapatanol y montano1 obtenida de Montanoa tomentosa s.s.p. tomentosa por cromatografia de líquidos de alta exactitud en fase inversa”. Arch. Invest. Méd. 16 : 209-216.

- Guzman, A., Wens, M., Ponce, H., Pedrón, N., Gallegos, A.J. (1988). ‘Zoapatle XIII. Isolation of water soluble fractions from Montanoa frutescens and some biological activities”. Arch. invest. Méd. 19: 157-163.

68

- Hamberger, L., Hillensjo, T., Ahren, K. (1978). “Steroid-genesis in isolated cells of preovulatory rat follicles”. Endocrinology 103: 771-777.

- Hansel., W., Concannon, P.W., Lukaszewska. J.H. (1973). “Corpora lutea of the large domestic animals”. Bol. Reprod. 8: 222-245.

- Hansen, E. & Meyer, O. (1994). “Animal models in reproductive toxicology”. En: Handbook oflaboratory animal science. Eds. Pert, Svendsen & Jann Hau. Capítulo 3: 17-25.

- Hashimoto, l., Henricks, D.M., Anderson, L.L., Melampy, R.M. (1968). “Progesterone and Pregn-4ene-20a-ol-3-one in ovarian venous blood during various reproductive states ín the rat”. Endocrinology 82: 333-341.

- Hashímoto, I. & Wiest, W.G. (1969a). “Correlation of the secretion of ovarian steroids with function of a single generation of corpora lutea ín the immature rat”. Endocrinology 64: 873-885.

- Hashimoto, I. & Wiest, W.G. (1969b). “Luteotrophic and luteolytic mechanisms in rat corpora lutea”. Endocrinology 84: 886-892.

- Hashímoto, l., Isomoto, N., Eto, M., Kawaminami, M., Sunazuka, Ch., Ueki, N. (1987). “Preovulatory secretion of progesterone, luteinizing hormone, and prolactin ín 4-day and 5day cycling rats”. Biol Reprod 36: 599-605.

- Heape, W. (1900). “The sexual season of mammals and the relation of the pro-estrum to menstruation”. Q. J. Micr. Sci 44: 1-70.

- Hedberg, l., Hedberg, O., Madati, P., Mshigeni, K.E., Mshiu, E.N. & Samuelsson, G. (1982). “Inventory of plants used in traditional medicine in Tanzania. I. Plants of the families Acanthacese -Cucurbítaceae”. Journal of Ethnopharmacology 6: 29-60.

- Hedberg, l., Hedberg, O., Madatí, P., Mshigeni, K.E., Mshiu, E.N. & Samuelsson, G. (1983a). “Inventory of plants used in traditional medicine in Tanzania (ll). Plants of the families Dilleniaceae -Opiliaceae”. Journal of Ethnopharmacology 9: 105-128.

- Hedberg, I., Hedberg, O., Madati, P., Mshigeni, K-E., Mshiu, EN. & Samuelsson, G. (1983b). “Inventory of plants used in traditional medicine in Tanzania. Part III. Plants of the families Papilionaceae -Vítaceae”. Journal of Ethnophamracology 9: 237-260.

- Herbst, A.L. (1981). “Developmental effects of diethylstilbestrol (DES) in pregnancy”. Herbst, AL., Bern HA. (eds) Thieme-Stratton Inc., New York, 318-320.

- Hixon, J.E., Pimentel, C.A., Weston, P.G., Chafetz E.P., Shanks, R.D., Hansel, W. (1983). “A luteolytic interaction between estradiol benzoate and prostaglandin F2α in cattle”. J. Anim. Sci 56: 1190-1197.

- Hoff, J.D., Quigley, M.E., Yen, S.S.C. (1983). “Hormonal dynamics at mídcycle: a reevaluation”. J Clin Endocrinol Metab 57: 792-796.

69

- Hoffman, J.C. & Schwartz, N.B. (1965). “Timing of post-partum ovulation in the rat”. Endocrinology 76: 620-625.

- Horvath, E., Varga, B., Stark, E. (1986). “Stimulation of progesterone production by adrenocorticotropic hormone and prostaglandin E2 in rat tutea1 cells”. Biol Reprod 35: 44-48.

- Hosenpud, J.D., Hart, M.V., Morton, M.J., Hohimer, A.R., Resko, J.A. (1983). “Progesterone-induced hyperventilation in tha guinea-pig”. Respir Physiol52: 257-264.

- Hughes, TL., Villa-Godoy, A., Kesner, J.S. & Fogwell, R.L. (1987). “Destruction of bovine ovarian foilicles: effects on the pulsatile release of luteinizing hormone and prostaglandin Fz~ induced luteal regression”. Bio/ogy of repmduction 36: 523-529.

- Inskeep, E.K. (1973). “Potential uses of prostaglandins in control of reproductive cycles of domestic animals”. J. Anim Sci 49: 1261-1269.

- Kaneko, S., Sato, N., Sato, K., Hashimoto, 1. (1986). “Changes in plasma progesterone, estradiol, follicle-stimulating hormone and luteinizing hormone during diestrus and ovulation in rats with 5-day estrous cycles: effect of anübody against progesterone, Biol Repmd 34: 488-494.

- Kato, j., Onouchi, T. (1977). “Specific progesterone receptors in the hypothalamus and anterior hypophysis of the rat“. Endoctinology 101: 920-928.

- Kimura, T., Tamitawa, O., Mor¡, K., Browstein, M.J., Okayama, H. (1992). “Structure and expression of a human oxytocin receptor”. Natum 356: 526-529.

- Korach, K.S. (1979). “Estrogen action in the mouse uterus characterization of the cytosol and nuclear receptor system”. Endocrinology 104: 1324-I 332.

- Krall, J.F., Mor¡, H., Tuck, M.L., Leshon, S.L., Korenman, S.G. (1978). “Demonstration of adrenergic catecholamine receptors in the rat myomelrium and their regulation by sex steroid hormones”. tife Sci 23: 1073-1082.

- Kumaresan, P., Anadarangan, P.B., Dianzon, W., Vasicak, A. (1974). “Plasma oxytocin levels during human pregnancy and the labor as delermined by radioimmunoassay”. Am J Obstel Gyneco/ ll 9: 215-223.

- Lam, P.C. & Rothchild, 1. (1977). “The influente of luteinizing hormone (LH), prolactin and the uterus on the development of a dependency on LH in the control of progesterone secrelion in the pseudopregnant rat”. Endocrinology 101: 1503-I 516.

- Landgren, B.M., Aedo, A.R., Hagenfeldt, K., Ditiatusy, E. (1979). “Clinical effects of oralty administered extra& of Montanoa tomentosa in early human pregnancy”. Am. J. Obstel. and Gynecol. 135: 480-484.

- Líndner, H-R., Zor, U., Kohen, F., Baominger, S., Amsterdam, A.. Lahav, M., Salomon, Y. (1980). “Significance of prostaglandins in the regulation of cyclic event in the ovary

70

and uterus”. Adv Prost Thromb Res 8: 1371-1390.

- Lindheimer, M.D., Barrón, W.M., Davison, J.M. (1989). “Osmoregulation of thirst and vasopressin release in pregnancy”. Am J Physiol 257: f159-f169.

- Liu, J.H. & Yen, S.S.C. (1983). “lnduction of midcycle gonadotrophin surge by ovarian steroids in women: a critical evaluation”. J Clin Endocrinol 57: 797-802.

- Lozoya, X., Enríquez, R.G., Bejar, E., Estrada, A.V., Girón, H., Ponce-Monter, H. & Gallegos, A. (1983). “The zoapatle V. The effect of kauradienoic acid upon uterine contractility”. Contraception, 27: 267-279.

- Lu, K.H., Chen, H.T., Huang, H.H, Grandison, L., Marshall, S. & Meites, J. (1976). “Relation between prolactin and gonadotrophin secretion in post-partum lactating rats”. J. Endocrinol. 68: 241-250.

- Lyons, H.A., Antonio, R. (1959). “Disensitivity of the respiratory center in pregnancy and after the administration of progesterone”. Trans Assoc Am Physicians 72: 173- 180.

- Macdonald, G.J. & Greep, R.O. (1968). “Maintenance of progestin secretion from rat corpora lutea”. Perspect Biol Med 11: 490-497.

- Madhwa-Raj, H.G. & Moudgal, N.R. (1970). “Hormonal control of gestation in the intact rat”. Endocrinology 86: 874-889.

- Maltier, J.P., Benghan-Eyene, Y. & Legrand, C. (1989). “Regulation of myometrial β2-, adrenergic receptors by progesterone and Estradiol-17β in late pregnant rats”. Biology of reproduction 40: 53 l-540.

- McLachlan, J.A., Newbold, B.C., Bullock, B.C. (1980). “Long-term effects on the female mouse genital tract associated with the prenatal exposure to diethylstibestrol”. Cancer Res 40: 3988-3999.

- Mizutani, S., Sumi, S., Oka, K. (1985). “Simultaneous determination of plasma oxytocin and serum placental leucine aminopeptidase (P-LAP) during late pregnancy”. Clín Biochem 15: 141-145.

- Mizutani, S., Kurauchi, O., Yamada, R., Narita, O., Tomoda, Y. (1986). “Effects of bestatin, its related compound, puromysin and bacitracin on human oxytocinase and human microsomal placental leucine aminopeptidase”. IRCS Med Sci 14: 270-271.

- Mori, T., Suzuki, A., Nashimura, T., Kambegawa, A. (1977). “lnhibition of ovulation in immature rats by progesterone antiserum”. J. Endocrinol 73: 185-186.

- Murakami, N., Takahashi, M., Suzuki, Y. (1979). “Indispensable role of peripheral progesterone levels for the ocurrence of prolactin surge in pseudopregnant rats”. Biol Reprod 21: 263.

71

- Naruki, M., Misutani, S., Goto, K., Tsujaimoto, M., Nakasato, H., Itakura, A., Mizuno, K., Kurauchi, O., Kikkawa, F. & Tomoda, Y. (1996). “Oxytocin ìs hydrolyzed by an enzime in human placenta that is identical to the oxytocin oxytocinase of pregnancy serum”. Peptides 17: 257-271.

- Neidlein, V.R. & Stumpf, U. (1977a). “Biotransformation and pharmakokinetic von grandiflorensaure (Kauradien-9(11) ,16-Saure-18)-1 Mitt: Spektroskopische untersu- chungen”. Arzneim-Forsch Drug Res. 27: 999-1004.

- Neidlein, V.R. & Stumpf, U. (1977b). “Biotransformation und phannakokinetic von grandiflorensaure (Kauradien-9(11),16-Saure-18)-2 Mitt: Untersuchungen zur biotransfomation an ratten”. Arzneim-Forsch Drug Res. 27: 1162-1166.

- Neidlein, V.R. & Stumpf, U. (1977c) “Biotransformation und pharmakokinetic von grandiflorensaure (Kauradien-9(11),16 Saure-18)-3 itt: Untersuchungen zur biotransformation an ratten”. Arzneim-Forsch Drug Res. 27: 1384-1390.

- Nequin, L.G., Alvarez, J., Schwartz, N.B. (1979). “Measurement of serum steroid and gonadotropin levels and uterine and ovarian variables throughout 4-day and 5-day estrous cycles in the rat”. Biol Reprod 20: 659-670.

- Nieto, A. (1953). “Informe final sobre la labor desarrollada en el Hospital General de Toluca”. Tesis. Facultad de Medicina, UNAM, México.

- Ortiz, A. (1995). Comunicación personal. Universidad Autónoma de Tlaxcala.

- Ortiz de Monte Llano, B. (1975). “Empirical Aztec Medicine”. Science, 188: 215-220.

- Oosterbaan, H-P., Swaab, D.F. (1989). “Amniotic oxytocin and vasopressin in relation to human fetal delopment and labour”. Early human Dev 19: 253-262.

- Pedrón, N., Estrada, A.V., Ponce-Monter, H., Valencia, A., Gúzman, A. & Gallegos, A.J. (1985). “The zoapatle VII. Antiimplantation effect in the rat of zoapatle aqueous crude extract (ZACE) from Montanoa tomentosa and Montanoa frutescens”. Contraception, 31: 499-507.

- Pedrón, N., Wens, M.A., García-Pineda, J., Estrada, A.V., Ponce-Monter, H. & Gallegos, A.J. (1988). “The zoapatle XIV. The effect of oral administration of zoapatle upon progesterone plasma levels in pregnant rabbits”. Contraception 38: 373-379.

- Phillipson, J.D. (1979). “Natural products as basis for new drugs”. Trends. Pharma. Sci 1: 36-38.

- Piacsek, B.E., Schneider, T.C., Gay, V.L. (1971). “Sequential study of luteinizing hormone (LH) and progestin secretion on the afternoon of proestrus in the rat”. Endocrinology 89: 39-45.

- Ponce-Monter, H., Girón, H., Lozoya, X., Enríquez, R-G., Bejar, E., Estrada, A.V. y Gallegos, A.J. (1983). “The zoapatle III. Biological and uterotonic properties of

72

aqueous plant extract”. Contraception, 27: 239-253.

- Ponce-Monter, H., Campos-Lara, G., Pedrón, N., De la Torre, L., Villanueva, T., Gallegos, A., Romo de Vivar, A., Azpeitia, E. & Pérez, A. (1988). “The zoapatle. XV. Activity of 16 alpha-hydroxy-ent-kauran-l9-oic acid isolated from Montanoa hibíscifolia, and its methyl ester on rat and guinea pig uterus”. J. Ethnopharmacol 24: 127-134.

- Quarmby, V. & Korach, K.S. (1984). “The influence of 17 beta estradiol on patterns of celf division in the uterus”. Endocrinology 114: 694-702.

- Quijano, L., Calderón, J.S., Gómez, F., Rosario, V. & Ríos, T. (1985a). “Acyclic precursors of the uterotonic oxepane diterpenoids of zoapatle (Montanoa tomentosa)“. Phytochemistry 24: 2741-2743.

- Quijano, L., Calderón, J.S., Gómez, F., Rosario, V. & Ríos, T. (1985b). “Oxepane diterpenoids and sesquìterpene lactones from zoapatle (Montanoa tomentosa), a mexican plant with oxytocic activity”. Phytochemistry 24: 2337-2340.

- Reza, A. (1887). “Acción fisiológica comparada del cuernecillo del centeno y el zihuatlpatl”. An. Inst. Med. Nac. Mex. 2: 43-60 (1897).

- Rivier, C., Rivier, J., Vale, W. (1986). “lnhibin-mediated feedback control of follicle stimulating hormone secretion in the female rat”. Science 234: 205208.

- Rivier, C. & Vale, W. (1989). “lnmunoneutralization of endogenous inhibin modifies hormone secretion and ovulation rate in the rat”. Endocrinology 125: 152-157.

- Rodríguez, J.M. (1869). “El cuernecillo de centeno y el zihuatlpatle (Montanoa tomentosa), sus indicaciones y contraindicaciones”. Gaceta Med. de Méx. 4: 196-200.

- Roser, S. & Block, R.B. (1969). “Variations du taux de la progesterone plasmatique su cours de cycles de 5 jours chez in ratte”. CR Hebd Seances Atad Sci 208: 1318-1320.

- Rothchild, I. (1981). “The regulation of the mammalian corpus luteum”. Recent. Prog. Horm. Res. 37: 183-298.

- Samuelsson, G., Kyerematen, G. & Farah, M. (1985). “Preliminary chemical characterization of pharmacologically active compounds in aqueous plant extracts”. Journal of Ethnopharmacology, 14: 193-201.

- Sánchez-Críado, J.R., van der Schoot, P. & Uilenbroek, J.Th.J. (1988). “Evidence for luteotrophic and antiluteolytic actions of prolactin in rats with 5-day oestrous cycles”. J. Endocrinol. 117: 455-460.

- Sánchez-Criado, J.R., Bellido, C., Galiot, F., López, F. J. & Gaytán, F. (1990). “A possible mechanism of the anovulatory action of antiprogesterone RU486 in the rat”. Biology of reproduction 42: 877-886.

73

- Sawada, M. & Carlson, J.C. (1996). “lntracellular regulation of progesterone secretion by the superoxide radical in the rat corpus luteum”. Endoctinology 137: 1580-1584.

- Schreiber, J.R., Hsueh, A.J.W. (1979). “Progesterone “receptor in rat ovary”. Endocrinology 105: 915-919.

- Schwartz, N.B. (1989). “A model for the regulation of ovulation in the rat”. Recent Prog Horm Res 25: 1-55.

- Seaman, F.C., Malcolm, A.J. & Fischer, N.H. (1984). “Tomexanthin an oxepane diterpene from Montanoa tomentosa”. Phytochemistry 23: 464-465.

- Sevanian, A., Wratten, M.L., McLeod, L.L., Kim, E. (1988). “Lipid peroxidation and phospholipase A2 activity in liposomes composed of unsaturated phospholipids: a structural basis for enzyme activation”. Biochim Biophys Acta 961: 316-327.

- Shoham, Z. & Schachter, M. (1996). “Estrogen biosyntesis-regulation, action, remote effects, and value of monitoring in ovarian stimulation cycles”. Fertility and Sterlity 65: 687-701.

- Smith, J.B., Smith, E.F., Lefer, A.M., Nicolaou, K.C. (1981). “Spasmogenic effects of the anti-fertility agent, zoapatanol”. Life Sc. 28: 2743-2746.

- Smith, MS., Freeman, M.E. & Neill, J.D. (1975). “The control of the progesterone secretion during the estrous cycle and early pseudopregnancy in the rat: prolactin, gonadotrophin and steroid levels associated with rescue of the corpus luteum of pseudopregnancy”. Endocrinology 96: 219-226.

- Smith, M.S. (1980). “Role of prolactin in regulating gonadotrophin secretion and gonad function in female rats”. Fed Proc 39: 2571-2576.

- Southam, L., Pedrón, N,, Ponce-Montier, H., Girón, H., Estrada, A., Lozoya, X., Enríquez, R.G., Bejar, E. & Gallegos, A.J. (1983). “The zoapatle IV. Toxicological and clinical studies”. Contmception, 27: 255-265.

- Spitz, I.M., Croxatto, H.B., Robbins, A. (1996). “Antiprogestins: mechanism of action and contraceptive potential”. Annu Rev PharmacoI, Toxicol 36: 47-81.

- Stock, M.K. & Metcalfe, J. (1994). “Maternal physiology during gestation”. En: The physiology of reproduction. Second edition, edited by Knobil, E. & Nell, J.D., Raven press, Ltd. New York. Capítulo 54: 947-983.

- Stouffer, R.L. (1988). “Perspectives on the corpus luteum of the menstrual cycle and early pregnancy”. Semin Reprod Endocrinol 6: 103-l 13.: 103-I 13.

- Stouffer, R.L. & Duffy, D.M. (1995). “Receptors for sex steroids in the primate corpus luteum”. TEM 6: 83-89.

- Stouffer, R.L. (1990). “corpus luteum function and dysfunction”. Clin Obstet gynecoI 33: 668-689.

74

- Strauss, J.F., Schuler, L.A., Rosenblum, M.F., Tanaka, T. (1981). “Cholesterol metabolism by ovarian tissue”. Adv. Lipid Res 18: 99-157.

- Strauss, J.F., Miller, W.L. (1991). “Molecular basis of ovarian steroids synthesis”. En: Hillier SG (ed) Ovatian Endocrinology. Oxford, UK. Blackwell Scientific publications, 25-72.

- Tebar, M., Ruiz, A., Gaytan, F. & Sánchez-Criado, J.E. (1995). “Follicular and luteal progesterone play different roles synchronizing pituitary and ovarian events in the 4- day cyclic rat”. Biology of reproduction 53: 1183-1189.

- Terkel, J. (1986). “Neuroendocrinology of coitally and non-coitally induced pseudopregnancy“. Annals New York Academic od Sciences 474: 66-94.

- Terkel, J. (1988). “Neuroendocrine processes ín the establishment of pregnancy and pseudopregnancy in rats”. Psychoneuroenndocrínology 13: 5-28.

- Tortora, G.J. & Anagnostaros, N.P. (1984). “Reproducción”. En: Principios de Anatomía y Fisiología. Edit. Harla & Row Latinoamericana, Mexico, D.F. Capítulo 28: 915-929.

- Uchida, K., Kadowaki, M., Miyake, T. (1969a). “Ovarian secretion of progesterone and Pregn-4ene-20a-ol-3-one during rat estrous cycle in chronological relation to pituitary release of luteinizing hormone”. Endocrinol Jpn 16: 227-237.

- Uchida, K., Kadowakii, M., Miyake, T. (1969b). “Acute effects of various ganadotropins and other pituitary hormones on preovulatory ovarian progestin secretion in hypophysectomized rats”. Endocrinol Jpn 16: 239-249.

- Uilenbroek, J.Th.J. (1991). “Hormone concentration and ovulatory response in rats treated with antiprogestagens”. J. Endocrinol. 129: 423-429.

- van der Schoot, P. & de Greef, W.J. (1976). “Dioestrous progesterone and pro-estrous luteinizing hormone in 4- and 5-day cycles of female rats”. J Endocrinol 70: 61-68

- van der Schoot, P. & Uilenbroek, J.Th.J. (1983). “Reduction of 5-day cycle length in the female rat”. Acta Endocrinol 97: 83-89.

- Vanluchene, E., Vandekerckhove, D., Jonckheere, J. & Da Leenheer, A. (1983). “Steroid profiles of body fluids other than urine, obtained by capillary gas chromatography”. Journal of Chromatograhy, 279: 573-580.

- van Rees, G.P. (1972). “Control of ovulation by the pituitary gland”. Prog Brain Res 38: 193-210.

- Voogt, J., Robertson, M. & Friesen, H. (1982). “lnverse relationship of prolacting and rat placental lactogen during pregnancy”. Biol. Reprod. 26: 800-805.

75

- Walter, D.P., Martin, A., Oshima, Y. & Fong, H.H.S. (1987). “Studies on zoapatle V. Correlation between in vitre uterine and in vitro pregnancy interruption effects in guinea pigs”. Contraception, 35: 147-153.

- Wani, M.C., Vishmivajjala, B.R., Swain, W.F., Rector, D.H., Cool, C.E., Petrow, V., Reel, J.R., Allen, K.M. & Levine, S.G. (1983). “Synthesis and biological activity of zoapatanol analogues”. J. Med. Chem. 26: 420-430.

- Welschen, R., Osmar, P., Dullaart, J., deGreef, W.J., Uilenbroek, J., deJong, J. (1975). “Levels of follicle-stimulating hormone, estradiol-17β and progesterone, and follicle growth in the pseudopregnant rat”. J Endocrinol 64: 37.

- Wens, A., Valencia, A., Pedrón, N., Ponce-Monter, H., Gúzman, H. & Gallegos, A.J. (1985). “The zoapatle. IX. In vitro effect of Montanoa tomentosa and Montanoa frutescens upon human sperm and red cells”. Confraception 31: 523-532.

- Williams, K.I. & El Tahir, K.E.H. (1980). “Effects of uterine stimulant drugs on prostacyclin production by the pregnant rat myomelrium. I. Oxytocin, Bradykinin and PGF2α”. Prostaglandins 19: 31-38.

- Wilson, J.G. (1974). “Factors determining the teratogenicity of drugs”. Teratogenicity of drug 205-217.

- Yogev, L. & Terkel, J. (1978). “The temporal relationship between implantation and termination of nocturnal prolactin surges in pregnant lactating rats”. Endocrinology 102: 160-165.

- Yoshinaga, K. (1977). “Hormonal interplay in the establíshment of pregnancy”. En: Reproductive Physiology II. Greep, R.O. Ed. 13: 201-223. Unversity Park Press. Baltimore, Md.