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UNIVERSIDAD DEL TURABO
DIVERSIDAD GENÉTICA BACTERIANA EN LOS SEDIMENTOS DE LA
RESERVA DE INVESTIGACIÓN ESTUARINA DE LA BAHÍA DE JOBOS, PUERTO
RICO
Por
Ladys D Contreras Medina
BS, Biología, Universidad de Puerto Rico en Cayey
TESIS
Escuela de Ciencias y Tecnología
Universidad del Turabo
Requisito parcial para el grado de
Maestría en Ciencias Ambientales
Especialidad en Análisis Ambiental
(Opción en Biología)
Gurabo, Puerto Rico
mayo, 2011
ii
UNIVERSIDAD DEL TURABO
Una tesis sometida como requisito parcial para el grado de
Maestría en Ciencias Ambientales
Diversidad Genética Bacteriana en los Sedimentos de la Reserva de Investigación
Estuarina de la Bahía de Jobos, Puerto Rico
Ladys D Contreras Medina
Aprobado:
____________________________
José R Pérez Jiménez, PhD
Asesor de Investigación
____________________________
Eddie N Laboy Nieves, PhD
Miembro
____________________________
Ángel Dieppa Ayala, MS
Miembro
© Copyright 2011
Ladys D Contreras Medina. All Rights Reserved.
iii
Dedicatoria
El camino recorrido no ha sido fácil, pero la fuerza que me impulsó a lograrlo fue
muy grande. Gracias Dios por no dejarme desfallecer. Le dedico este trabajo
primeramente al tesoro más grande que me ha regalado la vida, mi razón de ser, mi hijo
Dereck G Hernández. A mi esposo Jorge; gracias por tu apoyo y comprensión. A mis
padres Andreita y José por darme la vida. Andreita, madre a ti te debo lo que soy, me
enseñaste a nunca rendirme, eres mi orgullo y un gran ejemplo a seguir. Al hombre que
siempre creyó en mí y me vio como su hija, Edwin. A mis hermanas Andrialet y Andrea
que han sido grandes amigas en este gran reto. En general a toda mi familia porque solo
obtuve de cada uno de ustedes palabras de aliento y apoyo que permitieron que culminara
este gran reto.
iv
Agradecimientos
En el caminar de la vida siempre encontrarás personas que impactarán tu vida de
forma positiva. Desde que comencé con este proyecto hubo una serie de personas
especiales que contribuyeron a que finalmente alcanzara mi meta. Esta investigación no
hubiese sido posible sin la guía del Dr José R Pérez Jiménez. Gracias por la confianza y
el conocimiento brindado. Sus palabras de aliento siempre fueron muy oportunas y con
gran significado. También debo agradecer de forma muy especial al Dr Eddie N Laboy
Nieves y el Sr Ángel Dieppa Ayala por el asesoramiento y las recomendaciones
brindadas.
Gracias a la Administración Nacional Oceánica y Atmosférica (NOOA por sus
siglas en inglés) por facilitar muestras y a “Amgen Foundation” por la ayuda económica
brindada.
Agradezco muy especialmente a mis compañeros y amigos del laboratorio
PRIMER Instituto de Investigación Interdisciplinario, gracias por sus sonrisas y palabras
de ánimos. Diana Liz Laureano y Brenda Rodríguez son muy especiales, gracias por toda
la ayuda brindada y su asistencia incondicional en el laboratorio.
Finalmente a toda mi familia y amigos gracias por sus palabras y por la paciencia
que siempre tuvieron conmigo. Gracias por el apoyo.
v
Tabla de Contenido
página
Lista de Tablas .................................................................................................................. vii
Lista de Figuras ................................................................................................................ viii
Lista de Apéndices ............................................................................................................. ix
Abstract ................................................................................................................................x
Resumen ............................................................................................................................ xii
Capítulo Uno. Introducción .................................................................................................1
Justificación .............................................................................................................1
Metas y Objetivos ....................................................................................................3
Hipótesis ..................................................................................................................4
Capítulo Dos. Revisión de Literatura...................................................................................5
Capítulo Tres. Metodología ...............................................................................................24
Lugar de Estudio ....................................................................................................24
Colección de Muestras ...........................................................................................25
Extracción de ADN Genómico ..............................................................................26
Amplificación de 16 ADNr ....................................................................................26
Análisis de Comunidades Bacterianas por TRFLP ................................................27
Análisis Estadísticos de Diversidad .......................................................................28
Capítulo Cuatro. Resultados ..............................................................................................29
Introducción ...........................................................................................................29
Amplificación de 16 ADNr Bacteriano .................................................................29
Estructura de las Comunidades Bacterianas ..........................................................31
vi
Distribución Bacteriana en Función de Contaminantes .........................................37
Índice de Similitud de Sørensen ............................................................................41
Análisis de Varianza Múltiple ...............................................................................42
Capítulo Cinco. Discusión .................................................................................................45
Diversidad de la Comunidad Bacteriana................................................................46
Comparación de Contaminantes Versus Filotipos .................................................49
Conclusión .............................................................................................................51
Literatura Citada ................................................................................................................53
Apéndices ...........................................................................................................................59
vii
Lista de Tablas
página
Tabla 4.01. Amplificación del 16S ADNr para sedimentos en estaciones de
la Bahía de Jobos .......................................................................................30
Tabla 4.02. Estructura de la comunidad en la división general de la Bahía
de Jobos ......................................................................................................34
Tabla 4.03. Análisis de comunidad en los cinco sectores colectados ...........................34
Tabla 4.04. Descargas totales de contaminantes evaluados en el estudio de
Zitello et al. (2008) y los resultados del TRFLP en las
diferentes áreas de la Bahía de Jobos .........................................................38
Tabla 4.05. Datos fisicoquímicos del fondo de la columna de agua de las
estaciones estudiadas .................................................................................43
viii
Lista de Figuras
página
Figura 2.01. Representación de la Subcuenca 1 Costa Salinas ........................................8
Figura 2.02. Representación de la Subcuenca 2 Alto Salinas ..........................................9
Figura 2.03. Representación de la Subcuenca 3 Central Aguirre ...................................11
Figura 2.04. Representación de la Subcuenca 4 Quebrada Coquí..................................12
Figura 2.05. Representación de la Subcuenca 5 Quebrada Amoró ................................13
Figura 2.06. Representación de la Subcuenca 6 Bahía Norte ........................................14
Figura 2.07. Representación de la Subcuenca 7 Río Seco .............................................15
Figura 2.08. Representación de la Subcuenca 8 Barrio Jobos........................................16
Figura 2.09. Representación de la Subcuenca 9 Punta Pozuelo .....................................17
Figura 3.01. Mapa de la Reserva de Investigación Estuarina de Bahía de Jobos ..........24
Figura 3.02. Mapa de las estaciones estudiadas en la Bahía de Jobos ...........................26
Figura 4.01. Perfil de 16S ADNr para sedimentos en la Bahía de Jobos .......................32
Figura 4.02. Mapa de la división general de la Bahía de Jobos .....................................33
Figura 4.03. Perfil de TRFLP que exhibe la similitud de los filotipos entre
muestras del interior y exterior de la Bahía de Jobos ................................35
Figura 4.04. Perfil de TRFLP que exhibe la similitud de los filotipos entre
muestras del centro de la Bahía de Jobos...................................................36
Figura 4.05. Mapa de las nueve subcuencas en la Bahía de Jobos .................................37
Figura 4.06. Gráficas A-C representan la suma de las descargas totales de
contaminantes en JBNERR evaluados en el estudio de Zitello et al.
(2008), mientras que D representa el promedio de filotipos. .....................40
Figura 4.07. Representación de los resultados del Índice de similitud de
Sørensen .....................................................................................................41
Figura 4.08. Representación de los resultados del Análisis de Varianza Múltiple ........42
ix
Lista de Apéndices
página
Apéndice Uno. Protocolo alternativo para extracción de ADN genómico ...................59
Apéndice Dos. Protocolo para la reacción en cadena de la polimerasa ........................61
Apéndice Tres. Protocolo para precipitación de productos de digestión ......................62
x
Abstract
Ladys D Contreras Medina. (Master of Science, Environmental Science)
Diversity and distribution of bacteria in sediment at the Jobos Bay National Estuarine
Research Reserve, Puerto Rico. (April/2011)
Abstract of Master’s Thesis at Universidad del Turabo.
MS thesis supervised by Dr José R Pérez-Jiménez.
No. of the pages in the text: 63
The Jobos Bay National Estuarine Research Reserve has suffered anthropogenic
and natural disturbances that affect environmental quality compromising its
sustainability. Microorganisms control many of the processes essential to the
maintenance and operation of estuaries. Our objectives are to characterize the diversity
structure of bacterial communities in sediments; and the influence of pollutants in
distribution patterns. Genomic DNA was extracted from marine sediment samples
collected at Jobos Bay estuary (44 sites). The 16S rDNA gene was amplified by a
polymerase chain reaction (primers 1525R-27F) for terminal restriction fragment length
polymorphism (TRFLP) of Mnll digests for community analysis. The overall bacterial
community consisted of 1936 phylotypes; representing 217 different TRF’s. Averages of
phylotypes were distributed among five sites, ranged from 29.0 at Center Bay to 49.9 at
Inner Bay. The Sørensen similarity index, ranged for 26% to 79%, suggests a
distributional pattern congruent to the established nine subwatershed. Statistical analyses
confirm the observed clusters among the sites. In conclusion the bacterial community at
xi
Jobos Bay showed a pattern of distribution of microbial genetic diversity and found that
there is a direct relation with the contaminants evaluated.
xii
Resumen
Ladys D Contreras Medina. (Maestría en Ciencias Ambientales)
Diversidad Genética Bacteriana en los Sedimentos de la Reserva de Investigación
Estuarina de la Bahía de Jobos. (April/2011)
Resumen de una Tesis de Maestría de la Universidad del Turabo.
Tesis supervisada por el Dr José R Pérez-Jiménez.
Núm. de páginas en el texto: 63
La Reserva de Investigación Estuarina de la Bahía de Jobos ha sido infligida por
disturbios naturales y antropogénicos que han afectado la calidad del ecosistema. Los
microorganismos controlan muchos de los procesos esenciales para el mantenimiento y
supervivencia de los estuarios. Los objetivos son caracterizar comunidades de bacterias
encontradas en los sedimentos, y precisar patrones de distribución microbiológicos en
relación a contaminantes. El ADN genómico fue extraído de 44 muestras de sedimentos
marinos colectados del estuario de la Bahía de Jobos. El gen 16S ADNr fue amplificado
por Polymerase Chain Reaction (PCR) por los cebadores 1525R-27F para Terminal
Restriction Fragment Length Polymorphism (TRFLP) digerido por la enzima MnIl para
un análisis de comunidad. En general, la comunidad bacteriana consistió de 1936
filotipos, representados por 217 TRF’s diferentes. Los promedios de los filotipos fueron
distribuidos entre cinco lugares, que oscilaban desde 29.0 en el centro de la Bahía hasta
49.0 en el interior de la Bahía. El índice de similitud de Sørensen tiene un rango de 26%
a 79% que sugiere un patrón de distribución de acuerdo al establecido en las nueves
subcuencas. El análisis estadístico confirmó una agrupación de filotipos entre los
xiii
lugares. En conclusión, la comunidad bacteriana de Bahía de Jobos mostró un patrón en
la distribución de la diversidad genética microbiana y se determinó que existe una
relación directa con los contaminantes evaluados.
1
Capítulo Uno
Introducción
Justificación
Los ecosistemas con sus componentes de factores bióticos y abióticos
interaccionan en un entorno, donde el recurso agua tiene uno de los papeles más
importantes para la mayoría de los procesos funcionales. El mal uso, manejo y
explotación de este recurso han llevado a los procesos funcionales a un gran declive,
donde el panorama es uno de contaminación insostenible (Chiroles y González 2007). La
utilización de los cuerpos de agua como sumideros de desechos agrícolas, urbanos e
industriales con contaminantes peligrosos han provocado daños significativos a los
recursos naturales.
Históricamente, el ecosistema de la Reserva Estuarina de la Bahía de Jobos ha
sido afectado por disturbios naturales y antropogénicos que han podido afectar la calidad
del ecosistema. Esta alberga un ecosistema muy dinámico compuesto por diversos
manglares donde se exhibe un complejo de interacciones entre elementos bióticos y
abióticos. Sin embargo, por siglos el desarrollo urbano y la contaminación antropogénica
han afectado la evolución del Estuario, exhibiendo así áreas degradadas en la Reserva.
Por ejemplo, compuestos tóxicos pueden acumularse en los sedimentos, ocasionando
serios impactos en la ecología de la Reserva (Laboy-Nieves 2009). Los estuarios son
sistemas con características fisicoquímicas únicas debido a los fuertes gradientes de
salinidad, pH, oxígeno disuelto, potencial redox, características químicas de los
sedimentos y biodiversidad. Estos sistemas pueden ser considerados como receptores de
2
sedimentos que actúan como trampa para los materiales que llegan al medio marino. Los
sedimentos sirven como filtros entre la tierra y el mar para muchos contaminantes,
además que pueden actuar como una fuente de contaminantes para la biota marina
(Chapman y Wang 2001). Los contaminantes en los sedimentos pueden afectar
grandemente la calidad del ecosistema y las interacciones de los microorganismos.
En la naturaleza los microorganismos viven en comunidades. Estas comunidades
desempeñan un papel importante en la biosfera, principalmente reciclando elementos
biológicos importantes. Todos los ciclos bioquímicos esenciales como los de carbono,
hidrógeno, nitrógeno, oxígeno y azufre están mediados por comunidades de
microorganismos. El conocer la función de los microorganismos en su ambiente natural
facilitará distinguir áreas contaminadas o alteradas. Es sumamente importante entender
el papel de estos microorganismos en el ecosistema. Los microorganismos controlan
muchos de los procesos esenciales para el mantenimiento y supervivencia de los
estuarios. Las comunidades microbianas están vinculadas a su entorno, y en muchos
casos, las alteraciones ecológicas reflejan cambios en la abundancia y comportamiento de
estos microorganismos, antes de la detección de alguna señal externa en el ambiente
(Harwood y Buckley 2007).
La historia demuestra que a través del tiempo ha existido contaminación de las
aguas en los sistemas de almacenamiento, así como en las aguas subterráneas y
superficiales, generando un serio daño ambiental. Durante estas últimas décadas la
contaminación orgánica en los cuerpos de agua se ha convertido en un problema mundial.
Contaminantes químicos terminan en los sedimentos, y no permiten la biodisponibilidad
3
para transformaciones y procesos anaeróbicos importantes para la remediación (Eggleton
y Thomas 2004).
En este estudio se analizó la distribución de la diversidad genética microbiana y se
determinó si existe una relación directa con una serie de contaminantes evaluados a
través de la Reserva de Bahía de Jobos. Las comunidades bacterianas puedan estar
alteradas por la práctica errónea de actividades industriales, domésticas y agrícolas
aledañas a la Reserva. La misma está rodeada por diversas industrias donde cada una de
ellas han podido comprometer la calidad de los recursos naturales de la Reserva (Laboy-
Nieves 2009). Además de la complejidad de los disturbios mencionados anteriormente,
hay comunidades desarrolladas cerca del área de la Reserva. Estas comunidades
descargan incorrectamente aguas residuales no tratadas al área. Compuestos orgánicos se
han detectados en muestras de agua de la Bahía de Jobos (Dumas et al. 2003; Rodríguez
2006). Estos compuestos pueden acumularse en el sedimento de la Bahía y ser dañinos a
los mangles. Seguinot (2001) analizó concentraciones de metales pesados en sedimentos
de la Reserva y encontró que en ocasiones presentaban concentraciones que violaban el
estándar de la Junta de Calidad Ambiental. El estudio de Alers (2000) muestra
concentraciones de metales que sobrepasan los niveles de la EPA en tejidos de bivalvos.
En este estudio se buscó analizar la prevalencia de comunidades bacterianas como
muestra de alguna perturbación ambiental de manera que podría llegar a afectar el
entorno de la Reserva de Bahía de Jobos. En el mismo se aplicó la técnica de análisis de
comunidades (Terminal Restriction Fragment Lenght Polimorphism) para documentar la
diversidad microbiana en los sedimentos representados por diversos grupos taxonómicos.
4
Meta y Objetivos
La meta del estudio es relacionar la diversidad bacteriana con áreas de posible
impacto ambiental en los sedimentos de Bahía de Jobos. En otras palabras, se pretende
evaluar las comunidades microbianas comparando descargas totales de contaminantes.
El estudio se realizó en la Reserva de Investigación Estuarina de Bahía de Jobos en la
cual se dividió la Bahía en tres áreas principales interior, centro y exterior, las cuales se
compararon con descargas totales de unos contaminantes modelados en el estudio de
Zitello et al. (2008). Estos contaminantes provienen de las escorrentías que produce la
cuenca de Bahía de Jobos. La región se subdividió en nueve subcuencas hidrográficas y
se estableció la contribución de cada una al interior, centro y exterior de la Bahía de
Jobos. Los objetivos de estudio son:
Caracterizar comunidades de bacterias encontradas en los sedimentos, así como
las áreas de distribución, diversidad y abundancia.
Precisar patrones de distribución microbiológicos en relación a descargas de
contaminantes.
Comparar la distribución microbiológica con los factores fisicoquímicos.
Hipótesis:
Ha: La distribución de la diversidad microbiana en los sedimentos de la Bahía de
Jobos está relacionada con la descarga de contaminantes provenientes de la cuenca de
Bahía de Jobos.
Ho: La distribución de la diversidad microbiana en los sedimentos de la Bahía de
Jobos no está relacionada con la descarga de contaminantes provenientes de la cuenca de
Bahía de Jobos.
5
Capitulo Dos
Revisión de Literatura
La naturaleza de los cuerpos de agua es derivada por los gradientes fisicoquímicos
y la estructura biológica ligadas a impactos antropogénicos. Durante estas últimas
décadas, la contaminación en los cuerpos de agua se ha convertido en un problema
mundial. La falta de control en el uso de los terrenos y la contaminación de los abastos
de agua superficiales y subterráneos en Puerto Rico ha incrementado con el aumento en
el desarrollo de áreas urbanas, la deforestación, la proliferación de actividad industrial y
el crecimiento poblacional (Qu et al. 2008; Marίn-Guirao et al. 2005). Muchas de las
fuentes de contaminación descargan sus desperdicios directamente al cauce de ríos, aguas
costeras y otros cuerpos de agua a través de tuberías o canales, y representan fuentes
directas de contaminación. En adición, fuentes dispersas contaminan las aguas con
efectos adversos en el ambiente y son más difíciles de controlar y reglamentar. Una de
las mayores fuentes de estrés es la entrada excesiva de macronutrientes que resulta en un
cambio del estado trófico del cuerpo de agua (Rajendran et al. 1993; Marίn-Guirao et al.
2005; Grant et al. 2001). El aporte de macronutrientes al sistema incluye compuestos
orgánicos, xenobióticos e inorgánicos que pueden ser transferidos por actividad
microbiana como parte de ciclos biogeoquímicos o actividad detoxificadora. Los efectos
en los procesos microbiológicos son la clave para diversos aspectos del funcionamiento
del ecosistema. La microbiota ocupará sustratos según puedan sostener su estilo de vida.
La microbiota en suelos superficiales, costeros y bénticos está sujeta a condiciones
fisicoquímicas limitantes, como la disponibilidad de oxígeno y aceptadores finales de
6
electrones. En los sedimentos la estructura del ecosistema se verá influenciada por la
composición química, la profundidad, la disponibilidad de agua y la concentración de
materia orgánica. La biomasa microbiana, parte de la materia orgánica, confrontará los
impactos de nutrientes para sostener la cadena trófica y el funcionamiento de los
ecosistemas, incluyendo los estuarios (Marίn-Guirao et al. 2005; Sabrinho-da Silva et al.
2008; Wobus et al. 2003).
La microbiota en estuarios se han documentado por medios de cultivos. Se han
aislado bacterias de sedimentos de estuarios como bacterias reductoras de óxido de
hierro, bacterias que oxidan amonio, bacterias nitrificantes, entre otros (Bai et al. 2010;
Caccavo et al. 1992). Además, mediante técnicas moleculares con genes específicos, se
han observado diferentes bacterias. Por ejemplo: bacterias reductoras de sulfato (gen
dsrAB), bacterias que reducen mercurio (gen merA), bacterias metanogénicas (gen mcrA)
y bacterias reductoras de nitrato (gen nirS) (Pérez-Jiménez y Kerkhof 2005; Barkay et al.
2003; Dhillon et al. 2005; Dong et al. 2009). La identificación de este tipo de bacterias
es importante porque puede ser una señal de perturbación en el ambiente y por ende
puede afectar la calidad del ecosistema.
La calidad del ecosistema está sujeta a múltiples variables difícil de estimar con
precisión. La valoración integrada de varios parámetros nos conduce a modelajes para
describir servicios integrados del ecosistema. El modelaje de descargas de nutrientes
selectos aportó a describir las cuencas hidrográficas en la Bahía de Jobos (Zitello et al.
2008). En ese estudio, se examina la Bahía de Jobos para cuantificar los efectos
ambientales. Establece un análisis de la cuenca de Bahía de Jobos donde se exhiben las
áreas que proveen mayor estrés para el ecosistema. La cuenca de Bahía de Jobos fue
7
analizada mediante un modelaje explícito-espacial llamado N-SPECT (por las siglas en
inglés de Nonpoint Source Pollution and Erosion Comparison Tool). N-SPECT es una
aplicación desarrollada por la Administración Nacional Oceánica y Atmosférica (NOAA
por sus siglas en inglés) que caracteriza datos espaciales como: uso de terreno,
topografía, precipitaciones y características del suelo. Luego de la caracterización
realizan un modelaje donde establecen los límites de las cuencas hidrográficas, las
estimaciones de las escorrentías, la descarga de sedimentos y contaminantes, y las
diferentes fuentes no puntuales a través del lugar. Para este estudio la cuenca se dividió
en nueve subcuencas donde se evaluó la descarga de contaminantes de cada una hacia la
Bahía de Jobos. Los contaminantes evaluados fueron las descargas totales de nitrógeno,
fósforo y sólidos suspendidos. Cada subcuenca posee un sistema único de drenaje,
vegetación y condiciones de uso del terreno que influyen en el funcionamiento de la
Bahía de Jobos. Las subcuencas 1 y 2 pertenecen al área establecida como exterior de la
Bahía de Jobos. La subcuenca 1, Costa Salinas (Figura 2.01), está representada por una
estrecha franja de tierra costera que se encuentra al este de la salida del Río Nigua y al
oeste del complejo de humedales de Mar Negro.
En Costa Salinas dominan dos tipos de terreno: humedales y de alto desarrollo
urbano. Los humedales proveen filtración natural al terreno y aguas superficiales que
pueden surgir de operaciones agrícolas adyacentes a la subcuenca. Punta Arenas es una
comunidad residencial situada alrededor de los humedales en esta subcuenca y utiliza
sistemas individuales de eliminación de aguas tratadas. En adición, por el alto número de
residentes posee la segunda carretera de mayor densidad de todas las subcuencas.
8
Figura 2.01. Representación de la Subcuenca 1 Costa Salinas
(Zitello et al. 2008).
Costa Salinas contribuye el 1% de la carga total de los contaminantes evaluados.
Los contaminantes en esta subcuenca son mínimos en comparación con otras subcuencas
del área estudiada. No obstante, una gran porción de los contaminantes en esta
subcuenca son descargados directamente al estuario debido a la falta de vegetación entre
el desarrollo residencial y la Bahía de Jobos. Sin embargo, Zitello et al. (2008) señalan
que los impactos de los sistemas individuales de eliminación de aguas residuales no se
9
comprenden bien para esta comunidad en Puerto Rico y puede tener un efecto más nocivo
del previsto en el análisis.
La subcuenca 2, Altos Salinas (Figura 2.02), define su norte y límites occidentales
por la zona de drenaje del Río Niguas. Posee una serie de canales de riego que terminan
en un único punto de descarga en el oeste de la Bahía de Jobos.
Figura 2.02. Representación de la Subcuenca 2 Altos
Salinas (Zitello et al. 2008).
Esta subcuenca contiene la mayor cantidad de terreno alterado
antropogénicamente. Tierras cultivadas y desarrollo urbano abarcan un 56% de toda la
subcuenca mientras que el otro 33% son áreas reforestadas. Se compone de dos grandes
10
comunidades, Salinas y Coco, que tienen la carretera de mayor tránsito en todas las
subcuencas de Bahía de Jobos. Posee, en el centro de la subcuenca, la pista de carreras de
Salinas que está clasificada como de alto desarrollo urbano y podría ser una fuente
potencial de contaminantes como hidrocarburos aromáticos. Zitello et al. (2008) señala
que Altos Salinas provee la mayor descarga de contaminantes a la Bahía de Jobos con un
promedio de 37%.
La subcuenca 3 (Figura 2.03), Central Aguirre, pertenece al área de estudio del
centro de la Bahía de Jobos. El norte de la subcuenca converge con los Expresos 52 y 53.
La mayoría de su costa está formada por el complejo de humedales del Mar Negro y se
extiende hasta la costa de la Central Aguirre y su puerto de embarque. En esta subcuenca
existen diversos tipos de uso de terrenos que incluyen agricultura, industria, desarrollo
residencial, bosques naturales y humedales. Tiene el segundo terreno de mayor cultivo
en toda la cuenca de Bahía de Jobos. Se encuentra parte del vertedero municipal y un
depósito de dragado a 1.5 km de la costa, pero no existe información sobre filtraciones o
cómo los contaminantes interactúan con las escorrentías y las aguas subterráneas. Zitello
et al. (2008) establece que la carga total de contaminantes representa un 10% en la Bahía
de Jobos.
11
Figura 2.03. Representación de la Subcuenca 3 Central
Aguirre (Zitello et al. 2008).
El interior de la Bahía está compuesto por las subcuencas 4, 5, 6, 7, 8 y 9. La
subcuenca 4 (Figura 2.04), Quebrada Coquí, está dividida por el Expreso 53 y se
caracteriza por la presencia de dos quebradas perennes. La quebrada primaria es
Quebrada Coquí y la secundaria es Aguas Verdes en el este de la subcuenca, que
finalmente se une a Quebrada Coquí para descargar en la Bahía de Jobos. Esta subcuenca
está dominada por el crecimiento de pastizales y matorrales. Tiene una pequeña área
residencial, Coquí, que posee un sistema de alcantarillado municipal. En adición posee
una granja avícola que produce 1.8 millones de pollos por año. Esta subcuenca
12
contribuye un 15% a la descarga total de los contaminantes evaluados en el estudio de
Zitello et al. (2008).
Figura 2.04. Representación de la Subcuenca 4
Quebrada Coquí (Zitello et al. 2008).
La subcuenca 5 (Figura 2.05), Quebrada Amoró tiene la composición más
homogénea de terrenos a través de la cuenca de Bahía de Jobos. Además, el área muestra
el menor desarrollo residencial. Las cargas de contaminantes no son substanciales en
comparación con otras subcuencas, lo esperado debido a la reducida actividad
antropogénica en el terreno.
13
Figura 2.05. Representación de la Subcuenca 5
Quebrada Amoró (Zitello et al. 2008).
La subcuenca 6 (Figura 2.06), Bahía Norte, tiene redes de forma intermitente que
forman humedales inundados que se extienden por todo el centro de la cuenca. Estas
formaciones son el resultado de la escasa vegetación en el lugar. Por la falta de una
corriente principal, las escorrentías tienen varios puntos de descarga a través de la Bahía
de Jobos. Posee una variedad de tipos de terrenos como pastizales, matorrales y
humedales. La Bahía Norte contribuye el 1% de las descargas totales de contaminantes
(Zitello et al. 2008).
14
Figura 2.06. Representación de la Subcuenca 6 Bahía
Norte (Zitello et al. 2008).
La subcuenca 7 (Figura 2.07), Río Seco, posee un terreno único en comparación
con las otras subcuencas estudiadas. Tiene una red de drenaje hacia el Río Seco y sus
tributarios. La subcuenca está dividida por el Expreso 53, en dos zonas caracterizadas
por diferente topografía, ecología y terreno. La porción norte constituye el 85% de la
subcuenca y es localizada en las montañas de La Sierra de Cayey. La subcuenca tiene la
mayor área prístina de toda la cuenca de Bahía de Jobos y solo un 2% es de terrenos
15
desarrollados. Esta subcuenca contribuye un promedio de 12% de las descargas totales
(Zitello et al. 2008).
Figura 2.07. Representación de la Subcuenca 7 Río Seco
(Zitello et al. 2008).
La subcuenca 8 (Figura 2.08), Barrio Jobos, tiene el este formado por un drenaje
que divide la cuenca de Bahía de Jobos y el área de captación del Río Guamaní. Mientras
que el Río Seco define el área oeste. En sus terrenos posee una parte del Expreso 53
ubicado en la parte baja de la Sierra de Cayey. Tiene arroyos intermitentes que cuando se
inundan llevan las aguas superficiales a canales de drenajes artificiales que finalmente
16
descargan en la Bahía de Jobos. Un 80% del terreno está cubierto por vegetación,
mientras que un 15% son terrenos desarrollados para residencias e industrias. Se
encuentran dos comunidades residenciales, el Barrio Jobos y Puerto Jobos.
Figura 2.08. Representación de la Subcuenca 8
Barrio Jobos (Zitello et al. 2008).
Dentro del Barrio Jobos se encuentran industrias farmacéuticas y plantas
químicas. También existen las instalaciones inoperantes de la refinería de petróleo, una
planta de electricidad generada por carbón y un vertedero municipal. La planta de
energía procesa toneladas de cenizas como desperdicios. El vertedero está adyacente a
uno de los lagos que desemboca en la Bahía de Jobos. La subcuenca de Barrio Jobos fue
17
el mayor contribuidor de descargas totales a la Bahía de Jobos con un promedio de 18%
(Zitello et al. 2008).
La subcuenca 9 (Figura 2.09), Punta Pozuelo, forma una península que separa las
aguas del interior de la Bahía de Jobos del Mar Caribe.
Figura 2.09. Representación de la Subcuenca 9
Punta Pozuelo (Zitello et al. 2008).
Está caracterizada con áreas de vegetación natural y poco desarrollo residencial.
El terreno dominante es de manglares y charcas de aguas salinas. La mayoría del área de
18
drenaje es cubierta por vegetación natural, lo que resulta en menos de 1% de descargas
totales de contaminantes a la Bahía de Jobos.
El estudio revela que tres subcuencas de la Bahía de Jobos en la que se incluyen
Río Seco, Quebrada Coquí y Altos de Salinas son responsable del 85% de las posibles
descargas totales de fósforo y nitrógeno (Zitello et al. 2008). Las cuencas que se definen
en la región aportan nutrientes al estuario que pueden acumularse en los sedimentos y/o
llegar al ambiente marino.
Los estuarios son sistemas receptores de sedimentos y actúan como trampa para
materiales que llegan al medio marino (Marίn-Guirao et al. 2005). El estuario provee una
zona de amortiguación entre los ecosistemas acuáticos y terrestres en áreas urbanas e
industriales (Rajendran et al. 1993). Estos sedimentos sirven como filtro entre la tierra y
el mar para muchos contaminantes provenientes de escorrentías, patógenos y nutrientes
(Marίn-Guirao et al. 2005; Grant et al. 2001). Muchos contaminantes pueden ser
estabilizados e inmovilizados en los sedimentos. Comunidades microbianas en
sedimentos de estuarios pueden descomponer materia orgánica, transformar
contaminantes y afectar la disponibilidad de metales pesados (Benoit et al. 2003; Harris
1999). Los sedimentos de los estuarios están constituidos por altas concentraciones de
biomasa microbiana (Wobus et al. 2003). Procesos microbiológicos en los sedimentos
tienen mayor influencia en el balance de nutrientes en los cuerpos de agua (Gätcher y
Meyer 1993). Estos nutrientes pueden alterar ecológicamente el hábitat y reflejar
cambios en abundancia y comportamiento en los microorganismos (Harwood y Buckley
2007). Estudios señalan que en los sedimentos estuarinos se puede determinar
distribución y composición de comunidades microbianas o los efectos de los gradientes
19
de contaminantes en los microorganismos (Pérez-Jiménez y Kerkhof 2005; Polymenakou
et al. 2005; Findlay y Watling 1997; Qu et al. 2008; Batten y Scow 2003; Cordova-
Kreylos 2006).
En la naturaleza los microorganismos establecen comunidades heterogéneas.
Estas comunidades desempeñan un papel importante en la biosfera, principalmente
reciclando elementos biológicos importantes. Todos los ciclos biogeoquímicos
esenciales están mediados por comunidades especializadas de microorganismos tales
como: fermentadores, quimiosintéticos, nitrificadores, metanogénicos, solubilizadores de
fosfáto, sulfato reductores, entre otros (Holguin et al. 2001; Dat et al. 2006; Harwood y
Buckley 2007). La estabilidad de las comunidades microbianas, que es la habilidad para
mantener la composición y el buen funcionamiento de los procesos, depende de la
variabilidad del ambiente, la diversidad genética de la comunidad y la interacción entre
los miembros de la misma. Alguna variación en el ambiente puede tener una profunda
influencia en la expresión de genes, composición de especies y la abundancia de los
miembros entre comunidades microbianas. Una diversidad genética amplia de
comunidades puede ser crítica para la superación de una perturbación ambiental y otras
variaciones ambientales (Harwood y Buckley 2007). Los microorganismos controlan
muchos de los procesos esenciales para el mantenimiento y supervivencia de los
estuarios. La diversidad metabólica de los microorganismos marinos asume distintas
funciones que otros microorganismos no pueden llevar a cabo. Esta diversidad genética
representa un reto al estudio de los microorganismos en todo sistema. La condición de
cultivo varia grandemente y la mayoría no ha podido ser cultivado (Hunter-Cevera et al.
2005).
20
El método de cultivo de microorganismos tiene sus limitaciones ya que no son
adecuados para determinar la estructura de la comunidad microbiana y su dinámica a
través del tiempo. Generalmente se dificulta replicar las condiciones adecuadas del
microorganismo en su ambiente. La presencia de contaminantes y concentraciones
incorrectas de nutrientes fallan en recrear interacciones microbio-microbio y microbio-
hospedero. El crecimiento del microorganismo puede cambiar las condiciones químicas
del medio inhibiendo su crecimiento. También existen barreras ecológicas y genéticas
para cultivar. Por ejemplo, la dependencia de un microorganismo, ya sea simbiótica o
mutualista, no pueden ser representados de forma real en el laboratorio. El crecimiento
microbiano depende de la densidad celular, en otras palabras es crucial la colección de
suficientes microorganismos para el estudio. Por otra parte el error humano puede incluir
fallas en el tiempo de crecimiento del cultivo y una falta de creatividad en las condiciones
del cultivo. A pesar de estos inconvenientes, los cultivos de microorganismos han
aportado grandes descubrimientos en microbiología. Estos formaron la base histórica de
la microbiología, y hoy en día el estudio de los microbios en el laboratorio sigue siendo
fundamental para hacer muchos descubrimientos importantes. Los microbiólogos
estiman que alrededor de un 90% de bacterias no se han podido cultivar aún. Estos
microorganismos no cultivados podrían ser la clave para mantener la sostenibilidad de
actividades humanas (Harwood y Buckley 2007). En comparación con los cultivos, las
técnicas moleculares suponen una forma rápida y efectiva de generar un análisis de
estructura de las comunidades bacterianas más informativo.
Los métodos utilizados para estudiar microorganismos han progresado de la
estrategia de cultivo hacia la aplicación de técnicas moleculares. Las técnicas
21
moleculares basadas en el análisis de genes en el ambiente proveen información
filogenética o funcional. Filogenéticamente hay genes informativos como el 16S del
ácido desoxirribonucleico ribosomal (ADNr) que se utiliza para examinar diversidad con
inferencias taxonómicas. Los gremios microbianos pueden ser descritos a base de genes
funcionales que codifican funciones específicas como fijación de nitrógeno y
denitrificación, entre otras (Janssen 2006; Harwood y Buckley 2007). El desarrollo de
técnicas moleculares ha producido cambios en el conocimiento científico sobre los
microorganismos. Algunas de las contribuciones de las técnicas moleculares son el
cambiar la percepción de la cantidad de la diversidad genética microbiana. Además, de la
utilización de metagenómica de microorganismos no cultivados para producción
biotecnológica de productos como enzimas y antibióticos e identificación de
microorganismos importantes para procesos químicos (Harwood y Buckley 2007).
El desarrollo de las técnicas moleculares para el estudio de microorganismos
inicia en los 1930 con el hallazgo de los ribosomas en microscopía de campo oscuro por
Albert Claude. En el 1950, George Palade observó las células en microscopía
electrónica, y en el 1955, Paul Zamecnik demuestra que la síntesis de proteínas ocurre en
el ribosoma. Más adelante se conoce que el ribosoma procariota tiene un coeficiente de
sedimentación de 70S (Svedverg); y que se compone de dos subunidades pequeñas
desiguales en tamaño (50S y 30S). La subunidad grande (50S) consiste de una molécula
de ácido ribonucleico ribosomal (ARNr) 5S y otra de ARNr 23S, con 31 proteínas
diferentes, mientras que la subunidad pequeña (30S) consiste de una molécula de ARNr
16S y 21 proteínas diferentes. La importancia del ribosoma estriba en que las secuencias
de la molécula del ARNr se han conservado a través de la evolución, y las secuencias de
22
los genes que la codifican ya están identificados. La selección del ARNr tiende a ser del
16S ARNr, debido a su universalidad y su alta conservación en estructura y función.
Esto va a permitir que Carl Woese, en 1977, haga una comparación de secuencias
genéticas del 16S ARNr y facilite la caracterización futura de bacterias, incluyendo
microorganismos no cultivados aún y la elucidación de sus relaciones naturales. De esta
manera se pueden determinar relaciones filogenéticas entre entidades que presentan poca
homología entre su ADN. El análisis del 16S ARNr es el más adecuado para procariotas
porque contiene aproximadamente 1550 pares de bases permitiendo un análisis de
secuencia más completo y menos alterado en comparación con el 5S ARNr (Rosario y
Mendoza 2004).
Mediante el análisis molecular 16S ARNr se determina la diversidad bacteriana en
muestras ambientales. El análisis incluye reacción en cadena de la polimerasa (PCR por
las siglas en inglés de Polymerase Chain Reaction), digestión enzimática y un análisis de
las comunidades microbianas (TRFLP por las siglas en inglés de Terminal Restriction
Fragment Lenght Polymorphism). El PCR permite amplificar invitro porciones genéticas
en el transcurrir de pocas horas. El producto que se obtiene al finalizar la reacción es una
gran cantidad del fragmento genético con alto grado de pureza. El método se basa en tres
reacciones sucesivas llevadas a cabo a distintas temperaturas. Estas reacciones se repiten
cíclicamente. En el primer paso, ocurre la desnaturalización (~94 ºC) donde la doble
hebra de ADN se separa. En el segundo paso, la temperatura se reduce para permitir el
acoplamiento de los dos oligonucleótidos iniciadores con su hebra complementaria del
ADN molde. En tercer lugar, la enzima polimerasa de ADN extiende los iniciadores
sintetizando las secuencias complementarias de las hebras del ADN molde. Para ello la
23
polimerasa usa deoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs) agregados a la mezcla de
reacción. Al cabo del primer ciclo de tres reacciones (desnaturalización, acoplamiento y
extensión) el fragmento de ADN elegido se ha duplicado y el doble de su cantidad
original se encuentra disponible para ser nuevamente amplificado en un segundo ciclo
(Collins y Rocab 2007; Wawrik et al. 2005).
La técnica de TRFLP provee una base para el análisis comparativo entre
comunidades para entender su estructura y función. Mediante esta técnica se describen
comunidades y sus integrantes únicos o numéricamente dominantes bajo condiciones
definidas o controladas. El TRFLP utiliza fragmentos marcados con fluorescencia que
también han sido amplificados por medio de PCR. Utiliza las tecnologías de secuencias
automatizadas para separar los fragmentos terminales polimórficos después de la
digestión de la restricción donde se detectan las bandas fluorescentes, es decir el
fragmento terminal de la digestión con enzimas de restricción. Los fragmentos
resultantes son separados por electroforesis capilar acoplados a moléculas de peso
molecular correspondiente para determinar el largo de los fragmentos marcados
fluorescentes. Cada fragmento terminal de restricción es considerado un filotipo. De
esta manera, la selección de la enzima de restricción influenciará el número de filotipos
observados en cada muestra y en el cálculo de la diversidad estadística (Pérez-Jiménez y
Kerkhof 2005; Collins y Rocab 2007). El TRFLP es una herramienta útil para determinar
la diversidad de comunidades bacterianas complejas y para la comparación rápida de la
estructura de la comunidad y la diversidad de diferentes ecosistemas (Liut et al. 1997).
24
Capítulo Tres
Metodología
Lugar de estudio
La Reserva Nacional de Investigación Estuarina de Bahía de Jobos (JBNERR, por
sus siglas en inglés) fue establecida en septiembre de 1981 mediante acuerdo
colaborativo de la Administración Nacional Oceánica y Atmosférica (NOAA, por sus
siglas en inglés) y el Departamento de Recursos Naturales y Ambientales. El estuario de
la Reserva de Bahía de Jobos es uno de los pocos puertos naturales en la costa meridional
y el segundo de mayor tamaño en Puerto Rico.
Figura 3.01. Mapa de la Reserva de Investigación Estuarina de Bahía de Jobos
(Zitello et al. 2008).
25
La Reserva se encuentra en la costa sur-centro al este de Ponce, entre los
municipios de Guayama y Salinas. Cubre un área de 11 km2 (2,800 acres) y está
compuesta por Mar Negro (un complejo de mangles y humedales), Cayos La Barca (una
formación de 7 islas de mangle y arrecifes) y Cayos Caribe (una formación lineal de 15
islas de mangle y arrecifes) (Figura 3.01). Las condiciones climáticas, hidrológicas y
edáficas son los elementos claves para la gran variedad de flora en la bahía. Esto
proporciona hábitat y alimentación para muchas especies. La interacción entre los
bosques y las comunidades sumergidas promueven una ecología vulnerable y compleja
en un área muy pequeña (Laboy et al. 2009).
Colección de Muestras
La Bahía de Jobos fue dividida operacionalmente en cuatro zonas según Zitello et
al. (2008): interior, centro, exterior y los límites de la Reserva. Dentro de cada zona se
tomaron 10 muestras aleatorias de sedimento, 14 dentro de los límites de la Reserva y 30
dentro de la Bahía de Jobos, para un total de cuarenta y cuatro muestras de sedimentos
recogidas aleatoriamente por NOAA-NCCOS (equipo del Dr David Whitall), incluyendo
los lugares de monitoreo de la Reserva (Figura 3.02).
Las muestras de sedimentos fueron colocadas en envases estériles y transportadas
en neveras portátiles para luego ser almacenadas en congelador a -20 ºC. Estas muestras
fueron obtenidas durante el año 2008.
26
Figura 3.02. Mapa de las estaciones estudiadas en la Bahía de Jobos (Fotografía
tomada de Zitello et al. 2008).
Extracción de ADN Genómico
ADN genómico fue extraído y purificado del sedimento (~200 mg) para cada
muestra colectada utilizando el “UltraClean Soil DNA Isolation Kit” (MoBio
Laboratorios, Solana Beach, CA). Se procedió con el protocolo indicado por el
manufacturero para la extracción de ADN (Apéndice 1.01). La intensidad y la calidad
del ADN extraído se visualizó mediante electroforesis en agarosa 1% en TE (10 ml Tris
111 mM, 20 ml EDTA 111 mM, pH 8.0) teñida con bromuro de etidio.
Amplificación de 16S ADNr
El gen para el 16S ARNr fue utilizado como marcador molecular para describir la
comunidad bacteriana. Los segmentos específicos de 16S ADNr se amplificaron en el
ADN genómico por reacción de polimerasa en cadena (PCR, por sus siglas en inglés).
Se realizó un estimado de la concentración de ADN mediante electroforesis en agarosa
1%. Los oligonucleótidos iniciadores utilizados fueron 27F 5'-
27
AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' y 1525R, 5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3'. La
amplificación fue realizada con la enzima “Red Taq DNA Polymerase” (Sigma Aldrich,
St. Louis, MO). Cada reacción de amplificación contenía ~25 ng de ADN genómico y 20
pmol de cada iniciador. Las condiciones para la amplificación fueron un ciclo de 94 ºC
por 5 minutos, seguidos por 30 ciclos de 94 ºC por 30 segundos, seguidos por el
acoplamiento 52 ºC a 30 segundos y 72 ºC a 90 segundos, con una extensión del paso
final de 72 ºC por 10 min. La intensidad y calidad del amplicón generado se verificó por
electroforesis en agarosa 1% para los fragmentos ~1.5 kb esperados (Wawrik et al. 2005)
(Apéndice 1.02). Las muestras se procesaron por duplicado para la extracción de ADN,
amplificación y análisis de comunidades.
Análisis de Comunidades Bacterianas por TRFLP
Para estimar la diversidad de comunidades microbianas se utilizó la técnica de
“Terminal Restriction Fragment Lenght Polymorphism” (TRFLP, por sus siglas en
inglés). Después de la amplificación, ~20 µg de cada amplicón para el gen 16S ARNr
fueron digeridos con MnlI a 37 ºC por 2 horas. Los amplicones digeridos fueron
purificados mediante precipitación con alcohol. Los TRFs (terminal restriction
fragment) fluorescente fueron separados por electroforesis capilar en un analizador
genético automático de ABI 310 (Apéndice 1.03). La información de TRFLP fue
analizada con el programa “310 Genescan” versión 3.1 (Applied Biosystems Inc., Foster
City, CA.) y el “Liz 500 size standard” (Applied Biosystem, Warrinton, UK) (Pérez-
Jiménez y Kerkhof 2005).
28
Análisis Estadísticos de Diversidad
El perfil de filotipos para cada muestra se convirtió a una matriz de filotipos
presentes y ausentes. Se calculó el índice de Sørensen para cada muestra analizada. Las
muestras se compararon mediante el programa COMPAH96 (Combinatorial Polythetic
Agglomerative Hierarchical clustering software) (Pérez-Jiménez y Kerkhof 2005). En
adición, se hizo un análisis de varianza múltiple mediante el programa PAST
(PAlaeontological STatistics). Las comunidades bacterianas se evaluaron mediante el
análisis de varianza múltiple de escalamiento multidimensional no métrico en la cual se
obtuvo una matriz de similitud mediante el coeficiente de Bray-Curtis (Bordenave et al.
2007; Quinn y Keough 2002). Se comparó si los valores del análisis de comunidad
microbiana son significativamente distintos a los valores de los datos fisicoquímicos de
las muestras estudiadas en la Bahía de Jobos. Para consolidar datos y construir gráficas
que reflejaron los resultados de este estudio se utilizó Microsoft Office Excel 2007.
29
Capítulo Cuatro
Resultados
Introducción
La meta de este estudio fue caracterizar comunidades bacterianas en los
sedimentos de la Bahía de Jobos en términos de distribución, diversidad y abundancia.
Se recolectaron un total de 44 muestras de sedimentos en la Bahía de Jobos. Las
mismas fueron tomadas según el plan establecido por Characterizing Jobos Bay, Puerto
Rico: A watershed modeling analysis and monitoring plan (Zitello et al. 2008) y se
dividen en: interior (INR), centro (CNT, ACT, AIN), exterior (OTR), límites de la
Reserva (NER), y System-Wide Monitoring Program (SWP, por sus siglas en inglés)
(Figura 3.02).
Amplificación de 16 ADNr Bacteriano
El gen 16S para el ARNr se utilizó como marcador molecular para describir la
comunidad bacteriana general. El mismo pudo ser amplificado en 26 de 28 muestras
obtenidas de la extracción de ADN (Tabla 4.01). En la mayoría de los casos, el ADN
tuvo que ser diluido para generar el amplicón del tamaño esperado (~1.5 kb). Sin
embargo el ADN no logró ser extraído de los lugares ACT, CNT (11, 14, 17, 19, 20),
INR (3, 4, 5, 6), NER (22, 24), OTR (31, 32, 39) y SWP 42.
30
Tabla 4.01. Amplificación del 16 ADNr para sedimentos en estaciones de la Bahía de
Jobos.
Lugar
Intensidad del ADN
extraído¹
Dilución²
Filotipos (TRF’s)
AIN55
M
100
13
CNT12 M 10-1
10
CNT16 H 10ˉ² 4
INR10 M 10-1
25
INR02 M 10-1
21
INR07 H 10-1
54
INR08 M 10-1
58
INR09 M 10-1
44
NER21 L 100 39
NER23 M 10-1
24
NER24 M 10-1
11
NER26 M 10-1
33
NER27 M 100 16
NER28 M 10-1
8
NER29 M 10-1
27
NER30 M 10-1
16
OTR33 L 100 53
31
OTR34 L 10-1
24
OTR35 L 100 35
OTR36 M 10-1
9
OTR37 M 10-1
52
OTR38 M 100 9
OTR40 L 100 46
SWP41 L 100 36
SWP43 M 10-1
34
SWP44 H 10-1
29
¹ Intensidad estimada cualitativamente en comparación con el marcador de peso
molecular: H, superior; M, equivalente; L, inferior.
² Dilución de ADN genómico preparada con 2 µL de ADN en 18 µL de agua deionizada.
Estructura de las Comunidades Bacterianas
El amplicón generado para 16S ADNr en cada muestra se digirió con la enzima de
restricción MnlI para análisis por TRFLP. Los picos o TRF’s (terminal restriction
fragments) generados en el perfil representan filotipos y no entidades taxonómicas
definidas. El conjunto de picos en el perfil representa la comunidad microbiana del lugar.
Un total de 1936 filotipos fueron detectados entre las 26 muestras examinadas,
correspondiente a 217 filotipos diferentes. El conjunto de filotipos diferentes representa
la riqueza presente en las muestras analizadas. La muestra con menor número de
filotipos fue CNT16 (4), mientras que la de mayor número fue INR08 (58) (Tabla 4.01).
32
Cincuenta y cinco filotipos ocurrieron en solamente una muestra. Un filotipo (147 pb) fue
detectado para todos los sedimentos estudiados (Figura 4.01).
LONGITUD DEL FRAGMENTO TERMINAL (pb)
Figura 4.01. Perfil de 16S ADNr para sedimentos en la Bahía de Jobos.
UN
IDA
DE
S D
E F
LU
OR
ES
CE
NC
IA
INR
CNT
NER
OTR
SWP
33
La estructura de la comunidad se describe a base del número de filotipos
detectados. La Bahía de Jobos se ha dividido en tres sectores: interior, centro y exterior
(Figura 4.02). La abundancia promedio fue de 50, 36 y 45 respectivamente (Tabla 4.02).
La mayor abundancia de promedio de filotipos se halla para el sector interior (50 TRF),
mientras que el menor promedio de abundancia fue para el sector del centro (36 TRF)
(Tabla 4.02). Entre los diferentes lugares colectados refiriéndose a INR, CNT, OTR,
NER y SWP (Figura 3.02) se muestra que los valores del análisis de comunidad (Tabla
4.03) exhiben el mayor promedio de filotipos para las muestras pertenecientes al lugar de
INR, mientras que el menor es para las muestras del CNT.
Figura 4.02. Mapa de la división general de la Bahía de Jobos (Zitello et al. 2008).
Sedimentos del interior (INR) mostraron mayor promedio de filotipos que otros
sitios de estudio (INR, CNT, OTR, NER y SWP) (Tabla 4.03). Sin embargo OTR
34
dominan en abundancia y NER en riqueza (Tabla 4.03). En contraste, CNT tiene los
valores más bajos para abundancia promedio, abundancia total y riqueza.
35
Tabla 4.02. Estructura de la comunidad en la división general de Bahía de Jobos.
Lugar
TRFs (Abundancia)
Riqueza
Promedio TRFs
Interior
469
135
50
Centro
928 188 36
Exterior
539 146 45
Total
1936 217 131
Tabla 4.03. Análisis de comunidad en los cinco sectores colectados.
Lugar
TRFs (Abundancia)
Riqueza
Promedio TRFs
INR
469
135
50
CNT
116
78
29
OTR
539
146
45
NER 531 152 35
SWP
207
105
41
Los electroferogramas indican una similitud frecuente en la altura del fragmento
terminal de algunos filotipos pertenecientes a los lugares del interior (INR) y el exterior
(OTR) de la bahía. Se detectaron cuantitativamente hasta 46 filotipos iguales en una
agrupación de perfiles del interior y el exterior (Figura 4.03). Mientras que los perfiles
para las muestras del centro (CNT, NER y SWP) exhiben hasta 42 filotipos en común
(Figura 4.04).
36
LONGITUD DEL FRAGMENTO TERMINAL (pb)
Figura 4.03. Perfil de TRFLP que exhibe similitud de los filotipos entre muestras del
interior y exterior de la Bahía de Jobos.
UN
IDA
DE
S D
E F
LU
OR
ES
CE
NC
IA
37
LONGITUD DEL FRAGMENTO TERMINAL (pb)
Figura 4.04. Perfil de TRFLP que exhibe similitud de los filotipos entre muestras del
centro de la Bahía de Jobos.
UN
IDA
DE
S D
E F
LU
OR
ES
CE
NC
IA
38
Distribución Bacteriana en Función de Contaminantes
Zitello et al. (2008) en su estudio realizado a la cuenca de Bahía de Jobos evaluó
contaminantes que pueden llegar a la Reserva de Bahía de Jobos mediante escorrentías de
los diversos terrenos. Los contaminantes evaluados fueron las descargadas totales de
nitrógeno, fósforo y sólidos suspendidos. Cada uno de estos contaminantes fueron
evaluados, mediante un modelaje, según unas divisiones establecidas por el estudio
(Figura 4.05).
Figura 4.05. Mapa de las nueve subcuencas en la Bahía de Jobos (Modificado de
Zitello et al. 2008).
39
Para este estudio se definió cuáles son las subcuencas que impactan directamente
los diferentes sitios de la Bahía, refiriéndonos a interior, centro y exterior (Figura 4.02).
Además, se establecieron los componentes dentro de cada subcuenca, de tal manera que
pudimos comparar con los resultados del análisis de comunidad.
Una vez evaluada cada una de las subcuencas de la Bahía de Jobos del estudio de
Zitello et al. (2008) y las descargas totales de contaminantes a la Bahía de Jobos, se
establece una comparación entre el modelaje de descargas de contaminantes y los
filotipos obtenidos en este estudio. Para el mismo, se sumó las descargas totales para
cada contaminante en las subcuencas evaluadas en el estudio de Zitello et al. (2008) y se
posicionó en el área correspondiente de la Bahía de Jobos según la división general,
interior, centro y exterior (Tabla 4.04).
Tabla 4.04. Descarga totales de contaminantes evaluados en el estudio de Zitello et al.
(2008) y los resultados del TRFLP en las diferentes áreas de la Bahía de Jobos.
Lugar
Nitrógenos
Totales (kg/año)
Fósforos Totales
(kg/año)
Sólidos
Suspendidos
Totales (kg/año)
Promedio
Filotipos
Interior
37 150
3 453
635 169
50
Centro
4 805
718
110 464
36
Exterior
19 931
3 231
453 678
45
Total
61 886
7 402
1 199 311
131
40
Los resultados muestran un patrón similar con todos los contaminantes evaluados
y los promedios de los filotipos (Figura 4.06). La mayor descarga para cada
contaminante la recibe el interior de la Bahía Jobos, al igual que el mayor número de
filotipos. Mientras que la menor descarga para cada contaminante la recibe el centro de
la Bahía de Jobos, donde se obtiene también el menor número de filotipos. La Figura 4.06
está representada por cuatro gráficas A-D, en la que se muestran los diferentes
contaminantes totales (kg/año) evaluados y los promedios de los filotipos.
41
Figura 4.06. Gráficas A-C representan la suma de las descargas totales de contaminantes
en la Bahía de Jobos evaluados en el estudio de Zitello et al. (2008), mientras que D
representa el promedio de filotipos.
42
Índice de Similitud Sørensen
El índice de similitud de Sørensen entre las comunidades bacterianas está basado
en un rango que va desde un 26% a un 79%. El dendograma muestra un patrón de
similitud donde nos señala que las muestras del interior y el exterior de la Bahía forman
agrupaciones entre si, al igual que las muestras del centro. Algunos de los duplicados de
las muestras señalan una divergencia de las muestras originales (Figura 4.07).
INR 9 1 --------------I
INR 9* 27 --------------I-----------------------I
OTR 40 8 --------------------------I I
OTR 40* 33 --------------------------I-----I I--I
OTR 33 14 --------------------------------I-----I I--I
NER 21 22 -----------------------------------------I I
INR 8 2 -----I I
INR 8* 28 -----I--I I
INR 7* 29 --------I-----------------I I
OTR 37 10 -----------------I I I
OTR 37* 35 -----------------I--------I-----I I
NER 26* 41 --------------------I I I I--I
CNT 12* 47 --------------------I-----I I-----I I I
OTR 34* 37 --------------------------------I I I I
OTR 38* 34 --------------------I I I I
OTR 36* 36 --------------------I-----I I I I
NER 28* 40 --------------------------I--------I I I I--I
NER 29* 39 --------------------------I I--I I I I
NER 23* 43 --------------------------I--------I I-----I I I
CNT 55* 30 -----------------------I I I I
INR 2* 45 -----------------------I--------------I I I
INR 7 3 -----------------------------------------------I I
SWP 44 5 --------------I I
NER 26 19 --I I-----I I--I
NER 23 21 --I-----------I I-----I I I
NER 29 16 --------------------I I I I
SWP 41 7 -----------------------I I--------I I I
NER 21* 44 -----------------------I--I I I I
OTR 35 12 -----------------------------------I-----I I I
INR 10* 48 -----------------------------------I I-----I I I-----------I
INR 10 26 -----------------------------------------I I--I I I
OTR 34 13 -----------------------------------------------I I I
SWP 44* 31 -----------------------------I I I
CNT 16* 46 -----------------------------I--------I I I--------I
NER 24* 42 --------------------------------------I--------I I I I
NER 30* 38 -----------------------------------------------I-----I I I
SWP 43 6 -----------------------------------------------I I I
SWP 43* 32 -----------------------------------------------I-----------------I I
CNT 55 4 --------------------------------------------------------------I I
OTR 38 9 --------------------------------------------------------I I I
OTR 36 11 --I I I-----------I
NER 24 20 --I--------------I I I
NER 30 15 -----------------I-----------------I I-----I
NER 27 18 --------------I I-----I I
INR 2 23 --------------I--------------------I I I
NER 28 17 -----I I--------------I
CNT 12 25 -----I--------------------I I
CNT 16 24 --------------------------I--------------I
SIMILITUD 0.79 0.70 0.59 0.48 0.37 0.26
Figura 4.07. Representación de los resultados del Índice de Similitud de Sørensen.
Interior
Exterior
Centro
Interior
Exterior
Centro
Centro
43
Análisis de Varianza Múltiple
El plano de coordenadas sugiere que la comunidad bacteriana de sedimentos en el
interior y el exterior de la Bahía forman agrupaciones entre sí, igual que las muestras del
centro. Mientras que algunos de los duplicados de las muestras señalan una divergencia
de las muestras originales, como A y B (Figura 4.08).
9
8
7
55
44
43
41
40
38
37
36
35
34
33
30
29
28
27
26
24
23
21
216
12
10
9*
8*7*
55*
44*
43*
40*
38*
37*
36*34*
30*
29*
28*26*
24*
23* 21*2*
16*
12*
10*
-0.18 -0.12 -0.06 0 0.06 0.12 0.18 0.24 0.3 0.36
Coordinate 1
-0.2
-0.15
-0.1
-0.05
0
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
Coo
rdin
ate
2
Figura 4.08. Representación de los resultados del Análisis de Varianza Múltiple.
Estableciendo una comparación directa con los resultados obtenidos de los
factores fisicoquímicos del fondo de la columna de agua del lugar (oxígeno disuelto,
Interior y Exterior Centro
A
B
44
temperatura, salinidad y conductividad) (Tabla 4.05) podemos observar un patrón en
algunos de los lugares que no forman agrupaciones en el interior, exterior y centro. Las
muestras INR10, CNT12, NER24, OTR34, SWP43 y SWP44 presentan en la tabla dos
factores fisicoquímicos o más elevados. Mientras que en las muestras NER24, OTR34,
SWP43 y SWP44 se observan los datos de oxígeno disuelto más bajos con respecto a las
demás muestras. Las muestras INR10, CNT12, NER24, SWP43 y SWP44 exhiben datos
elevados en cuanto a la salinidad y la conductividad.
Tabla 4.05. Datos fisicoquímicos del fondo de la columna de agua de las estaciones
estudiadas.
Lugar
Oxígeno
disuelto (mg/L)
Temperatura
(ºC)
Salinidad
(psu)
Conductividad
(mS)
ACT45
7.55
29.4
34.8
57.4
AIN55
6.30
29.9
35.3
58.7
CNT12
7.96
31.0
36.2
61.2
CNT16
ND
ND
ND
ND
CNT18 7.41 29.4 34.9 57.4
INR02
4.07
29.0
35.3
57.9
INR07 4.83 28.9 35.5 57.9
INR08 5.02 28.9 35.7 58.1
INR09 6.90 30.3 35.5 59.4
INR10 5.60 31.0 36.5 61.6
45
NER21 8.04 29.7 34.8 57.8
NER23 6.67 30.2 35.1 58.6
NER24 0.06 30.8 36.5 61.4
NER26 6.90 29.9 35.2 58.5
NER27 6.33 29.6 35.0 57.9
NER28 6.12 28.8 34.7 56.4
NER29 6.12 29.8 35.3 58.6
NER30 5.24 29.6 35.6 58.9
OTR33 6.65 29.1 34.8 57.1
OTR34 2.2 29.2 35.9 59.0
OTR35 6.47 29.4 35 57.8
OTR36 6.42 29.0 34.8 57.0
OTR37 6.00 29.5 35.1 58.0
OTR38 6.52 29.4 35.0 58.0
OTR40 6.41 28.8 34.6 56.6
SWP41 6.06 29.8 34.8 57.8
SWP43 0.11 30.2 39.6 65.4
SWP44 2.78 30.0 36.4 60.5
ND, no determinado
46
Capítulo Cinco
Discusión
Sistemas estuarinos se exponen a influencias de tierra, río y mar que influyen en
sus características y sustentabilidad. La variante en condiciones ambientales supera las
posibilidades de control experimental estricto. Ante tal panorama, la actividad microbiana
en la operación de ciclos biogeoquímicos supone la participación de múltiples taxones de
distribución heterogénea. La microbiota resultará difícil de describir basado en métodos
tradicionales de cultivo.
Este estudio ha permitido describir la distribución bacteriana a través de
sedimentos en la Bahía de Jobos. Su comparación con descripciones del trasfondo
fisicoquímico de la región, que conllevó al modelaje de las cuencas hidrográficas (Zitello
et al. 2008) según la particularidad de actividad antropogénica, representa una
contribución para entender el ecosistema de la Reserva Estuarina. Los objetivos del
estudio incluían caracterizar las comunidades de bacterias en sedimentos y precisar
patrones de distribución microbiológicos en relación a descargas de contaminantes.
La región que rodea a JBNERR es una atracción directa para desarrolladores por
sus aguas subterráneas, topografía, acceso a carreteras principales y su naturaleza. Esto
ha generado asentamientos en los puertos que han alterado y degradado el ambiente por
contaminación y destrucción de hábitat. Además, el sector ha experimentado un
crecimiento poblacional que vierte sus aguas residuales sin tratar directamente en la
bahía. Vertederos y actividades industriales en el área ponen en riesgo la salud ambiental
y pública. Cada uno de estos factores han provocado que la calidad del agua se afecte y,
47
por ende, han afectado la biota marina resultando en la disminución de la calidad
ambiental de JBNERR (Laboy-Nieves 2009).
El impacto de los disturbios antropogénicos afectará el balance ecológico de los
ecosistemas incluyendo la actividad microbiana. Las bacterias son los organismos de
mayor abundancia en los sedimentos y desempeñan funciones importantes en el manejo
de materia orgánica e inorgánica natural y contaminante. Por ejemplo el disturbio
antropogénico, podría resultar en la alteración de los ciclos biogeoquímicos produciendo
un desbalance en su entorno. Ciertas transformaciones bacterianas reducen la toxicidad
de contaminantes por mineralización que limita la disponibilidad de nutrientes. Además,
las bacterias pueden volatilizar o precipitar metales hasta transformarlos en derivados
orgánicos tóxicos (Sabrinho-da Silva et al. 2008; Gillan et al. 2005). En estos casos, los
sedimentos marinos pueden convertirse en una fuente secundaria de contaminación.
Diversidad de la Comunidad Bacteriana
Sedimentos estuarinos y marinos alojan microorganismos metabólicamente
diversos. Tal versatilidad es esencial para las operaciones naturales ordinarias y en
respuesta a disturbios. El cultivo microbiano resulta limitado en capturar amplias
funciones metabólicas que interaccionan en la naturaleza (Hunter-Cevera et al. 2005). Sin
embargo, mediante la aplicación de técnicas moleculares basadas en ADN, se documenta
por primera vez la diversidad, riqueza y distribución de la comunidad bacteriana en
sedimentos de la Bahía de Jobos. Aún así, la complejidad química de las muestras ha
podido influenciar en la extracción de ADN genómico para el estudio de la microbiota
bentónica. Componentes inorgánicos y complejos orgánicos de los sedimentos pueden
interferir con el protocolo fisicoquímico y hasta inhibir el proceso de amplificación
48
genética (Qu et al. 2008; Koizumi et al. 2003). Por tanto, no se alcanzó la detección de
comunidades bacterianas para todas las muestras.
La aplicación del gen 16S ADNr como marcador molecular anticipa la detección
del componente bacteriano, no arquea. Sin embargo, limitaciones intrínsecas de
oligonucleótidos degenerados puede evitar la detección de integrantes bacterianos
relevantes o favorecer la detección de otros. Las limitaciones del procedimiento natural
no impide una mayor resolución del componente microbiano (Koizumi et al. 2003) .
La comunidad bacteriana bentónica en la Bahía de Jobos es especialmente diversa
para el momento del estudio. El análisis de comunidad, basado en TRFLP, presenta
perfiles dominados por filotipos de baja intensidad fluorescente y pocos de alta
intensidad. En ambos casos, los niveles de fluorescencia no se mantienen para el mismo
filotipo entre las muestras. Sólo un filotipo es común para todas las muestras y cincuenta
y cinco filotipos fueron detectados para una muestra como posible taxón endémico. Por
tanto, las comunidades bacterianas no parecen estar dominadas por el mismo filotipo a
través de los sedimentos de la bahía. La marca molecular sugiere la prevalencia de
comunidades genéticamente diversas con potencial de contribuir a la redundancia
fisiológica del sistema.
La técnica del TRFLP nos mostró comunidades bastante particulares al sedimento
estudiado en la Bahía de Jobos. Los sectores interior y exterior de la Bahía de Jobos son
los lugares de mayor diversidad bacteriana encontradas. Mostrando así un patrón directo
con el estudio de Zitello et al. (2008) por que los sectores del interior y el exterior,
respectivamente, muestran mayor concentración de descargas totales de nitrógeno,
fósforo y sólidos disueltos. En los perfiles de TRFLP se observa un alto número de
49
filotipos similares entre las muestras interior y exterior en comparación con las muestras
del centro. Según los usos de terrenos en la cuenca de Bahía de Jobos podemos observar
que el interior y el exterior se caracterizan por un desarrollo urbano e industrial mayor
que el del área central en la cuenca de Bahía de Jobos. El interior de la Bahía de Jobos es
el sector más impactado y de mayor número de filotipos para el 16S ADNr. De igual
manera es comprensible por las implicaciones que conllevan el uso de terreno específico
del lugar, como la planta termoeléctrica, el vertedero, las industrias farmacéuticas y la
inadecuada disposición de aguas residuales. La descarga de sustancias químicas en
ecosistemas acuáticos afecta la integridad biótica del lugar. Los efectos de estos
contaminantes pueden llevar a severas patologías, problemas de comportamiento y
desaparición y migración de especies. Las sustancias principales envueltas en
contaminación química envuelven metales pesados, compuestos orgánicos, plaguicidas,
hidrocarburos aromáticos, residuos de drogas y nitratos y fosfatos. Cada uno puedo
ocasionar daños a largo plazo en el ambiente acuático (Laboy-Nieves 2009).
El índice de similitud de Sørensen exhibe que la mayor parte de las muestras del
interior y el exterior tienen una mayor similitud en comparación con las muestras del
centro de la Bahía de Jobos. Este patrón nos puede dar a entender que los problemas de
contaminación que afectan el área de Bahía de Jobos pueden ser ocasionados por uno o
más disturbios similares en las áreas del interior y exterior. El análisis de varianza
múltiple en comparación con los datos fisicoquímicos exhibe un patrón similar al de
Sørensen, las muestras del interior y exterior se agrupan entre sí al igual que las del
centro. La mayoría de las muestras aisladas en el plano se caracterizan por altos niveles
de salinidad, conductividad y temperatura o bajos niveles de oxígeno disuelto. Los
50
factores fisicoquímicos de los sedimentos pueden reflejar contaminación y relación con la
distribución bacteriana (Reed et al. 2006). El análisis de varianza múltiple revela una
relación de las muestras que se agrupan entre sí con similares factores fisicoquímicos
contaminación. Comparando las muestras con sus duplicados, vemos que existe una
divergencia que se puede deber a la selectividad de los microorganismos en el ambiente.
Los hábitats de los microorganismos en los ambientes dependen de la concentraciones de
nutrientes, factores fisicoquímicos (luz, pH, temperatura, oxigeno, redox),
concentraciones de contaminantes como metales, entre otros. Las aportaciones terrestres
crean gradientes de contaminantes, nutrientes y otros materiales que afectan los
microorganismos y su entorno. En adición, ejercen influencias sobre sus hábitats
mediante el consumo, producción y secuestro de una variedad de compuestos (Hunter-
Cevera et al. 2005).
Comparación de Contaminantes Versus Filotipos
Comunidades bacterianas contrastantes fueron detectadas en sedimentos marinos
a nivel global con una distribución fraccionada en respuesta a contaminantes (Pérez-
Jiménez y Kerkhof 2005). A nivel local, la comunidad bacteriana en Bahía de Jobos
demuestra una similitud mayor según regiones geográficas. La comunidad bacteriana del
centro de la Bahía de Jobos tiene menor abundancia promedio de filotipos que las
regiones del interior y exterior. La región central recibe menor descarga de nitrógeno
total, fósforo total y sólidos suspendidos (Zitello et al. 2008). La entrada de tales
nutrientes puede influenciar el desarrollo de las comunidades más abundantes descritas
para las regiones del interior y el exterior.
51
Los contaminantes modelados en el estudio de Zitello et al. (2008) abarcan
nitrógeno, fósforo y sólidos suspendidos. Estos contaminantes afectan la diversidad
microbiana marina. La descarga de nutrientes ha tenido un impacto masivo en los
ambientes costeros. Actividades antropogénicas han demostrado ser responsables de
grandes cambios en las comunidades microbianas (Hunter-Cevera et al. 2005). Los
nutrimentos como los nitrógenos y fosfatos conducen a eutroficación, uno de los mayores
disturbios producidos por contaminación de nutrientes. Además, que alteran los ciclos
biogeoquímicos resultando en acumulación de intermediarios tóxicos capaces de generar
desbalance ecológico. Los sólidos suspendidos pueden llegar al ambiente por
precipitación provocando contaminación. Durante periodos secos se deposita y acumula
diferentes tipos de sustancias en las carreteras y pavimentos que son arrastradas por las
corrientes de las primeras lluvias que limpian la superficie. Estos contaminantes son
dispersados en la masa de agua produciendo una contaminación que puede ser comparada
con los efluentes urbanos (Emmanuel et al. 2009).
Del análisis de comparación, surge que la cuenca de Bahía de Jobos provee
descargas totales de contaminantes importantes para la Bahía de Jobos, y así lo demuestra
el análisis de comunidad. La actividad antropogénica asociada a las subcuencas que
conducen a los sectores (interior, centro y exterior), según modeladas por Zitello et al.
(2008) hacen disponibles nutrientes contaminantes que parece estimular la diversidad
bacteriana en la región. Los resultados del modelaje para las descargas de contaminantes
en Zitello et al. (2008) muestran que el uso de los terrenos afecta la Bahía de Jobos y, de
igual manera, el número de filotipos obtenidos en el análisis del TRFLP. Por tanto, la
hipótesis alterna es cierta, la distribución de la diversidad microbiana en los sedimentos
52
de la Bahía de Jobos está relacionada con la descarga de contaminantes provenientes de
la cuenca de Bahía de Jobos. Podemos concluir que los contaminantes evaluados en la
cuenca de la Bahía de Jobos afectan directamente la composición de las comunidades
bacterianas. El estudio sugiere que las comunidades bacterianas responden a los
nutrientes. En ecosistemas tropicales, acuáticos o terrestres, el reciclaje de nutrientes por
comunidades bacterianas es usualmente un proceso eficiente (Alongi 1994). Las
comunidades bentónicas son estables, siempre y cuando no se vean perturbadas natural o
antropogénicamente. Estas alteraciones pueden provocar en los sedimentos cambios en
el crecimiento de la microbiota. Esto implica que la degradación y, asimismo, la
restauración de ecosistemas tropicales dependen de la salud de las comunidades
microbianas bentónicas y su ambiente geoquímico (Alongi 1994; Holguin et al. 2001).
Conclusión
El área geográfica de Bahía de Jobos ha sido señalada como receptor de diversos
disturbios ambientales y mediante este estudio se examinaron diversas áreas con un
mayor detalle, específicamente para la diversidad genética bacteriana. Los datos se
apoyan en estudios fisicoquímicos desarrollados por Zitello et al. (2008). Presentamos
una comunidad bacteriana dominante, diversa y distribuida en función al impacto
antropogénico y de contaminantes que pueden surgir en el ambiente. Este es un estudio
que aporta en la detección y manejo de la contaminación en el área, y puede llevar a
estudios interdisciplinarios posteriores en el ambiente.
Por último, muy pocos trabajos de investigación han aplicado la técnica de
TRFLP al estudio de las comunidades microbianas en los estuarios del Caribe. En este
estudio se aplicó de forma novel la técnica de TRFLP en la Reserva Estuarina de
53
Investigación de Bahía de Jobos. Las técnicas moleculares nos brindan una serie de
ventajas en este tipo de investigaciones como: crear una perspectiva de la diversidad
microbiana, incluyendo las bacterias no cultivables, y permite identificar
microorganismos importantes para los procesos químicos y la aplicación del uso de genes
para la metagenómica entre otras (Harwood y Buckley 2008; Koizumi et al. 2003). Sin
embargo, todavía se necesitan realizar más investigaciones que nos ayuden a entender la
diversidad microbiana y el efecto de los contaminantes.
54
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60
Apéndice Uno
Protocolo alternativo para extracción de ADN genómico
(UltraClean Soil DNA Isolation Kit, MoBio Laboratorios, Solana Beach, CA)
1. Añadir 0.25 g de muestra del suelo a la solución ya preparada (2 mL Bead
Solution Tubes). Enumerar cada solución.
2. Agitar las soluciones.
3. Cotejar la solución S1, para verificar que no haya precipitado. Si hay precipitado se
tendrá que calentar la solución a una temperatura de 60 ºC, hasta que se disuelva el
precipitado.
4. Añadir 60 µL de la solución S1 y moverla brevemente.
5. Añadir 200 µL de la solución IRS (“Inhibitor Renoval Solution”), se requiere solo si
el ADN será utilizado en PCR.
6. Colocar los tubos horizontalmente en el “Mo Bio Vortex Adapter’’ y mover a
velocidad máxima por 10 minutos.
7. Centrifugar los tubos a 10 000 x g durante 30 segundos.
8. Transferir el sobrenadante a tubos microcentrifugados limpios.
9. Se espera tener alrededor de 400 µL a 450 µL de sobrenadante.
10. Añadir 250 µL de la solución S2 y moverla por 5 segundos. Colocarla en el
congelador a 4 ºC por 5 minutos
11. Centrifugar los tubos a 10 000 x g.
12. Transferir el volumen completo de sobrenadante a un tubo de sobrenadante limpio.
13. Añadir 1.3 mL de la solución S3 al sobrenadante y moverlo por 5 minutos.
61
14. Colocar 700 mL en el filtro “Spin filter” y centrifugar por 1 minuto a 10 000 x g.
Descartar el flujo. Repetir el proceso con el sobrenadante que falta. Se realizará un total
de 3 veces por cada muestra.
15. Añadir 300 µL de la solución S4 y centrifugar por 30 segundos a 10 000 x g.
16. Descartar el flujo.
17. Centrifugar nuevamente por 1 minuto.
18. Colocar cuidadosamente el filtro en un tubo nuevo provisto.
19. Añadir 50 µL de la solución S5 en el centro de la membrana del filtro.
20. Centrifugar por 30 segundos.
21. Desechar el filtro. El ADN en el tubo está listo para las aplicaciones. Se recomienda
que se almacene el tubo con el ADN a una temperatura de -20 ºC.
62
Apéndice Dos
Protocolo para la reacción en cadena de la polimerasa
1. Obtener la dilución de los iniciadores oligonucleotidos “primers” para bacterias.
1525 R
Ci = 100 pmol
20 pmol (100 µL )
Vi = = 20 µL “primer”
100 pmol
27 F (FAM)
Ci = 48.2 pmol
20 pmol (100 µL )
Vi = = 20 µL “primer”
100 pmol
2. Identificar los tubos con los nombres de las muestras.
3. Añadir 2 µL de ADN en un tubo de 0.2 mL de PCR.
4. Prepara el coctel de PCR:
“Red Taq” = 12.5 µL
“Primer R” = .625 µL
“Primer F” = .625 µL
“dd H2O” = 9.25 µL
5. Añadir 18 µL del coctel a los tubos con los contenidos de ADN.
6. Colocar en el termociclador.
20 µL “primer”
80 µL “ddH2O”
20 µL “primer”
80 µL “ddH2O”
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Apéndice Tres
Protocolo para precipitación de productos de digestión
Volumen inicial 20 μL
1. Transferir todo el volumen de la digestión a un microtubo de 1.5 mL.
2. Preparar y añadir:
a. 49 μL de agua deionizada estéril
b. 6 μL de 3M acetato de sodio
c. 125 μL de etanol 95%
3. Mezclar bien (vortex) e incubar a temperatura ambiente por 15 a 20 minutos.
4. Centrifugar a velocidad máxima por 20 minutos. Asegurarse de colocar los microtubos
en la misma orientación para localizar el “pellet”.
5. Utilizando una micropipeta, aspirar todo el sobrenadante con mucho cuidado y en la
dirección opuesta a donde se supone que esté el “pellet”.
6. Añadir 250 µL de etanol 70% para lavar el “pellet”.
7. Centrifugar a velocidad máxima por 5 minutos. Asegurarse de colocar los microtubos
en la misma orientación.
8. Aspirar el sobrenadante con mucho cuidado con una micropipeta.
9. Dejar secar las muestras en un bloque termal a 70 ºC por 15 minutos o dejarlo abierto
de forma horizontal hasta evaporarse el alcohol residual.
10. Resuspender el “pellet” en formamida (CH3NO) y en el marcador de peso molecular
“Liz 500’’ (Applied Biosystem, Warrinton, UK). Utilizar 14.8 μL de formamida + 0.2 μL
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de “Liz marker” (por muestra). Luego, con una micropipeta, se transfieren todas las
muestras al plato de secuenciar y se le coloca el septo.
11. El plato de secuenciar se coloca en el termociclador y se aplica el programa de
desnaturalizar. Este método es aplicado para romper interacciones débiles como los
puentes de hidrógeno que pueden formarse.
12. Cuando finalice el ciclo de desnaturalizar, colocar rápidamente el plato de secuenciar
que contiene las muestras en un baño de agua fría para un cambio drástico de temperatura
por 2 minutos. Luego secar el plato y colocar la base y la cubierta requerida para la
secuenciación en el Analizador Genético.
