UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida...
Transcript of UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida...
![Page 1: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/1.jpg)
UNIDAD 4. TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN
Elaboró: Dra. Kadiya del C. Calderón Alvarado
UNIVERSIDAD DE SONORA
POSGRADO EN BIOCIENCIAS
MICROBIOLOGÍA MOLECULAR (2442)
![Page 2: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/2.jpg)
FundamentoPermite la detección de moléculas diana inmovilizadas sobre un soporte físico,mediante el empleo de una sonda específica.
La sonda es una molécula de ADN complementaria (total o parcialmente) a la dela molécula diana (ADN ó RNA).
Mezclademoléculas
Moléculadiana
Separacióneinmovilización
soporte
Adicióndesondamarcada
Lavadodesondanounida
detección
Hibridación con marcaje fluorescente
La complementariedad posibilita la formación de un híbrido entre la molécula dianay la sonda.
Si la sonda es marcada de modo visible (fluorocromo), tras la hibridación seproduce la detección de la molécula diana, gracias a su unión con la sondamarcada.
![Page 3: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/3.jpg)
Comunidadmixta
fijación
hibridación
Célulashibridadas
Análisismicroscópico
sonda
Diana(ARNr16S)
fluorocromo
Ribosoma
Subunidad30S,conARNr16S
Sondas(oligonucleótidos)marcadas
lavado
Hibridacióninsituconfluorescencia (FISH)
citoplasma nucleoide ribosomas
pared membranacitoplasmática
plásmido
Lascélulasfijadassepermeabilizan
![Page 4: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/4.jpg)
Una célula bacteriana puede contener un promedio de 10.000 ribosomas(30% del peso de la célula)
RIBOSOMAS
En células procariotas funcionales y activas, el citoplasma está repleto de ribosomas libres de unión a membranas y distribuidos al azar
![Page 5: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/5.jpg)
La técnica FISH “colorea” las células conviertiendo los ribosomas en puntos de emisión de luz
En células procariotas funcionales y activas, el citoplasma está repleto de ribosomas libres de unión a membranas y distribuidos al azar
FISHRIBOSOMAS
![Page 6: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/6.jpg)
Muestra con secuencia diana
FijaciónImmobilizacionDeshidratacion
Diagrama de flujo
![Page 7: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/7.jpg)
¿Porqué es necesaria la fijación de las muestras?
•La degradación de ARNr se detiene• La morfología de las células se preserva• La membrana de las células o tejido a observar se permeabiliza.
• OJO: Para muestras frescas es necesario fijar rapidamente en el sitio!!!!• Después de la fijación, las muestras se pueden preservar porperiodos largos a -20°C.
Depende del material a fijar…..Gram negative bacteria Þ 4 % buffer formaldehídoGram positive bacteria Þ Etanol
![Page 8: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/8.jpg)
Influencia en la preparación de las muestras
![Page 9: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/9.jpg)
Inmovilización y deshidratación
• En porta objetos especiales• Un prota objetos adicional para cubrir la muestra
puede o no ser necesario• poly-lysin coating• gelatine coating
• Se debe realizar una deshidratación paulatina con etanol (50 %, 80%, 96%)
• Permite largo tiempo de alamcenamiento (-20°C)
![Page 10: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/10.jpg)
Muestra
Permeabilizacion de la pared o membranaAdición de la sonda
(verde & roja marcado)
![Page 11: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/11.jpg)
Sondas-ADN: desoxioligonucleotidos marcados fuorescentemente fluorescent para organismos blanco
sonda NIT2
Nitrobacter hamburgensis
Nitrobacter winogradskyi
Blastobacter denitrificans
Bradyrhizobium japonicum
Blastobacter natatorius
3’-TCCGCCACGCGATTGGGC-5’
5’-AGGCGGUGCGCUAACCCG-3’
5’-..................-3’
5’-...............A..-3’
5’-..A...............-3’
5’- ....C............-3’
Ejemplo
![Page 12: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/12.jpg)
3’-TCCGCCACGCGATTGGGC-5’
-AGGCGGUGCGCUAACCCG--- ----CGATCCCAUUUAAGCCGA-
16SrRNA
MATCH NO MATCH
![Page 13: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/13.jpg)
Optimizacióndelascondicionesdehibridación
• Condiciones:determinanlaespecificidaddelahibridación
• Bufferdehibridación• %NaCl• %Formamida
• Temperaturadeincubacióndelahibridación
• LaconcentracióndeNaCl ylaTnopermitengrandesvariaciones• Sesuelehibridaratemperaturafija(46°C)y0.9mM deNaCl.• Laespecificidadselograajustandolaconcentracióndeformamida
1%aumentoconcentracióndeformamida =0.5°CaumentoTº dehibridación
Hibridacióninsituconfluorescencia (FISH)
![Page 14: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/14.jpg)
[S]
%Formamida0 20 40 60 80 100
blanco + sondaNo blanco + sonda
Determinación de astringencia de las sondas
Intensidad de fluorescencia
Agente desnaturalizante Ojo: con sondas competitivas!!!
![Page 15: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/15.jpg)
Elconceptodelcompetidor
Sincompetidor
Señalesinespecíficas
Especie1
Especie2
sonda
Bet42a GCCTTCCCACTTCGTTTGAM42a GCCTTCCCACATCGTTT
Hibridacióninsituconfluorescencia (FISH)
![Page 16: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/16.jpg)
Sincompetidor
Señalesinespecíficas
sonda
competidor
Bet42a GCCTTCCCACTTCGTTTComp GCCTTCCCACATCGTTTGAM42a GCCTTCCCACATCGTTTComp GCCTTCCCACTTCGTTT
Elconceptodelcompetidor
Especie1
Especie2
Hibridacióninsituconfluorescencia (FISH)
Poniendoeloligocompetidor,esteseunepreferentementeagammayasílasondadebetamarcadaconelfluorocromoyanoselespegayeliminamoslaunióninespecífica.
![Page 17: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/17.jpg)
Probe labelling3’ or 5’ modification with a fluorescent dye
Dye Colour AbsorptionMax. (nm)
EmissionMax. (nm)
Molar ExtinctionCoefficient (cm-1 M-1)
Dabcyl 453 None 32.000Cy2 Green 489 506 150.000Fluorescein (FITC) Green 494 525 73.000FAM(Carboxyfluorescein)
Green 496 516 83.000
TET(Tetrachlorofluorescein)
Orange 521 536 73.000
HEX(Hexachlororluorescein)
Pink 535 556 73.000
Cy3 Orange 550 570 150.000TAMRA(Carboxytetramethylrhodamine)
Rose 565 580 89.000
Cy3.5 Scarlet 581 596 150.000ROX (carboxy--x-rhodamine)
Red 575 602 82000
Texas Red Red 596 615 85.000Malachite Green Green 630 None 76.000Cy5 Far Red 649 670 250.000Cy5.5 Near-IR 675 694 250.000Cy7 Near IR 743 767 250.000FluorX Green 494 520 68.000
JenaBioscience GmbH,http://www.jenabioscience.com/images/741d0cd7d0/bro_FluorescentProbes_WEB.pdf,23.04.2015.
![Page 18: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/18.jpg)
Ethidium
PE
cis-Parinaric acid
Texas Red
PE-TR Conj.
PI
FITC
600 nm300 nm 500 nm 700 nm400 nm457350 514 610 632488Common
Laser Lines
Purdue University Cytometry Laboratories
![Page 19: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/19.jpg)
• DAPI ó(4',6-diamino-2-fenilindol)esunmarcadorfluorescente queseunefuertementearegionesenriquecidasenAdenina yTimina ensecuenciasdeADN.
DAPI DAPIFISHProbe EUB338
CARD-FISHProbe EUB338
AEM 69 (5): 2928-2935
![Page 20: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/20.jpg)
¿Dónde encuentro las sondas?
1. Literatura
2. Probebase (http://www.microbial-ecology.de/probebase/)
3. Se pueden diseñar (software especial)
• PRIMROSE (http://rdp.cme.msu.edu/)
• ARB (www.arb-home.de/)
¿Dónde las ordeno?
Compañías especializadas (Eurogentec, Sigma, etc)
![Page 21: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/21.jpg)
http://www.microbial-ecology.net/probebase/
Hibridacióninsituconfluorescencia (FISH)
Diseñodelassondas
>2700sondasregistradas
![Page 22: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/22.jpg)
Microscopio confocal, fluorescencia u epifluorescencia
Analisis de las muestras con....
software
![Page 23: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/23.jpg)
https://iie.fing.edu.uy/investigacion/grupos/gti/timag/trabajos/2007/proteus/confocal.html
![Page 24: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/24.jpg)
https://iie.fing.edu.uy/investigacion/grupos/gti/timag/trabajos/2007/proteus/confocal.html
![Page 25: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/25.jpg)
FISHconunasondaespecífica +EUBmixImagendelaseñaldelasondaespecífica(poblacióndiana)
ImagendelaseñaldelasondaEUBmix (poblacióndianaen
amarillo)
20-30paresdeimágenes
Tomadasenposicionesx-y-zalazar
Árearelativadelapoblacióndianamedidaencadapardeimagenes
Mediadelárea=fraccióndebiovolumen delapoblacióndiana
DaimsH,LückerS,WagnerM. 2006.daime,anovelimageanalysisprogramformicrobialecologyandbiofilmresearch.Environ.Microbiol.8:200-213.
Cuantificación
EsposibleconCLSM+software (daime®)
Hibridacióninsituconfluorescencia (FISH)
![Page 26: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/26.jpg)
Flavobacteriumpsychrophilum
Tras3díasdecultivo Tras16semanasdecultivo
(Vatsosetal.2003,DisAqOrg56:115)
Poblacionesactivasdebacterias
CélulasbajodéficitnutricionalCélulasbajoestrésambiental
Célulasenfasedemuerte
à Síntesisproteicaà alto niveldeARNrà SeñalesdeFISHmuypotentes
à BajosnivelesdeARNrà SeñalesdeFISHdébiles
à SinnivelesdetectablesdeARNrà SinseñalesdeFISH
![Page 27: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/27.jpg)
Bacteriasdelsuelo (Christensenetal.1999,AEM65:1763)
Poblacionesactivasdebacterias
CélulasbajodéficitnutricionalCélulasbajoestrésambiental
Célulasenfasedemuerte
à Síntesisproteicaà alto niveldeARNrà SeñalesdeFISHmuypotentes
à BajosnivelesdeARNrà SeñalesdeFISHdébiles
à SinnivelesdetectablesdeARNrà SinseñalesdeFISH
Bacteriasactivas
Bacteriasinactivas
Artefactos
SondadeFISHmarcada(colorrojo)
OJO:IntensidadNOsiempre=actividad
![Page 28: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/28.jpg)
Nitrosococcus sp.:amarillo(CY3)restodebacterias:azul(DAPI)
Nitrosomonas spp.:amarillo(CY3)restodebacterias:verde(FLUOS)
Lacuantificación esposibleconCLSMysoftware(daime®)
Examen:microscopíadeepifluorescenciaoláserconfocal
Hibridacióninsituconfluorescencia (FISH)
Almstrand et al., ASPD conference 2009
![Page 29: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/29.jpg)
Diversidaddebacteriasnitrificantes(oxidadorasdeamonioynitrito)enfiltrossumergidos.
AOB: amarilloNOB: azulBacteria: verde
Hibridacióninsituconfluorescencia (FISH)
Almstrand et al., Bioresource Technology 102 (2011) 7685–7691
![Page 30: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/30.jpg)
Diversidaddebacteriasoxidadorasdeamonioyanammoxenunreactorgranular.
Figueroaetal.,ASPDconference2009
85días,superficiedelosgránulosNEU653:coloramarilloEUBmix:colorverde
250días,400µmprofundidaddentrodelosgránulosNEU653:colorverdeAMX820:colorazul
Hibridacióninsituconfluorescencia (FISH)
![Page 31: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/31.jpg)
(Fernándezetal.,2008,MicrobialEcology56:121)
Sondas:Verde:eubacteria
Rojo:arqueas
SEM
Desarrollodebiopelículasenuntratamientoanaeróbicodeaguaresidualurbana
Hibridacióninsituconfluorescencia (FISH)
![Page 32: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/32.jpg)
VariantesdelatécnicaFISHaplicablesenmicrobiologíaambiental
VolpiyBridger,2008,BioTechniques45:385-409
CARD-FISHMICRO-CARD-FISHClone-FISHExpression-FISH(ARNm-FISH)FISH-MARRainbow-FISHRaman-FISHRing-FISH
![Page 33: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/33.jpg)
CARD:catalyzedreporterdepositionHRP=peroxidasaderábano(horseradish)
Sondas-HRP
célulabacteriana
1.HibridaciónconlasondaligadaaHRP
2.Incubaciónconfluoresceín-tiramida
Radicalizacióndelafluoresceín-tiramida poracción
delaperoxidasa
Card-FISH
Tiramida-Fluorocromo
Las señales de FISH incrementan su intensidad hasta 20 veces en comparación con las mismas sondas con marcaje de FISH convencional
Es preciso ajustar los protocolos de permeabilización de las células ya que el oligo marcado con la peroxidasa es mas difícil que penetre en las células
![Page 34: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/34.jpg)
CARD-FISH
-técnica de marcaje alternativa. -los oligos específicos van marcados con la peroxidasa de rábano (HRP) (unión covalente).-Cuando usamos estos oligos, la tinción fluorescente es resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas a los ribosomas catalizan la deposición de los compuestos reportermarcados en el interior de las células diana de la sonda, pues la tiramida es el sustrato de la peroxisada HRP. -Las señales de FISH incrementan su intensidad hasta 20 veces en comparación con las mismas sondas con marcaje de FISH convencional. Sin embargo, es preciso ajustar los protocolos de permeabilización de las células ya que el oligo marcado con la peroxidasa es mas difícil que penetre en las células.
![Page 35: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/35.jpg)
FISHestándar
CARD-FISH
Microscopiodecontrastedefases
Microscopioconfocal
Schönhuberetal.,1997,AEM63:3268
>20xintensidad
Card-FISH
![Page 36: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/36.jpg)
FISHESTÁNDAR CADR-FISH
VELOCIDAD >1h 2días
Pasosdelavado >3 10
Pérdidadebiomasa poca mucha
costo 50-200euros Másde400euros
Tiempodealmacenamiento
ilimitada Aprox.6meses
Mezclaconsondassimultáneamente
>3 1
enzima - Peroxidasa
FISH VERSUS CARD FISH
![Page 37: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/37.jpg)
Comparación entre FISH & CARD-FISH
DAPI DAPIFISHProbe EUB338
CARD-FISHProbe EUB338
AEM 69 (5): 2928-2935
Bacterias de un lago
![Page 38: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/38.jpg)
Applicación: bacteria y archaea de sedimentos marinos• Oxidación anaerobia de metano• Acopladas a sulfato reductoras• “Simbiosis” entre Archaea y sulfato reductoras (SRB)
DAPI
5 µm CARD-FISH:Rojo: Archaeaverde: SRB
![Page 39: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/39.jpg)
FISH-MAR
Sondadeoligonucleótido
marcadaconfluorocromo
Incubaciónconsustratomarcadoconradioactividad(14C)
Hibridación
FijaciónMuestraambiental
Capadeemulsiónfotográfica
Lee,N.,Nielsen,O.H,Andreasen,K.H.,Juretschko,S.,Nielsen,J.L.,Schleifer,K.H.,Wagner,M.1999.Combinationoffluorescentinsituhybridizationandmicroautoradiography:anewtoolforstructure-functionanalysesinmicrobialecology.AppliedandEnvironmentalMicrobiology,65:1289-1297
FISH+MAR
-Los portas se tratan con emulsión autoradiográfica, que se deposita sobre las células radioactivas.
-Las muestras se observan con CLSM.
-La detección fluorescente mas la detección readioactiva permiten identificar la población que metaboliza el sustrato marcado.
MAR=microautoradiografía
![Page 40: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/40.jpg)
FISH-MARparaelestudiodecomunidadescomplejasenfangosactivosparaeltratamientodeaguasresiduales
33PSondas:GAM42a(Cy3,blancoenlaimagen),BET42a(Cy5,verdeenlaimagen)
14C AcetatoSondas:Nitrosomonaseuropaea NEU(Cy3+Cy5amarilloenlaimagen),BET42a(Cy5,verdeenlaimagen)
14C AcetatoSonda:BET42a(FLUOS,verdeenlaimagen)
Leeetal,1999,AEM65:1289
![Page 41: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/41.jpg)
Resumen:• La combinacion de diferentes sondas es posible.
• Ventaja, se detectan células ACTIVAS àrARN...mayor fluorescencia.
• Técnica muy usada para el rastreo de gruposespecíficos de células o bacterias en comunidadesmixtas basados en su rARN.
• ¿Se puede medir el mARN?Principio muy similar con la técnica de CARD-FISHSin embargo es bastante dificil porque:
t1/2 mARN es muy inestableAdemás de buscar el % óptimo para permeabilizar la célula
![Page 42: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/42.jpg)
Aplicaciones
Cuantificación• Combinando sondas de grupos totales y sondas específicas (o DAPI)• % concentración o número por superficie o área
Identificación de patógenos• Rápida identificación de patógenos en muestras. • 1 a 4 días más rápido comparado con un cultivo.
Análisis funcional de muestras ambientales•FISH & microautoradiography (FISH-MAR)
![Page 43: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/43.jpg)
§Detección de secuencias conocidas de ADN (Southern blot) o ARN(Northern blot) mediante hibridación con sondas específicasmarcadas.
Aplicaciones:§Localización de genes (ADN) o de la expresión de genes (mARN)en bacterias o células eucariotas.§Aplicaciones de diagnóstico (pruebas de paternidad, medicinaforense).
Ventajas:§Técnica muy sensible y específica.§Más económica que PCR.
Desventajas:§Técnica muy laboriosa.§Está siendo desbancada por la PCR.
Hibridación Southern y Northern
![Page 44: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/44.jpg)
1234M
Gel de agarosa
Hibridación ADN-ADN: Técnica Southern-blot
geldeagarosa
depurinación del ADNdesnaturalización química
ADNs genómicos cortadoscon enzima de restricción
digestión del ADNcon enzimas de restricción
![Page 45: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/45.jpg)
1234M
geldeagarosa
0.5Kg
membrana de nylon
buffer detransferencia
papel absorbente
peso
ADN transferido a la membrana
Gel de agarosaADNs genómicos cortadoscon enzima de restricción
Hibridación ADN-ADN: Técnica Southern-blot
![Page 46: UNIVERSIDAD DE SONORA POSGRADO EN BIOCIENCIAS ...resultado de una segunda incubación con tiramida marcada con fluorocromos.-Las moléculas de la peroxidasa especificamente unidas](https://reader033.fdocumento.com/reader033/viewer/2022041618/5e3d3f096e06a05c7d2fe929/html5/thumbnails/46.jpg)
Gel de agarosa original
1234M
revelado conantiDIG másreactivo coloreado
1234M
membrana de nylon con ADN transferido
ADN sonda,marcadocon digoxigenina
La sonda hibridará con lascadenas de ADN desecuencia complementaria
Hibridación ADN-ADN: Técnica Southern-blot