UNIVERSITAT POLITÉCNICA DE VALENCIA DEPARTAMENTO DE ...
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UNIVERSITAT POLITÉCNICA DE VALENCIA
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS
EVOLUCIÓN DE LOS RESIDUOS DE PLAGUICIDAS EN
FRUTAS CÍTRICAS FRESCAS. INCIDENCIA SOBRE LOS
ACEITES ESENCIALES
TESIS DOCTORAL
Presentada por:
Prof. Hilda F. Rousserie
Dirigida por:
Dra. Isabel Fernández Segovia
Dr. Hugo Rodolfo Cives
Enero de 2016
AGRADECIMIENTOS
A todas las personas que de una u otra
manera han colaborado en la realización
de esta tesis.
Resumen
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
Evolución de los Residuos de Plaguicidas en frutas cítricas frescas.
Incidencia sobre los aceites esenciales
RESUMEN
En Argentina la producción citrícola constituye una de las
actividades de fundamental importancia en la economía nacional y
regional. Abastece al mercado interno y al mercado exterior con frutas
frescas y productos industrializados.
El empleo de agroquímicos durante la producción en campo y
en empaque, para el control y tratamiento de enfermedades de los
cítricos, conlleva que queden residuos en los frutos tratados. Es
esencial controlar los niveles de plaguicidas que quedan en los frutos,
tanto para el consumo en fresco, como para su empleo como materia
prima en la industria de procesado. En la actualidad, las exportaciones
de cítricos se han incrementado considerablemente. Con ello, las
exigencias respecto a los niveles de tolerancia de residuos de
plaguicidas también han ido en aumento, por lo que cobra especial
relevancia disponer de técnicas analíticas capaces de evaluar niveles
de plaguicidas a concentraciones traza.
El objetivo general de este trabajo fue establecer la
correlación entre los niveles iniciales de agroquímicos en naranjas que
llegan a la industria de elaboración de aceites esenciales y los niveles
hallados en el producto terminado (aceites esenciales descerados).
Para ello, se estableció otro objetivo general que fue validar
metodologías analíticas para la determinación de clorpirifos,
Resumen
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
carbendazim, procloraz y tiabendazol por cromatografía de gases y
cromatografía líquida, acopladas a espectrometría de masas, en
diferentes matrices cítricas (naranjas y aceite esencial descerado de
naranja).
En fruta entera se empleó la técnica de cromatografía de
gases con detector de espectrometría de masas tipo simple cuadrupolo
(GC-MS) para la cuantificación de clorpirifos, mientras que para la
cuantificación de tiabendazol se utilizó la técnica de cromatografía
líquida con doble detector de masas triple cuadrupolo (LC-MS/MS).
Para aceites esenciales se utilizó la técnica LC-MS/MS para la
determinación de procloraz, carbendazim y tiabendazol, y la
cromatografía de gases con doble detector de masas triple cuadrupolo
(GC-MS/MS) para la cuantificación de clorpirifos.
Las técnicas de extracción de los analitos empleadas fueron la
extracción con disolventes y la extracción en fase sólida dispersiva.
Para comprobar el efecto matriz, se emplearon blancos de muestras de
naranjas de producción orgánica y aceites esenciales obtenidos a partir
de ellas. Para cada uno de los métodos se evaluó la linealidad,
exactitud, precisión, límite de detección y límite de cuantificación.
Todos los métodos evaluados fueron lineales en el rango de
concentraciones estudiadas en las distintas matrices. Los parámetros
de precisión y exactitud, en todos los casos presentaron valores dentro
del rango establecido para métodos exactos y precisos. Los límites de
detección y cuantificación obtenidos fueron adecuados, teniendo en
cuenta los límites máximos de residuos (LMRs) establecidos en la
legislación argentina y europea, para naranjas.
Resumen
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
Los residuos evaluados en las muestras de naranja que llegan
a la industria presentaron valores inferiores a los LMRs establecidos
en Argentina y en la Unión Europea. Para todos los plaguicidas
evaluados se pudo establecer una correlación entre los niveles
presentes en la fruta y los valores residuales obtenidos en los aceites
esenciales.
El desarrollo y validación de los métodos de análisis de estos
plaguicidas, en naranjas y aceites esenciales descerados, permite
ofrecer una valiosa herramienta al sector industrial, con la que
determinar de forma exacta y precisa los niveles de plaguicidas de los
productos que adquieren, elaboran y/o comercializan. Esto ayudará a
la mejora de los procesos de control de calidad, permitiendo
seleccionar solo materias primas que cumplan con los criterios
exigidos por la legislación en materia de residuos, a la vez que
establecer estrategias apropiadas de comercialización, teniendo en
cuenta las diferencias de los LMRs que hay en los distintos mercados.
Palabras Claves
Cítricos, Aceites esenciales, Plaguicidas, Validación,
Cromatografía de gases, Cromatografía líquida
Resum
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
RESUM
La producció citrícola en Argentina constituïx una de les
activitats de fonamental importància en l'economia nacional i regional.
Abastix al mercat intern i al mercat exterior amb fruites fresques i
productes industrialitzats.
L’ús d'agroquímics durant la producció en camp i en
embalatge per tal de controlar i tractar les malalties dels cítrics té com
a conseqüència la permanència de residus en els fruits tractats. És
essencial controlar els nivells de plaguicides que queden tant en els
fruits com en aquells destinats a ser matèria primera per a la indústria
del processat. En l'actualitat, les exportacions de cítrics s'han
incrementat considerablement. Amb això, les exigències respecte als
nivells de tolerància de residus de plaguicides també han augmentant.
D’esta manera cobra especial rellevància disposar de tècniques
analítiques capaces d'avaluar nivells de plaguicides a concentracions
traça.
L'objectiu general d'este treball va ser establir la correlació
entre els nivells inicials d'agroquímics en taronja que arriba a la
indústria d'elaboració d'olis essencials i els nivells trobats en el
producte acabat (olis essencials descerats). Per a això, es va establir un
altre objectiu general: validar metodologies analítiques per a la
determinació de clorpirifos, carbendazim, procloraz i tiabendazol per
cromatografia de gasos i cromatografia líquida, acoblades a
espectrometria de masses en diferents matrius cítriques (taronges i oli
essencial descerat de taronja).
Resum
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
En fruita sencera es va emprar la tècnica de cromatografia de
gasos amb detector d'espectrometria de masses tipus simple
cuadrupolo (GC-MS) per a la quantificació de clorpirifos, mentre que
per a la quantificació de tiabendazol es va utilitzar la tècnica de
cromatografia líquida amb doble detector de masses triple cuadrupolo
(LC-MS/MS) . Per a olis essencials es va utilitzar la tècnica LC-
MS/MS per a la determinació de procloraz, carbendazim i tiabendazol,
així com la cromatografia de gasos amb doble detector de masses
triple cuadrupolo (GC-MS/MS) per a la quantificació de clorpirifos.
Les tècniques d'extracció dels analits empleades van ser
l'extracció amb dissolvents i l'extracció en fase sòlida dispersiva. Per a
comprovar l'efecte matriu, es van emprar blancs de mostres de
taronges de producció orgànica i olis essencials obtinguts a partir de
les mateixes. Per a cadascun dels mètodes es va avaluar la linealitat,
exactitud, precisió, límit de detecció i límit de quantificació.
Tots els mètodes avaluats van ser lineals en el rang de
concentracions estudiades en les diferents matrius. Els paràmetres de
precisió i exactitud, en tots els casos van presentar valors dins del rang
establert per a mètodes exactes i precisos. Els límits de detecció i
quantificació obtinguts van ser adequats, tenint en compte els límits
màxims de residus (LMRs) establerts a la legislació argentina i
europea per a taronges.
Els residus avaluats en les mostres de taronja al moment
d’arribar a la indústria van presentar valors inferiors als LMRs
establerts en Argentina i la Unió Europea. Per a tots els plaguicides
Resum
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
avaluats es va poder establir una correlació entre els nivells presents
en la fruita i els valors residuals determinats en els olis essencials.
El desenvolupament i validació dels mètodes d'anàlisi d'estos
plaguicides en mostres de taronges i olis essencials descerats, permet
oferir una eina valuosa al sector industrial, amb la qual determinar de
forma exacta i precisa els nivells de plaguicides dels productes que
s’adquireixen, elaboren i/o comercialitzen. Açò ajudarà a la millora
dels processos de control de qualitat i permetran seleccionar només
matèries primeres que complisquen amb els criteris exigits per la
legislació en matèria de residus. Al mateix temps permetrà establir
estratègies apropiades de comercialització, tenint en compte les
diferències dels LMRs que hi ha en els diferents mercats.
Paraules Claus
Cítrics, Olis essencials, Plaguicides, Validació,
Cromatografia de gasos, Cromatografia líquida
Summary
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
SUMMARY
Citrus fruit production in Argentina is one of the activities of
fundamental importance in the national and regional economy. It
supplies the internal and the foreign market with fresh and processed
fruits.
The use of agrochemicals during production in the field and
packaging, for the control and treatment of diseases of citrus, involves
residues in treated fruits. It is essential to monitor pesticide levels
remaining in fruits, for both fresh consumption and for use as raw
material in the processing industry. At present, citrus fruit exports
have considerably increased. As a result, the demands on tolerance
levels for pesticide residues have also been increasing, so is of special
relevance the availability of analytical techniques able to assess levels
of pesticides at trace levels.
The overall objective of this study was to establish the
correlation between the initial levels of agrochemicals in oranges
reaching the processing industry of essential oils and the levels found
in the finished product (essential oils dewaxed). For this, another
general objective was established that was to validate analytical
methodologies to determine chlorpyrifos, carbendazim, prochloraz
and thiabendazole by gas chromatography and liquid chromatography,
coupled with mass spectrometry, in different citrus matrices (orange
and orange essential oil dewaxing).
In whole fruit, the gas chromatography technique with mass
spectrometric detector type simple quadrupole (GC-MS), was used for
quantification of chlorpyrifos, while for thiabendazole quantification,
Summary
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
liquid chromatography/tandem mass spectrometry detection (triple
quadrupole) (LC-MS/MS) was used. For essential oils LC-MS/MS
was used for determining prochloraz, carbendazim and thiabendazole,
and gas chromatography/tandem mass spectrometry detection (triple
quadrupole) (GC-MS/MS) for quantification of chlorpyrifos.
The extraction techniques employed were solvent extraction
and dispersive solid phase extraction. To check the matrix effect,
blank samples of oranges from organic production and essential oils
made from them were used. For each method linearity, accuracy,
precision, limit of detection and limit of quantification were assessed.
All methods evaluated were linear in the range of
concentrations studied in the different matrices. The parameters of
precision and accuracy in all cases showed values within the range
established for accurate and precise methods. The limits of detection
and quantification obtained were adequate, taking into account the
maximum residue limits (MRLs) established in Argentina and
European legislation, for oranges.
The residues evaluated in orange samples, which reach the
industry exhibited values below MRLs established in Argentina and
the European Union. For all the pesticides evaluated, a correlation
between the levels in the fruit and residual values obtained in essential
oils, could be established.
The development and validation of analytical methods of
these pesticides, in oranges and essential oils dewaxed, can provide a
valuable tool for the industrial sector, with which to determine
accurately and precise levels of pesticides in the products they buy,
Summary
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
produce and/or market. This will help to improve the quality control
processes, allowing the operator to select only raw materials that meet
the criteria required by the legislation on residues, as well as to
establish appropriate marketing strategies, taking into account the
differences in MRLs that exist in the different markets.
Keywords:
Citrus, Essential oils, Pesticides, Validation, Gas
chromatography, Liquid chromatography.
Índice.
Índice
Í N D I C E G E N E R A L
I. INTRODUCCIÓN .................................................................................................. 1
I.1. PRODUCCIÓN NACIONAL Y REGIONAL DE CITRUS EN ARGENTINA ..................................... 1
I.2. PRODUCCIÓN DE ACEITES ESENCIALES. ....................................................................... 4
I.3. ENFERMEDADES Y PLAGAS EN CITRUS ...................................................................... 14
I.3.1. Cancrosis de los citrus ............................................................................. 15
I.3.2. Clorosis variegada de los cítricos (CVC) .................................................. 16
I.3.3. Virus de la tristeza de los cítricos o citrus tristeza virus (CTV) ................ 17
I.3.4. Sarna de los cítricos ................................................................................ 18
I.3.5. Mancha negra de los cítricos .................................................................. 19
I.3.6. Moho verde y Moho azul ........................................................................ 21
I.3.7. Podredumbre amarga de los cítricos ...................................................... 22
I.3.8. Podredumbre morena o marrón ............................................................. 23
I.3.9. Podredumbres pedunculares .................................................................. 23
I.3.10. Mosca de la fruta (Ceratitis capitata)................................................... 24
I.3.11. Pulgones (Aphis spiraecola, A. gossypii, A. citricola, Toxoptera aurantii,
Myzus persicae) ............................................................................................... 24
I.3.12. Cóccidos o cochinillas ........................................................................... 25
I.4. PLAGUICIDAS ..................................................................................................... 26
I.4.1. Denominación y clasificación ................................................................. 30
I.4.2. Características de plaguicidas utilizados en la citricultura ..................... 38 I.4.2.1. Benzimidazoles ............................................................................................. 39
I.4.2.1.1. Tiabendazol ........................................................................................... 41 I.4.2.1.2. Carbendazim ......................................................................................... 43
I.4.2.2. Organofosforados ......................................................................................... 45 I.4.2.2.1. Clorpirifos .............................................................................................. 48 I.4.2.2.2. Imidazoles: Procloraz ............................................................................ 49
I.5. MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE PLAGUICIDAS........................................................ 51
I.5.1. Metodología de preparación de la muestra ........................................... 53 I.5.1.1. Extracción con solventes ............................................................................... 55 I.5.1.2. Extracción mediante adsorción en superficies sólidas .................................. 58
I.5.2. Técnicas cromatográficas de análisis ..................................................... 65 I.5.2.1. Cromatografia de gases (GC) ........................................................................ 68 I.5.2.2. Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) .......................................... 71 I.5.2.3. Tipos de detectores en cromatografía .......................................................... 75
I.5.3. Validación de métodos ........................................................................... 77
II. OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO ...................................................................... 85
Índice
II.1.OBJETIVOS ........................................................................................................ 85
II.1.1. Objetivos generales ............................................................................... 85
II.1.2. Objetivos Específicos ............................................................................. 86
II.2. PLAN DE TRABAJO .............................................................................................. 86
III. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................... 91
III.1. REACTIVOS Y EQUIPAMIENTO .............................................................................. 92
III.1.1. Reactivos .............................................................................................. 92
III.1.2. Equipamiento ....................................................................................... 92
III.2. PLAN DE MUESTREO .......................................................................................... 94
III.3. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS PARA EL ANÁLISIS EN LABORATORIO ........................ 100
III.3.1. Submuestreo ....................................................................................... 100
III.3.2. Procedimiento de extracción de plaguicidas en fruta entera ............. 101
III.3.3. Procedimiento de extracción de plaguicidas en aceites esenciales .... 102
III.3.4. Preparación de estándares ................................................................. 103
III.3.5. Preparación de muestras adicionadas................................................ 103
III.4. CONDICIONES CROMATOGRÁFICAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LOS PLAGUICIDAS ........ 104
III.4.1. Determinación de clorpirifos en fruta por cromatografía de gases con
detector de espectrometría de masas tipo simple cuadrupolo (CG-MS) ....... 105
III.4.2. Determinación de clorpirifos en aceites esenciales por cromatografía de
gases con doble detector de masas/masas tipo triple cuadrupolo (GC-MS/MS)
....................................................................................................................... 105
III.4.3. Determinación de procloraz, carbendazim y tiabendazol por
cromatografía líquida con doble detector de masas/masas tipo triple
cuadrupolo (LC-MS/MS) ................................................................................ 106
III.5. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS DE LOS RESULTADOS ......................................................... 107
III.6. ESTUDIO DE LA CORRELACIÓN DE LOS NIVELES RESIDUALES DE PLAGUICIDAS ENTRE FRUTA
CÍTRICA ENTERA Y ACEITES ESENCIALES......................................................................... 111
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ........................................................................... 117
IV.1. DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE LOS MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE CLORPIRIFOS EN
FRUTA ENTERA POR CROMATOGRAFÍA DE GASES CON DETECTOR DE ESPECTROMETRÍA DE MASAS
TIPO SIMPLE CUADRUPOLO (CG-MS) ......................................................................... 117
IV.1.1. Clorpirifos ........................................................................................... 118 IV.1.1.1. Análisis unidimensional ............................................................................ 118 IV.1.1.2. Linealidad ................................................................................................. 119 IV.1.1.3. Precisión y exactitud ................................................................................. 126 IV.1.1.4. Límites de detección y cuantificación ....................................................... 128
Índice
IV.2. DESARROLLO Y VALIDACIÓN DEL MÉTODO DE DETERMINACIÓN DE CLORPIRIFOS EN ACEITES
ESENCIALES DE NARANJA POR CROMATOGRAFÍA DE GASES CON DOBLE DETECTOR DE
ESPECTROMETRÍA DE MASAS TIPO TRIPLE CUADRUPOLO (CG-MS/MS). ............................ 129
IV.2.1. Clorpirifos ........................................................................................... 129 IV.2.1.1. Análisis unidimensional ............................................................................ 129 IV.2.1.2. Linealidad ................................................................................................. 130 IV.2.1.3. Precisión y exactitud ................................................................................. 135 IV.2.1.4. Límites de detección y cuantificación ....................................................... 136
IV.3. DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE LOS MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DE CARBENDAZIM,
PROCLORAZ Y TIABENDAZOL POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA CON DOBLE DETECTOR DE
ESPECTROMETRÍA DE MASAS TIPO TRIPLE CUADRUPOLO (LC-MS/MS) ............................. 137
IV.3.1. Validación del de determinación de tiabendazol en fruta entera ...... 138 IV.3.1.1. Análisis unidimensional ............................................................................ 138 IV.3.1.2. Linealidad ................................................................................................. 139 IV.3.1.3. Precisión y exactitud ................................................................................. 146 IV.3.1.3. Límites de detección y cuantificación ....................................................... 147
IV.3.2. Validación de los métodos de determinación de procloraz, carbendazim
y tiabendazol en aceites esenciales descerados de naranja. ......................... 148 IV.3.2.1. Procloraz ................................................................................................... 148
IV.3.2.1.1. Análisis unidimensional ..................................................................... 148 IV.3.2.1.2. Linealidad .......................................................................................... 149 IV.3.2.1.3. Precisión y exactitud ......................................................................... 154 IV.3.2.1.4. Limites de detección y cuantificación ................................................ 155
IV.3.2.2. Carbendazim ............................................................................................. 155 IV.3.2.2.1. Análisis unidimensional ..................................................................... 155 IV.3.2.2.2. Linealidad .......................................................................................... 156 IV.3.2.2.3. Precisión y exactitud ......................................................................... 161 IV.3.2.2.4. Límites de detección y cuantificación ................................................ 162
IV.3.2.3. Tiabendazol .............................................................................................. 163 IV.3.2.3.1. Análisis unidimensional ..................................................................... 163 IV.3.2.3.2. Linealidad .......................................................................................... 163 IV.3.2.3.3. Precisión y exactitud ......................................................................... 167 IV.3.2.3.4. Limites de detección y cuantificación ................................................ 168
IV.4. ESTUDIO DE LA PRESENCIA DE RESIDUOS DE PLAGUICIDAS EN FRUTAS ENTERAS Y EN ACEITES
ESENCIALES Y DETERMINACIÓN DE SU CORRELACIÓN. ...................................................... 169
IV.4.1. Presencia de residuos de plaguicidas en frutas y aceites esenciales
descerados ..................................................................................................... 169
IV.4.2. Determinación de la correlación entre los niveles residuales de
plaguicidas en aceites esenciales y la fruta de la cual provienen .................. 173
V. CONCLUSIONES ............................................................................................. 183
Índice
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 187
Í N D I C E D E T A B L A S
Tabla 1. Clasificación de los plaguicidas según su toxicidad. ................................... 31
Tabla 2. Clasificación de los plaguicidas recomendada por la OMS (OMS, 2004) .... 32
Tabla 3. Clasificación de los plaguicidas según su vida media ................................. 33
Tabla 4. Clasificación de los plaguicidas, según la familia química .......................... 34
Tabla 5. Gradiente de elución ................................................................................ 106
Tabla 6. Serie de pares de las variables en cada lote ............................................. 112
Tabla 7. Análisis estadístico unidimensional. Disoluciones patrón de clorpirifos
(n=21 y α=0,05) ............................................................................................. 118
Tabla 8. Análisis estadístico unidimensional. Fruta pre-adicionada con clorpirifos
(n=21 y α=0,05) ............................................................................................. 118
Tabla 9. Análisis estadístico unidimensional. Fruta post-adicionada con clorpirifos
(n=21 y α=0,05) ............................................................................................. 119
Tabla 10. Resultados de los parámetros calculados para la determinación de la
precisión del método de determinación de clorpirifos en fruta (n=21, α=0,05)
....................................................................................................................... 128
Tabla 11. Características de identificación para clorpirifos por GC-MS/MS .......... 129
Tabla 12. Análisis estadístico unidimensional. Disoluciones de patrón de clorpirifos
(n=21 y α=0,05) ............................................................................................. 130
Tabla 13. Análisis estadístico unidimensional. Muestras de aceite adicionadas con
clorpirifos (n=21 y α=0,05) ............................................................................ 130
Tabla 14. Resultados de los parámetros calculados para la determinación de la
precisión del método de determinación de clorpirifos en aceites esenciales
....................................................................................................................... 135
Tabla 15. Características de identificación para procloraz, carbendazim y
tiabendazol por LC-MS/MS............................................................................ 137
Tabla 16. Análisis estadístico unidimensional. Disoluciones patrón de tiabendazol
(n=21 y α=0,05) ............................................................................................. 139
Tabla 17. Análisis estadístico unidimensional. Fruta pre-adicionada con tiabendazol
(n=21 y α=0,05) ............................................................................................. 139
Tabla 18. Análisis estadístico unidimensional. Fruta post-adicionada con
tiabendazol (n=21 y α=0,05) .......................................................................... 139
Índice
Tabla 19. Resultados de los parámetros calculados para la determinación de la
precisión del método de determinación de tiabendazol en fruta (n=21,
α=0,05) .......................................................................................................... 147
Tabla 20. Análisis estadístico unidimensional. Disoluciones patrón de procloraz
(n=21 y α=0,05) ............................................................................................. 148
Tabla 21. Análisis estadístico unidimensional. Muestras de aceite adicionadas con
procloraz (n=21 y α=0,05) ............................................................................. 149
Tabla 22. Resultados de los parámetros calculados para la determinación de la
precisión del método de determinación de procloraz en aceites esenciales 154
Tabla 23. Análisis estadístico unidimensional. Disoluciones patrón de carbendazim
(n=21 y α=0,05) ............................................................................................. 156
Tabla 24. Análisis estadístico unidimensional. Muestras de aceite adicionadas con
carbendazim (n=21 y α=0,05) ........................................................................ 156
Tabla 25. Resultados de los parámetros calculados para la determinación de la
precisión del método de determinación de carbendazim en aceites esenciales
....................................................................................................................... 162
Tabla 26. Análisis estadístico unidimensional. Muestras de aceite adicionadas con
tiabendazol (n=21 y α=0,05) ......................................................................... 163
Tabla 27. Resultados de los parámetros calculados para la determinación de la
precisión del método de determinación de tiabendazol en aceites esenciales
....................................................................................................................... 167
Tabla 28. Valores medios de niveles residuales de plaguicidas expresados en mg/Kg
y desviación estándar (valores entre paréntesis) (n=9, α=0,05). Temporada
2012, 2013 y 2014 ......................................................................................... 170
Tabla 29. Resumen estadístico para los niveles de residuos de probloraz, para el par
aceite-fruta. ................................................................................................... 174
Tabla 30. Resumen estadístico para los niveles de residuos de clorpirifos, para el
par aceite-fruta.............................................................................................. 175
Tabla 31. Resumen estadístico para los niveles de residuos de carbendazim, para el
par aceite-fruta.............................................................................................. 176
Tabla 32. Resumen estadístico para los niveles de residuos de tiabendazol, para el
par aceite-fruta.............................................................................................. 177
Tabla 33. Coeficientes de correlación hallados entre los niveles de residuos de
plaguicidas de la fruta entera y los aceites esenciales de naranja Valencia.
Temporadas 2012, 2013 y 2014. ................................................................... 178
Índice
Í N D I C E D E F I G U R A S
Figura 1. Distribución geográfica de producción de naranjas en Argentina. ............. 2
Figura 2. Distribución de la producción de cítricos en las regiones del NOA y el NEA
en Argentina ...................................................................................................... 5
Figura 3. Diagrama del proceso de extracción simultanea de jugo, emulsión aceites-
agua y cáscaras, semillas, pulpa y membranas. Tecnología FMC ...................... 9
Figura 4. Diagrama del proceso de aceite descerado en línea ................................. 12
Figura 5. Estructura química del benzimidazol ........................................................ 40
Figura 6. Estructura química del tiabendazol ........................................................... 42
Figura 7. Estructura química del carbendazim ......................................................... 43
Figura 8. Estructura química general de compuestos organofosforados. ............... 45
Figura 9. Estructura química general de plaguicidas organofosforados .................. 46
Figura 10. Estructura química del clorpirifos ........................................................... 48
Figura 11. Estructura química del procloraz ............................................................ 50
Figura 12. Etapas de la metodología de Extracción en Fase Sólida (SPE) ................ 60
Figura 13. Ejemplo de distintos pasos en la preparación de una muestra de naranja
siguiendo el método QuEChERS. (Fuente: Fuentes et al. (2015)) ................... 65
Figura 14. Esquema de la separación de pigmentos en una columna cromatográfica
de Tsweet. ....................................................................................................... 66
Figura 15. Esquema del proceso de separación cromatográfica ............................. 68
Figura 16. Respuesta en función de la concentración del analito. Atributos de los
métodos .......................................................................................................... 81
Figura 17. Diagrama del proceso de obtención de aceite esencial descerado ........ 96
Figura 18. Esquema del plan de muestreo para frutas de ingreso .......................... 97
Figura 19. Recolección de muestras de frutas enteras ............................................ 98
Figura 20. Toma de muestra y acondicionamiento de muestras de aceites
esenciales descerados ..................................................................................... 99
Figura 21. Preparación de muestras de frutas enteras .......................................... 100
Figura 22. Cromatograma de clorpirifos obtenido por GC-MS .............................. 117
Figura 23. Regresión lineal con disoluciones patrón de clorpirifos ........................ 120
Figura 24. Regresión lineal en muestras de fruta entera pre-adicionada con
clorpirifos ...................................................................................................... 121
Figura 25. Regresión lineal en muestras de fruta entera post-adicionada con
clorpirifos. ..................................................................................................... 123
Índice
Figura 26. Rectas de regresión de clorpirifos de las disoluciones patrón y de las
muestras de fruta pre-adicionadas. .............................................................. 124
Figura 27. Rectas de regresión de clorpirifos de las disoluciones patrón y de las
muestras de frutas post adicionadas. ........................................................... 125
Figura 28. Regresión lineal con disoluciones patrón de clorpirifos ........................ 131
Figura 29. Regresión lineal en muestras de aceite esencial adicionadas con
clorpirifos ...................................................................................................... 132
Figura 30. Rectas de regresión de clorpirifos de las disoluciones patrón y de las
muestras de aceite esencial adicionadas. ..................................................... 134
Figura 31. Cromatogramas obtenidos por LC-MS/MS: (a) Carbendazim, (b)
Procloraz, (c) Tiabendazol ............................................................................. 138
Figura 32. Regresión lineal con disoluciones patrón de tiabendazol ..................... 140
Figura 33. Regresión lineal en muestra de fruta entera pre-adicionada con
tiabendazol .................................................................................................... 141
Figura 34. Regresión lineal en muestras de fruta entera post-adicionada con
tiabendazol .................................................................................................... 142
Figura 35. Rectas de regresión de tiabendazol de las disoluciones patrón y de las
muestras de frutas pre-adicionadas .............................................................. 144
Figura 36. Rectas de regresión de tiabendazol de las disoluciones patrón y de las
muestras de frutas post-adicionadas. ........................................................... 145
Figura 37. Regresión lineal con disoluciones patrón de procloraz ......................... 149
Figura 38. Regresión lineal en muestras de aceite esencial adicionada con procloraz
....................................................................................................................... 151
Figura 39. Rectas de regresión de procloraz de las disoluciones patrón y de las
muestras de aceite esencial adicionadas. ..................................................... 153
Figura 40. Regresión lineal con disoluciones patrón de carbendazim .................. 157
Figura 41. Regresión lineal en muestras de aceite esencial adicionada con
carbendazim .................................................................................................. 159
Figura 42. Rectas de regresión de carbendazim de las disoluciones patrón y de las
muestras de aceite esencial adicionadas. ..................................................... 160
Figura 43. Regresión lineal en muestras de aceite esenciales adicionadas con
tiabendazol .................................................................................................... 164
Figura 44. Rectas de regresión de tiabendazol de las disoluciones patrón y de las
muestras de aceite esencial adicionadas ..................................................... 166
Figura 45. Diagrama de cajas y bigotes para procloraz en el par muestral aceite-
fruta ............................................................................................................... 174
Figura 46. Diagrama de cajas y bigotes para clorpirifos en el par muestral aceite-
fruta ............................................................................................................... 175
Índice
Figura 47. Diagrama de cajas y bigotes para carbendazim en el par muestral aceite-
fruta ............................................................................................................... 176
Figura 48. Diagrama de cajas y bigotes para tiabendazol en el par muestral aceite-
fruta ............................................................................................................... 177
CAPITULO I
INTRODUCCIÓN
Introducción
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
1
I. INTRODUCCIÓN
I.1. Producción nacional y regional de citrus en Argentina
Argentina manifiesta un continuo crecimiento del sector
citrícola, tanto en frutos frescos como en procesados. Su producción
provoca un importante impacto socioeconómico, fundamentalmente
en la región del Noroeste Argentino (NOA) con la representación del
63% de la producción nacional y el resto en la región Noreste
Argentino (NEA). La producción nacional de citrus en el contexto
internacional sitúa a Argentina como uno de los países más
importantes en la exportación de frutos frescos, jugos concentrados y
aceites esenciales. El principal mercado de aceites esenciales es la
industria de aromas y bebidas (Cohn y Cohn, 1996). El Informe
Regional 2011-2012 del Instituto Nacional de Tecnologías
Agropecuarias destaca que el volumen de producción total estimado
para cítricos en Argentina es de 2.895.761 toneladas (Federación
Argentina del Citrus, 2012).
La producción citrícola nacional abastece al mercado interno
de frutos frescos y a la producción de jugos. El resto de la producción,
como jugos concentrados, aceites esenciales, cáscara deshidratada y
pulpa congelada, es exportada a diferentes países. La provincia de
Entre Ríos, ubicada en la región del NEA, localiza su producción
sobre la costa del Río Uruguay en los Departamentos de Concordia,
Federación y zona norte de Colón. Esta región de la provincia es la
principal productora nacional de naranjas y mandarinas, con una
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2
participación del 46% para naranjas y 63% para mandarinas con
respecto a la producción nacional, y un 90% entre ambas con respecto
a la producción provincial. Las variedades de limón y pomelo se
producen mayoritariamente en la región del NOA, especialmente en la
provincia de Tucumán, representando un 75% de la producción de
dicha provincia. En la provincia de Entre Ríos se estima que un 22%
de la producción de frutas frescas es destinada al mercado exterior,
58% a mercado interno y el 20% a industria (Informe Provincia de
Entre Ríos, 2011).
En la figura 1 se indica la distribución geográfica de la
producción citrícola de naranjas en la región Noreste Argentino
(NEA).
Figura 1. Distribución geográfica de producción de naranjas en Argentina.
Región NEA
Fuente: CECNEA, 2015. http://www.cecnea.com/es/exportacion/default.htm
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3
El sector citrícola continuamente se esfuerza para estar
tecnológicamente actualizado y mejorar su producción primaria,
transporte, capacidad de empaque y procesado industrial, a pesar de
las dificultades fiscales actuales del país que continúan siendo
desfavorables para el exportador. Además, se han desarrollado
políticas con el fin de afianzar las relaciones con la Unión Europea,
España en especial, lo que ha contribuido al incremento permanente
de las exportaciones y al reconocimiento de la calidad de estos
productos en los mercados mundiales (Federación Argentina del
Citrus, 2012). Esto implica que es necesario adaptarse a las
legislaciones de los distintos países, cada vez más exigentes en
relación a los niveles de plaguicidas. Es imprescindible hacer un
esfuerzo para reducir el uso de los mismos y desarrollar metodologías
analíticas que permitan controlar los residuos de plaguicidas en los
productos que van a ser comercializados, tanto en las frutas frescas
como en los productos derivados.
El tema de los residuos de plaguicidas en frutos cítricos es
particularmente importante debido a que, por el carácter lipófilo de la
mayor parte de ellos (aunque no de todos), estas sustancias penetran
con facilidad en las celdillas donde se encuentran los aceites
esenciales que tapizan la corteza de los frutos cítricos y quedan allí
bloqueadas y retenidas, con lo que su persistencia es mayor de lo que
sería en otro tipo de productos vegetales (Coscollá, 2003).
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4
I.2. Producción de aceites esenciales.
En materia de producción de aceites esenciales, Argentina se
encuentra entre los principales exportadores del mundo,
fundamentalmente el aceite obtenido a partir de limón producido en el
NOA, con la mayor participación de la provincia de Tucumán. A
menor escala se cuenta con la producción de aceites a partir de
naranjas y mandarinas, especialmente en la región del NEA. En la
última década, Argentina se ha destacado en la producción de aceites
esenciales de limón llegando a producir 2413 toneladas durante el año
2014 y habiendo alcanzado su mayor producción en el año 2006 con
6000 Tn (FEDERCITRUS, 2015). El principal mercado de estos
productos es la industria de aromas y bebidas, ya que el contenido de
compuestos oxigenados, le confieren el bouquet y cualidad olfativa
característica, estimándose su valor comercial por la riqueza de estos
constituyentes, principalmente aldehídos, alcoholes y ésteres
monoterpénicos (Retamar, 1982).
En la figura 2 se indica la producción de cítricos en las
regiones del NOA, donde predomina el limón y la del NEA, donde
predomina la producción de naranjas y mandarinas.
Los aceites esenciales son productos en los que se hallan
concentrados sabores y aromas característicos, constituidos por
mezclas complejas de hidrocarburos, compuestos oxigenados y
residuos no volátiles. Son extraídos de receptáculos o vesículas
oleosas del flavedo de cítricos, y la calidad y cantidad de estos aceites
depende de la variedad y madurez de la fruta, así como de la
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5
localización de la plantación. El aceite extraído de naranja Valencia es
considerado como el de mayor calidad dentro de los aceites de
naranja, como así también lo son dentro de su grupo el aceite de limón
italiano y el de mandarinas verdes (Mazzuz, 1996). En su composición
existe presencia del d-limoneno, el cual comprende más del 95% en el
aceite de naranja y 90% en el aceite de limón, aunque su contribución
al sabor es limitada. Las fracciones importantes que contribuyen al
aroma frutal son ésteres y aldehídos solubles en agua. El aceite
concentrado de mandarina (Citrus reticulata) puede utilizarse como
colorante y saborizante para bebidas, cuando el contenido de
carotenoides se concentra por encima de 4000 ppm en el aceite (Cohn
y Cohn, 1996).
Figura 2. Distribución de la producción de cítricos en las regiones del NOA y el
NEA en Argentina
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6
Para la obtención de aceite esencial de frutas cítricas, se
emplean tanto frutas provenientes de campo como de descarte de los
empaques. Es por ello que el manejo de la materia prima y el control
de los lotes de producción resulta de suma importancia para la
industria citrícola. Según la procedencia y los métodos extractivos
aplicados para su obtención, los aceites esenciales cítricos tienen
diferencias marcadas en su composición. Las diferencias en las
variedades cítricas, partes de la planta o del tejido vegetal, zona de
producción, épocas de recolección, madurez de los frutos, etc., son
factores de relevancia en la composición y diversificación de la
utilización de estos aceites y, por ende, inciden sobre la calidad y
cotización durante la comercialización de los mismos (Kimball, 1999).
Los aceites esenciales son extraídos de todas las variedades
de cítricos y de las diferentes partes del tejido vegetal, tal como los
obtenidos de hojas, flores y de la cáscara de los frutos. Por ejemplo,
aquellos extraídos de la cáscara de los frutos contienen como
componente principal del aceite cítrico el d-limoneno, que
mayoritariamente proviene de naranjas, como se ha comentado
anteriormente. El aceite petit-grain es un producto muy buscado por
las perfumerías, que se obtiene de las hojas de los árboles cítricos,
específicamente del naranjo amargo, y es Paraguay su principal
productor y exportador en el mundo. Está constituido
fundamentalmente por compuestos oxigenados y en él predomina el
acetato de linalilo. Su rendimiento es del orden del 0,2% y su precio
en el mercado es muy alto (Pássaro-Carvalho y Londoño-Londoño,
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7
2012). También se extrae el nerolí de las flores, cuyos componentes
oxigenados de mayor proporción son los alcoholes monoterpénicos.
Del mandarino se extraen dos tipos de aceites, el petit-grain de las
hojas, y el de la cáscara del fruto, el cual tiene un elevado contenido
de hidrocarburos terpénicos y su grupo odorante está formado por la
asociación de aldehídos, alcoholes y ésteres, que incluye pequeñas
fracciones de metilantranilato de metilo. La combinación variable de
estos compuestos da lugar a unas características específicas para su
uso o aplicación en la industria.
La metodología de extracción es de fundamental importancia
en la calidad de los aceites extraídos, como también de los jugos. El
rendimiento de extracción para aceites en fruta fresca es de
aproximadamente 0,4% en limón, 0,2-0,4% en naranja y 0,2% en
pomelo. Para producir 1 tonelada de aceite pulido y descerado, la
industria procesadora utiliza entre 250 a 500 toneladas de fruta,
relación que puede variar en función de las condiciones climáticas
imperantes durante el ciclo de producción (ECA, 2015).
En general, los aceites pueden obtenerse por varios
procedimientos. Cuando se obtienen por prensado en frío, seguido de
clarificación y centrifugación, no cabe esperar ninguna degradación o
pérdida importante de los residuos de plaguicidas que estén en los
aceites. Cuando el aceite que no ha sido obtenido por el método
anterior, se recupera de las pieles en corriente por destilación de
vapor, se favorece la hidrólisis del plaguicida (Dupuis, 1975). En
general, el análisis de los aceites, especialmente los obtenidos por
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8
prensado por frío, indican la presencia de altos niveles de residuos de
plaguicidas (Coscollá, 1993).
El método de obtención por frío de los aceites esenciales
contenidos en la cáscara de las frutas cítricas, a las cuales se le extraen
los jugos contenidos en la pulpa, depende del tipo de extractor de jugo
utilizado en la línea de la industria. Existen dos tipos de extractores,
uno de ellos separa el aceite de la fruta simultáneamente durante el
proceso de extracción de jugo, y se usa en la mayoría de los países
productores de cítricos, denominado extractor FMC “In-Line” (Food
Machine Corporation) (Lorente et al., 2011), como muestra la figura
3. Se pueden describir las siguientes fases:
1- En la primera fase del ciclo de extracción, la copa
superior se desplaza hacia abajo provocando una presión
en el cítrico de forma que las cuchillas superior e inferior
comienzan a cortar los extremos superior e inferior del
fruto.
2- En la segunda fase, los dedos de las copas se entrecruzan,
el aumento de presión sobre el cítrico obliga al zumo y a
las partes interiores del fruto (pulpa, membranas y
semillas) a pasar a través del fondo al cilindro tamizador,
a la vez que la corteza empieza a salir por la parte
superior, entre la copa y la cuchilla.
3- En la última fase, las porciones interiores del cítrico se
hallan localizadas en el interior del cilindro tamizador, el
tubo del orificio se mueve hacia arriba, presionando el
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9
contenido del cilindro tamizador, lo que provoca que el
zumo y la pulpa pasen a través de los orificios del tamiz y
pasen al depósito colector de zumo. Las cortezas rotas al
ser forzadas a pasar a través de los dedos de las copas, se
eliminan por la parte superior de la máquina y se depositan
en un colector.
Durante la extracción, las pieles forzadas a pasar a través de
los dedos de las copas, sueltan el aceite esencial contenido en las
vesículas. Este aceite puede ser arrastrado mediante una corriente de
agua y recogido por separado como una emulsión de aceite (Pássaro
Carvalho y Londoño-Londoño, 2012).
Figura 3. Diagrama del proceso de extracción simultánea de jugo, emulsión aceites-
agua y cáscaras, semillas, pulpa y membranas. Tecnología FMC
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10
El otro tipo de extracción corresponde al sistema Brown; en
este método la extracción de aceites esenciales es previa a la
extracción de jugo, siendo su principio extractivo, el efecto que
ejercen sierras circulares sobre la superficie de las frutas parcialmente
sumergidas en agua (Kimball, 1999).
El sistema del extractor FMC In-Line es capaz de procesar
entre 5.000 y 15.000 Kg de fruta. En la FMC In line, las partículas de
la corteza (raspaduras o frit) son separadas resultando una emulsión
aceitosa, con tres componentes: agua, gotas de aceite esencial y
sólidos finos que han atravesado el finisher. Para que éste funcione
correctamente, se debe asegurar que el finisher empleado tenga
capacidad para procesar la mezcla con que es alimentado y retenga los
sólidos particulados. La presión del mismo debe de ser
cuidadosamente controlada, de forma que se consiga una presión
intermedia, ya que si es alta muchos sólidos y pectinas pueden ser
forzados a pasar a la emulsión, con lo que aumentaría la viscosidad y
dificultaría la separación en las centrífugas. Por el contrario, si es muy
baja se perdería gran cantidad de agua y aceite esencial que serían
expulsados fuera del sistema a través de la corriente de raspaduras.
Usando cabezas de aire o mecánicas se consigue una presión media
que permite que la emulsión que va a la primera centrífuga tenga en
torno a un 2-4% de sólidos que se pueden separar mediante
centrifugación a 4500 r.p.m.
Acoplando dos centrífugas se recupera prácticamente la
totalidad del aceite esencial contenida en la emulsión “ligera”
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procedente del finisher, como aceite esencial puro. El paso por la
primera centrífuga se conoce como concentración o deslodado o
desludging, y el paso por la segunda como refinado o polishing (figura
4). El último paso del proceso de recuperación del aceite en frutos
cítricos es el refinado polisher, que consiste en pasar la emulsión
enriquecida a través de una centrífuga de alta velocidad, que opera
entre las 16000 y las 18000 r.p.m., con lo que se consigue separar el
aceite esencial del agua sobrenadante, decantando al mismo tiempo las
partículas sólidas presentes en la emulsión. Tras la centrifugación, el
aceite esencial es recogido en un tanque de acero inoxidable, donde
floculan las ceras a bajas temperaturas. Se obtiene así el denominado
aceite descerado, alcanzando temperaturas de -18°C durante 15 a 30
días (FMC, 1980). Si a estos mismos aceites se les vuelve a
centrifugar, filtrar y/o seguir el tratamiento de descerado en frío, la
calidad de estos aceites es de aceite súper descerado.
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12
Figura 4. Diagrama del proceso de aceite descerado en línea
La calidad de los aceites obtenidos en las condiciones
anteriormente mencionadas, corresponde para el aceite descerado a un
producto brillante y sin presencia de ceras cuando se los expone a
temperatura ambiente y para aceite súper descerado, cuando
permanecen brillantes y no presentan cera al ser sometidos a
temperatura de -10°C durante un periodo de tiempo no superior a 24
horas.
Estos productos definen su valor en el mercado externo en
función de sus propiedades y características fisicoquímicas, siendo el
nivel de residuos de agroquímicos uno de los factores de calidad de
fundamental importancia a considerar, al momento de la
comercialización. Para sostener las exportaciones, es necesario
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13
cumplir con las rigurosas exigencias del mercado internacional, que
incluyen también el control de estos residuos.
El contenido de residuos de agroquímicos en el producto, se
encuentra al igual que en el jugo concentrado, en estrecha relación con
los niveles residuales en la fruta utilizada como materia prima
(Blasco, Font, Pico, 2002). Durante el proceso de limpieza del fruto,
especialmente cuando se hace por lavado en agua con algún
detergente específico y posterior cepillado con pulverización de agua,
puede ocurrir una eliminación parcial de los residuos de plaguicidas
que llevaba el fruto como consecuencia de los tratamientos pre y
postcosechas. La proporción de residuos eliminados en este proceso
de lavado depende, básicamente de tres factores, entre ellos, el tiempo
transcurrido entre el tratamiento y el procedimiento de lavado,
características del lavado y tipo de plaguicida y/o fungicida (Coscollá,
1993). Para aceites cítricos extraídos se han hallado valores que
demuestran que los niveles iniciales de residuos en la fruta que ingresa
a la industria es eliminada parcialmente en el proceso de lavado y
cepillado, pero los residuos remanentes en la fruta post lavado logran
persistir en los aceites esenciales, aunque tal persistencia presenta
diferencias significativas para los diversos analitos en los aceites
pulidos y descerados (Montti, 2013).
Diferentes estudios han demostrado que productos
industriales pueden contener niveles elevados de plaguicidas, al
derivar de frutas que han sido tratadas con fitosanitarios (García-
Reyes et al., 2008). Por ello, es imprescindible el control de los
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14
niveles de residuos en productos obtenidos a partir de frutas en
general y cítricas en particular, para asegurar que los productos que
resultan de la industrialización no comprometan la seguridad del
mismo. Algunos de los plaguicidas hallados a niveles residuales son
clorpirifos, procloraz y tiabendazol, entre otros, para aceites esenciales
pulidos y descerados extraídos a partir de cítricos de la variedad
naranja valencia (Montti et al., 2013)
I.3. Enfermedades y plagas en Citrus
Los principales factores que influyen en la producción de
cítricos se encuentran fundamentalmente vinculados a la expansión de
plagas y enfermedades. Entre los patógenos que se destacan por sus
efectos devastadores se encuentran el virus de la tristeza, el cancro, la
clorosis variegada y la muerte súbita, cuyo agente causal aún no se
conoce, y otras. También hay que destacar la introducción y
dispersión de diferentes plagas que en su mayoría son vectores de las
enfermedades antes mencionadas. De acuerdo a los tratados de
comercialización establecidos entre los diversos países, los
citricultores se ven obligados a incrementar la producción por hectárea
bajo estrictas normas ambientales, de inocuidad y calidad, al tiempo
que deben competir en precios a nivel internacional. Dada la
importancia económica de los cultivos cítricos en Argentina, se
contempla desde el sector una mejora sustancial en la producción,
mediante la certificación de semillas y de yemas que aseguren la
ausencia de enfermedades y de patógenos en el cultivo, el
fortalecimiento de las cadenas de producción-consumo, y la oferta de
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Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
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15
diversos productos cítricos de calidad (Marcó, 2001; Huerga y San
Juan, 2005; Palacios, 2005).
Según el informe fitopatológico realizado por la Estación
Experimental Agroindustrial Obispo Colombres en el año 2012, los
cítricos padecen enfermedades, siendo algunas de ellas provocadas en
el campo durante el periodo de crecimiento y maduración de los frutos
y otras características del periodo de postcosecha
(http://www.eeaoc.org.ar/upload/publicaciones/archivos/29/20120207
185614000000.pdf) Algunas de las enfermedades que aparecen
durante la producción del sector primario son las siguientes:
I.3.1. Cancrosis de los citrus:
Es causada por Xanthomonas citri subsp. citri, bacteria Gram
negativa, no esporulada, con forma de bastón recto. Esta enfermedad
se presenta como endémica en las principales regiones productoras de
cítricos del mundo. La bacteria penetra en los diferentes órganos
aéreos de la planta directamente a través de las aberturas naturales
(estomas, lenticelas, hidatodos, etc) o heridas de tejidos susceptibles.
Los frutos son susceptibles los primeros 90 días desde el cuaje, un
período mucho mayor que el de las hojas. En frutos pequeños, los
cancros pueden tener unos 2-5 mm de diámetro y pueden unirse unos
a otros afectando áreas importantes de la epidermis. La apariencia de
las lesiones también es suberificada y crateriforme, pero el halo suele
ser menos definido, aunque siempre hay una zona de aspecto húmedo
aceitoso en los márgenes de la lesión cuando éstas son recientes. El
daño que produce en frutos se limita a la epidermis y en forma parcial
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al albedo, no llegando a afectar la calidad ni cantidad de jugos, por eso
se la denomina cosmética. Un ataque severo de la enfermedad produce
defoliación, caída prematura de frutos y declinamiento general de la
planta, aunque nunca se ha observado la muerte de la misma. El
mayor inconveniente de esta enfermedad es que se trata de una
enfermedad cuarentenaria para la Unión Europea y EE.UU (Graham y
McGuire, 1987; Anderson et. al., 1996; Canteros, 2001, Brunings y
Gabriel, 2003; Graham et al., 2004; Polek et. al., 2007; Tennant et al.,
2009).
El minador de los citrus causada por Phyllocnistis citrella
Sta, es una enfermedad relacionada con la cancrosis. Provoca daño
directo en hojas, ya que causa numerosas galerías lo que produce
puertas de entrada para la bacteria que produce cancrosis y disminuye
la capacidad fotosintética de la planta. Las plantas de vivero y
plantaciones jóvenes son las más susceptibles al ataque del minador
por tener frecuentes brotaciones (Heppner, 1993; Amorós, 1994;
Knapp, 1996; Rodríguez et al., 1998).
I.3.2. Clorosis variegada de los cítricos (CVC):
Es causada por Xylella fastidiosa subsp. pauca, bacteria
Gram negativa, circula por xilema y se cultiva en medios sintéticos.
Esta enfermedad afecta la producción y comercialización de fruta
fresca y la producción de jugo cítrico concentrado. Produce
defoliación de ramas superiores de los árboles y muerte de ramas.
Afecta a todas las variedades de naranjo dulce, siendo las más
susceptibles Valencia y Hamlin. La enfermedad es más severa en
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17
plantas jóvenes, hasta 10 años de edad. Se transmite por injerto o por
insectos vectores. En los frutos se manifiesta por reducción del
tamaño y endurecimiento de los mismos, además, aparece un color
amarillo intenso que contrasta con los frutos normales (Anderson et.
al., 1996; Tennant et al., 2009; Canteros, 2010; Ramírez Lluch y Cruz,
2011).
I.3.3. Virus de la tristeza de los cítricos o citrus tristeza virus (CTV):
El virus de la tristeza de los cítricos pertenece a los
closterovirus (virus filamentoso), siendo el causante de la enfermedad
viral más grave de los cítricos (Anderson et. al., 1996). El daño más
evidente es el decaimiento y muerte de los árboles injertados sobre
naranjo amargo y clorosis nervial y acanaladuras en la madera. El
virus causa la muerte de las células del floema en el naranjo amargo,
produciendo un bloqueo de los tubos conductores de savia elaborada a
nivel de la línea de injerto. El decaimiento lento comienza con una
clorosis progresiva de las hojas y seca de las ramillas en la parte
exterior de la copa. Las nuevas brotaciones son cortas y tienen lugar
en las ramas viejas dando lugar a una disminución progresiva del
volumen de la copa. La producción de frutos es menor y éstos son de
tamaño reducido y color más pálido que los frutos de árboles sanos.
Otro síntoma es la formación de orificios visibles en la cara cambial
de la corteza, en los que suele observarse una zona de color pardo
debajo de la línea de injerto; este síntoma no suele ser apreciable en
árboles recientemente infectados. La identificación de CTV por
síntomas en campo no es segura, además la ausencia de síntomas no
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implica que el virus no esté presente, ya que éste puede albergarse en
plantas tolerantes (http://www.infoagro.com/citricos/naranja2.htm)
(Anderson et. al., 1996; Cambra y Moreno, 2000; Cambra et al., 2000;
Palacios, 2005; Tennant et al., 2009)
I.3.4. Sarna de los cítricos:
Existen diferentes tipos de sarna, causadas por hongos
(Anderson et. al., 1996):
- Sarna del naranjo agrio (Elsinoe fawcetti - Sphaceloma fawcetti):
afecta al limón, mandarina, pomelo y portainjertos.
- Sarna del naranjo dulce (Elsinoe australis – Sphaceloma australis):
afecta a la naranja y mandarina.
- Sarna de Tryon (Elsinoe fawcetti var. scabiosa - Sphaceloma
fawcetti var. Scabiosa): afecta al limonero rugoso.
Esta enfermedad produce daños en el aspecto externo de los
frutos, disminuyendo su valor comercial. Además reduce la superficie
activa de la epidermis del fruto, afectando su crecimiento, madurez y
calidad industrial. El síntoma más característico es la aparición de
protuberancias de aspecto corchoso sobre la superficie de los frutos.
Cuando el fruto crece, las pústulas coalescen formando grandes áreas
costrosas o escaldadas, que se resquebrajan en placas a medida que el
fruto se expande (Palacios, 2005; Dewdney y Timmer, 2012).
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Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
19
I.3.5. Mancha negra de los cítricos:
Es causada por Guignardia citricarpa Kiely (fase asexual:
Phyllosticta citricarpa McAlpine van der Aa). Es una enfermedad
fúngica que afecta a la calidad comercial de los frutos cítricos en el
campo y durante el transporte. Las ascosporas, cuando maduran son
liberadas y dispersadas por el viento. Éstas infectan hojas jóvenes
(brotes), frutos desde recién cuajados hasta los 4 ó 5 meses de edad,
período durante el cual el fruto permanece susceptible. Provoca
lesiones en la cáscara a nivel de flavedo y, en ataques severos, puede
ocasionar la caída prematura de frutos en aquellos cultivares de
maduración tardía (Anderson et. al., 1996; Kotze, 2000; Palacios,
2005; Canteros, 2010). El mayor inconveniente es que se trata de una
enfermedad cuarentenaria para la Unión Europea y EE.UU. Provoca
cuatro síntomas diferentes en los frutos, lo que hace difícil su
diagnóstico en campo:
a- Mancha típica o mancha dura o hard spot: es el síntoma
típico de esta enfermedad. Comienza a observarse cuando
el fruto inicia el cambio de color, aunque puede ser
observado en frutos verdes que han alcanzado su tamaño
definitivo. Son lesiones circulares, normalmente de 2 a 5
mm de diámetro pudiendo llegar a 10 mm. Tienen un
margen, que puede ser sobre elevado o no, de color
castaño a negro que se diferencia claramente del centro de
la lesión, el cual es de color grisáceo o castaño más claro y
levemente deprimido. A menudo se puede observar un
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halo rodeando a cada lesión de color amarillo cuando el
fruto está verde, y verde cuando el fruto colorea. Algunas
lesiones muestran, sobre el centro de las mismas,
puntuaciones negras que corresponden a las
fructificaciones asexuales (picnidios de Phyllosticta
citricarpa) (Bazan, 2002; Spósito, 2004; Palacios, 2005;
Stein, 2011).
b- Mancha pecosa o freckle spot: aparece cuando el fruto ha
cambiado su color. Son puntuaciones deprimidas, de color
rojizo, que van aumentando su tamaño a medida que
avanza la madurez del fruto. Frutos que en la cosecha se
muestran como aparentemente sanos, pueden manifestar
este tipo de lesión en post-cosecha, cuando permanecen
expuestos a la luz solar y altas temperaturas. Además, la
mancha pecosa puede avanzar y formar lesiones virulentas
(Anderson et. al., 1996; Kotze, 2000; Palacios, 2005;
Stein, 2011).
c- Mancha virulenta o virulent spot: es observada en frutos
maduros, sobre todo en plantaciones viejas, con ataques
severos, o afectadas con virus. Son lesiones al principio
circulares y luego irregulares, deprimidas, de color rojo
ladrillo a castaño rojizo, pueden confluir formando
grandes áreas necróticas y profundas. El borde de la lesión
es rojizo y va oscureciéndose a medida que avanza la
madurez del fruto. El centro puede ser rojizo o mantenerse
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Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
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grisáceo, y normalmente desarrolla numerosos picnidios
(Kotze, 2000; Palacios, 2005; Almeida, 2009, Stein, 2011)
d- Falsa melanosis o speckled blotch: en este caso el fruto
manifiesta lesiones circulares, pequeñas, de color castaño
a negro, rodeadas de puntuaciones menores. Suelen
presentar un halo verdoso. A menudo se distribuyen en
forma agrupada del lado expuesto al sol, aunque a veces se
distribuyen en forma de lagrimeo. Se las observa desde
frutos recién cuajados hasta frutos maduros. Son suaves al
tacto y no se desprenden del tejido. No desarrolla
picnidios.
Existen otras enfermedades fúngicas que presentan síntomas
similares a la mancha negra, tales como, septoriosis, melanosis,
mancha grasienta y antracnosis.
El grupo de enfermedades características del período de post-
cosecha también provoca daños en los frutos. Entre ellas cabe
mencionar las enfermedades provocadas por moho verde y moho
azul, podredumbre amarga de los cítricos, podredumbre morena o
marrón y podredumbres pedunculares.
I.3.6. Moho verde y Moho azul:
Las enfermedades provocadas por estos mohos son causados
por Penicillium digitatum (moho verde) y Penicillium italicum (moho
azul) provenientes del aire, suelo, líneas de empaque y otras fuentes
de contaminación. Estas enfermedades frecuentemente causan
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pudrición en frutos cítricos, provocando importantes pérdidas
económicas, manifestándose con la aparición de una zona blanda muy
humedecida, que se cubre progresivamente de un moho blanco (parte
vegetativa del hongo). Luego aparecen las esporas de color verde o
azul. Ninguno de estos patógenos puede afectar a la fruta si no tiene
heridas en su superficie. Pueden permanecer sobre la piel de los frutos
varios meses y luego infectar a través de líquidos segregados de la
corteza del fruto. Estos hongos completan su ciclo de reproducción
entre 24 a 48 h a una temperatura media de 20 a 25 ºC con alta
humedad (Anderson et. al., 1996; Smilanick y Sorenson, 2001; Prusky
et al., 2004; Smilanick y Mansour, 2007; Tennant et al., 2009).
I.3.7. Podredumbre amarga de los cítricos:
Esta enfermedad es causada por Geotrichum citri aurantii.
Las esporas del hongo son hialinas, de olor característico a levadura.
Este hongo está presente normalmente en el suelo y es dispersado por
el viento o por gotas de agua. Las enzimas extracelulares producidas
por el hongo degradan la cáscara, causando la desintegración del fruto
en una masa acuosa (podredumbre blanda) con desprendimiento de
líquido y olor ácido (Anderson et. al., 1996). Se presenta en todos los
cultivares cítricos del mundo. Es una de las enfermedades de mayor
incidencia en la exportación, considerando la dificultad de su control y
la magnitud del daño. Los frutos más susceptibles al ataque de este
patógeno son los maduros o sobremaduros cercanos al suelo y con
algún tipo de lesión. Normalmente se encuentra asociado a
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Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
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Penicillium digitatum y Penicillium italicum en infecciones mixtas
(Villalba Buendia, 1997; Palacios, 2005).
I.3.8. Podredumbre morena o marrón:
Esta enfermedad es causada por un hongo denominado
Phytophthora sp. Éste es de penetración directa, es decir, que no
necesita heridas para infectar. La pudrición ocasionada por este
patógeno, ocurre principalmente en épocas de lluvias y con
temperaturas entre 14 y 24 ºC. Comienza con una podredumbre dura
de color marrón claro que se extiende desde un extremo de la fruta y
avanza progresivamente causando la pudrición total de la misma. Los
frutos afectados despiden un olor rancio característico a pasto
fermentado (Erwin y Ribeiro, 1996; Tennant et al., 2009).
I.3.9. Podredumbres pedunculares:
Esta enfermedad es causada por Diplodia natalensis y
Phomopsis citri. Provoca una pudrición firme de color marrón en la
zona peduncular de escasa importancia, manifestándose en los frutos
más débiles (Anderson et. al., 1996). Comienza en esta zona, luego se
extiende a la parte interior del fruto presentando una coloración más
oscura. El podrido se extiende en forma irregular a partir del
pedúnculo. El grado de infección varía con la madurez del fruto y la
humedad presente, y suele ser grave en frutos desverdizados. Las
heladas, las altas temperaturas, exceso de humedad y ataques de
insectos favorecen la infección
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(http://www.eeaoc.org.ar/upload/publicaciones/archivos/29/20120207
185614000000.pdf).
En materia de plagas que afectan a la citricultura podemos
considerar las siguientes:
I.3.10. Mosca de la fruta (Ceratitis capitata):
Ceratitis capitata, es la mosca mediterránea de la fruta, es un
díptero tefrítido encontrado en más de 350 especies vegetales, entre
ellas cítricos y frutales. Esta plaga produce daños por la picadura de la
hembra en la oviposición. Se manifiesta por la producción de un
pequeño orificio en la superficie del fruto que forma a su alrededor
una mancha amarilla, en naranjas y mandarinas. Cuando la larva se
alimenta de la pulpa favorece los procesos de oxidación y maduración
prematura de la fruta, originando una pudrición del fruto que queda
inservible para el mercado. Si se envasan frutos picados con larvas en
fase inicial de desarrollo, se produce su evolución durante
el transporte. Los principales daños se suelen producir sobre las
variedades más precoces de mandarinas y naranjas (Thomas et al.,
2001; Beitia et al., 2002; Palacios, 2005; Alonso- Muñoz y García-
Marí, 2009)
I.3.11. Pulgones (Aphis spiraecola, A. gossypii, A. citricola, Toxoptera
aurantii, Myzus persicae):
El daño que causan consiste en la sustracción de linfa, que
comporta el debilitamiento de la planta, solo en caso de infecciones
masivas que es cuando se produce una gran emisión de melaza,
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Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
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25
acompañada del acartonamiento de las hojas.
Su agresividad y su capacidad para transmitir ciertas virosis como el
CTV, hacen que esta plaga sea potencialmente peligrosa. Su
dependencia de factores ambientales y la presencia de enemigos
naturales hacen que en algunos casos la incidencia sea menor. En
cualquier caso, el comportamiento errático de la plaga en condiciones
adversas (elevadas temperaturas y ambientes secos), hace muy difícil
su predicción sobre la posible virulencia del ataque (Melia y Blasco,
1980; Palacios, 2005; Ripa y Larral, 2008).
I.3.12. Cóccidos o cochinillas:
Los daños causados por las cochinillas consisten,
esencialmente, en la sustracción de savia que provoca una depresión
general en toda la planta. Además, la mayor parte de las especies
producen melaza, un líquido azucarado responsable de las
innumerables colonias de hormigas, comunes en las plantas infectadas
por las cochinillas y pulgones. Por otra parte, la melaza también es el
sustrato donde se desarrolla la fumagina. Las cochinillas viven en las
hojas, las ramas y sus ramificaciones y, en menor número, en los
frutos. Las numerosas generaciones que aparecen durante el año se
caracterizan por su elevada prolificidad
(http://www.infoagro.com/citricos/naranja2.htm).
Las plagas y enfermedades que afectan a los cítricos, desde
una óptica productiva, difícilmente configuran, en la actualidad, un
obstáculo insuperable para el desarrollo de la actividad. En la mayoría
de los casos con tradición técnica del manejo integrado de los cultivos
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Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
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26
se logra superar esta problemática. El uso de plaguicidas utilizados
para el control de plagas puede provocar grandes efectos perjudiciales:
intoxicaciones en el trabajador rural y en la población del campo,
contaminación del ambiente rural, los recursos naturales y muy
comúnmente presencia de niveles elevados en los alimentos, que
pueden suponer un riesgo importante para la salud de los
consumidores.
I.4. Plaguicidas
La agricultura tradicional demanda acciones tendentes a
estudiar, desarrollar y valorar estrategias que aseguren e incrementen
la producción agrícola con objeto de garantizar el suministro de
alimentos de calidad a la creciente población mundial. En este sentido,
la introducción de productos químicos de uso agrícola como los
plaguicidas, revolucionó la agricultura, hasta tal punto que este tipo de
compuestos ha llegado a ser indispensable para cultivar en áreas en las
que sin el uso de los mismos no sería posible. Asimismo los
fitosanitarios permiten extender el período de desarrollo de las plantas,
incrementar su rendimiento y producción, así como mantener su
calidad y aumentar su vida útil (Huerga y San Juan, 2005).
La necesidad de preservar los frutos cítricos destinados, tanto
para la comercialización en fresco como para industria, hace necesario
la utilización de plaguicidas. Estos frutos necesitan tratamientos
específicos en la etapa de producción en campo para preservarlos de
las plagas que atacan tanto a la planta como a los frutos. Además, en
la etapa de post-cosecha son tratados para preservarlos de las
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Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
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27
enfermedades fúngicas que puedan padecer durante el
almacenamiento, transporte y comercialización.
Actualmente se utilizan centenares de plaguicidas de
diferente naturaleza química mayoritariamente en agricultura, para
eliminar malas hierbas, plagas y hongos de los cultivos. Pese a que los
beneficios obtenidos a partir del uso de plaguicidas son numerosos, la
utilización a escala mundial de grandes cantidades de estos
compuestos ha dado origen a un conjunto de problemas que afectan al
medio ambiente y a la salud humana. De hecho, el uso continuado e
incontrolado de los plaguicidas, así como la elevada persistencia de
muchos de ellos en el medio ambiente, ha provocado la aparición de
problemas que inciden directamente sobre la salud humana y la
supervivencia de numerosas especies. En este sentido, es posible
encontrar residuos de plaguicidas en frutas, verduras, aguas, suelos,
etc. como consecuencia de su utilización en actividades agrícolas,
industriales y domésticas (OMS y PNUMA, 1992). En frutas se
encuentran niveles de residuos, principalmente, como consecuencia de
aplicaciones de plaguicidas de carácter sistémico y de mayor
persistencia, en diferentes momentos de producción: en el campo,
almacenamiento, en el drencher del empaque y/o fábrica. La entrada
de frutas con residuos de plaguicidas en la línea de producción
industrial, conlleva que los diferentes productos obtenidos a partir de
ellas, como pueden ser jugos y aceites esenciales, entre otros, también
presenten residuos de plaguicidas. Entre otros, en cítricos cabe
destacar el tiabendazol, carbendazim, procloraz y clorpirifos.
Introducción
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
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Ante la problemática originada por el uso de plaguicidas de
forma abusiva e incontrolada, en los últimos años se han ido
desarrollando nuevos medios de protección de los cultivos de nulo o
escaso impacto ambiental. El control biológico de plagas es el método
que produce menos daños ecológicos; sin embargo, por su acción más
lenta, menos efectiva y por la complejidad de los trabajos de
investigación y desarrollo, no ha podido competir con la lucha
química, de elevada toxicidad, pero de acción rápida y altamente
efectiva. En general, el control biológico de plagas se basa en la
utilización, por parte del hombre, de enemigos naturales (especies que
se alimentan de los parásitos dañinos de las plantas), con objeto de
reducir la población de la plaga a un nivel que no produzca daños
económicos importantes. En lo que respecta a la lucha integrada, a
diferencia de la lucha química tradicional donde el principal objetivo
es la eliminación total de la plaga, el sistema integrado tiene como
meta considerar el hábitat y la dinámica poblacional de las especies en
cuestión, para así utilizar todas las técnicas y métodos apropiados de
forma compatible, con objeto de mantener las plagas a niveles que no
originen daños económicos, sin dañar el medioambiente ni poner en
peligro la salud humana. Los sistemas integrados combinan la lucha
química y biológica, con controles genéticos, etológicos, mecánicos y
físicos e, incluso, el uso de plantas trampa.
La adopción de prácticas de control de plagas y enfermedades
menos agresivas para la salud y el medio ambiente por parte de los
productores argentinos, sin embargo, es muy baja. En su gran mayoría
Introducción
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
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han optado por las prácticas tradicionales, dado que el factor
socioeconómico del productor es clave. Es primordial optimizar el uso
de plaguicidas de forma que evite y/o minimice daños y enfermedades
en las frutas, manteniendo los niveles de residuos al mínimo posible
para lograr satisfacer las exigencias en el sector agroindustrial, el
mercado interno y de exportación, preservar el medio ambiente y
garantizar la salud de los consumidores de frutas y productos
derivados. Para esto es necesario, no solo compatibilizar acciones
tendentes a optimizar la producción citrícola regional, apuntando a
tratamientos con menores dosis de plaguicidas, sino también dotar de
medios y métodos analíticos de control acordes a las necesidades del
sector (Huerga y San Juan, 2005).
Si bien el concepto de calidad alimentaria abarca muchos
aspectos, la calidad higiénico-sanitaria es uno de los aspectos más
importantes. Por ello, en los productos agrícolas, en especial para los
cítricos, es necesario enfocar la calidad en relación a los niveles
residuales de los plaguicidas, tanto en frutas como en sus productos
industriales, como ya se ha comentado.
Resulta de vital importancia conocer los riesgos y la
toxicidad de estos compuestos, así como asegurar su aplicación
correcta (siguiendo las pautas de seguridad establecidas, aplicando las
dosis adecuadas y respetando los tiempos de seguridad indicados), de
manera que el alimento llegue al consumidor con mínimos riesgos
para su salud. Sin embargo, no siempre se llevan a cabo estas
indicaciones y, si no existe un control apropiado, los alimentos pueden
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Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
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llegar al consumidor con niveles de plaguicidas más elevados de los
que deberían contener. Como consecuencia, resulta necesario disponer
de métodos adecuados para su análisis, especialmente en alimentos,
con el fin de asegurar un consumo seguro.
I.4.1. Denominación y clasificación
Según el Codex Alimentarius, se define plaguicida como
“cualquier sustancia o mezcla de sustancias destinadas a prevenir,
destruir, repeler o mitigar cualquier plaga de los cultivos, incluidos
los vectores de enfermedades humanas o de animales y las especies
no deseadas en plantas o animales que causen perjuicio o interfieran
de cualquier forma en la producción, elaboración, almacenamiento,
transporte o comercialización de alimentos, productos agrícolas,
madera, productos de la madera o alimentos para animales, o
aquellos que puedan administrarse a los animales para combatir
ectoparásitos”.
Los plaguicidas se clasifican en función de algunas de sus
características principales, como son su toxicidad, su estructura
química, plaga que controlan y modo de acción. En 1978, la
Organización Mundial de la Salud (OMS) estableció una clasificación
basada en su peligrosidad o grado de toxicidad aguda (tabla 1),
definida ésta como la capacidad del plaguicida de producir un daño
agudo a la salud a través de una o múltiples exposiciones, en un
período de tiempo relativamente corto (Organización Mundial de la
Salud, Organización Panamericana de la Salud, División Salud y
Ambiente. Plaguicidas y salud en las Américas, 1993),
Introducción
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frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
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(http://www.sistemamid.com/panel/uploads/biblioteca/2014-05-
01_11-59-0899004.pdf).
Tabla 1. Clasificación de los plaguicidas según su toxicidad.
Fuente. Ramírez y Lacasaña (2001)
Clase Toxicidad Ejemplos
Clase IA Extremadamente peligroso Paratión, Dieldrín
Clase IB Altamente peligroso Eldrín, Diclorvos
Clase II Moderadamente peligroso DDT, Clordano
Clase III Ligeramente peligroso Malatión
La toxicidad se mide a través de la dosis letal media (DL50) o
de la concentración letal media (CL50), siendo la DL50, la cantidad
mínima de una sustancia, generalmente expresada en mg de
sustancia/Kg de peso del animal, capaz de provocar la muerte de un
50% de animales de prueba (generalmente ratas). Cuando la
exposición a la sustancia tóxica es a través del aire o del agua se le
llama CL50 y se expresa en mg/L. Ambos parámetros varían conforme
a múltiples factores, como la presentación del producto (sólido, gel,
líquido, gas, polvo, etc.), la vía de entrada (oral, dérmica o
respiratoria), la temperatura, la dieta, la edad, el sexo, etc. Los
resultados de DL50 obtenidos, proporcionan una orientación sobre la
toxicidad aguda del producto en su utilización y, al basarse en la
observación de especies animales, es importante señalar que estos
indicadores no proporcionan información en humanos sobre los
efectos crónicos ni sobre la citotoxicidad de algún compuesto. En base
a los valores de DL50, la OMS realiza una clasificación de los
Introducción
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plaguicidas en función de su toxicidad, vía de contacto (oral y tópica)
y formulación del producto (sólido o líquido) (tabla 2).
Tabla 2. Clasificación de los plaguicidas recomendada por la OMS
(OMS, 2004)
Fuente. ftp://tesis.bbtk.ull.es/ccppytec/cp582.pdf
Clasificación
DL50 en ratas (mg/kg de peso del animal)
Vía oral Vía tópica
Sólidos Líquidos Sólidos Líquidos
Extremadamente
tóxicos ≤ 5 ≤ 20 ≤ 10 ≤ 40
Altamente tóxicos 5-50 20-200 10-100 40-400
Moderadamente
tóxicos 50-500 200-2000
100-
1000 400-4000
Ligeramente
tóxicos > 500 > 2000 > 1000 > 4000
Según su vida media, los plaguicidas se clasifican en
permanentes, persistentes, moderadamente persistentes y no
persistentes (Organización Mundial de la Salud, Organización
Panamericana de la Salud, Centro Panamericano de Ecología Humana
y Salud, 1990) (tabla 3).
Introducción
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
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Tabla 3. Clasificación de los plaguicidas según su vida media
Fuente. Ramírez y Lacasaña (2001)
http://www.scsmt.cat/Upload/TextComplet/2/1/216.pdf
Persistencia a
Vida media b
Ejemplos
No persistentes De días hasta 12 semanas Malatión, Carbarilo,
Paratión,etc
Moderadamente
persistentes De 1 a 18 meses Paratión, Lannate, etc
Persistentes De varios meses a 20 años DDT, Aldrín,
Dieldrín,etc
Permanentes Indefinidamente Productos obtenidos a
partir de mercurio,
plomo, arsénico
a Capacidad de una sustancia o un compuesto, de permanecer en un sustrato del
ambiente en particular, después de que ha cumplido el objetivo por el cual se aplicó. b Lapso de tiempo necesario para que se degrade la mitad del compuesto o mezcla
aplicada.
De acuerdo a su estructura química, los plaguicidas se
clasifican en diversas familias, que incluyen desde los compuestos
organoclorados y organofosforados hasta compuestos inorgánicos
(tabla 4). En este trabajo nos referiremos solamente a algunas familias
de plaguicidas relevantes por el daño que causan a la salud y por su
gran uso.
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Tabla 4. Clasificación de los plaguicidas, según la familia química
Fuente. Ramírez y Lacasaña (2001)
http://www.scsmt.cat/Upload/TextComplet/2/1/216.pdf
Familia Química Ejemplo
Organoclorados DDT, aldrín, endosulfán, endrín
Organofosforados Bromofos, diclorvos, malatión
Carbamatos Carbaril, metomilo, propoxur
Tiocarbamatos Ditiocarbamato, mancozeb, maneb
Piretroides Cipermetrina, fenvalerato, permetrín
Derivados bipiridilo Clormequat, diquat, paraquat
Derivados del ácido
fenoxiacético
Dicloroprop, piclram, silvex
Derivados cloronitrofenólicos DNOC, dinoterb, dinocap
Derivados de triazinas Atrazina, ametrina, desmetrina,
simazina
Compuestos orgánicos del
estaño
Cihexatina, dowco, plictrán
Compuestos inorgánicos
Arsénico pentóxido, obpa, fosfito de
magnesio, cloruro de mercurio,
arsenato de plomo, bromuro de
metilo, antimonio, mercurio, selenio,
talio y fósforo blanco
Compuestos de origen
botánico
Rotenona, nicotina, aceite de canola
De acuerdo al ámbito de aplicación al que están destinados,
los plaguicidas se pueden clasificar en: acaricidas, alguicidas,
avicidas, bactericidas, defoliantes, fumigantes, fungicidas, herbicidas,
insecticidas, larvicidas, molusquicidas, nematicidas, ovicidas,
repelentes y rodenticidas
(http://www.epa.gov/pesticides/about/types.htm).
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Las propiedades fisicoquímicas de los plaguicidas utilizados
y la naturaleza del tejido vegetal son, entre otros, los factores de
mayor importancia a considerar. En este sentido, cobra especial
interés disponer de la información correcta respecto al grupo de
clasificación al cual pertenecen los fitosanitarios utilizados en los
tratamientos, ámbito de aplicación y la forma en que se depositan, la
penetración y persistencia en el tejido vegetal, entre otros aspectos.
También es interesante conocer si es posible la disminución o
eliminación de los residuos por causas diversas y/o durante los
procesos tecnológicos a los que son sometidos los frutos, tanto en
quintas, empaques, industria, etc.
Se define “residuos de plaguicidas” como la cantidad (mg/kg)
del producto, o de sustancias derivadas de su degradación, que quedan
sobre el producto cosechado y que pueden afectar al consumidor. Se
relaciona con la toxicidad, tanto aguda como crónica
(http://www.pv.fagro.edu.uy/cursos/pvh/DocsPVH/C-QUIMICO.pdf).
La denominación de residuo de plaguicida se refiere a cualquier
sustancia presente en el medio (suelos, corrientes de agua), en los
productos agrícolas o en los alimentos destinados al consumo humano
o animal como consecuencia del empleo de un plaguicida. Esta
definición no se limita al compuesto activo original, sino que también
incluye todas las moléculas derivadas del mismo por acción de los
factores ambientales o biológicos (metabolitos secundarios, productos
de conversión, de degradación) con propiedades tóxicas (Coscollá,
1993; González-Rumayor et al., 2005).
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Los residuos de plaguicidas se han convertido en uno de los
problemas ambientales y sanitarios que más interés despierta entre los
consumidores de todo el mundo, recibiendo actualmente un gran
esfuerzo investigador en todos los campos. La importancia que se
asigna en la actualidad a los residuos de plaguicidas en productos
frescos y procesados hace necesario el control de la presencia y
evolución de los mismos (Milán y Celma, 1984).
El Codex Alimentarius define el límite máximo de residuos
(LMR) como “la concentración máxima de residuos de un plaguicida
(expresada en mg/Kg) para que se permita legalmente su uso en la
superficie o en la parte interna de los productos alimenticios para
consumo humano y de piensos”. Los LMRs se basan en datos de
buenas prácticas agrícolas (BPA) en el uso de plaguicidas y en datos
de toxicidad. En definitiva, estos valores permiten controlar el uso de
plaguicidas, facilitar el comercio y proteger al consumidor.
Los organismos oficiales internacionales regulan los LMRs
admisibles de plaguicidas en los productos agroalimentarios y también
en las aguas, especialmente en las superficiales y subterráneas, puesto
que son las que más se utilizan para el consumo humano. Por tanto,
los residuos de plaguicidas presentes en vegetales y productos
derivados, tienen una notable influencia en las transacciones
comerciales, ya que su presencia constituye una barrera que limita la
comercialización de productos en los mercados internacionales. Los
permanentes cambios a los que están sometidas las normativas
internacionales deben ser analizados por todos los actores vinculados
Introducción
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al sector productivo, para conocer el impacto de las reformas y
establecer las estrategias de control fitosanitario más adecuadas
(Coscollá, 1998).
Por todo ello, es necesario llevar a cabo controles periódicos
con implementación de programas de monitorización del contenido de
plaguicidas y sus residuos de los productos agroalimentarios y de las
aguas naturales destinadas al consumo humano y animal, con la
finalidad de verificar que estén exentos de los mismos o bien que la
concentración de estos compuestos sea inferior al LMR establecido
por las distintas legislaciones, con objeto de incrementar la seguridad
alimentaria.
En la industria de cítricos la fruta que llega puede tener
diferentes procedencias y, por tanto, cobra especial relevancia la
trazabilidad de la misma. Cabe destacar que en la industria de aceites
esenciales, la corteza de los cítricos presenta una capa lipofílica y una
importante densidad de glándulas o vesículas de aceites esenciales,
que favorecen el bloqueo de plaguicidas liposolubles, ofreciendo allí
un medio donde son relativamente estables, lo que contribuye
notablemente a su mayor persistencia. Es predecible que la
eliminación de estos residuos será problemática, incluso durante las
distintas etapas que conforman los procesos de industrialización de las
frutas a la entrada en la línea de extracción, por lo que también es
necesario evaluar los niveles residuales en los aceites esenciales
obtenidos.
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Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
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38
I.4.2. Características de plaguicidas utilizados en la citricultura
En este apartado se describirán solo las características de los
plaguicidas abordados para el análisis del presente trabajo. El criterio
de selección de los mismos está en relación al uso de agroquímicos
más frecuentes por el sector empresarial de la citricultura y, entre
ellos, se seleccionaron solo aquellos que suelen presentar más a
menudo dificultades de comercialización por causa de que sus niveles
residuales sobrepasan los LMR en los productos considerados, entre
ellos los aceites esenciales.
Entre el grupo de plaguicidas seleccionados, se puede
diferenciar dos categorías o clasificación de los mismos, según su
acción: insecticidas y fungicidas, y según sus estructuras químicas:
benzimidazoles y organofosforados.
Los plaguicidas se dividen en dos grandes grupos: de
contacto o no sistémicos y sistémicos.
Los fungicidas fueron diseñados para prevenir el desarrollo
de las esporas fúngicas en plantas y frutos. Los primeros fungicidas
desarrollados fueron de carácter no sistémico o de contacto. Éstos no
penetran notablemente en los tejidos del sistema vascular de la planta,
siendo una de sus desventajas la imposibilidad de resistir las
inclemencias del clima (viento, lluvia y sol) durante mucho tiempo y,
la otra, que al crecer la planta, las partes nuevas quedan desprotegidas
y, por lo tanto, expuestas al ataque de los hongos. La ventaja de los no
sistémicos es que no presentan tantos problemas de toxicidad como en
el caso de los fungicidas sistémicos. En estos últimos, el producto
químico entra en contacto íntimo con los tejidos de la planta huésped,
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Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
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39
por lo que debe ser altamente selectivo para el hongo, porque de lo
contrario se corre el riesgo de que dañe a la planta huésped. Los
fungicidas sistémicos son denominados quimioterapéuticos vegetales,
ya que no solo protegen a la planta contra un ataque fúngico, sino que
también “curan” o inhiben una infección establecida. Son poco
afectados por el clima y confieren inmunidad a los brotes nuevos que
crecen en la planta (Cremlyn, 1995).
Los insecticidas fueron diseñados para combatir los insectos
y otros artrópodos que afectan a los vegetales y animales. Al igual que
los fungicidas, estos pueden ser no sistémicos o de contacto y
sistémicos. En citrus se les utiliza para combatir las “moscas de los
frutos”, siendo ésta uno de los problemas más graves de la citricultura
del NEA. Principalmente se usan contra la “mosca del Mediterráneo”,
y en segundo lugar contra la “mosca Sudamericana”. La importancia
de las moscas de las frutas radica, no solamente en el daño directo que
producen (destrucción de los frutos), sino también en los problemas
que ocasionan en la comercialización, por tratarse de plagas
cuarentenarias (Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, 2012).
I.4.2.1. Benzimidazoles
De acuerdo a la composición química de los benzimidazoles
son hidrocarburos aromáticos y heterocíclicos, que se caracterizan por
la fusión del benceno con un imidazol que contiene dos átomos de
nitrógeno ácidos y básicos (Danaher et al., 2007) (figura 5).
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Estas estructuras químicas adquieren propiedades específicas
de acción antifúngica, lo que han permitido el desarrollo de diversos
fungicidas sistémicos derivados del benzimidazol desde mediados de
la década de los sesenta. El tiabendazol cobra gran importancia dentro
de este grupo dado que es uno de los más utilizados.
En función de su constitución química, pueden diferenciarse
claramente dos grupos derivados de los benzimidazoles (Veneziano et
al., 2004):
1- Derivados tipo tiabendazol, que comprende a éste y al fuberidazol.
2- Derivados tipo benomil o benomilo, que incluye a este fungicida y
al carbendazim, al metil y etil tiofanato, etc.
Los fungicidas benzimidazoles se utilizan para la prevención
y tratamiento de infecciones en la agricultura y la acuicultura, ya que
inhiben el desarrollo de una amplia variedad de hongos a bajas dosis
de aplicación. Se aplican ya sea directamente sobre el suelo, o
pulverizándose sobre los campos de cultivo (Wu et al., 2009). La
Figura 5. Estructura química del benzimidazol
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mayoría de estos compuestos persisten en el medio ambiente después
de su aplicación, algunos incluso durante muchos años, debido a que
el anillo benzimidazólico es difícil de romper y su degradación
bacteriana es lenta (Barberá, 1989; Pattanasupong et al., 2004).
Algunos de ellos también han encontrado aplicaciones como
fungicidas pre o post-cosecha para el control de una amplia gama de
patógenos.
Los benzimidazoles inhiben la elongación del micelio a bajas
concentraciones y actúan sobre la germinación de las esporas a altas
concentraciones. Su acción sobre la inhibición de la formación de
microtúbulos conlleva la ausencia de la división celular,
produciéndose además una desorganización citoplasmática de tipo
general (Danaher et al., 2007).
A continuación se detallan los dos plaguicidas que se han
estudiado en este trabajo y que pertenecen al grupo de
benzimidazoles.
I.4.2.1.1. Tiabendazol
Nomenclatura química: 2-(4-tiazolil)-benzimidazol
CAS N°: 148-79-8
Fórmula química: C10H7N3S (figura 6)
Clasificación química: benzimidazol
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Figura 6. Estructura química del tiabendazol
Propiedades fisicoquímicas: Sólido cristalino, estable a la
hidrólisis, luz y calor. Peso Molecular: 201,26. Su solubilidad en agua
es igual a 50 mg/L a 25 ºC. Solubilidad en diclorometano: 10 mg/mL.
Solubilidad en etilacetato: 15 mg/mL. Solubilidad en metanol: 80
mg/mL. P.E.: 304 - 305 ºC. Acción: sistémica y de contacto. Uso:
fungicida.
Este fungicida tiene la facultad de circular por dentro de las
plantas, pero su difusión a través de la epidermis de los frutos es
considerada reducida. Su espectro de actividad es muy amplio
(Ascochyta, Aspergillius, Cercospor, Fusarium, Penicillium, Phoma,
Septoria, Ustilago, Rihizoctomia, Glousporium, etc.). Actúa en forma
preventiva y curativa.
En citrus actúa sobre la melanosis, moho azul, moho verde y
podredumbre peduncular.
Posee la particularidad de combatir a bajas dosis el
Penicillium, por lo que tiene una importante aplicación en el
tratamiento post-cosecha de cítricos, manzanas, pera y plátanos.
Además de estas acciones, tiene un efecto polivalente, lo que hace que
se emplee también en tratamientos de semillas y de suelos aparte de
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una serie de aplicaciones foliares, solo o combinado con otros
fungicidas (Ito et al., 1998).
Se ha determinado una ingesta diaria admisible (ADI) de 0,1
mg/kg peso, un nivel de exposición aceptable para el operario (AOEL)
de 0,070 mg/Kg peso al día y una dosis aguda de referencia (ARfD)
de 0,10 mg/Kg peso (European Commission, 2015).
Riesgos ambientales: Este producto no presenta riesgo
significativo para los peces y fauna silvestre.
Límite Máximo de Residuos en Argentina para fruta cítrica
entera 10 ppm (mg/Kg) (SENASA, 2015), mientras que en la Unión
Europea es de 5 mg/Kg (European Commission, 2015).
I.4.2.1.2. Carbendazim
Nomenclatura química: metil benzimidazol-2-ilcarbamato.
CAS N°: 10605-21-7
Fórmula Química: C9H9N3O2 (figura 7)
Clasificación química: benzimidazol
Figura 7. Estructura química del carbendazim
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Propiedades fisicoquímicas: Sólido cristalino grisáceo. P.F.:
302 – 307 ºC. Peso Molecular: 191 Solubilidad en agua: 5,8 mg/Kg.
Soluble en dimetilformamida. Poco soluble en disolventes orgánicos.
Se descompone por álcalis y forma sales con ácidos. Acción:
sistémica, preventiva y curativa. Uso: fungicida.
Información general: Fungicida polivalente y sistémico, que se
absorbe por los órganos verdes y las raíces de los vegetales, siendo su
persistencia de acción de 2 a 3 semanas.
Aplicaciones principales: se emplea para el tratamiento contra
Venturia, Monilla, Botrytis, Oidium, Gloesporium, Sphaeropsis,
Cocomyces, Phoma, Colletotrichum, etc.
Su acción en citrus: combate la mancha grasienta, melanosis,
moho azul y verde, podredumbre peduncular y de los frutos, sarna del
naranjo agrio, etc. Se ha utilizado también en tratamiento en suelo y
semillas.
Se ha establecido una ADI de 0,02 mg/Kg peso, un AOEL de
0,02 mg/Kg peso al día y una ARfD de 0,02 mg/Kg peso (European
Commission, 2015).
Riesgos ambientales: no tóxico para abejas, moderadamente
tóxico para peces y no tóxico para fauna silvestre.
En Argentina, la legislación (SENASA, 2015) establece
como LMR para frutas un valor de 5 mg/Kg, mientras que en la UE se
establecen valores de 0,2 y 0,7 mg/Kg para naranjas y mandarinas,
respectivamente (European Commission, 2015).
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I.4.2.2. Organofosforados
Los compuestos organofosforados son ésteres del ácido
fosfórico (unión de un ácido y un alcohol) y una variedad de
alcoholes, generalmente liposolubles. Su estructura básica se puede
observar en la figura 6, en donde R1 y R2 pueden ser alquilo, alcoxi,
ariloxi, amido u otros, y X puede ser un grupo haluro, fenoxi,
tiofenoxi, fosfato, carboxilato, etc.
Figura 8. Estructura química general de compuestos organofosforados.
Cuando el átomo que se une al fósforo con el doble enlace es
el oxígeno, el compuesto se denomina oxon (figura 9), y es un potente
inhibidor de la enzima colinesterasa y de otras esterasas. Sin embargo,
con el oxígeno en esta posición, también se favorece la hidrólisis del
compuesto, especialmente bajo condiciones alcalinas. Para hacer estos
compuestos más resistentes a la hidrólisis y, por consiguiente,
prolongar su vida media en el ambiente, muchos organofosforados
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presentan un átomo de azufre en vez del átomo de oxígeno. Estos
organofosforados se denominan tiones (figura 9), son inhibidores
pobres de la colinesterasa, pero penetran en las membranas biológicas
más rápidamente que los oxones. En el ambiente, los tiones se
convierten en oxones por acción del oxígeno y la luz solar y, en el
organismo, por acción de las enzimas microsomales del hígado. Por
ello, los tiones son sustancias altamente tóxicas, debido a su habilidad
de atravesar las barreras biológicas y su facilidad de convertirse en
oxones dentro del organismo.
Figura 9. Estructura química general de plaguicidas organofosforados
Durante la Segunda Guerra Mundial comenzaron a llevarse a
cabo numerosas investigaciones acerca de la síntesis de compuestos
organofosforados tóxicos como gases de guerra potenciales, dando
lugar a los primeros avances en el diseño de plaguicidas
organofosforados (Katagi, 1990). Desde entonces, se consideran a
estos compuestos como insecticidas muy potentes, pero debido a su
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alta toxicidad para los mamíferos, su uso como insecticidas ha sido
limitado (Cremlyn, 1995).
Es de destacar, en diseño de plaguicidas organofosforados,
los trabajos de Schrader, quien desarrolló el paratión en el año 1946,
uno de los organofosoforados más masivamente usado como
plaguicida en las décadas siguientes. Marcando hitos se sintetizaron
luego el malatión (1952), el diazinón (1953) y el clorpirifos en 1965,
año que marcó el máximo en términos de aparición de nuevos
productos organofosofrados (Casida, 1998).
En la actualidad hay más de 200 sustancias químicas
incluidas en este grupo de compuestos, que se emplean principalmente
como insecticidas y nematicidas; sin embargo, algunas de ellas se
utilizan también como herbicidas, fungicidas, plastificantes y fluidos
hidráulicos en la industria.
Los compuestos organofosforados ejercen su efecto tóxico a
través de un mecanismo que provoca la inhibición de la acetil-
colinesterasa (ACh), la enzima responsable de la destrucción y
terminación de la actividad biológica del neurotransmisor acetilcolina
(AC). Con la acumulación de la AC se altera el funcionamiento
normal del impulso nervioso.
En el caso de algunos organofosforados, inhiben también la
esterasa neuropática (NTE) y esta inhibición, junto con el incremento
del Ca2+
intracelular por alteración de la enzima calcio-calmodulina-
quinasa II, parece constituir el mecanismo de producción de la
neuropatía retardada.
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48
Los compuestos de uso agrícola, a diferencia de los de uso
doméstico, están formulados a altas concentraciones que varían desde
20%-70% del principio activo. Los más usados son los de tipo no
sistémico, como el clorpirifos.
I.4.2.2.1. Clorpirifos
Nomenclatura química: O,O-dietil O- 3,5,6-tricloro-2-piridinil
fosforotioato.
CAS N°: 2921-88-2
Formula química: C7H7Cl3NO3PS (figura 10)
Clasificación química: organofosforado
Figura 10. Estructura química del clorpirifos
El clorpirifos es un plaguicida orgánico de tipo sistémico,
derivado fosfórico. Se comenzó a utilizar en 1965, siendo en la
actualidad uno de los más utilizados. Actúa por contacto sobre
diversas plagas de la fruta y se clasifica como tóxico.
Propiedades fisicoquímicas: Sólido cristalino de color blanco
con leve olor a azufre. Peso molecular: 350,62. Solubilidad en agua:
0,4 mg/L a 23°C. Solubilidad en otros disolventes: benceno, acetona,
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cloroformo, disulfuro de carbono, éter dietílico, xileno, cloruro de
metileno, metanol. Punto de Fusión: 41,5- 44°C.
En citrus se utiliza para combatir ácaros de la yema y del
tostado en época de prefloración, y para cochinilla blanda y pulgón del
citrus al nacimiento de las ninfas.
Se ha establecido una ADI de 0,001 mg/Kg peso, un AOEL de
0,001 mg/Kg peso al día y una ARfD de 0,005 mg/Kg peso (European
Commission, 2015).
En Argentina, la legislación (SENASA, 2015) establece como
LMR para frutas un valor de 0,3 mg/Kg, mientras que en la UE se
establecen valores de 0,3 y 2 mg/Kg para naranjas y mandarinas,
respectivamente (European Commission, 2015).
I.4.2.2.2. Imidazoles: Procloraz
Nomenclatura química: N-propil-N-[2-(2,4,6-
triclorofenoxi)etil]-1H-imidazol-1 carboxamida
CAS N°: 67747-09-5
Formula química: C15H16Cl3N3O2 (figura 11)
Clasificación química: imidazol
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Figura 11. Estructura química del procloraz
Propiedades fisicoquímicas: Sólido cristalino incoloro e
inodoro. Su punto de fusión se encuentra entre los 46,5 y 49,3 °C y su
punto de ebullición es de 210 °C. Tiene una presión de vapor igual a
1,5x10-1
mPa a 25 °C. Su solubilidad en agua es de 34,4 g/L a 20 °C.
Es soluble en keroseno, cloroformo, xileno, dietil éter, tolueno y
acetona. Esta sustancia se descompone durante el calentamiento
prolongado a temperaturas mayores a 200 °C.
El procloraz se utiliza como fungicida protector y erradicante,
capaz de prevenir con eficacia una amplia gama de enfermedades que
afectan cosechas, frutas, césped y verduras. Tiene buena actividad
contra las enfermedades de almacenamiento y tránsito en cítricos y
frutas tropicales cuando se aplica como un tratamiento de inmersión
(0,5-0,7 g/L).
En Argentina, la legislación (SENASA) establece como LMR
para frutas un valor de 5 mg/Kg, mientras que en la UE se establecen
valores para la suma de procloraz y de sus metabolitos que contengan
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la fracción 2,4,6-triclorofenólica, expresados en procloraz de 10
mg/Kg para cítricos (European Commission, 2015).
I.5. Métodos de determinación de plaguicidas
Dada la importancia que reviste el control de plaguicidas a
niveles traza en alimentos, es de especial relevancia la selección de
técnicas de análisis adecuadas que proporcionen información
cualitativa y cuantitativa fiable. Los métodos de análisis utilizados
para dicho control deben presentar una serie de características, tales
como permitir la determinación simultánea de un gran número de
plaguicidas, es decir métodos multiresiduos (MMR), presentar elevada
sensibilidad y selectividad, ofrecer confirmación de la identidad,
permitir la cuantificación de cualquier residuo detectado de forma
exacta y precisa, así como proporcionar la información analítica en el
menor tiempo posible (Garrido-Frenich, 2014).
Los métodos cromatográficos responden a las rigurosas
exigencias de los controles, lo que significa poder contar con técnicas
apropiadas para la determinación de niveles trazas de plaguicidas. Sin
duda, en las últimas décadas se ha producido un gran avance en el
desarrollo y mejora de la instrumentación analítica (fases
estacionarias, cromatógrafos, detectores, etc.), así como en las
técnicas de preparación de muestra (Garrido-Frenich, 2014). Estas
significativas innovaciones de la tecnología en equipamiento
cromatográfico, han permitido el desarrollo de metodologías analíticas
selectivas para la cuantificación de plaguicidas, con importantes
mejoras en los sistemas de detección, como es el caso de los
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detectores de espectrometría de masas, que son irremplazables en la
identificación de analitos y cuantificación a niveles traza.
La optimización de métodos adecuados de extracción,
identificación y cuantificación de plaguicidas en distintas matrices,
permiten tener un control de los productos fitosanitarios, para asegurar
que los alimentos que se comercializan en el mercado cumplen con la
legislación y son inocuos para los consumidores.
Después de la extracción de los analitos de interes, limpieza
de la muestra y/o concentración, la correcta separación de los
compuestos es crítica, por eso las técnicas cromatográficas han sido
ampliamente utilizadas con la finalidad de resolver muestras
complejas (Gilbert-López et al., 2009). Las técnicas de cromatografía
de gases (GC) y cromatografía líquida de alta resolución (HPLC),
acopladas a distintos tipos de detectores son las más usadas en
matrices complejas para la determinación de niveles residuales de
plaguicidas (Cortés-Aguado et al., 2008; Koesukwiwat et al., 2010;
Rouvière et al., 2012).
La cromatografía de gases ha sido la técnica mas empleada
para la separación de compuestos no-polares y/o volátiles, mientras
que la cromatografía líquida ha sido la técnica elegida para la
separación de compuestos polares y/o no volátiles, y/o termolábiles.
En general, para que el análisis de un determinado compuesto
sea compatible con cromatografía gaseosa, no sólo debe mostrar
elevada volatilidad a temperaturas por debajo de 350-400ºC, sino que
también debe ser resistente a la degradación o a la reacción con otros
compuestos a dichas temperaturas (Hajšlová et al., 2007). Hay que
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destacar que en los últimos años se ha experimentado una creciente
tendencia al desarrollo de nuevos plaguicidas con estructuras más
complejas y de mayor polaridad, que proporcionan una mejor
respuesta mediante cromatografía líquida (Hernández et al., 2006).
I.5.1. Metodología de preparación de la muestra
La etapa de preparación de la muestra es de vital importancia,
ya que ésta puede constituir una fuente de error muy importante,
especialmente en la determinación de plaguicidas que se encuentran a
nivel de trazas. Si no se selecciona la técnica adecuada o si la
preparación de muestras no se lleva a cabo de forma cuidadosa, se
pueden dar pérdidas de analito en las diferentes etapas, tales como la
extracción, el “clean up”, etc., o contaminaciones que interfieren en
los resultados de los análisis.
Los métodos de extracción y de limpieza han tenido que
hacer frente al reto de responder al creciente número de analitos y de
familias de compuestos con diferentes características físico-químicas,
así como a la ampliación en el número de matrices bajo control
(European Commission, 2013). En consecuencia, se trabaja con
métodos extractivos y de limpieza de carácter más genérico, a fin de
cubrir una amplia gama de compuestos y matrices, experimentando
una evolución hacia la automatización y la miniaturización, con el
objetivo de disminuir el consumo de disolventes orgánicos, la
reducción de costes y el tiempo de manipulación de la muestra
(Garrido-Frenich, 2014).
Introducción
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Es necesario realizar un proceso de toma de muestra
adecuado, con una cuidadosa homogeneización de la muestra previa a
la extracción de los residuos para el análisis.
Por otra parte, dada la complejidad de la matriz que suponen
los alimentos, donde se encuentran presentes contenidos importantes
de proteínas, lípidos, hidratos de carbono, agua y otros componentes
minoritarios, la muestra requiere generalmente una purificación de los
extractos, para eliminar las sustancias interferentes antes de realizar la
medida analítica. A menudo, los componentes de interés se encuentran
a concentraciones muy bajas, a nivel de trazas, como ya se ha
comentado, siendo necesario procedimientos de concentración del
extracto para poder detectarlos. Es decir, la muestra antes de ser
sometida al análisis cromatográfico debe inevitablemente adecuarse
en la etapa de “preparación de la muestra” que, tal como ya se ha
descrito, conforma uno de los pasos más importantes en toda cadena
analítica y que puede tener como objetivos, principalmente:
- Extraer los analitos de la matriz
- Eliminar interferentes
- Concentrar analitos
La etapa de preparación de la muestra puede llegar a
constituir entre el del 60 y el 85% del tiempo total de análisis. Del
éxito de esta etapa dependerán parámetros analíticos tan importantes
como la eficiencia de recuperación de analitos, la reproducibilidad y la
robustez de la técnica, afectando también a la sensibilidad y
selectividad del método en su conjunto, el tiempo requerido para el
análisis, su coste, etc. (Stashenko y Martínez, 2011).
Introducción
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A continuación se detallan algunas de las metodologías más
empleadas en la preparación de muestras en alimentos para el análisis
de residuos de plaguicidas en diferentes matrices (Ridgway et al.,
2009):
I.5.1.1. Extracción con solventes:
Es una técnica muy empleada en la extracción de plaguicidas.
Se han usado diferentes disolventes orgánicos como el acetonitrilo,
acetato de etilo, metanol, acetona o éter de petróleo, entre otros.
Dentro de este apartado cabe destacar la extracción sólido-líquido
llevada a cabo de forma tradicional mediante el método Soxhlet. Por
otra parte, también se incluye aquí la extracción líquido-líquido
(LLE), que ha sido y continúa siendo ampliamente utilizada en la
preparación de muestras para análisis de plaguicidas. El principal
inconveniente de estas técnicas de análisis, consideradas como
técnicas clásicas es que requieren bastante tiempo, son tediosas y se
emplean cantidades importantes de disolventes orgánicos que pueden
aportar impurezas y que son tóxicos (Farajzadeh et al., 2016).
Para evitar estos inconvenientes, dentro de la extracción con
solventes, se han desarrollado otros sistemas de extracción, que
presentan importantes ventajas frente a estas técnicas clásicas, como
son:
- Extracción asistida por microondas (Microwave-
Assisted Extraction, MAE), en donde se emplean
equipos diseñados especialmente para ello. Se introduce
la muestra sólida o semisólida en las celadas de
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extracción del equipo, se añade el disolvente y se somete
a radiación microondas, calentando a temperaturas
superiores al punto de ebullición del disolvente y
aumentando la presión en el interior de la celda.
Posteriormente se enfría y se separa el extracto. Tiene la
ventaja de ser una técnica muy rápida, se pueden extraer
varias muestras a la vez y emplea menos disolventes que
las técnicas tradicionales. Además se trata de una técnica
robusta. Uno de los inconvenientes es que requiere una
inversión en el equipo.
- Extracción acelerada con disolventes (Accelerated
Solvent Extraction, ASE), en donde también se emplean
equipos diseñados especialmente para ello. Se introduce
la muestra sólida o semisólida en la celda de extracción,
se añade el disolvente y se calienta a una temperatura
superior al punto de ebullición del disolvente,
conllevando un aumento de presión en la celda.
Finalmente se recoge el extracto en un vial. Este sistema
hace que aumente la solubilidad del analito en el
disolvente y se consigue una mayor difusión del analito
desde la matriz al disolvente. Las extracciones en este
caso, también son rápidas y efectivas, y requieren menos
disolvente. Al igual que en el caso anterior, se requiere
una inversión en el equipo. Una variante de ésta es la
extracción con agua a altas temperaturas (Super-Heated
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Water Extraction, SHWE), que permite la eliminación
del uso de disolventes orgánicos.
- Extracción con fluidos supercríticos (Supercritical-Fluid
Extraction, SFE). En esta técnica se hace una extracción
de la muestra con un fluido supercrítico, que
normalmente suele ser el CO2. Las ventajas que presenta
es que el CO2 no es tóxico, se trabaja a temperaturas
moderadas y las extracciones son rápidas y eficaces. El
inconveniente es el alto coste del sistema y que requiere
personal altamente cualificado para la puesta en marcha
y funcionamiento del mismo.
- Extracción líquido-líquido homogénea (Homogeneous
Liquid-Liquid Extraction, HLLE), utiliza el fenómeno de
separación de fases en una solución homogénea. Una
versión de HLLE es “Salting-out Homogeneous Liquid-
Liquid Extraction” (SHLLE), que emplea el fenómeno
de separación de fases inducido por sal, en el que la fase
orgánica se separa de la solución homogénea y los
analitos son extraidos simultáneamente en la fase
orgánica separada (Farajzadeh et al., 2016).
- Microextracción líquido-líquido dispersiva (Rezaee et
al., 2006) desarrollaron esta técnica novedosa basada en
un sistema ternario de disolventes, en el que una solución
de un disolvente de extracción en un solvente disperso es
inyectado rápidamente en una muestra acuosa con una
jeringa. El solvente dispersante debe ser totalmente
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miscible con la muestra acuosa y con el solvente de
extracción, mientras que el solvente de extracción debe
ser insoluble en agua y tener una densidad diferente de la
muestra acuosa. Esta técnica es simple, barata y rápida.
Su principal inconveniente es que el disolvente de
extracción suele ser un disolvente halogenado, que son
altamente tóxicos y difíciles de manipular en el
laboratorio (Farajzadeh et al., 2016).
I.5.1.2. Extracción mediante adsorción en superficies sólidas
La aplicación de este principio generó novedosas técnicas de
extracción y clean-up que permitió, en muchos casos, mejorar los
límites de detección establecidos para plaguicidas y sus metabolitos,
en muestras de alimentos (Lambropoulou y Albanis, 2007). Se
distinguen la extracción en fase sólida (Solid Phase Extraction, SPE),
la micro- extracción en fase sólida (Solid-Phase Microextraction,
SPME), extracción con barra agitadora con capacidad de adsorción
(Stir-Bar Sorptive Extraction, SBSE) y la extracción mediante
dispersión de la matriz en la fase sólida (Matrix Solid-Phase
Dispersion, MSPD).
Extracción en fase sólida (SPE)
Este tipo de extracción es una de las técnicas más empleadas
en el tratamiento y concentración de muestras antes de su análisis por
cromatografía, tanto líquida como de gases. Esta técnica permite
realizar la extracción, el clean-up y la reconcentración de los analitos
de las matrices. El principio de esta metodología es la retención
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(adsorción) de los solutos sobre un lecho de adsorbente adecuado y
posterior elución de los mismos con un reducido volumen de
disolvente. De esta manera se reduce significativamente el tiempo de
análisis, los costes y el consumo de disolventes orgánicos (Fritz,
1999).
En el procedimiento de SPE podemos distinguir distintas
etapas, como muestra la figura 12.
1- Etapa de acondicionamiento: En primer lugar se ha de llevar a
cabo la activación del adsorbente y de los grupos funcionales. Esto
se consigue pasando un volumen de disolvente o mezcla de
solventes apropiados a través del cartucho. Se suele utilizar
metanol o acetonitrilo para activar adsorbentes hidrofóbicos,
mientras que para los hidrofílicos se usa hexano o cloruro de
metileno. Se recomienda usar de 2 a 4 volúmenes de lecho.
2- Etapa de carga de la muestra: Se deposita la muestra (liquida o en
disolución) en la parte superior del lecho de adsorbente. Algunos
interferentes pueden pasar por la columna sin ser retenidos;
mientras que otros componentes de la matriz pueden retenerse más
o menos fuertemente en la superficie del adsorbente. Para obtener
la máxima eficacia se debe controlar el caudal de solvente,
logrando con ello establecer tiempos óptimos de extracción e
interacción entre el adsorbente y el extracto.
3- Etapa de lavado: El lavado permite la eliminación de cualquier
interferente que haya quedado en el cartucho retenido,
manteniendo los analitos en el lecho de adsorbente. Se pueden
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usar solventes o mezcla de solventes de diferente tipo para mejorar
la eficacia del lavado.
4- Etapa de elución: Se pasa un solvente adecuado por el cartucho
para eliminar la interacción analito absorbente y eluir el 100% de
los analitos. El solvente adecuado ha de tener la máxima
interacción con el analito y una interacción mínima con las demás
impurezas, si aún quedaran, dejándolas en el lecho de adsorbente.
El volumen de elución ha de ser el menor posible para mantener
alto el factor de concentración.
5- Etapa de concentración: Los compuestos de interés se concentran
evaporando una parte del solvente. A veces es necesario secar el
eluato con sulfato de sodio para eliminar posibles trazas de agua.
La muestra concentrada ya está lista para el análisis
cromatográfico.
Figura 12. Etapas de la metodología de Extracción en Fase Sólida (SPE)
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El gran desarrollo que ha experimentado esta técnica en los
últimos años, ha conllevado al diseño de distintos formatos para la
extracción, comos cartuchos de volumen variable, puntas de pipetas,
pocillos, etc. que permiten introducir cantidades variables de relleno.
Asimismo se dispone de un gran número de materiales de relleno de
naturaleza muy diversa que comprenden desde adsorbentes muy
polares (diol, ciano, hidroxilo o Florisil), hasta muy poco polares
(fases octadecilsilano (C18), octilsilano (C8)), pasando también por
materiales de intercambio iónico, que permiten extraer de forma
efectiva, rápida y sencilla, un gran número de compuestos, lo que hace
que esta técnica tenga un gran número de aplicaciones.
Para la determinación de plaguicidas de diferentes
características químicas las más utilizadas son las de tipo C8 y C18.
En general, la capacidad de retención de solutos de una
columna de SPE depende del tipo de material de relleno, del tamaño
de la columna, del tipo de analito y de las condiciones de extracción.
Extracción en fase sólida dispersiva (dSPE)
Dentro de la extracción en fase sólida, cabe destacar una
variante de la misma que fue desarrollada en el año 2003 por
Anastassiades et al. (2003) para el análisis de residuos de plaguicidas
en material vegetal, denominada QuEChERS. Su nombre hace
referencia a las ventajas que presenta el método (Quick, Easy, Cheap,
Effective, Rugged y Safe). Este método también es llamado extracción
en fase sólida dispersiva y puede, ser utilizado en el análisis de
plaguicidas en alimentos y productos agrarios, proporcionando
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recuperaciones aceptables para los plaguicidas en matrices ácidas,
neutras y básicas, como las frutas y verduras (Anastassiades et al.,
2003; Aysal et al., 2007). En resumen, es un método que ofrece las
ventajas de altas recuperaciones, resultados precisos, rapidez de
tratamiento, poco uso de solvente y material de vidrio y además
requiere poco espacio de laboratorio y pocos reactivos. Este método
ha sido aprobado por la AOAC (Método 2007.01) y en Europa bajo
prEN-15662 (http://www.cromlab.es/EFS_HS_QUECHERS.htm).
El método QuEChERS consta de dos etapas, una primera
etapa de extracción y una segunda etapa de clean-up que es la fase
dispersiva.
1. Etapa de extracción una mezcla de sales de MgSO4 y
NaCl para reducir el contenido de agua en la muestra.
Los productos para la etapa de extracción se
suministran en tubos de polipropileno para centrífuga
de 50 mL para facilitar la extracción. En la primera
etapa, se realiza una extracción con un disolvente
orgánico, generalmente acetonitrilo, en presencia de
diferentes sales. Las sales que pueden ser empleadas
en esta etapa son el sulfato de magnesio, el cloruro
sódico, el citrato tribásico de sodio dihidrato y citrato
de sodio dibásico sesquihidrato. La función de cada
una de estas sales en la etapa de extracción es
diferente:
Sulfato de magnesio (MgSO4): mejora la
recuperación del analito al facilitar la partición de los
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plaguicicidas en la fase orgánica (acetonitrilo) gracias
a que retiene agua.
Cloruro sódico (NaCl): ayuda a controlar la
polaridad favoreciendo la separación de fases entre el
contenido de agua y la orgánica.
Acetato de sodio: ayudan a la regulación del pH.
Sales de citrato: se emplean para ajustar del pH
a valores de 5,5 donde se extraen la mayoría de los
componentes ácidos y básicos de la muestra.
La selección de las sales a emplear va a
depender de los compuestos que se desean analizar y
el tipo de protocolo de análisis a utilizar:
Método original “QuEChERS”: sulfato de
magnesio y cloruro sódico
Método AOAC (AOAC 2007.01): sulfato de
magnesio y acetato de sodio
Método EN 15662: sulfato de magnesio, cloruro
sódico, citrato tribásico de sodio dihidrato y citrato de
sodio dibásico sesquihidrato.
2. Etapa de clean-up: en esta etapa se realiza la limpieza
del extracto mediante la extracción en fase sólida
dispersiva. Este paso facilita la eliminación del agua
residual y de los compuestos presentes en la matriz
del alimento que podrían provocar interferencias en el
análisis, como los lípidos, azúcares, ácidos orgánicos
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y pigmentos. Se usa PSA (amina primaria/secundaria)
para la eliminación de ácidos orgánicos, ácidos
grasos, azúcares y pigmentos de antocianina, y sulfato
de magnesio (MgSO4) para eliminar el exceso de agua
residual. Se puede emplear un sorbente C18 para
eliminar grasas, esteroles y otras interferencias no
polares de la muestra y carbón negro grafitado (GCB)
que elimina pigmentos de la muestra como clorofilas
y carotenoides.
La selección de la fase sólida dispersiva va a
depender, por tanto, del tipo de alimento que es
analizado, así existen diferentes protocolos de “clean-
up” para:
• Frutas y verduras en general.
• Frutas y verduras con grasas y ceras.
• Frutas y verduras pigmentadas (vegetales
verdes, zanahorias, vino, etc)
• Frutas y verduras altamente pigmentadas.
• Frutas y verduras con pigmentos y grasas (estos
también pueden emplearse para el análisis de leche,
carne y pescado).
Después del proceso de limpieza, se lleva a cabo una
centrifugación y el extracto está listo para ser
directamente analizado o sometido a evaporación y
recomposición en el disolvente apropiado para su
análisis.
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En la figura 13 se muestran las distintas etapas de
preparación de muestra mediante este método.
Figura 13. Ejemplo de distintos pasos en la preparación de una muestra de naranja
siguiendo el método QuEChERS. (Fuente: Fuentes et al. (2015))
I.5.2. Técnicas cromatográficas de análisis
Antecedentes históricos
La cromatografía es un método físico de separación en el cual
los componentes a ser separados son distribuidos entre dos fases, una
de las cuales es estacionaria mientras la otra se mueve en una
dirección definida. Los componentes son separados por sus
diferencias en las constantes de distribución de los componentes de la
mezcla entre ambas fases. La cromatografía puede ser clasificada por
su utilidad y en base al material que se utilice como eluyente para
separar los solutos. De acuerdo a su utilidad la cromatografía se
clasifica en: analítica, utilizada para determinar los químicos presentes
en una mezcla y en que concentración; y preparativa, utilizada para
purificar grandes cantidades de químicos.
El origen de esta técnica se remonta a principios del siglo
XX. En el año 1906, el botánico ruso Mikhail Seménovich Tsweet
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(1872-1919) realizo la primera experiencia cromatografica en
columna, empleando carbono cálcico y alumina para separar
pigmentos vegetales.
Tsweet empacó una columna de vidrio con el material
adsorbente. A continuación depositó una mezcla de pigmentos
vegetales extraídos de las hojas molidas de una planta y añadió éter de
petróleo, observando al cabo de un tiempo que el material empacado
en la columna había adquirido una coloración diferente por
segmentos. Es decir, había logrado la separación de los pigmentos
naturales de la planta (figura 14).
Figura 14. Esquema de la separación de pigmentos en una columna cromatográfica
de Tsweet.
Fuente: http://pt.slideshare.net/marcelborgesb/cromatografia-líquida-moderna
Tras su descubrimiento la cromatografía quedó prácticamente
olvidada hasta 1930, año en que Richard Khum y Lereder, la
utilizaron para la separación de carotenoides. A partir de ese
momento, el uso de esta técnica se fue extendiendo cada vez más, al
tiempo que se desarrollaban diferentes versiones de la misma.
Hay que destacar que, siendo la cromatografía en sus
orígenes una técnica exclusivamente de separación se han ido
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desarrollando y/o acoplando dispositivos para monitorizar las especies
químicas que se iban separando, transformándose asi de forma
paulatina en una valiosa técnica de análisis. Con el paso de los años, el
desarrollo de las técnicas cromatográficas ha sido espectacular, siendo
hoy en día una de las metodologías analíticas más potentes para la
identificación y cuantificación de compuestos en un amplio rango de
concentraciones y en cualquier tipo de matriz.
Mecanismo básico de la cromatografía
Como ya se ha comentado, en cromatografía los solutos se
separan en función de las diferentes velocidades de desplazamiento,
cuando son arrastrados por una fase móvil a través de un lecho
cromatográfico que contiene una fase estacionaria.
Los analitos que son retenidos fuertemente por la fase
estacionaria se mueven más lentamente con el flujo de la fase móvil,
en comparación con aquellos que los retiene débilmente y que
avanzan más rápidamente (figura 15). Al final del proceso los
componentes separados emergen en orden creciente de interacción con
la fase estacionaria. El componente menos retardado emerge primero,
el retenido más fuertemente eluye último. El reparto entre las fases
aprovecha las diferencias entre las propiedades físicas y/o químicas de
los componentes de la muestra.
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Figura 15. Esquema del proceso de separación cromatográfica
La cromatografía se puede clasificar en función de distintos
parámetros, pero la clasificación más importante es la que se hace
atendiendo a la naturaleza de la fase móvil, así podemos diferenciar
dos tipos de métodos cromatográficos: cromatografía de gases (la fase
móvil es un gas) y cromatografía líquida (la fase móvil es un líquido).
I.5.2.1. Cromatografia de gases (GC)
En este tipo de cromatografía la fase móvil es un gas y la fase
estacionaria puede ser líquida o sólida. Básicamente, la
instrumentación en CG consta de las siguientes partes:
- Gas portador (fase móvil): Se utiliza un gas inerte, ya
que no ha de interaccionar con los analitos ni con la fase
estacionaria. Los gases más empleados en CG son el
hidrógeno, nitrógeno y helio, especialmente estos dos
últimos. Han de ser de elevada pureza, siendo
recomendable el uso de filtros antes de la entrada al
FASE
MOVIL
FASE
MOVIL
FASE
MOVIL
MEZCLA A
FASE ESTACIONARIA
ELUYE PRIMERO
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cromatógrafo, para eliminar impurezas de hidrocarburos,
O2 o H2O.
- Inyector: Los inyectores más comunes son el inyector
split/splitless y el inyector on-column. El primero de
ellos permite trabajar de 2 modos, en modo split (o con
división), donde la muestra es depositada en el liner
(tubo de evaporación), que está a temperatura elevada
(normalmente entre 200-300 ºC), se mezcla con el gas
portador que arrastra una parte determinada hacia la
columna, mientras que otra parte de la muestra y del gas
portador, sale al exterior por la válvula de split; es decir,
que solo una parte de la muestra que se inyecta entra en
la columna. Cuando se trabaja en modo splitless (o sin
división), el proceso es el mismo que se acaba de
describir, pero la válvula de válvula de split permanece
cerrada durante la inyección, de forma que toda la
muestra inyectada entraría a la columna. Se suele trabajar
en split cuando se tienen muestras concentradas,
mientras que se trabaja en splitless cuando se trata de
análisis de trazas. Por otra parte, la inyección on-column,
se basa en introducir la muestra directamente en la base
de la columna, es decir, en este caso no hay liner o tubo
de evaporación.
- Columna: La columna está dentro de un horno, ya que en
este tipo de cromatografía la temperatura de la columna
es un parámetro esencial para optimizar la separación. La
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70
columna contiene la fase estacionaria y es, por tanto,
donde se produce la separación. Las columnas más
empleadas son las columnas capilares de sílice fundida
en cuyo interior está la fase estacionaria, recubiertas por
un polímero de poliimida que les confiere resistencia y
flexibilidad. Hay diferentes tipos de fases estacionarias
que varían en un amplio rango de polaridad. En el
análisis de plaguicidas, las fases estacionarias más
empleadas suelen ser las que constan de un esqueleto de
polisiloxano en donde, dependiendo de la proporción y
tipo de radicales que lleve unidos, se van obteniendo
columnas de diferente polaridad. Por ejemplo, la
columna más apolar de este tipo es la 100%
metilpolisiloxano; otra columna también muy empleada
en análisis de plaguicidas es la 5% fenil 95%
metilpolisiloxano. También se pueden encontrar grupos
cianopropil o trifluoropropil en las columnas de
polisiloxano.
- Detector: A la salida de la columna hay un dector por
donde pasan los analitos ya separados, que emite una
señal proporcional a la cantidad de analito que pasa por
él. Más adelante se comentarán los detectores más
empleados en análisis de plaguicidas.
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I.5.2.2. Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
En cromatografía líquida la fase móvil es un líquido y la fase
estacionaria puede ser líquida o sólida.
La cromatografía líquida, a su vez, se puede clasificar en
función del mecanismo de separación de los componentes entre las
fases. Así, se puede hablar de cromatografía de adsorción, partición,
intercambio iónico, exclusión molecular y afinidad (Quattrocchi,
1992; Romero-García, 2002; Lamarque et al., 2008):
a) Cromatografía de adsorción: La fase estacionaria es un
sólido en el que los componentes de la muestra son adsorbidos. La
adsorción ocurre en la superficie de la partícula de la fase estacionaria
y es debida a la atracción entre el soluto y el adsorbente por
interacciones dipolo-dipolo, formación de puentes de hidrogeno, etc.
(FAO, 2003; Lamarque et al., 2008; Iñon, 2010). La separación de los
analitos se basa en diferencias en las propiedades de adsorción sobre
la fase estacionaria y en diferencias de solubilidad en la fase móvil.
Las fases estacionarias más empleadas suelen ser de sílice o alúmina,
mientras que las fases móviles que se utilizan en esta modalidad
suelen ser disolventes orgánicos de polaridad baja o media, como
hexano, iso-octano, etc. En general, cuanto más polar es un compuesto
más fácilmente será adsorbido y mayor retención presentará.
Este tipo de cromatografía está particularmente bien adaptada
para la separación de compuestos de polaridad baja y media, solubles
en disolventes apolares. La separación de compuestos muy polares
mediante cromatografía de adsorción requiere, debido a la gran
retención que ofrecen, la utilización de adsorbentes muy pocos
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activos, o bien, tratamientos químicos previos para la preparación de
la muestra a fin de reducir su polaridad.
b) Cromatografía de partición: En este caso, la fase
estacionaria es un líquido soportado en un sólido inerte. La separación
de los analitos se basa en diferencias de solubilidad en la fase
estacionaria líquida y la fase móvil también líquida (ambas fases
inmiscibles entre sí). Dependiendo de la polaridad de las fases
estacionaria y móvil, se distingue la cromatografía en fase normal y la
cromatografía en fase reversa (Valcárcel y Gómez Hens, 1988). En
fase normal, se emplean fases móviles apolares (como hexano,
diclorometano, etc) y fases estacionarias polares, mientras que en fase
reversa se emplean fases móviles polares (agua, acetonitrilo, metanol,
etc) y fases estacionarias apolares (octadecilo o C18, octilo o C8, C4,
etc). Recientemente se ha desarrollado una variante de la fase normal,
que es la modalidad “Hilic” o de interacción hidrofílica, en donde
ambas fases son polares. Es importante destacar que la fase reversa es
de las modalidades más empleadas. Mediante esta técnica se pueden
analizar compuestos de un amplio rango de polaridades, ácidos y
bases débiles, etc.
c) Cromatografía de intercambio iónico: Las fases
estacionarias son rellenos cargados iónicamente. La separación en la
cromatografía de intercambio iónico depende la adsorción reversible
de moléculas de soluto cargadas, a una resina con grupos iónicos de
carga opuesta. El mecanismo de separación se basa en un equilibrio de
intercambio iónico. Los analitos presentan diferentes grados de
interacción con el intercambiador iónico, debido a diferencias en sus
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cargas, densidades de carga y distribuciones de carga en su superficie.
Estas interacciones pueden ser controladas variando condiciones como
la fuerza iónica y el pH.
Los analitos que se pueden analizar por esta técnica son
aniones y cationes inorgánicos (nitratos y nitritos, sodio, potasio, etc.),
y también compuestos orgánicos (aminoácidos, azúcares, etc.).
d) Cromatografía de exclusión por tamaño: En este tipo de
cromatografía la fase estacionaria es un sólido de porosidad
controlada. En la separación no interviene ninguna interacción
química, solamente se basa en diferencias en el tamaño molecular de
los analitos en disolución.
Esta técnica es poco empleada en análisis cuantitativo. Se usa
comúnmente para las separaciones preparativas de macromoléculas de
origen biológico, así como para la purificación de polímeros orgánicos
sintéticos.
e) Cromatografía de afinidad: La fase estacionaria es un
sólido con propiedades de retención bioespecífica, como un enzima o
un antígeno. Este tipo de cromatografía utiliza interacciones altamente
específicas entre un tipo de moléculas de soluto y una segunda
molécula unida covalentemente (inmovilizada) a la fase estacionaria.
La fase móvil ha de contener un sustrato capaz de competir por el
soluto con la fase estacionaria.
De todas las modalidades comentadas, la más empleada en
análisis de plaguicidas es la cromatografía de partición.
Básicamente, la instrumentación en HPLC consta de las
siguientes partes:
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- Depósitos de fase móvil: La fase móvil es un disolvente o
mezcla de varios disolventes. Al contrario de lo que
sucedía en CG, aquí la fase móvil interviene de manera
decisiva en la separación de analitos, por lo que la
elección de la composición de la fase móvil y del modo de
trabajo (isocrático o composición constante durante el
análisis, o en gradiente que conlleva variación de la
composición), es primordial en la optimización del
método. La naturaleza de los disolventes empleados,
depende del tipo de cromatografía líquida en el que se esté
trabajando.
- Bomba a alta presión: En cromatografía líquida de alta
resolución se trabaja a altas presiones, por lo que las
bombas han de poder trabajar en un amplio rango de
presiones (entre 500 a 6000 psi).
- Inyector: Es es por donde se introduce la muestra y se
mezcla con la fase móvil para ser conducida a la columna.
- Columna: Al igual que en CG, es donde se encuentra la
fase estacionaria y, por tanto, donde tiene lugar la
separación. También en HPLC, se dispone de una gran
variedad de fases estacionarias. Las columnas son tubos de
acero de longitud variable en cuyo interior se encuentra la
fase estacionaria. A menor tamaño de partícula, mayor es
la eficacia, pero la principal limitación es que a menor
tamaño de partícula, mayor es la presión de trabajo. Los
tamaños de partícula con los que normalemente se trabaja
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en HPLC son superiores a 3,5 µm, y las longitudes de
columna normales de 15 a 30 cm. Para poder aumentar la
eficacia disminuyendo el tamaño de partícula, se han
diseñado equipos que soportan presiones de trabajos
mayores, permitiendo así disminuir el tamaño de partícula
por debajo de 2 µm; estos equipos son los llamados
UHPLC (Ultra High Performance Liquid
Chromatography). Al disminuir el tamaño de partícula,
aumenta la eficacia espectacularmente, pudiéndose
disminuir la longitud de la columna, lo que permite acortar
considerablemente los tiempos de análisis (hasta 10 veces)
y el consumo de eluyente (hasta en un 90%) sin
comprometer los resultados analíticos (Perkin Elmer,
2009).
- Detector: A la salida de la columna hay un dector por
donde pasan los analitos ya separados, que emite una señal
proporcional a la cantidad de analito que pasa por él y que
se comenta a continuación.
I.5.2.3. Tipos de detectores en cromatografía
Hay distintos tipos de detectores empleados en CG y HPLC,
destacando entre todos ellos el acoplamiento de la cromatografía de
gases y líquida a la espectrometría de masas. Este acoplamiento
permite combinar la gran versatilidad de estas dos técnicas de
separación, con la elevada sensibilidad y especificidad de la
espectrometría de masas.
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76
Se emplean distintos tipos de espectrómetros de masas como
el simple cuadrupolo, triple cuadrupolo, trampa iónica, tiempo de
vuelo o el orbitrap. Se pueden emplear diferentes técnicas de
ionización como el impacto electrónico (EI), ionización química (CI),
ionización química a presión atmosférica (APCI) o ionización por
electrospray (ESI).
A su vez, se pueden utilizar diferentes modos de adquisición,
como el llamado full-scan (o modo de barrido completo), el modo
SIM (selected ion monitoring), modo SRM (selected reaction
monitoring) o modo MRM (multiple reaction monitoring). La
combinación de diferentes tipos y modos de operación en los
detectores de espectrometría de masas dan lugar a diferentes grados de
selectividad y especificidad (European Commission, 2013).
Aparte de los espectrómetros de masas, se pueden emplear
otros detectores. En cromatografía de gases hay detectores selectivos
como el de captura electrónica (ECD) o el detector termoiónico
(NPD), que presentan alta sensibilidad y selectividad frente a grupos
químicos presentes en distintos grupos de plaguicidas. También en
cromatografía líquida se pueden emplear detectores como el de red de
diodos (DAD) o el detector de fluorescencia. Sin embargo, todos estos
detectores son menos empleados que los espectrómetros de masas en
el análisis de plaguicidas debido a su limitada especificidad (European
Commission, 2013).
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I.5.3. Validación de métodos
La validación de un método analítico consiste en establecer
mediante estudios de laboratorio, que las características de desempeño
del método cumplen con los requisitos para las aplicaciones analíticas
previstas (Organización Panamericana de la Salud, 2002).
Los métodos de análisis requieren confiabilidad, siendo éste un
término general que incluye el grado de cumplimiento satisfactorio de
un método analítico en términos de sus distintos atributos técnicos
(aplicabilidad, exactitud, precisión, sensibilidad y detectabilidad)
(AOAC, 1990; Masson, 2007). Los nuevos métodos analíticos deben
validarse para demostrar su idoneidad. La validación consiste, por
tanto, en confirmar y documentar que los resultados derivados de la
aplicación de un método de análisis son confiables.
Para la validación de un método, deben considerarse
parámetros como la linealidad, especificidad y selectividad, precisión,
exactitud, sensibilidad y limites de detección y cuantificación, entre
otros (European Commission, 2013; Vinagre, 2007; Quattrocchi,
1992). A continuación se describen estos parámetros.
Linealidad
La linealidad de un método analítico es su capacidad para
obtener resultados que sean proporcionales, bien directamente o bien
mediante una transformación matemática, a la concentración de
analito en muestras en un intervalo determinado (Organización
Panamericana de la Salud, 2002). El rango lineal, que también se
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determina, es el intervalo comprendido entre la concentración mínima
y máxima de analito para el cual el método es lineal.
Especificidad y selectividad
La especificidad básicamente se refiere a la propiedad del
método de producir una señal medible debida sólo a la presencia del
analito, libre de interferencia de otros componentes en la matriz de la
muestra.
Según la Guía de procedimientos de validación para análisis de
residuos de plaguicidas de la Comisión Europea (European
Commission, 2013), la especificidad es la habilidad del detector
(apoyada por la selectividad del proceso de extracción, clean-up,
derivatización o separación, si fuese necesario) para dar señales que
identifiquen de forma efectiva al analito, mientras que la selectividad
es la habilidad de los procesos de extracción, clean-up, derivatización,
sistema de separación y, especialmente del detector para discriminar
entre el analito y otros compuestos. Por ejemplo, la cromatografía de
gases con detector de captura electrónica (CG-ECD) es un sistema de
determinación selectiva que no aporta especificidad.
Precisión
Se puede definir como el grado de coincidencia entre los
resultados de distintos análisis sobre muestras individuales de una
muestra homogénea. La precisión de un método ha de incluir todas las
fuentes de variación en todas las etapas del procedimiento analítico.
Introducción
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
79
La medida de precisión normalmente se expresa en términos de
imprecisión, la medida de la precisión (o imprecisión) es la desviación
estándar o la desviación estándar relativa. Este parámetro se determina
haciendo ensayos repetitivos de una misma muestra analítica o de
cada conjunto de muestras analíticas, y luego se calcula la desviación
estándar, siendo muy importante en este caso la homogeneidad del
sustrato.
Se pueden considerar distintos niveles de precisión:
- Repetibilidad, que hace referencia al grado de coincidencia
entre resultados de varios análisis realizados por un mismo
analista, en un periodo corto de tiempo y empleando la
misma instrumentación.
- Precisión intermedia, que es la coincidencia entre los
resultados de análisis llevados a cabo en el mismo
laboratorio, pero en días diferentes, con analistas diferentes.
- Reproducibilidad, que es la coincidencia entre los
resultados realizados por distintos laboratorios, con
diferentes analistas y equipos (como en los ejercicios de
comparación interlaboratorio).
Exactitud
Es la cercanía o proximidad del valor analítico al valor
verdadero. Es la concordancia entre la mejor estimación de una
cantidad y su valor real. La inexactitud es la diferencia numérica entre
Introducción
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
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80
el valor promedio de un conjunto de repeticiones y el valor verdadero.
La exactitud se puede calcular como el porcentaje de analito
recuperado o por la diferencia entre el valor obtenido y el valor real,
evaluado estadísticamente.
La exactitud o mejor dicho la inexactitud debe ser tan
pequeña como sea posible para que el valor medido se aproxime al de
referencia, o sea, la recuperación debe acercarse al 100%. Según la
Guía de procedimientos de validación para análisis de residuos de
plaguicidas de la Comisión Europea (European Commission, 2013),
en un método analítico cuantitativo se consideran recuperaciones
medias aceptables las que está entre 70 y 120%, con una repetibilidad
asociada RSDr (desviación estándar relativa) ≤ 20%.
Sensibilidad
Es la pendiente de la recta resultante de representar la
respuesta frente a la concentración, o el cambio de respuesta por
unidad de concentración. A mayor pendiente mayor sensibilidad del
método y viceversa.
Límites de detección y cuantificación
El límite de detección es la menor cantidad de analito que
puede ser detectada en una muestra, aunque no necesariamente
cuantificada. Cuando hay ruido de fondo, como es el caso de la
cromatografía, en los que los cromatogramas presentan una línea base,
correspondiente al ruido de fondo, el cálculo de los límites de
Introducción
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
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81
detección puede realizarse con un valor con el cual la relación entre
señal/ruido (S/R) es 2:1 ó 3:1. Esta última relación es la que suele
emplearse en cromatografía.
El límite de cuantificación (LC o LOQ) es la menor cantidad
de un analito en una muestra que puede determinarse
cuantitativamente, con precisión y exactitud aceptables.
En la figura 16 se muestran algunos de los parámetros que
acaban de definirse.
Figura 16. Respuesta en función de la concentración del analito. Atributos de los
métodos
Fuente: Vinagre, J. (2007) ftp://ftp.fao.org/docrep/fao/010/ah833s/AH833S07.pdf
El hecho de que un método en particular empleado sobre un
alimento haya dado un buen cumplimiento con todos los atributos de
calidad, indica que el método es adecuado para esa matriz. Esto no
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Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
82
significa que también sea adecuado cuando se aplique a un alimento
diferente, sino que, por el contrario, se debe asumir la posición
opuesta hasta comprobarlo. Por tanto, la validación de un método ha
de hacerse en todas las matrices a las que se quiera aplicar,
especialmente cuando se trata de alimentos de composición muy
diferente, como sería el caso de la fruta fresca y de los aceites
esenciales.
La validación de metodologías analíticas para la
determinación de diversos plaguicidas en frutos cítricos y sus aceites
esenciales, permiten garantizar la aplicación de una metodología
adecuada para evaluar la probable correlación entre los niveles de los
analitos hallados entre ambas matrices.
CAPITULO II
OBJETIVOS Y
PLAN DE TRABAJO
Objetivos y Plan de Trabajo
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
85
II. OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO
II.1.Objetivos
II.1.1. Objetivos generales
El objetivo general de la presente tesis doctoral fue
determinar los contenidos de distintos plaguicidas en fruta a la entrada
de la línea de producción y en los aceites esenciales obtenidos a partir
de las mismas, para evaluar la probable correlación entre los niveles
de los analitos en los productos y materia prima de las cuales
provienen. Para ello se estableció también como objetivo general,
validar metodologías analíticas para la determinación de clorpirifos,
carbendazim, procloraz y tiabendazol, por cromatografía de gases y
líquida, en diferentes matrices cítricas, tales como frutas y aceite
pulido y descerado.
El cumplimiento de estos objetivos contribuirá a la mejora de
la calidad de los productos citrícolas de la región Noreste Argentino
(NEA), gracias a la transferencia de los resultados obtenidos, con el
fin de dar respuesta a las demandas de los sectores involucrados.
Mediante la validación de una metodología analítica de adecuada
sensibilidad, pretende dotar al sector industrial de una herramienta
adecuada para llevar a cabo controles de calidad que permitan
garantizar la seguridad alimentaria en materia de residuos de
plaguicidas, a la vez que establecer estrategias adecuadas de
comercialización, teniendo en cuenta los Límites Máximos de
Residuos establecidos en la legislación de los distintos mercados.
Objetivos y Plan de Trabajo
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frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
86
II.1.2. Objetivos Específicos
Los objetivos generales del presente trabajo se pueden
desglosar en los siguientes objetivos específicos:
- Establecer y desarrollar el plan de muestreo: determinar los
puntos de muestreo, frecuencia y tamaño de la muestra.
- Validar métodos analíticos para la determinación de
residuos de clorpirifos y tiabendazol en frutas cítricas, mediante la
aplicación cromatografía de gases y cromatografía líquida.
- Validar métodos analíticos para la determinación de
residuos de clorpirifos, carbendazim, procloraz y tiabendazol en
aceites esenciales extraídos de frutas cítricas, mediante la aplicación
cromatografía de gases y cromatografía líquida.
- Evaluar los niveles de los residuos de dichos plaguicidas en
las frutas y su incidencia en aceites esenciales.
- Determinar la probable correlación entre los niveles de los
analitos en los productos y materia prima de la cual provienen.
II.2. Plan de trabajo
El plan de actividades propuestas y llevado a cabo para lograr
los objetivos anteriormente mencionados se detalla a continuación:
- Identificación de los plaguicidas a determinar en función de
la importancia e impacto que revisten por su aplicación en los
productos obtenidos en la industria de la región del Noreste Argentino
(NEA).
Objetivos y Plan de Trabajo
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87
- Selección de las matrices a evaluar en función de las
problemáticas que se manifiestan durante la comercialización en los
mercados nacionales e internacionales.
- Diseño y ejecución del plan de muestreo para las diferentes
matrices de acuerdo a los objetivos propuestos en la industria.
- Estudio de las condiciones óptimas de las técnicas
cromatográficas acopladas a la espectrometría de masas para la
determinación de clorpirifos, carbendazim, procloraz y tiabendazol
por GC-MS; LC- MS/MS y GC- MS/MS.
- Validación de los métodos para la determinación de
clorpirifos y tiabendazol en frutas, así como de clorpirifos,
carbendazim, procloraz y tiabendazol aceites esenciales por GC-MS;
LC- MS/MS y GC- MS/MS: determinación de la linealidad, precisión,
recuperación o exactitud, límites de detección y cuantificación del
método.
- Aplicación de las metodologías validadas para la
determinación de los niveles de residuos en frutas y aceites esenciales,
en condiciones controladas en la entrada y salida de la línea de
producción, respectivamente.
- Evaluación de la correlación entre los niveles de residuos en
fruta y los que presentan los aceites esenciales obtenidos a partir de la
misma.
- Tratamiento de datos y discusión de resultados.
- Elaboración del informe final.
CAPITULO III
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales y Métodos
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frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
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III. MATERIALES Y MÉTODOS
En este trabajo se llevó a cabo el desarrollo de métodos de
análisis cromatográfico y validación de los mismos, para la
determinación de clorpirifos y tiabendazol en muestras de naranja de
la variedad Valencia, y de los aceites esenciales descerados obtenidos
a partir de las mismas. Asimismo, se desarrollaron y validaron
métodos de análisis de procloraz y carbendazim en estos mismos
aceites esenciales.
Una vez validados los métodos de análisis, se realizaron
determinaciones de clorpirifos y tiabendazol en muestras de naranjas y
en los aceites esenciales descerados obtenidos. Se determinó la
persistencia de dichos plaguicidas en los aceites, además de llevar a
cabo un estudio de correlación entre los niveles de ambos plaguicidas
presentes en la fruta y los niveles residuales en los aceites esenciales.
Asimismo, se realizaron análisis de procloraz y carbendazim en estos
mismos aceites esenciales. Para poder estudiar la persistencia en los
aceites y la correlación entre niveles en fruta y en aceites, se tomaron
datos de concentraciones de procloraz y carbendazim, que habían sido
determinados en las materias primas con las que se elaboraban los
aceites, por Martínez (2016) en un trabajo llevado a cabo en paralelo
con el presente estudio.
A continuación se describen los reactivos, materiales y
equipamiento empleado, así como las metodologías de muestreo,
tratamiento de muestras, análisis y tratamiento de datos.
Materiales y Métodos
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III.1. Reactivos y Equipamiento
Se detallan a continuación los reactivos y equipamiento
utilizados en el desarrollo de la presente tesis:
III.1.1. Reactivos
- Acetato de etilo grado plaguicida (Merck, Darmstadt,
Alemania)
- Acetonitrilo grado GC y HPLC (J.T.Backer)
- Estándares certificados de clorpirifos, carbendazim, procloraz
y tiabendazol (Accu Standard Inc.)
- Agua grado 1 (agua calidad cromatográfica ultra pura).
- Hidróxido de sodio, ácido clorhídrico, cloruro de sodio,
sulfato de magnesio y sulfato de sodio calidad p.a. (Merck).
- Metanol calidad cromatográfica (Merck)
- Hexano calidad cromatográfica (Merck)
- Acetona calidad cromatográfica (Merck)
- Soluciones estándar stock de 1000 ppm en metanol de los
diferentes analitos.
- PSA (cartuchos para extracción)
III.1.2. Equipamiento
- Cromatógrafo de gases con detector de espectrometría de
masas tipo simple cuadrupolo (CG-MSD), marca Agilent
Technologies, modelo GC 6850 y MSD 5973 Network.
Columna ZB-5MS Guardian (5% polysilarylene-95%
polydimetilsiloxano) de 30m x 0,25 mm (di) x 0,25 µm de
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93
espesor de film, con precolumna de 5 m. Helio como gas
portador.
- Cromatógrafo de gases Agilent Technologies 7890A con
doble detector de espectrometría de masas, tipo triple
cuadrupolo modelo 7000 con software QQQ Quantitative
Analysis Mass Hunter. Columna ZB-5MS Guardian (5%
polysilarylene-95% polydimetilsiloxano) de 30m x 0,25 mm
(di) x 0,25 µm de espesor de film, con precolumna de 5 m.
Helio como gas portador.
- Cromatógrafo líquido con doble detector de masas triple
cuadrupolo, marca Shimadzu, modelo Nexera con detector
AB SCIEX triple cuadrupolo modelo 5500. Columna marca
Phenomenex modelo Sinergi 4u Fusión RP-80 de 100 mm de
longitud y 2 mm de diámetro interno, con relleno de fase
reversa C18.
- Agitador magnético Mistral Large Magnestir II - Lab Line
Mod 1170-1, con sistema aislante, para mantener la
temperatura constante.
- Baño de ultrasonido NEY-Dental International con controles
ajustables.
- Balanza analítica Ohaus
- Congelador Electrolux
- Centrífugas Gelec 130-D y Gelec G-142-D de 13.000 y 5.000
rpm.
- Procesadora semi-industrial Ultracomb.
- Miniprocesadora de uso doméstico Philip con refrigeración.
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- “Vacuum Maninfold” marca Alltech, bomba de vacío
regulable, con capacidad para 16 columnas o cartuchos.
Cartuchos de 6 y 25 mL, provistos de filtros de teflón de 0,45
m marca Alltech.
- Cámara de frío para conservación. Temperatura 5°C y 90%
HRE.
III.2. Plan de muestreo
El muestreo constituye una etapa crítica en el desarrollo de
un método analítico; ya que puede constituir una fuente de error
importante. Su objetivo es obtener una muestra representativa de todos
lotes sobre los cuales se pretende determinar el nivel de residuos de
plaguicidas.
Para el diseño de los planes de muestreo de las diferentes
matrices cítricas se consideraron las normas establecidas por la
FAO/OMS, con el fin de garantizar la calidad y representatividad de
las muestras, tanto para materia prima como productos obtenidos
(http://www.fbioyf.unr.edu.ar/evirtual/pluginfile.php/117409/mod_res
ource/content/1/Guia_para_muestreo_de_alimentos_FAO.pdf).
En el presente trabajo, las muestras de fruta fresca estudiadas
fueron naranjas de la variedad Valencia. Asimismo, se evaluaron,
muestras de aceites esenciales descerados obtenidos a partir de dichas
frutas. Las muestras empleadas en este trabajo fueron facilitadas por la
industria de jugos y aceites cítricos de la zona, ECA y Litoral Citrus
S.A. (Concordia, Entre Ríos, Argentina), quienes disponen de un
sistema de extracción del tipo FMC y, por lo tanto, el proceso de
Materiales y Métodos
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95
obtención de aceites esenciales fue el descrito para dicha tecnología en
el capítulo de Introducción.
La recolección y manejo de las muestras se efectuó en la
propia industria con la colaboración de profesionales de la Estación
Experimental Agropecuaria del Instituto Nacional de Tecnología
Agropecuaria (INTA) de Concordia, junto con las empresas locales de
empaque de fruta fresca y de industria de extracción de jugo, citadas
anteriormente.
El período de muestreo corresponde a tres temporadas
consecutivas de producción comprendidas entre los años 2012 y 2014,
durante un mes de producción, a intervalos de 1 semana, de forma que
cada año se hacían 4 muestreos. Se seleccionó el mes de octubre ya
que se corresponde con en el período de mayor volumen de
producción de la variedad seleccionada.
Se diseñó un plan de muestreo para los lotes de fruta entera
que llegan a la industria de aceites, asi como para los aceites
esenciales descerados obtenidos a partir de las mismas.
Se seleccionaron los puntos de muestreo inicial y final del
proceso de obtención de aceite esencial descerado en la industria, que
muestra la figura 17. Así, las muestras fueron identificadas de la
siguiente manera:
- Frutas de ingreso (a la entrada de la línea)
- Aceite esencial descerado (a la salida de la centrífuga
concentradora)
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96
Figura 17. Diagrama del proceso de obtención de aceite esencial descerado
Dada la complejidad del proceso de extracción, los puntos de
toma de muestra de las diferentes matrices cítricas determinan, para
cada una de ellas, una modalidad de muestreo diferente a considerar:
Para fruta de ingreso, se tomaron muestras de frutas enteras a
granel, procedentes de cada uno de los camiones que llegan a la
industria, constituyendo los lotes a procesar los camiones que llegan
en un turno laboral de 8 horas.
Se procedió con un plan de muestreo simple tomando un
tamaño total de la muestra del 1% del total de frutas que llegó en cada
camión, representado como n (figura 18 (a)). Para llevar a cabo la
toma de muestra, se realizó un muestreo geométrico en cada uno de
los camiones, para lo cual se tomaron 1/3 de n frutas de la parte
superior del contenedor, 1/3 de la parte central y 1/3 de la parte
inferior, teniendo en cuenta las zonas extremas y centrales de cada uno
de los planos considerados.
Materiales y Métodos
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97
Una vez obtenidas las porciones del total del lote a muestrear,
se procedió al cuarteo de la misma, hasta alcanzar una cantidad n´ de
frutas, que correspondía al 10% de n, como se observa en la figura 18
(b).
Figura 18. Esquema del plan de muestreo para frutas de ingreso
En la figura 19 se puede observar el momento de la toma de
muestra de la fruta. El muestreo al ingreso de la fruta en la industria
para cada uno de los diferentes camiones, previamente identificados,
se puede resumir de la siguiente forma:
- 1% de 20 toneladas / camión = 0,2 toneladas/camión = 200
Kg/camión
- 200 Kg x 6 frutos/ Kg = 1200 frutos = n
- 10 % de 1200 frutos = 120 frutos totales = n’ (constituye
muestra representativa del lote)
Para cada día de muestreo, se obtuvieron 10 muestras
representativas, habiéndose realizado un total de 12 días de muestreo
durante el desarrollo total del plan de muestreo, se obtuvo un total de
120 muestras.
Materiales y Métodos
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Figura 19. Recolección de muestras de frutas enteras
Para aceites esenciales descerados el plan de muestreo se
realizó en la modalidad de producción-tiempo, ya que se tomaron
directamente sobre la línea de producción a intervalos de tiempos
iguales, correspondientes al tiempo de procesado de la fruta de cada
camión volcado, este tiempo fué de aproximadamente 45 minutos.
Para preparar cada una de las muestras, a la salida de la centrífuga
concentradora se toma un volumen de 500 mL de emulsión rica en
aceite. Las muestras así obtenidas se sometieron a un proceso de
centrifugado en laboratorio de la misma industria, con un posterior
tratamiento a temperaturas de -18ºC para realizar el pulido y
descerado de las mismas. Se tomaron 50 mL de cada una de las
muestras así procesadas (figura 20). Se tomaron un total de 120
muestras.
Todas las muestras fueron perfectamente identificadas y
rotuladas, declarando la fecha y hora de muestreo, variedad cítrica, n°
de lote, punto de muestreo y responsable técnico del mismo. Para su
conservación, hasta el momento de envío al laboratorio, las muestras
Materiales y Métodos
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de frutas enteras fueron conservadas en bolsas plásticas, en cámaras
de frío a una temperatura de 5ºC y 90% HR, con circulación y
recambio de aire. Los aceites fueron conservados en frascos de vidrio
color caramelo con tapa y contratapa de teflón o aluminio a
temperaturas de congelación.
Figura 20. Toma de muestra y acondicionamiento de muestras de aceites esenciales
descerados
Los blancos de muestra para ambas matrices (fruta y aceite
esencial) se obtuvieron y conservaron de igual manera, a partir de
frutas libres de plaguicidas, provenientes de una producción orgánica
perteneciente a la misma empresa.
Materiales y Métodos
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100
III.3. Preparación de las muestras para el análisis en laboratorio
III.3.1. Submuestreo
El método de submuestreo adoptado para frutas enteras fue el
de preparación de una muestra de laboratorio compuesta; es decir, que
las unidades individuales correspondientes a cada uno de los lotes
muestreados se combinaron para formar una mezcla homogénea. Para
ello, las frutas enteras fueron cortadas en pequeños trozos y
homogeneizadas en procesadora industrial de acero inoxidable. Se
conservaron en congelación y luego se procedió a tomar porciones de
la muestra compuesta para la reconstitución y homogenización previa
al análisis de laboratorio. Esta última homogenización se realizó en
miniprocesadora de uso doméstico con refrigeración (figura 26).
(a) (b) (c)
Figura 21. Preparación de muestras de frutas enteras
(a) Homogeneizado (b) Envasado (c) Rotulado
Para las muestras de aceites esenciales descerados no se
realizaron tratamientos previos de las muestras, ya que las mismas
fueron enviadas al laboratorio para su análisis en las condiciones en
que fueron tomadas en la industria.
Materiales y Métodos
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101
Todas las muestras fueron preparadas y conservadas en el
Laboratorio del Área de Química de la Facultad de Ciencias de la
Alimentación de la Universidad de Entre Ríos y luego son remitidas
al Laboratorio de Análisis de Plaguicidas de la Sección Química de la
Estación Experimental Agroindustrial “Obispo Colombres” (EEAOC),
en la ciudad de San Miguel de Tucumán. En un trabajo compartido
con personal de dicho laboratorio se procedió a la optimización de los
métodos de extracción de los residuos de plaguicidas objeto de estudio
(tiabendazol, clorpirifos, carbendazim y procloraz) y métodos de
análisis de los mismos.
III.3.2. Procedimiento de extracción de plaguicidas en fruta entera
Las metodologías de extracción adoptadas para el
procedimiento de preparación previa de las muestras fueron
extracción con disolvente, y método QuEChERS o extracción en fase
sólida dispersiva.
Para clorpirifos, se pesaron 10 g de la muestra
homogeneizada, se agregaron alícuotas de solución de NaOH hasta
alcanzar un pH final comprendido entre 8 y 9. Se adicionaron 10 mL
de acetato de etilo grado plaguicida, luego se agitó 1 min y
posteriormente se adicionaron una mezcla de sulfato de magnesio y
acetato de sodio. Se agitó vigorosamente durante 1 min para lograr la
homogeneización total de los reactivos y la muestra. Se centrifugó
durante 5 min a 4500 r.p.m. y posteriormente, se recogió el
sobrenadante para su posterior análisis.
Materiales y Métodos
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102
Para la extracción de tiabendazol en esta matriz, se utilizó la
variante del método QuEChERS con buffer acetato, considerado
método oficial (AOAC 2007). Se pesaron 10 g de muestra en los
cuales se extrajeron los analitos con una mezcla de ácido acético al
1% v/v en acetonitrilo. Posteriormente se adicionaron sulfato de
magnesio para favorecer la separación de fases entre el contenido de
agua de la muestra y la capa de acetonitrilo, y acetato de sodio para
regular el pH. Se agitó intensamente durante 1 min la dispersión y
posteriormente se centrifugó durante 5 min a 4000 r.p.m. Para la
limpieza del extracto orgánico se empleó una amina primaria y
secundaria (PSA) y C18. El eluato así obtenido se utilizó para su
posterior análisis.
III.3.3. Procedimiento de extracción de plaguicidas en aceites
esenciales
El procedimiento de extracción para todos los analitos se
unificó de la siguiente manera: se pesaron 5 g de muestra a la que se
adicionaron 10 mL agua y 15 mL de acetonitrilo, luego se agitó 1 min
y posteriormente se agregaron sulfato de magnesio y cloruro de sodio.
Se agitó vigorosamente durante 1 min para la homogenización total de
los reactivos y la muestra. A continuacion se centrifugó durante 5 min
a 5000 r.p.m. Se realizó la limpieza de 1 mL del extracto por adición
de sulfato de magnesio, carbono grafitado, PSA y C18, agitando
durante 2 min en forma manual. Finalmente se centrifugó durante 5
min a 5000 r.p.m. y se tomó el sobrenadante para su posterior análisis.
Materiales y Métodos
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III.3.4. Preparación de estándares
Se prepararon disoluciones patrones en acetonitrilo por
triplicado para los diferentes analitos, teniéndose en cuenta la
concentración esperada de éstos en las muestras. Las concentraciones
a las que se prepararon los patrones para fruta entera fueron las
siguientes:
- Clorpirifos: 0,025; 0,030; 0,035; 0,040; 0,045 y 0,050 mg/L
- Tiabendazol: 0,005; 0,006; 0,007; 0,008; 0,009 y 0,010 mg/L
Para aceites se prepararon en las siguientes concentraciones:
- Clorpirifos: 0,025; 0,030; 0,035; 0,040 y 0,050 mg/L
- Tiabendazol y carbendazim: 0,005; 0,006; 0,007; 0,008; 0,009
y 0,010 mg/L
- Procloraz: 0,05; 0,06; 0,07; 0,08; 0,09 y 0,10 mg/L
III.3.5. Preparación de muestras adicionadas
A partir de las muestras de frutas enteras y aceites esenciales,
cuya trazabilidad y control analítico permitía considerarlos como
blancos de muestra, se prepararon las muestras adicionadas por
triplicado a diferentes concentraciones de clorpirifos y tiabendazol.
Se llamó fruta pre-adicionada, a las muestras en las cuales la
adición de los analitos fue previa al proceso de extracción aplicado.
Las concentraciones correspondientes fueron:
- Clorpirifos: 0,040; 0,045; 0,050; 0,075; 0,090 y 0,100 mg/Kg.
- Tiabendazol: 0,007; 0,008; 0,009; 0,010; 0,020 y 0,050 mg/Kg.
Materiales y Métodos
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Las muestras de fruta post-adicionada corresponden a
aquellas en las que, la adición de los analitos se efectuó al extracto
obtenido al final del proceso extractivo, siendo las mismas de:
- Clorpirifos: 0,025; 0,030; 0,035; 0,040; 0,045 y 0,050 mg/Kg.
- Tiabendazol: 0,005; 0,006; 0,007; 0,008; 0,009 y 0,010 mg/Kg.
Las muestras adicionadas de aceites esenciales fueron
adicionadas previamente al proceso de extracción, a las siguientes
concentraciones:
- Clorpirifos: 0,035; 0,040; 0,050; 0,075 y 0,100 mg/Kg.
- Carbendazim, procloraz y tiabendazol: 0,007; 0,008; 0,009; 0,010;
0,020 y 0,050 mg/Kg.
III.4. Condiciones cromatográficas para la identificación de los
plaguicidas
A fin de establecer una metodología adecuada para el análisis
cromatográfico, se llevaron a cabo numerosas pruebas con el objeto de
lograr las condiciones óptimas de análisis.
Las modificaciones en las distintas pruebas realizadas se
basaron fundamentalmente en las temperaturas del inyector y rampas
de temperaturas del horno, en cromatografía de gases, y en el flujo,
composición y gradiente de fase móvil en HPLC, a fin de lograr la
mejor separación de los analitos y adecuadas respuestas del detector.
Establecidas las condiciones cromatográficas, el desarrollo
metodológico implicó la determinación de la curva de regresión lineal,
intervalos de confianza, precisión, exactitud y límites de detección y
cuantificación.
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105
III.4.1. Determinación de clorpirifos en fruta por cromatografía de
gases con detector de espectrometría de masas tipo simple cuadrupolo
(CG-MS)
Teniendo en cuenta las características propias de las técnicas
combinadas de GC-MS y las características fisicoquímicas de los
compuestos en estudio, se seleccionó esta técnica para la separación y
cuantificación de clorpirifos en la matriz fruta entera.
La condiciones cromatográficas que se establecieron para la
determinación de clorpirifos fueron las siguientes: temperatura del
inyector 280ºC en modo splitless, volumen de inyección 1,00 L, gas
portador He a 1,0 mL/min. El programa de temperaturas del horno de
la columna fue el siguiente:
- T1 = 70ºC t1 =2 min R1 = 25ºC/min
- T2 = 150ºC t2 =0 min R2 = 3ºC/min
- T3 = 200ºC t3 =0 min R3 = 8ºC/min
- T4 = 280ºC t4 =10 min
III.4.2. Determinación de clorpirifos en aceites esenciales por
cromatografía de gases con doble detector de masas/masas tipo triple
cuadrupolo (GC-MS/MS)
Se seleccionó esta técnica para la separación y cuantificación
de clorpirifos en las muestras de aceites esenciales. Para ello se
establecieron las siguientes condiciones: temperatura del inyector
280ºC, en modo splitless, volumen de inyección 1,00 L, gas portador
He 1,0 mL/min. El programa de temperaturas del horno fue el
siguiente:
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106
- T1 = 60ºC t1 =1,05 min R1 = 40ºC/min
- T2 = 150ºC t2 =0 min R2 = 3ºC/min
- T3 = 200ºC t3 =0 min R3 = 7ºC/min
- T4 = 280ºC t4 =10 min
III.4.3. Determinación de procloraz, carbendazim y tiabendazol por
cromatografía líquida con doble detector de masas/masas tipo triple
cuadrupolo (LC-MS/MS)
Se seleccionó esta técnica para la separación y cuantificación
de procloraz, carbendazim y tiabendazol en las muestras de aceites
esenciales, y tiabendazol en fruta entera. Para ello se establecieron las
siguientes condiciones: Temperatura de columna = 40ºC, composición
de la fase móvil A: agua/metanol (90:10) + 5mM formiato de amonio
y composición de la fase móvil B: metanol/agua (90:10) + 5mM
formiato de amonio. Flujo de la fase móvil: 0,4 mL/min. La tabla 5
muestra el gradiente de elución empleado.
Tabla 5. Gradiente de elución
Tiempo (min) % Fase móvil A % Fase móvil B
0.01 100 0
1.00 100 0
15.00 0 100
18.00 0 100
18.05 100 0
20.00 100 0
20.01 Stop
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107
III.5. Análisis estadísticos de los resultados
Los datos obtenidos de los análisis cromatográficos para las
diferentes matrices fueron sometidos a un tratamiento estadístico
mediante el software Statgraphics Centurión XV, versión 15.2.06. Se
llevó a cabo un análisis unidimensional de los datos, se determinó la
desviación estándar y el coeficiente de variación relativo, la
linealidad, intervalo de confianza, precisión, exactitud, límites de
detección y cuantificación del método, independencia y normalidad de
los residuos.
Para evaluar la linealidad se prepararon disoluciones patrón
para calibración a 6 niveles de concentración por triplicado, como se
ha detallado anteriormente. Estas disoluciones fueron analizadas por
GC/MS, GC/MS/MS y por LC/MS/MS, haciendo 7 inyecciones de
cada una de las disoluciones preparadas. Los intervalos de
concentración empleados se basaron en las concentraciones estimadas
en muestras reales, teniendo en cuenta la bibliografía consultada. De
los cromatogramas obtenidos para cada uno de los estándares de las
diferentes concentraciones, se sacaron las áreas correspondientes.
Se llevó a cabo un análisis de regresión lineal y se determinó
la independencia y normalidad de los residuos, a partir de los
estadísticos de Durbin Watson y Kolmogorov, para un nivel de
confianza del 95%. Se estableció la ecuación de la recta y el
estadístico R2 que indica la relación entre las variables.
Del análisis de los factores de respuestas obtenidos para cada
uno de los puntos de la gráfica de calibración, se calculó la desviación
estándar relativa (RSD) de los mismos para cada nivel de
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108
concentración. El criterio de aceptación adoptado para el valor de la
RSD es que éste debe ser inferior o igual al 20% (European
Commission, 2013). Además, se obtuvo la ecuación de la recta de
calibración para cada analito y los coeficientes de correlación y
determinación, R y R2
respectivamente, adoptando como criterio de
aceptación que R sea mayor o igual que el valor 0,995 y R2 sea mayor
o igual que 0,990. Para evaluar el valor residual individual se realiza
un cálculo de la diferencia que existe entre el residuo y el predicho
para cada uno de los datos obtenidos para cada nivel de concentración,
adoptando como criterio de aceptación en linealidad un valor de ±
20% (European Commission, 2013).
De igual modo se procedió con muestras de fruta entera y
aceites esenciales adicionadas.
Los procesos adoptados para determinar precisión y límites
de detección y cuantificación, se resumen a continuación:
Para el cálculo de la precisión se emplearon disoluciones
patrón y disoluciones de muestras adicionadas. Todas las repeticiones
de los análisis fueron realizadas por un solo analista, el mismo día y
en idénticas condiciones cromatográficas. La precisión se evaluó con
el coeficiente de variación (CV) o desviación estándar relativa (RSD),
obtenido a partir de la la desviación estándar (σ), estimada
analíticamente por s.
El estimador s de la desviación estándar se calcula como:
𝑆 = √∑ 𝑛
𝑙=1 (𝑥𝑖 − 𝑥 ̅)2
𝑛 − 1
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109
Donde n es el número de medidas, xi es el valor medido en el
ensayo i, y �̅� el estimador de la media poblacional µ, calculado como:
𝑥 ̅ = ∑ 𝑥𝑖
𝑛𝑙=1
𝑛
Por su parte, la desviación estándar relativa o coeficiente de
variación se calcula como:
RSD= 𝑠∗100
�̅�
Ambos estimadores, desviación estándar y desviación estándar
relativa, permiten evaluar la incertidumbre en la estimación de la
medida, es decir, el error aleatorio correspondiente a la dispersión de
datos alrededor de la media. Para el estudio de la precisión del sistema
se evaluó la dispersión de 7 inyecciones de una de las disoluciones
patrón y de un nivel de concentración en muestras adicionadas,
realizándose por triplicado. Se obtuvieron también los valores del
sesgo estandarizado y de curtosis estandarizada para evaluar si los
datos provienen de una distribución normal. Los valores de estos
estadísticos fuera del rango de -2 a +2 indicarían desviaciones
significativas de la normalidad, lo que tendería a invalidar cualquier
prueba estadística con referencia a la desviación estándar.
Los límites de detección y de cuantificación, se estimaron a
partir de la curva de regresión, para bajas concentraciones de los
analitos, para n=21 determinaciones individuales y α= 0,05. De dicha
curva se determinó la pendiente y por extrapolación a concentración
cero, se obtuvo un estimado de la respuesta del blanco (Ybl). A partir
de la desviación estándar a cada concentración, se determinó la recta
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110
correspondiente y por extrapolación se estimó la desviación estándar
del blanco (Sbl).
Para evaluar los límites de detección se usaron los datos
obtenidos de las curvas de calibración. Los límites de detección y
cuantificación se calcularon a partir de las ecuaciones que se detallan
a continuación y en las que se considera 3 y 10 veces la desviación
estándar del blanco respectivamente, para n determinaciones
individuales.
Límite de detección 𝑦𝑏𝑙 + 3 𝑆𝑏𝑙
𝑏 *
1
√𝑛´
Límite de cuantificación 𝑦𝑏𝑙 + 10 𝑆𝑏𝑙
𝑏 *
1
√𝑛´
Donde:
Ybl: señal del blanco
Sbl: desviación estándar del blanco
b: pendiente de la curva de regresión lineal
n´: número de veces que se repite la medida
Para determinar la exactitud se trabajó con muestras
adicionadas a diferentes niveles de concentración y se calcularon los
porcentajes de recuperación y sus desviaciones estándar relativas. La
exactitud se determinó para el promedio de recuperaciones de todas
las concentraciones, adoptando como criterios de aceptación los
siguientes parámetros: recuperaciones del 70 a 120% y desviaciones
estándares relativas menores que 20% (European Commission, 2013).
Con los datos obtenidos en la determinación de clorpirifos y
tiabendazol en las muestras de naranja se llevó a cabo un ANOVA
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111
simple, para determinar si había diferencias significativas entre los 4
lotes evaluados cada año, tomando como variables los niveles de
plaguicidas y como factor el lote para cada año. Se llevó a cabo otro
ANOVA simple para determinar si había diferencias entre los 3 años
evaluados, siendo las variables los niveles de plaguicidas y el factor el
año. Estos mismos análisis se realizaron con los niveles de clorpirifos,
tiabendazol, procloraz y carbendazim en las muestras de aceites
esenciales. Se utilizó el procedimiento LSD (least significant
diference) para comprobar las diferencias a un nivel de significación
del 5%.
III.6. Estudio de la correlación de los niveles residuales de
plaguicidas entre fruta cítrica entera y aceites esenciales.
Se llevó a cabo un estudio de la correlación de los datos
obtenidos en los diferentes ensayos experimentales en la
determinación de niveles residuales de plaguicidas en muestras reales
de frutas cítricas enteras que llegan a la industria y los aceites
esenciales obtenidos a partir de ellas. Dado que en este trabajo las
concentraciones de procloraz y carbendazim solamente se habían
determinado en aceites esenciales, se tomaron los datos de
concentraciones de la materia prima de un trabajo que había sido
llevado a cabo en paralelo a este estudio (Martínez, 2016), tal y como
se ha comentado anteriormente.
La correlación estadística determina la relación o
dependencia que existe entre las dos variables que intervienen en una
distribución bidimensional. Es decir, determinan si los cambios en una
Materiales y Métodos
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112
de las variables influyen en los cambios de la otra. En caso de que esto
suceda, se puede decir que las variables están correlacionadas o que
hay correlación entre ellas.
Para el estudio de la correlación estadística de los resultados,
se establecieron dos series simples para cada lote muestreado, cada
una de las series corresponde a los niveles residuales de plaguicidas
hallados en la fruta que ingresa a la industria y en aceites descerados,
respectivamente. Después de establecer las series, se estudió si existía
alguna correlación entre los pares de variables de igual índice para
cada lote, como puede observarse en la tabla 6.
Tabla 6. Serie de pares de las variables en cada lote
Nivel residual en muestras
de fruta entera para el lote
N, (RfN)
Rf1 Rf2 Rf3 ……. RfN
Nivel residual en muestras
de aceites descerados para
el lote N, (RaN)
Ra1 Ra2 Ra3 …….. RaN
Cada una de las series fue sometida a un tratamiento
estadístico en donde se determinaron las correlaciones de momento
producto de Pearson, entre cada par de variables y la significanción
estadística de las correlaciones estimadas.
El cálculo del coeficiente de correlación de Pearson (r) se
basa en la relación que existe entre la distribución de los datos y se
calcula mediante la siguiente expresión:
r = 𝑛 ∑ 𝑥𝑦− ∑ 𝑥 ∑ 𝑦
√(𝑛 ∑ 𝑥2− (∑ 𝑥)2)(𝑛 ∑ 𝑦2− ( ∑ 𝑦)2)
Materiales y Métodos
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113
Donde:
x: variable de población x
y: variable de población y
n: número de mediciones
El coeficiente de correlación de Pearson, pensado para
variables cuantitativas, es un índice que mide el grado de covariación
entre distintas variables relacionadas linealmente. Esto significa que
puede haber variables fuertemente relacionadas, pero no de forma
lineal; en estos últimos casos no se puede proceder a aplicar la
correlación de Pearson.
El coeficiente de correlación de Pearson es un índice y sus
valores absolutos oscilan entre 0 y 1. Esto es, si tenemos dos variables
X e Y, y definimos el coeficiente de correlación de Pearson entre estas
dos variables como rxy entonces:
0 ≤ rxy ≤ 1
El coeficiente se ha definido en términos de "valores
absolutos" ya que en realidad si se contempla el signo el coeficiente de
correlación de Pearson, éste oscila entre –1 y +1. Para cada caso
indica una fuerte relación, en el caso de +1 la relación es perfecta
positiva y en el caso de -1 es perfecta negativa, consecuentemente será
menor cuanto más cerca de cero sea su valor absoluto.
La significanción estadística de las correlaciones estimadas se
halló mediante el P-valor. Un P-valor menor a 0,05 indica que existen
correlaciones significativas, con un nivel de confianza del 95,0%.
Materiales y Métodos
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114
CAPITULO IV
RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
Resultados y Discusión
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117
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
IV.1. Desarrollo y validación de los métodos de determinación de
clorpirifos en fruta entera por Cromatografía de Gases con
detector de Espectrometría de masas tipo simple cuadrupolo
(CG-MS).
Una vez llevados a cabo los análisis cromatográficos con las
condiciones establecidas se identificó el analito.
- Clorpirifos: monitorea desde los 18 min, los iones de m/z
197, 199, 258, 288, 314. Se cuantificó con el ión de m/z 314, que
presentó un tiempo de retención (tr) de 20,50 minutos (figura 22).
Figura 22. Cromatograma de clorpirifos obtenido por GC-MS
Resultados y Discusión
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118
IV.1.1. Clorpirifos
IV.1.1.1. Análisis unidimensional.
Los resultados del análisis unidimensional para las
disoluciones patrón y de muestras de frutas pre y post-adicionadas de
clorpirifos a 6 niveles de concentración, que se realizaron por
triplicado, con un total de 7 réplicas (7 pinchazos de una misma
disolución), se detallan en las tablas 7, 8 y 9, respectivamente.
Tabla 7. Análisis estadístico unidimensional. Disoluciones patrón de clorpirifos
(n=21 y α=0,05)
Patrón (mg/Kg) 0,025 0,030 0,035 0,040 0,045 0,050
Área Media 409 766 1124 1485 1844 2203
Desviación típica 1,41 3,26 3,56 3,74 3,74 1,41
Mínimo 407 760 1121 1480 1840 2201
Máximo 411 769 1129 1489 1849 2205
Rango 4 9 8 9 9 4
Coef. de
variación 0,34% 0,43% 0,32% 0,25% 0,20% 0,06%
Tabla 8. Análisis estadístico unidimensional. Fruta pre-adicionada con clorpirifos
(n=21 y α=0,05)
Adiciones
(mg/Kg) 0,040 0,045 0,050 0,075 0,090 0,100
Área Media 2085 2343 3054 4738 6094 6718
Desviación
típica 8,56 5,32 9,71 7,33 8,84 11,46
Mínimo 2075 2335 3038 4728 6078 6700
Máximo 2097 2350 3061 4746 6101 6730
Rango 22 15 23 18 23 30
Coef. de
variación 0,41% 0,23% 0,32% 0,15% 0,14% 0,17%
Resultados y Discusión
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119
Tabla 9. Análisis estadístico unidimensional. Fruta post-adicionada con clorpirifos
(n=21 y α=0,05)
Adiciones
(mg/Kg) 0,025 0,030 0,035 0,040 0,045 0,050
Área Media 521 1017 1540 2014 2610 3154
Desviación típica 38,13 10,70 17,28 7,09 3,33 9,71
Mínimo 490 1005 1510 2005 2605 3138
Máximo 595 1035 1555 2025 2615 3161
Rango 105 30 45 20 10 23
Coef. de
variación 7,32% 1,05% 1,12% 0,35% 0,13% 0,31%
El análisis unidimensional de los datos indicó para todas las
concentraciones de los analitos en todas las muestras una distribución
normal. Como era de esperar el área aumentó al aumentar la
concentración de clorpirifos en los 3 casos (patrones y muestras
adicionadas).
Se puede observar que el coeficiente de variación fue mayor
a medida que disminuía la concentración, tanto en los patrones, como
en las muestras pre- y post adicionadas (tablas 7 a 9), lo que indica
una mayor variabilidad en los resultados del análisis a bajas
concentraciones.
IV.1.1.2. Linealidad
En la figura 23 se detallan los resultados obtenidos para el
cálculo de linealidad en disoluciones patrón de clorpirifos.
Resultados y Discusión
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120
Figura 23. Regresión lineal con disoluciones patrón de clorpirifos
La ecuación del modelo ajustado correspondiente fue la
siguiente:
y = -1386,87 + 71791,4 *concentración disoluciones patrón (mg/Kg)
(ec. 1)
Donde y representa la respuesta cromatográfica expresada en
área de pico.
El estadístico R-cuadrado indica que el modelo explica un
99,9978% de la variabilidad de la respuesta cromatográfica expresada
en área de picos. El coeficiente de correlación fue de 0,999989, lo que
indica una relación fuerte entre las variables. El error estándar de la
estimación muestra la desviación típica de los residuos que fue de
2,95777.
Para todos los niveles de concentración se establecieron los
valores predichos de las respuestas cromatográficas para el modelo
ajustado y los residuos correspondientes. El porcentaje del valor
residual respecto del valor predicho para cada uno, se encuentra
dentro de los criterios de aceptación establecidos, habiéndose hallado
Linea de Regresion. Soluciones de estándares de Clorpirifos
Re
sp
ue
sta
cro
ma
tográ
fica (
Áre
as)
Concentracion de estándar (mg/Kg)
25 30 35 40 45 50(X 0,001)
0
400
800
1200
1600
2000
2400
Resultados y Discusión
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121
un valor mínimo de – 0,89% y un máximo de 0,76%, siendo el criterio
de aceptación establecido de ± 20% (European Commission, 2013).
En la figura 24 se detallan los resultados para la obtención de
la curva de linealidad en muestras de frutas pre-adicionadas con
clorpirifos.
Figura 24. Regresión lineal en muestras de fruta entera pre-adicionada con
clorpirifos
La ecuación del modelo ajustado correspondiente fue la
siguiente:
y = -1015,68 + 77392,7*concentración muestra de fruta pre-
adicionada (mg/Kg) (ec. 2)
Donde y representa la respuesta cromatográfica expresada en
área de pico.
El estadístico R-cuadrado indica que el modelo explica un
99,9987% de la variabilidad en área de picos. El coeficiente de
correlación fue de 0,999994, indicando una relación fuerte entre las
variables. El error estándar de la estimación muestra la desviación
típica de los residuos fue de 7,85274.
Resultados y Discusión
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122
Para todos los niveles de concentración se establecieron los
valores predichos de las respuestas cromatográficas para el modelo
ajustado y los residuos correspondientes, el porcentaje del valor
residual respecto del valor predicho para cada uno, al igual que para
las disoluciones patrón, se encuentra dentro de los criterios de
aceptación establecidos para estos valores, habiéndose hallado un
valor mínimo de – 0,59 % y un máximo de 0,66%.
Finalmente, en la figura 25 se detallan los resultados para la
obtención de la curva de linealidad en muestras de frutas post-
adicionadas con clorpirifos.
La ecuación del modelo ajustado correspondiente fue la
siguiente:
y = -2109,29 + 105234*concentración muestra de fruta post-
adicionada (mg/Kg) (ec. 3)
Donde y representa la respuesta cromatográfica expresada en
área de pico.
El estadístico R-cuadrado indica que el modelo explica un
99,9998% de la variabilidad del área de los picos. El coeficiente de
correlación fue igual a 0,999999, indicando una relación fuerte entre
las variables. El error estándar de la estimación muestra la desviación
típica de los residuos que fue de 1,69453.
Al igual que en los dos casos anteriores, para todos los
niveles de concentración se establecieron los valores predichos de las
respuestas cromatográficas para el modelo ajustado y los residuos
correspondientes. El porcentaje del valor residual respecto del valor
predicho para cada uno se encuentra dentro de los criterios de
Resultados y Discusión
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123
aceptación establecidos, habiendo hallado un valor mínimo de – 3,25
% y un máximo de 2,06%.
Figura 25. Regresión lineal en muestras de fruta entera post-adicionada con
clorpirifos.
En los tres casos (patrones, muestras pre- y post-adicionadas)
los estadísticos Durbin Watson y Kolmogorov permitieron establecer
la independencia de los residuos y una distribución normal de los
mismos para un nivel de confianza del 95%.
De los resultados obtenidos para los 3 casos, se puede
concluir que el método de determinación de clorpirifos en muestras de
naranja es lineal.
Comparación de líneas de regresión
Con el fin de evaluar si el efecto matriz era significativo para
la adopción de la curva de calibración, se procedió a realizar el estudio
comparativo entre las curvas de regresión lineal obtenidas para
disoluciones patrón y para muestras de frutas adicionadas.
Línea de Regresión. Muestra de fruta posadicionada
Concentración (mg/Kg)
Respuesta
Cro
mato
grá
fica (
Áre
as)
25 30 35 40 45 50(X 0,001)
0
1
2
3
4(X 1000,0)
Resultados y Discusión
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124
Las figuras 26 y 27 muestran la comparación de las curvas de
regresión obtenidas para las disoluciones patrón con las obtenidas para
las muestras de frutas pre-adicionadas (figura 26) y post- adicionadas
(figura 27).
Las ecuaciones 1 y 2 corresponden a las líneas de regresión
comparativas indicadas en la figura 26.
Figura 26. Rectas de regresión de clorpirifos de las disoluciones patrón y de las
muestras de fruta pre-adicionadas.
El estadístico R-cuadrado se utilizó para comparar los
modelos ajustados en el cálculo de regresión de las disoluciones
patrón y muestras de fruta pre-adicionada, en los que han resultado
con diferente número de coeficientes. El valor de este estadístico
explica el 99,9994% de la variabilidad en área de picos. El estadístico
R-cuadrado ajustado, que es más adecuado para comparar modelos
con diferente número de variables independientes fue 99,9992%. El
error estándar estimado muestra que la desviación estándar de los
residuos es 5,61244.
Resultados y Discusión
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125
El P-valor en el test ANOVA es inferior a 0,05, hay una
relación estadísticamente significativa entre las variables, con un nivel
de confianza del 99%.
El hecho de que el P-valor para las pendientes y para los
interceptos fuera inferior a 0,01, estaría indicando que existen
diferencias estadísticamente significativas entre las pendientes y entre
los interceptos para los distintos valores de disoluciones patrón y
muestras de frutas pre-adicionadas, con un nivel de confianza del
99%.
Las ecuaciones 1 y 3 corresponden a las líneas de regresión
comparativas indicadas en la figura 27.
Figura 27. Rectas de regresión de clorpirifos de las disoluciones patrón y de las
muestras de frutas post adicionadas.
El estadístico R-cuadrado se utilizó para comparar los
modelos ajustados en el cálculo de regresión de las disoluciones
patrón y muestras de fruta post-adicionada, en los que han resultado
con diferente número de coeficientes. El valor de este estadístico
explica el 99,9129% de la variabilidad del área. El estadístico R-
Resultados y Discusión
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126
cuadrado ajustado, que es más adecuado para comparar modelos con
diferente número de variables independientes fue 99,9091%. El error
estándar del estimado muestra que la desviación estándar de los
residuos fue 24,5906.
Al igual que en muestras de fruta pre-adicionada, en este caso
el P-valor en el test ANOVA fue inferior a 0,05, demostrando que hay
una relación estadísticamente significativa entre las variables, con un
nivel de confianza del 99%.
Debido a que el P-valor para las pendientes y para los
interceptos fue inferior a 0,01, existen diferencias estadísticamente
significativas entre las pendientes y entre los interceptos, para los
distintos valores de disoluciones patrón y muestras de frutas post-
adicionadas con un nivel de confianza del 99%.
Por todo ello, se puede concluir que el efecto matriz es
significativo, lo que implica que, en la determinación de clorpirifos en
muestras reales de frutas, es necesario efectuar un blanco de muestra y
muestras adicionadas para establecer la curva de linealidad
correspondiente. De esta forma se obtendrían rectas de calibrado
adecuadas para la cuantificación del analito en las muestras.
IV.1.1.3. Precisión y exactitud
La precisión se determinó para disoluciones patrón, muestras
de fruta pre-adicionadas y post-adicionadas.
La exactitud, calculada en términos de recuperación, se
determinó en muestras pre-adicionadas y post-adicionadas, calculando
Resultados y Discusión
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127
la media de las recuperaciones obtenidas a las distintas
concentraciones ensayadas en ambos tipos de muestra.
Las recuperaciones obtenidas para las muestras pre-
adicionadas con clorpirifos a 0,040; 0,045; 0,050; 0,075; 0,090 y
0,100 mg/kg, fueron de 112%, 112%, 113%, 114%, 116% y 116%;
respectivamente. En el caso de muestras post-adicionadas a 0,025;
0,030; 0,035; 0,040; 0,045 y 0,050 mg/Kg, los valores de recuperación
obtenidos fueron de 113%, 113%, 114%, 115%, 116% y 117%,
respectivamente. El valor medio de recuperación, considerando los
datos obtenidos en muestras pre- y post-adicionadas, fue del 114%,
que está dentro del rango de 70-120%, considerado como una
recuperación media aceptable por la Comisión Europea (European
Commission, 2013). Estos resultados demuestran que el método de
determinación de clorpirifos desarrollado en el presente trabajo es
exacto.
En la tabla 10 se muestran los valores de los distintos
parámetros que se calcularon para determinar la precisión.
El valor del sesgo estandarizado y el valor de curtosis
estandarizada se encuentran dentro del rango esperado para datos
provenientes de una distribución normal (en el rango de ±2). El
coeficiente de variación resultó en todos los casos ser menor del 20%,
lo que indica que el método de determinación de clorpirifos
desarrollado en este estudio es preciso (European Commission, 2013).
Resultados y Discusión
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
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128
Table 10. Resultados de los parámetros calculados para la determinación de la
precisión del método de determinación de clorpirifos en fruta (n=21, α=0,05)
Disolución patrón
de clorpirifos
0,03 mg/Kg
Muestra de
fruta pre-
adicionada
0,10 mg/Kg
Muestra de
fruta post-
adicionada
0,05 mg/Kg
Área Media 766 6718 3154
Coeficiente de
variación 0,43% 0,17% 0,31%
Sesgo
Estandarizado -1,09563 -0,526966 1,13383
Curtosis
Estandarizada -0,106291 -0,452676 0,464889
IV.1.1.4. Límites de detección y cuantificación
A partir de las curvas de regresión para frutas adicionadas a
bajas concentraciones, se determinaron los límites de detección y
cuantificación, tal como ha sido descrito en el capítulo de Material y
Métodos. Los límites de detección y cuantificación obtenidos para
clorpirifos fueron de 0,025 y 0,050 mg/Kg respectivamente. Teniendo
en cuenta que los LMR establecidos en la legislación son del orden de
0,3 mg/Kg para naranjas en la Unión Europea (European Commission,
2015) y en Argentina (SENASA, 2015), se podría concluir que ambos
límites son adecuados, por ser considerablemente menores a LMR.
Del análisis estadístico de los resultados antes detallados,
podemos concluir que el método es adecuado para determinar el nivel
de residuos de clorpirifos en naranjas que llegan a la línea de
producción de forma confiable.
Resultados y Discusión
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
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129
IV.2. Desarrollo y validación del método de determinación de
clorpirifos en aceites esenciales de naranja por
Cromatografía de Gases con doble detector de
Espectrometría de masas tipo triple cuadrupolo (CG-
MS/MS).
Establecidas las condiciones cromatográficas el clorpirifos se
identificó con las características, según se detalla en tabla 11.
Tabla 11. Características de identificación para clorpirifos por GC-MS/MS
Compuesto Q1 (Da) Q3 (Da) Tiempo
(min)
Energía de
Colisión (V)
Clorpirifos 313,9 257,9
18,60 14
313,9 165,9 43
IV.2.1. Clorpirifos
IV.2.1.1. Análisis unidimensional.
Los resultados del análisis unidimensional para las
disoluciones patrón y de muestras de aceites adicionadas con
clorpirifos a 5 niveles de concentración, realizadas por triplicado y
con un total de 7 réplicas (7 pinchazos de una misma disolución), se
detallan en las tablas 12 y 13, respectivamente.
El análisis unidimensional de los datos indicó para todas las
concentraciones de las muestras una distribución normal.
Si se comparan los coeficientes de variación en las
disoluciones patrón obtenidas mediante esta metodología, con los
obtenidos mediante CG con detector de espectrometría de masas tipo
simple cuadrupolo (CG-MS) (tabla 7), se puede observar, en general,
Resultados y Discusión
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
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130
menores coeficientes de variación en el caso de CG-MS, que
indicarían una menor variabilidad de las medidas.
Tabla 12. Análisis estadístico unidimensional. Disoluciones de patrón de clorpirifos
(n=21 y α=0,05)
Patrón (mg/Kg) 0,025 0,030 0,035 0,040 0, 050
Área Media 5588 13532 24651 55724 108416
Desviación típica 4,95 408,25 404,91 258,19 258,19
Mínimo 5579 12866 23977 55391 108250
Máximo 5592 13866 24977 55891 108750
Rango 13 1000 1000 500 500
Coef. de
variación 0,22% 3,02% 1,64% 0,46% 0,23%
Tabla 13. Análisis estadístico unidimensional. Muestras de aceite adicionadas con
clorpirifos (n=21 y α=0,05)
Adiciones (mg/Kg) 0,035 0,040 0,050 0,075 0,100
Área Media 28179 70424 140453 210649 281822
Desviación típica 63,49 34,58 64,82 34,81 18,70
Mínimo 28091 70395 140400 210602 281800
Máximo 28244 70482 140571 210682 281850
Rango 153 87 171 80 50
Coef. de variación 0,22% 0,05% 0,05% 0,02% 0,01%
IV.2.1.2. Linealidad
En la figura 28 se detallan los resultados obtenidos para el
cálculo de linealidad en disoluciones de patrón de clorpirifos.
Resultados y Discusión
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
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131
Figura 28. Regresión lineal con disoluciones patrón de clorpirifos
La ecuación del modelo ajustado correspondiente fue la
siguiente:
y = -96979,5 + 4,10502E6*concentración de disolución patrón
(mg/Kg) (ec. 4)
Donde y representa la respuesta cromatográfica expresada en
área de pico.
El estadístico R-cuadrado indica que el modelo explica un
99,9956% de la variabilidad en respuesta cromatográfica expresada en
área de pico. El coeficiente de correlación fue 0,999978, lo que indica
una relación fuerte entre las variables. El error estándar estimado
muestra la desviación típica de los residuos que es 242,999.
Para todos los niveles de concentración se establecieron los
valores predichos de las respuestas cromatográficas para el modelo
ajustado y los residuos correspondientes. El porcentaje del valor
residual respecto del valor predicho para cada uno se encuentra dentro
de los criterios de aceptación establecidos, fue de un valor mínimo de
– 8,65 % y un máximo de 3,82%.
Línea de Regresión. Soluciones de estándares de Clorpirifos
Concentración (mg/Kg)
Re
sp
ue
sta
Cro
ma
tog
ráfica (
Áre
as)
25 30 35 40 45 50(X 0,001)
0
2
4
6
8
10
12(X 10000,0)
Resultados y Discusión
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132
En la figura 29 se detallan los resultados para la obtención de
la curva de linealidad en muestras de aceite adicionadas con
clorpirifos.
Figura 29. Regresión lineal en muestras de aceite esencial adicionadas con
clorpirifos
La ecuación del modelo ajustado correspondiente fue la
siguiente:
y = -107056 + 3,88761E6*concentración muestra de aceite adicionada
(mg/Kg) (ec. 5)
Donde y representa la respuesta cromatográfica expresada en
área de pico.
El estadístico R-cuadrado indica que el modelo explica un
99,9961% de la variabilidad en respuesta cromatográfica expresada en
área de pico. El coeficiente de correlación fue 0,999981, lo que indica
una relación fuerte entre las variables. El error estándar estimado
muestra la desviación típica de los residuos que fue 609,347.
Para todos los niveles de concentración se establecieron los
valores predichos de las respuestas cromatográficas para el modelo
Línea de Regresión. Muestras de aceites adicionadas
Concentración (mg/Kg)
Re
sp
ue
sta
Cro
ma
tog
ráfica (
Áre
as)
35 55 75 95 115(X 0,001)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3(X 100000,)
Resultados y Discusión
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
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133
ajustado y los residuos correspondientes. El porcentaje del valor
residual respecto del valor predicho para cada uno se encuentra dentro
de los criterios de aceptación establecidos (valor mínimo de -0,21 % y
máximo de 0,67%).
En ambos casos (patrones, muestras adicionadas) los
estadísticos Durbin Watson y Kolmogorov permitieron establecer la
independencia de los residuos y una distribución normal de los
mismos para un nivel de confianza del 95%.
De los resultados obtenidos, se puede concluir que el método
de determinación de clorpirifos en aceites esenciales descerados de
naranja es lineal.
Comparación de líneas de regresión
La figura 30 muestra la comparación de las curvas de
regresión obtenidas para las disoluciones patrón con las obtenidas para
las muestras de aceites esenciales adicionadas.
Las ecuaciones 4 y 5 corresponden a las líneas de regresión
comparativas indicadas en la figura 30.
El estadístico R-cuadrado explica el 99,915% de la
variabilidad de las áreas y el R-cuadrado ajustado, que es más
adecuado para comparar modelos con diferente número de variables
independientes, como ya se ha comentado, es 99,9105%. El error
estándar estimado muestra que la desviación estándar de los residuos
fue 2921,67.
Resultados y Discusión
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134
El P-valor en el test ANOVA fue inferior a 0,05, lo que
nuevamente demostró la relación estadísticamente significativa entre
las variables, con un nivel de confianza del 99%.
Figura 30. Rectas de regresión de clorpirifos de las disoluciones patrón y de las
muestras de aceite esencial adicionadas.
Debido a que el P-valor para las pendientes y para los
interceptos fue menor que 0,01, en este caso también se demostró la
existencia de diferencias estadísticamente significativas entre las
pendientes y entre los interceptos, para los distintos valores de
disoluciones patrón y muestras de aceites adicionadas, con un nivel de
confianza del 99%.
Por todo ello, se puede concluir que el efecto matriz es
significativo, lo que implica que, en la determinación de clorpirifos en
muestras reales de aceites esenciales descerados, es necesario efectuar
un blanco de muestra y muestras adicionadas para establecer la curva
de linealidad correspondiente. De esta forma se obtendrían rectas de
Regresión Líneal Comparativa. Estándares vs Muestras de aceites adicionadas
Re
sp
ue
sta
Cro
ma
tog
ráfica (
Áre
as)
Concentración (mg/Kg)
codigo
estándar
muestra adicionada
0,025 0,045 0,065 0,085 0,105
0
1
2
3
4(X 100000,)
Resultados y Discusión
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135
calibrado adecuadas para la cuantificación del analito en las muestras
de aceites esenciales.
IV.2.1.3. Precisión y exactitud
La precisión se determinó para disoluciones patrones y
muestras de aceites adicionadas.
La exactitud se determinó calculando la media de las
recuperaciones obtenidas en muestras de aceites adicionadas con
clorpirifos a distintas concentraciones. Las recuperaciones obtenidas
para las muestras adicionadas a 0,035; 0,040; 0,050; 0,075 y 0,100
mg/Kg, fueron de 91%, 93%, 95%, 97% y 99%, respectivamente. En
este caso la exactitud medida en términos de recuperación fue del
95%, valor que pone de manifiesto la adecuada exactitud de este
método, según la Comisión Europea (European Commission, 2013).
En la tabla 14 se muestran los valores de los distintos parámetros que
se calcularon para determinar la precisión.
Tabla 14. Resultados de los parámetros calculados para la determinación de la
precisión del método de determinación de clorpirifos en aceites esenciales
(n=21, α=0,05)
Disolución patrón de
clorpirifos
0,030 mg/Kg
Muestra de aceite
adicionada
0,050 mg/Kg
Área Media 13532 140453
Coeficiente de
variación 3,02% 0,05%
Sesgo
Estandarizado -0,00607494 1,44548
Curtosis
Estandarizada -1,504 1,61738
Resultados y Discusión
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136
El valor del sesgo estandarizado y el valor de curtosis
estandarizada se encuentran dentro del rango esperado para datos
provenientes una distribución normal. Los coeficientes de variación
fueron < 20%, lo que indica que el método de determinación de
clorpirifos en aceites esenciales descerados de naranja es preciso
(European Commission, 2013).
IV.2.1.4. Límites de detección y cuantificación
A partir de las curvas de regresión para muestras de aceite
adicionadas a bajas concentraciones, se determinaron los límites de
detección y cuantificación. Los límites de detección y cuantificación
obtenidos para clorpirifos fueron de 0,015 y 0,050 mg/Kg
respectivamente. Teniendo en cuenta que para aceites esenciales no
están establecidos los LMRs ni en la legislación de la Unión Europea
ni en la legislación de Argentina, no se puede comparar con los
LMRs, pero se podrían considerar adecuados al observar los límites en
la fruta de la cual proceden.
De estos resultados se puede concluir que el método es
adecuado para determinar el nivel de residuos de clorpirifos en aceite
esencial descerado de naranja obtenido en la línea de producción, con
un buen nivel de exactitud y precisión.
Resultados y Discusión
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137
IV.3. Desarrollo y validación de los métodos de determinación de
carbendazim, procloraz y tiabendazol por Cromatografía
Líquida con doble detector de Espectrometría de masas tipo
triple cuadrupolo (LC-MS/MS)
Después de optimizar las condiciones cromatográficas, se llevaron a
cabo las determinaciones y los analitos se identificaron según detalla en tabla
15 (figura 31).
Tabla 15. Características de identificación para procloraz, carbendazim y
tiabendazol por LC-MS/MS.
DP: Declustering Potential- EP: Entrance Potential- CE: Collision Energy-CXP: Collision
Cell Exit Potential
Compuesto Q1
(Da)
Q3
(Da) Tiempo (min) Parámetro Valor
Carbendazim1 192,2 160,2 5,7
DP 76
EP 4,5
CE 27
CXP 4
Carbendazim2 192,2 132,1 5,7
DP 76
EP 4,5
CE 41
CXP 4
Procloraz1 376 308,1 12,3
DP 64
EP 7,5
CE 17
CXP 6
Procloraz2 376 69,9 12,3
DP 64
EP 7,5
CE 43
CXP 4
Tiabendazol1 202 131,1 6,9
DP 79
EP 5
CE 43
CXP 4
Tiabendazol1 202 131,1 6,9
DP 79
EP 5
CE 35
CXP 4
Resultados y Discusión
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138
Figura 31. Cromatogramas obtenidos por LC-MS/MS: (a) Carbendazim, (b)
Procloraz, (c) Tiabendazol
IV.3.1. Validación del método de determinación de tiabendazol en
fruta entera
IV.3.1.1. Análisis unidimensional
Los resultados del análisis unidimensional para disoluciones
patrón y de muestras de frutas preadicionadas y post-adicionadas de
tiabendazol a 6 niveles de concentración que se realizaron por
triplicado, con un total de 7 réplicas (7 pinchazos de una misma
disolución), se detallan en las tablas 16, 17 y 18, respectivamente.
El análisis unidimensional de los datos indicó para todas las
concentraciones de las muestras una distribución normal.
Se puede observar que a bajas concentraciones, el coeficiente
de variación fue mayor en las muestras pre-adicionadas, en
comparación con las disoluciones patrón y las muestras post-
adicionadas, lo que indicaría que la etapa de extracción de analitos,
estaría influyendo en la variabilidad de los resultados.
Resultados y Discusión
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139
Tabla 16. Análisis estadístico unidimensional. Disoluciones patrón de tiabendazol
(n=21 y α=0,05)
Patrón (mg/Kg) 0,005 0,006 0,007 0,008 0,009 0,010
Área Media 220131 264130 308198 352230 396207 440287
Desviación típica 72,00 38,99 48,34 66,63 79,16 28,05
Mínimo 220050 264100 308110 352100 396070 440250
Máximo 220250 264180 308250 352280 396280 440320
Rango 200 80 140 180 210 70
Coef. de
variación 0,03 % 0,014 % 0,016 % 0,019 % 0,019 % 0,006 %
Tabla 17. Análisis estadístico unidimensional. Fruta pre-adicionada con tiabendazol
(n=21 y α=0,05)
Adiciones (mg/Kg) 0,007 0,008 0,009 0,010 0,020 0,050
Área Media 443918 501787 567986 626432 1249219 3073018
Desviación típica 2580,05 2572,50 2568,31 2594,14 24,66 13,41
Mínimo 442225 500109 564668 624743 1249198 3073006
Máximo 447277 505111 569651 629786 1249265 3073041
Rango 5052 5002 4983 5043 67 35
Coef. de variación 0,58 % 0,51 % 0,45 % 0,41 % 0,002 % 0,0004 %
Tabla 18. Análisis estadístico unidimensional. Fruta post-adicionada con
tiabendazol (n=21 y α=0,05)
Adiciones (mg/Kg) 0,005 0,006 0,007 0,008 0,009 0,010
Área Media 275754 332849 389466 440373 501157 549596
Desviación típica 229,54 142,98 173,60 247,37 282,77 270,91
Mínimo 275495 332728 389184 440097 500764 549224
Máximo 276120 333088 389664 440704 501556 549918
Rango 625 360 480 606 792 693
Coef. de variación 0,08 % 0,04 % 0,04 % 0,05 % 0,05 % 0,04 %
IV.3.1.2. Linealidad
En la figura 32 se detallan los resultados obtenidos para el
cálculo de linealidad en disoluciones patrón de tiabendazol.
Resultados y Discusión
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140
Figura 32. Regresión lineal con disoluciones patrón de tiabendazol
La ecuación del modelo ajustado correspondiente fue:
y = -26,2222 + 4,40298E7 *concentración disoluciones patrón
(mg/Kg) (ec. 6)
Donde y representa la respuesta cromatográfica expresada en
área de pico.
El estadístico R-cuadrado indica que el modelo explica un
99,9999 % de la variabilidad de la respuesta cromatográfica (área de
picos). El coeficiente de correlación fue 1,0, lo que indica una relación
fuerte entre las variables. El error estándar estimado muestra la
desviación típica de los residuos que fue 59,0252.
Para todos los niveles de concentración se establecieron los
valores predichos de las respuestas cromatográficas para el modelo
ajustado y los residuos correspondientes. El porcentaje del valor
residual respecto del valor predicho para cada uno se encuentra dentro
de los criterios de aceptación establecidos, hallándose un valor
mínimo de – 0,0043% y un máximo de 0,057%.
Línea de Regresión. Soluciones de estándares de Tiabendazole
Concentración (mg/kg)
Re
sp
ue
sta
Cro
ma
tog
ráfica (
Áre
a)
5 6 7 8 9 10(X 0,001)
22
26
30
34
38
42
46(X 10000,0)
Resultados y Discusión
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141
En la figura 33 se detallan los resultados para la obtención de
la curva de linealidad en muestras de frutas pre-adicionadas con
tiabendazol.
Figura 33. Regresión lineal en muestra de fruta entera pre-adicionada con
tiabendazol
La ecuación del modelo ajustado correspondiente fue:
y = 16642,1 + 6,1178E7*concentración muestra de fruta pre-
adicionada (mg/Kg) (ec. 7)
Dónde y representa la respuesta cromatográfica expresada en
área de pico.
El estadístico R-cuadrado indica que el modelo explica un
99,9974 % de la variabilidad del área de los picos. El coeficiente de
correlación fue 0,999987, indicando una relación fuerte entre las
variables. El error estándar estimado muestra la desviación típica de
los residuos que fue 4855,79.
Nuevamente para todos los niveles de concentración se
establecieron los valores predichos de las respuestas cromatográficas
para el modelo ajustado y los residuos correspondientes. El porcentaje
Línea de Regresión. Muestras de frutas preadicionadas
Concentración (mg/kg)
Resp
ue
sta
Cro
ma
tog
ráfica (
Áre
a)
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05
0
1
2
3
4(X 1,E6)
Resultados y Discusión
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142
del valor residual respecto del valor predicho para cada uno se
encuentra dentro de los criterios de aceptación establecidos,
habiéndose hallado un valor mínimo de – 1,17 % y un máximo de
0,73%.
En la figura 34 se detallan los resultados para la obtención de
la curva de linealidad en muestras de frutas post-adicionadas con
tiabendazol.
Figura 34. Regresión lineal en muestras de fruta entera post-adicionada con
tiabendazol
La ecuación del modelo ajustado correspondiente fue la que
se muestra a continuación:
y = 1891,14 + 5,47809E7*concentración muestra de fruta post-
adicionada (mg/Kg) (ec. 8)
Donde y representa la respuesta cromatográfica expresada en
área de pico.
El estadístico R-cuadrado indica que el modelo explica un
99,9997% de la variabilidad en área de picos. El coeficiente de
Línea de Regresión. Muestras de fruta posadicionadas
Re
sp
ue
sta
Cro
ma
tog
ráfica (
Áre
as)
Concentración (mg/Kg)
5 6 7 8 9 10(X 0,001)
27
32
37
42
47
52
57(X 10000,0)
Resultados y Discusión
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143
correlación fue 0,999998, indicando una relación fuerte entre las
variables. El error estándar estimado muestra la desviación típica de
los residuos que fue 199,746.
Para todos los niveles de concentración se establecieron los
valores predichos de las respuestas cromatográficas para el modelo
ajustado y los residuos correspondientes. El porcentaje del valor
residual respecto del valor predicho para cada uno se encuentra dentro
de los criterios de aceptación establecidos (valor mínimo de – 0,67 %
y un máximo de 0,84%).
En los tres casos (patrones, muestras pre- y post-adicionadas)
los estadísticos Durbin Watson y Kolmogorov permitieron establecer
la independencia de los residuos y una distribución normal de los
mismos para un nivel de confianza del 95 %.
Estos resultados demuestran que el método desarrollado para
la determinación de residuos de tiabendazol en naranjas es lineal.
Comparación de líneas de regresión
Para evaluar el efecto matriz, se procedió a realizar el estudio
comparativo entre las curvas de regresión lineal obtenidas para
disoluciones patrón y muestras de frutas adicionadas.
Las figuras 35 y 36 muestran la comparación de las curvas de
regresión obtenidas para las disoluciones patrón con las obtenidas para
las muestras de frutas pre-adicionadas (figura 35) y post- adicionadas
(figura 36).
Las ecuaciones 6 y 7 corresponden a las líneas de regresión
comparativas indicadas en la figura 35.
Resultados y Discusión
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
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144
Figura 35. Rectas de regresión de tiabendazol de las disoluciones patrón y de las
muestras de frutas pre-adicionadas
El estadístico R-cuadrado fue empleado para comparar los
modelos ajustados en el cálculo de regresión de las disoluciones
patrón y muestras de fruta pre-adicionada, en los que han resultado
con diferente número de coeficientes. El valor de este estadístico
explica el 99,9981% de la variabilidad de las áreas. El estadístico R-
cuadrado ajustado, que es más adecuado para comparar modelos con
diferente número de variables independientes fue 99,998%. El error
estándar estimado muestra que la desviación estándar de los residuos
fue 3433,81.
Dado que el P-valor en el test ANOVA fue inferior a 0,05, se
puede afirmar que hay una relación estadísticamente significativa
entre las variables, con un nivel de confianza del 99%.
El P-valor para las pendientes y para los interceptos fue
menor que 0,01, lo que demuestra que existen diferencias
estadísticamente significativas entre las pendientes y entre los
interceptos, para los distintos valores de disoluciones patrón y
muestras de frutas pre-adicionadas con un nivel de confianza del 99%.
Resultados y Discusión
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
145
Las ecuaciones 6 y 8 corresponden a las líneas de regresión
comparativas indicadas en la figura 36.
Figura 36. Rectas de regresión de tiabendazol de las disoluciones patrón y de las
muestras de frutas post-adicionadas.
El estadístico R-cuadrado explica el 99,9691% de la
variabilidad en áreas y el R-cuadrado ajustado, fue 99,9677%. El error
estándar estimado muestra que la desviación estándar de los residuos
fue 1720,31.
En este caso, también el P-valor en el test ANOVA fue
inferior a 0,05, demostrando la relación estadísticamente significativa
existente entre las variables, con un nivel de confianza del 99%.
Debido a que el P-valor para las pendientes y para los
interceptos también fue menor que 0,01, se estableció que existen
diferencias estadísticamente significativas entre las pendientes y entre
los interceptos, para los distintos valores de disoluciones patrón y
muestras de frutas post-adicionadas, con un nivel de confianza del
99%.
Resultados y Discusión
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
146
Por todo ello, se puede concluir que el efecto matriz es
significativo, lo que implica que, en la determinación de tiabendazol
en muestras de naranja, es necesario efectuar un blanco de muestra y
muestras adicionadas para establecer la curva de linealidad
correspondiente. De esta forma se obtendrían rectas de calibrado
adecuadas para la cuantificación de este analito.
IV.3.1.3. Precisión y exactitud
La precisión se determinó para disoluciones patrón, muestras
de fruta pre-adicionadas y post-adicionadas.
La exactitud se determinó para muestras pre-adicionadas con
tiabendazol en los siguientes niveles de concentración: 0,007; 0,008;
0,009; 0,010; 0,020 y 0,050 mg/Kg, obteniendo recuperaciones del
89%, 91%, 91%, 93%, 93% y 95%, respectivamente. Para muestras
post-adicionadas en los niveles de concentración siguientes: 0,005;
0,006; 0,007; 0,009 y 0,010 mg/Kg, las recuperaciones obtenidas
fueron del 90%, 90%, 92%, 92%, 93% y 95%, respectivamente. El
valor promedio de las recuperaciones halladas en todas las
concentraciones, fue del 92%, lo que indica una adecuada exactitud
(European Commission, 2013).
En la tabla 19 se muestran los valores de los distintos
parámetros que se calcularon para determinar la precisión.
El valor del sesgo estandarizado y el valor de curtosis
estandarizada se encuentran dentro del rango esperado para datos
provenientes una distribución normal. Los coeficientes de variación,
en todos los casos fueron muy bajos, estando siempre por debajo del
Resultados y Discusión
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
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147
límite del 20%, lo que indica que el método de determinación de
residuos de tiabendazol en muestras de naranja es preciso.
Tabla 19. Resultados de los parámetros calculados para la determinación de la
precisión del método de determinación de tiabendazol en fruta (n=21, α=0,05)
Disolución patrón
de tiabendazol
0,006 mg/Kg
Muestra de fruta
pre-adicionada
0,010 mg/Kg
Muestra de fruta
post-adicionada
0,006 mg/Kg
Área Media 264130 626432 332849
Coeficiente de
variación 0,014% 0,41 % 0,04 %
Sesgo
Estandarizado -0,315236 -0,113578 -0,233042
Curtosis
Estandarizada -0,845743 -0,957037 -1,26278
IV.3.1.3. Límites de detección y cuantificación
A partir de las curvas de regresión para frutas adicionadas a
bajas concentraciones, se determinaron los límites de detección y
cuantificación. Los límites de detección y cuantificación obtenidos
para tianbendazol fueron de 0,005 y 0,010 mg/Kg respectivamente.
Teniendo en cuenta que los LMRs establecidos en la legislación son 5
mg/Kg para naranjas en la Unión Europea (European Commission,
2015) y 10 mg/Kg en Argentina (SENASA, 2015), se podría concluir
que ambos límites son adecuados, por ser considerablemente menores
a los LMRs.
Del análisis estadístico de los resultados, se puede afirmar
que el método de determinación de tiabendazol desarrollado en este
trabajo es adecuado para ser aplicado a muestras de naranja, para
Resultados y Discusión
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148
determinar el nivel de residuos de tiabendazol en la fruta que llega a la
línea de producción, ya que se trata de un método exacto, preciso, de
linealidad y límites de detección y cuantificación adecuados a este tipo
de análisis.
IV.3.2. Validación de los métodos de determinación de procloraz,
carbendazim y tiabendazol en aceites esenciales descerados de
naranja.
IV.3.2.1. Procloraz
IV.3.2.1.1. Análisis unidimensional
Los resultados del análisis unidimensional para disoluciones
patrón y de muestras de aceites adicionadas con procloraz a 6 niveles
de concentración, realizados por triplicado y con un total de 7 réplicas,
se detallan en las tablas 20 y 21, respectivamente.
El análisis unidimensional de los datos indicó para todas las
concentraciones de las muestras una distribución normal.
Se puede observar que el coeficiente de variación fue mayor
a medida que disminuía la concentración, en los 2 casos, lo que
indicaría una mayor variabilidad para las concentraciones más bajas.
Tabla 20. Análisis estadístico unidimensional. Disoluciones patrón de procloraz
(n=21 y α=0,05)
Patrón (mg/Kg) 0,005 0,006 0,007 0,008 0,009 0,010
Área Media 3050 3774 4376 5052 5464 6118
Desviación típica 255,49 117,92 75,04 84,16 45,99 11,07
Mínimo 2666 3688 4276 4915 5411 6103
Máximo 3301 3950 4471 5145 5541 6133
Rango 635 262 195 230 130 30
Coef. de
variación 8,37% 3,12% 1,71% 1,66% 0,84% 0,18%
Resultados y Discusión
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149
Tabla 21. Análisis estadístico unidimensional. Muestras de aceite adicionadas con
procloraz (n=21 y α=0,05)
Adiciones (mg/Kg) 0,007 0,008 0,009 0,010 0,015 0,020
Área Media 5013 5798 6416 7199 10670 14233
Desviación típica 54,58 56,56 61,08 52,58 18,25 17,16
Mínimo 4922 5720 6325 7120 10644 14212
Máximo 5077 5870 6488 7266 10692 14261
Rango 155 150 163 146 48 49
Coef. de variación 1,08% 0,97% 0,95% 0,73% 0,17% 0,12%
El análisis unidimensional de los datos indicó para todas las
concentraciones de las muestras una distribución normal.
Se puede observar que el coeficiente de variación fue mayor
a medida que disminuía la concentración, en los 2 casos, lo que
indicaría una mayor variabilidad para las concentraciones más bajas.
IV.3.2.1.2. Linealidad
En la figura 37 se detallan los resultados obtenidos para el
cálculo de linealidad en disoluciones de patrón de procloraz.
Figura 37. Regresión lineal con disoluciones patrón de procloraz
Línea de Regresión. Soluciones de estándar de Procloraz
Respuesta
Cro
mato
grá
fica (
Áre
as)
Concentración (mg/Kg)
5 6 7 8 9 10(X 0,001)
3
4
5
6
7(X 1000,0)
Resultados y Discusión
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
150
La ecuación del modelo ajustado correspondiente fue la
siguiente:
y = -28,1429 + 615286*concentración disolución patrón (mg/Kg)
(ec. 9)
Donde y representa la respuesta cromatográfica expresada en
área de pico.
El estadístico R-cuadrado indica que el modelo explica un
99,9994% de la variabilidad del área de los picos. El coeficiente de
correlación fue 0,999997, lo que indica una relación fuerte entre las
variables. El error estándar estimado muestra la desviación típica de
los residuos que fue 3,1053.
Para todos los niveles de concentración se establecieron los
valores predichos de las respuestas cromatográficas para el modelo
ajustado y los residuos correspondientes. El porcentaje del valor
residual respecto del valor predicho para cada uno se encuentra dentro
de los criterios de aceptación establecidos (valor mínimo de – 1,09 %
y máximo de 1,21%)
En la figura 38 se detallan los resultados para la obtención de
la curva de linealidad en muestras de aceite adicionadas con procloraz.
Resultados y Discusión
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
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151
Figura 38. Regresión lineal en muestras de aceite esencial adicionada con procloraz
La ecuación del modelo ajustado correspondiente fue la
siguiente:
y = 141,343 + 703231*concentración muestras de aceite adicionada
(mg/Kg) (ec. 10)
Donde y representa la respuesta cromatográfica expresada en
área de pico.
El estadístico R-cuadrado indica que el modelo explica un
99,9998% de la variabilidad en respuesta cromatográfica expresada en
área de picos. El coeficiente de correlación fue 0,999999, lo que
indica una relación fuerte entre las variables. El error estándar
estimado muestra la desviación típica de los residuos que fue 6,027.
Para todos los niveles de concentración se establecieron los
valores predichos de las respuestas cromatográficas para el modelo
ajustado y los residuos correspondientes. El porcentaje del valor
residual respecto del valor predicho para cada uno se encuentra dentro
de los criterios de aceptación establecidos, habiéndose hallado un
valor mínimo de – 2,41 % y un máximo de 2,08%.
Línea de Regresión. Muestras de aceite adicionadas
Concentración (mg/Kg)
Respuesta
Cro
ma
tog
ráfica (
Áre
as)
7 10 13 16 19 22(X 0,001)
5
7
9
11
13
15(X 1000,0)
Resultados y Discusión
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152
En ambos casos, los estadísticos Durbin Watson y
Kolmogorov permitieron establecer la independencia de los residuos y
una distribución normal de los mismos para un nivel de confianza del
95 %.
Estos resultados demuestran que el método de determinación
de procloraz en aceites esenciales descerados de naranja empleado en
este estudio es lineal.
Comparación de líneas de regresión
Para evaluar el efecto matriz nuevamente se realizó un
estudio comparativo entre las curvas de regresión lineal obtenidas para
disoluciones patrón y muestras de aceites adicionadas.
La figura 39 muestra las curvas de regresión determinadas
para disoluciones patrón y muestras de aceite adicionadas.
Las ecuaciones 9 y 10 corresponden a las líneas de regresión
comparativas indicadas en la figura 39.
El estadístico R-cuadrado explica el 99,9958% de la
variabilidad de las áreas y el estadístico R-cuadrado ajustado fue
99,9942%. El error estándar estimado muestra que la desviación
estándar de los residuos fue 25,5779.
Resultados y Discusión
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
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153
Figura 39. Rectas de regresión de procloraz de las disoluciones patrón y de las
muestras de aceite esencial adicionadas.
El P-valor en el test ANOVA fue inferior a 0,05, por lo que
se deduce que hay una relación estadísticamente significativa entre las
variables, con un nivel de confianza del 99%.
Debido a que el P-valor para las pendientes y para los
interceptos fue menor que 0,01, se puede afirmar que existen
diferencias estadísticamente significativas entre las pendientes y entre
los interceptos para los distintos valores de disoluciones patrón y
muestras de aceites esenciales adicionadas, con un nivel de confianza
del 99%.
Se puede concluir, por tanto, que el efecto matriz es
significativo, lo que implica que, en la determinación de procloraz en
muestras de aceites esenciales descerados, es necesario efectuar un
blanco de muestra y muestras adicionadas, para establecer la curva de
linealidad correspondiente. De esta forma se obtendrían rectas de
calibrado adecuadas para la cuantificación del analito en las muestras.
Regresión Líneal Comparativa. Estándares vs Muestras de aceite adicionadas
Respuesta
Cro
mato
grá
fica (
Áre
as)
Concentración (mg/Kg)
código
Aceite adicionada
Estándar
5 8 11 14 17 20(X 0,001)
0
3
6
9
12
15(X 1000,0)
Resultados y Discusión
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154
IV.3.2.1.3. Precisión y exactitud
La precisión se determinó para disoluciones patrones y
muestras de aceites adicionadas.
La exactitud se determinó para muestras de aceites
adicionadas con procloraz en los siguientes niveles de concentración:
0,007; 0,008; 0,009; 0,010 y 0,020 mg/Kg, obteniendo recuperaciones
del 94%, 95%, 95%, 96%, 97% y 99%, respectivamente. La exactitud
medida en términos de recuperación media fue del 96%, valor que está
dentro del rango de 70-120% y, por tanto, indica que el método
cumple el criterio de exactitud considerado en la Unión Europea
(European Commission, 2013).
En la tabla 22 se muestran los valores de los distintos
parámetros que se calcularon para determinar la precisión.
Tabla 22. Resultados de los parámetros calculados para la determinación de la
precisión del método de determinación de procloraz en aceites esenciales
(n=21, α=0,05)
Disolución patrón de
procloraz
0,006 mg/Kg
Muestra de aceite
adicionada
0,008 mg/Kg
Área Media 3774 5798
Coeficiente de
variación 3,12% 0,97%
Sesgo
Estandarizado 0,668866 -0,143253
Curtosis
Estandarizada -0,157622 -0,870066
El valor del sesgo estandarizado y el valor de curtosis
estandarizada se encuentran dentro del rango esperado para datos
Resultados y Discusión
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155
provenientes una distribución normal. Los coeficientes de variación
fueron inferiores al 20%, lo que indica que el método es preciso
(European Commission, 2013).
IV.3.2.1.4. Límites de detección y cuantificación
A partir de las curvas de regresión para muestras de aceite
adicionadas a bajas concentraciones, se determinaron los límites de
detección y cuantificación. Los límites de detección y cuantificación
obtenidos fueron de 0,005 y 0,010 mg/Kg respectivamente. Teniendo
en cuenta que para aceites esenciales no están establecidos los LMRs
ni en la legislación de la Unión Europea ni en la legislación de
Argentina, no se puede comparar con los LMRs, pero se podrían
considerar adecuados al observar los límites en la fruta de la cual
proceden.
Del análisis estadístico de estos resultados, se puede concluir
que el método es adecuado para determinar el nivel de residuos de
procloraz en aceite esencial descerado de naranja obtenido en la línea
de producción, con un buen nivel de exactitud y precisión.
IV.3.2.2. Carbendazim
IV.3.2.2.1. Análisis unidimensional
Los resultados del análisis unidimensional para disoluciones
patrón y de muestras de aceites adicionadas con carbendazim a 6
niveles de concentración, realizadas por triplicado y con un total de 7
réplicas, se detallan en las tablas 23 y 24, respectivamente.
Resultados y Discusión
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156
Tabla 23. Análisis estadístico unidimensional. Disoluciones patrón de carbendazim
(n=21 y α=0,05)
Patrón (mg/Kg) 0,005 0,006 0,007 0,008 0,009 0,010
Área Media 1236309 1485869 1725579 1957991 2215779 2489083
Desviación típica 8217,68 9858,12 4056,66 3805,77 4129,49 4082,49
Mínimo 1226750 1467509 1723802 1950255 2214010 2480750
Máximo 1248788 1497610 1733855 1959978 2224208 2490810
Rango 22038 30101 10053 9723 10198 10060
Coef. de
variación 0,66% 0,66% 0,23% 0,19% 0,18% 0,16%
Tabla 24. Análisis estadístico unidimensional. Muestras de aceite adicionadas con
carbendazim (n=21 y α=0,05)
Adiciones (mg/Kg) 0,007 0,008 0,009 0,010 0,020 0,050
Área Media 2026416 2365104 2593077 2895096 5710214 14275928
Desviación típica 25622,0 26077,8 26104,8 26076,8 72,91 238,06
Mínimo 1988075 2325111 2553054 2855099 5710152 14275495
Máximo 2058044 2395120 2623120 2925105 5710357 14276102
Rango 69969 70009 70066 70006 205 607
Coef. de variación 1,26% 1,10% 1,00% 0,90% 0,001% 0,001%
El análisis unidimensional de los datos indicó para todas las
concentraciones de las muestras una distribución normal. Los mayores
coeficientes de variación se obtuvieron para las menores
concentraciones. Estos valores también fueron mayores en las
muestras de aceites esenciales, en comparación con los patrones, lo
que pondría de manifiesto el efecto matriz en la variabilidad de los
resultados.
IV.3.2.2.2. Linealidad
En la figura 40 se detallan los resultados obtenidos para el
cálculo de linealidad en disoluciones patrón de carbendazim.
Resultados y Discusión
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157
Figura 40. Regresión lineal con disoluciones patrón de carbendazim
La ecuación del modelo ajustado correspondiente fue la que
se muestra a continuación:
y = -9135,57 + 2,48101E8*concentración disoluciones patrón
(mg/Kg) (ec. 11)
Donde y representa la respuesta cromatográfica expresada en
área de pico.
El estadístico R-cuadrado indica que el modelo explica un
99,9999% de la variabilidad de la respuesta cromatográfica. El
coeficiente de correlación fue 1,0, lo que indica una relación fuerte
entre las variables. El error estándar estimado muestra la desviación
típica de los residuos que fue 444,114.
Para todos los niveles de concentración se establecieron los
valores predichos de las respuestas cromatográficas para el modelo
ajustado y los residuos correspondientes. El porcentaje del valor
residual respecto del valor predicho para cada uno se encuentra dentro
Línea de Regresión. Muestras de estándar de Carbendazim
Re
sp
ue
sta
Cro
ma
tog
ráfica (
Áre
as)
Concentración (mg/Kg)
5 6 7 8 9 10(X 0,001)
12
15
18
21
24
27(X 100000,)
Resultados y Discusión
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158
de los criterios de aceptación establecidos, hallándose un valor
mínimo de – 1,29 % y un máximo de 1,41%.
En la figura 41 se detallan los resultados para la obtención de
la curva de linealidad en muestras de aceite adicionadas con
carbendazim.
La ecuación del modelo ajustado correspondiente fue la
siguiente:
y = 38412,4 + 2,84773E8*concentración muestras de aceite
adicionada (mg/Kg) (ec. 12)
Donde y representa la respuesta cromatográfica expresada en
área de pico.
El estadístico R-cuadrado indica que el modelo explica un
99,9999% de la variabilidad del área de los picos. El coeficiente de
correlación fue 0,999999, lo que indica una relación fuerte entre las
variables. El error estándar estimado muestra la desviación típica de
los residuos que es 5906,03.
Para todos los niveles de concentración se establecieron los
valores predichos de las respuestas cromatográficas para el modelo
ajustado y los residuos correspondientes, el porcentaje del valor
residual respecto del valor predicho para cada uno se encuentra dentro
de los criterios de aceptación establecidos (valor mínimo de – 2,48 %
y máximo de 3,10%).
Resultados y Discusión
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159
Figura 41. Regresión lineal en muestras de aceite esencial adicionada con
carbendazim
En ambos casos, los estadísticos Durbin Watson y
Kolmogorov permitieron establecer la independencia de los residuos y
una distribución normal de los mismos para un nivel de confianza del
95 %.
De estos resultados se concluye que el método de
determinación de carbendazim en aceites esenciales descerados de
naranja es lineal.
Comparación de líneas de regresión
Se estudió el efecto matriz a través de un estudio comparativo
entre las curvas de regresión lineal obtenidas para disoluciones patrón
y muestras de aceite adicionadas.
La figura 42 muestra la comparación de las curvas de
regresión obtenidas para las disoluciones patrón con las obtenidas para
las muestras de aceites esenciales adicionadas
Las ecuaciones 11 y 12 corresponden a las líneas de regresión
comparativas indicadas en la figura 42.
Línea de Regresión. Muestras de aceite adicionadas con Carbendazim
Concentración (mg/Kg)
Respuesta
Cro
mato
grá
fica (
Áre
as)
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05
0
3
6
9
12
15(X 1,E6)
Resultados y Discusión
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frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
160
El estadístico R-cuadrado nuevamente fue empleado para
comparar los modelos ajustados en el cálculo de regresión de las
disoluciones patrón y muestras de aceite adicionadas, en los que han
resultado con diferente número de coeficientes. El valor de este
estadístico explica el 99,9999% de la variabilidad en áreas. El
estadístico R-cuadrado ajustado fue del 99,9999%. El error estándar
estimado muestra que la desviación estándar de los residuos fue
4187,98.
Figura 42. Rectas de regresión de carbendazim de las disoluciones patrón y de las
muestras de aceite esencial adicionadas.
Dado que el P-valor en el test ANOVA fue inferior a 0,05, se
puede concluir que hay una relación estadísticamente significativa
entre las variables, con un nivel de confianza del 99%.
El P-valor para las pendientes y para los interceptos fue
menor que 0,01, lo que indica que existen diferencias estadísticamente
significativas entre las pendientes y entre los interceptos para los
distintos valores de disoluciones patrón y muestras de aceites
adicionadas con un nivel de confianza del 99%.
Regresión Líneal Comparativa. Estándares vs Muestras de aceite adicionadas
Re
sp
ue
sta
Cro
ma
tog
ráfica (
Áre
as)
Concentración (mg/Kg)
código
Muestra adicionada
estándar
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05
0
3
6
9
12
15(X 1,E6)
Resultados y Discusión
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
161
Se puede concluir que el efecto matriz es significativo, lo que
implica que, en la determinación de carbendazim en muestras de
aceites esenciales descerados, es necesario efectuar un blanco de
muestra y muestras adicionadas para establecer la curva de linealidad
correspondiente. De esta forma se obtendrían rectas de calibrado
adecuadas para la cuantificación del analito en las muestras de aceites
esenciales.
IV.3.2.2.3. Precisión y exactitud
La precisión se determinó para disoluciones patrón y
muestras de aceites adicionadas.
La exactitud del método se determinó para muestras de
aceites adicionadas con carbendazim en los siguientes niveles de
concentración: 0,007; 0,008; 0,009; 0,010; 0,020 y 0,050 mg/Kg,
obteniendo valores de recuperación del 87%, 88%, 92%, 93%, 96% y
96%, respectivamente. En este caso la exactitud medida en términos
de recuperación fue de 92% (European Commission, 2013).
En la tabla 25 se muestran los valores de los distintos
parámetros que se calcularon para determinar la precisión.
El valor del sesgo estandarizado y el valor de curtosis
estandarizada se encuentran dentro del rango esperado para datos
provenientes una distribución normal. El coeficiente de variación en
todos los casos fue muy bajo, cumpliendo el criterio establecido para
el parámetro (20%), lo que indica que el método es preciso (European
Commission, 2013).
Resultados y Discusión
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
162
Tabla 25. Resultados de los parámetros calculados para la determinación de la
precisión del método de determinación de carbendazim en aceites esenciales
(n=21, α=0,05)
Disolución patrón
de carbendazim
0,006 mg/Kg
Muestra de aceite
adicionada
0,010 mg/Kg
Área Media 1485869 2895096
Coeficiente de
variación 0,66% 0,90%
Sesgo
Estandarizado -0,279685 0,758678
Curtosis
Estandarizada -0,739555 -0,984858
IV.3.2.2.4. Límites de detección y cuantificación
A partir de las curvas de regresión para muestras de aceite
adicionadas a bajas concentraciones, se determinaron los límites de
detección y cuantificación, siendo 0,005 y 0,010 mg/Kg,
respectivamente. Teniendo en cuenta que para aceites esenciales no
están establecidos los LMRs ni en la legislación de la Unión Europea
ni en la legislación de Argentina, no se puede comparar con los
LMRs, pero se podrían considerar adecuados al observar los límites en
la fruta de la cual proceden.
Del análisis estadístico de los resultados, se puede concluir
que el método desarrollado en este estudio, es adecuado para
determinar el nivel de residuos de carbendazim en aceite esencial
descerado de naranja obtenido en la línea de producción, con un buen
nivel de exactitud y precisión.
Resultados y Discusión
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
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163
IV.3.2.3. Tiabendazol
IV.3.2.3.1. Análisis unidimensional
Los resultados del análisis unidimensional para disoluciones
patrón y de muestras de aceites adicionadas con tiabendazol en 6
niveles de concentración y con un total de 7 réplicas, se detallan en las
tablas 16 y 26, respectivamente.
Tabla 26. Análisis estadístico unidimensional. Muestras de aceite adicionadas con
tiabendazol (n=21 y α=0,05)
Adiciones (mg/Kg) 0,007 0,008 0,009 0,010 0,020 0,050
Área Media 433361 494893 558134 616124 1238193 3095411
Desviación típica 2572,32 2585,74 1295,58 1556,26 37,50 105,74
Mínimo 430007 493220 556112 614815 1238150 3095280
Máximo 435054 498235 559362 619098 1238238 3095556
Rango 5047 5015 3250 4283 88 276
Coef. de variación 0,59% 0,52% 0,23% 0,25% 0,003% 0,003%
El análisis unidimensional de los datos indicó para todas las
concentraciones de las muestras una distribución normal.
Se puede observar que el coeficiente de variación fue mayor
a medida que disminuía la concentración, en ambos casos, lo que
demuestra una mayor variabilidad a concentraciones mas bajas.
IV.3.2.3.2. Linealidad
En la figura 32 se detallan los resultados obtenidos para el
cálculo de linealidad en disoluciones patrón de tiabendazol y la
ecuación (6) es la correspondiente ecuación del modelo ajustado.
En la figura 43 se detallan los resultados para la obtención de
la curva de linealidad en muestras de aceite adicionadas con
tiabendazol.
Resultados y Discusión
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
164
Figura 43. Regresión lineal en muestras de aceite esenciales adicionadas con
tiabendazol
La ecuación del modelo ajustado correspondiente fue la que
se muestra a continuación:
y = -604,253 + 6,19206E7*concentración muestras de aceite
adicionada (mg/Kg) (ec. 13)
Donde y representa la respuesta cromatográfica expresada en
área de pico.
El estadístico R-cuadrado indica que el modelo explica un
99,9998% de la variabilidad en respuesta cromatográfica expresada en
área de pico. El coeficiente de correlación fue 0,999999, lo que indica
una relación fuerte entre las variables. El error estándar estimado
muestra la desviación típica de los residuos que fue 1473,74.
Para todos los niveles de concentración se establecieron los
valores predichos de las respuestas cromatográficas para el modelo
ajustado y los residuos correspondientes. El porcentaje del valor
residual respecto del valor predicho para cada uno se encuentra dentro
Concentración (mg/Kg)
Re
sp
ue
sta
Cro
ma
tog
ráfica (
Áre
as)
Línea de Regresión. Muestras de aceite adicionadas con Tiabendazol
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05
0
1
2
3
4(X 1,E6)
Resultados y Discusión
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
165
de los criterios de aceptación establecidos (valor mínimo de – 0,65 %
y máximo de 0,70%).
En ambos casos, los estadísticos Durbin Watson y
Kolmogorov permitieron establecer la independencia de los residuos y
una distribución normal de los mismos para un nivel de confianza del
95 %.
De los resultados obtenidos, se puede concluir que el método
de determinación de tiabendazol en aceites esenciales descerados de
naranja es lineal.
Comparación de líneas de regresión
La figura 44 muestra la comparación de las curvas de
regresión obtenidas para las disoluciones patrón con las obtenidas para
las muestras de aceites esenciales adicionadas.
Las ecuaciones 6 y 13 corresponden a las líneas de regresión
comparativas indicadas en la figura 44.
El estadístico R-cuadrado explica el 99,9999% de la
variabilidad de las áreas y el R-cuadrado ajustado fue del 99,9998%.
El error estándar estimado muestra que la desviación estándar de los
residuos fue 1080,6.
Resultados y Discusión
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
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166
Figura 44. Rectas de regresión de tiabendazol de las disoluciones patrón y de las
muestras de aceite esencial adicionadas
El P-valor en el test ANOVA fue inferior a 0,05,
demostrando que hay una relación estadísticamente significativa entre
las variables, con un nivel de confianza del 99%.
Debido a que el P-valor para las pendientes y para los
interceptos fue menor que 0,01, se puede afirmar que existen
diferencias estadísticamente significativas entre las pendientes y entre
los interceptos para los distintos valores de disoluciones patrón y
muestras de aceites esenciales adicionadas con un nivel de confianza
del 99%.
Se puede concluir que el efecto matriz es significativo, lo que
implica que, en la determinación de tiabendazol en muestras de aceites
esenciales descerados, es necesario efectuar un blanco de muestra y
muestras adicionadas para establecer la curva de linealidad
correspondiente. De esta forma se obtendrían rectas de calibrado
adecuadas para la cuantificación del analito en la muestra.
Regresión Líneal Comparativa. Estándares vs Muestras de aceite adicionadas
Concentración (mg/Kg)
Respuesta
Cro
mato
grá
fica (
Áre
as)
código
Aceite adicionada
Estándar
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05
0
1
2
3
4(X 1,E6)
Resultados y Discusión
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frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
167
IV.3.2.3.3. Precisión y exactitud
La precisión se determinó para disoluciones patrón y
muestras de aceites adicionadas.
La exactitud se determinó para muestras adicionadas en los
siguientes niveles de concentración: 0,007; 0,008; 0,009; 0,010; 0,020
y 0,050 mg/Kg, obteniendo recuperaciónes del 84%, 84%, 85%, 87%,
89% y 91%, respectivamente. La exactitud medida en términos de
recuperación media fue del 87%, lo que está dentro del rango
considerado como una recuperación media aceptable por la Comisión
Europea (European Commission, 2013). Por lo tanto, se puede afirmar
que el método de determinación de tiabendazol en muestras de aceite
esencial descerado es exacto.
En la tabla 27 se muestran los valores de los distintos
parámetros que se calcularon para determinar la precisión.
Tabla 27. Resultados de los parámetros calculados para la determinación de la
precisión del método de determinación de tiabendazol en aceites esenciales
(n=21, α=0,05)
Disolución patrón
de tiabendazol
0,006 mg/Kg
Muestra de aceite
adicionada
0,010 mg/Kg
Área Media 321307 616124
Desviación típica 4411,67 1923,14
Coeficiente de
variación 1,63% 0,25%
Sesgo
Estandarizado 0,164338 -0,210968
Curtosis
Estandarizada -1,02481 -1,43505
Resultados y Discusión
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
168
El valor del sesgo estandarizado y el valor de curtosis
estandarizada se encuentran dentro del rango esperado para datos
provenientes una distribución normal. Los coeficientes de variación
fueron < 20%, lo que indica que el método de determinación de
tiabendazol en aceites esenciales descerados de naranja es preciso
(European Commission, 2013).
IV.3.2.3.4. Límites de detección y cuantificación
A partir de las curvas de regresión para muestras de aceite
adicionadas a bajas concentraciones, se determinaron los límites de
detección y cuantificación, siendo éstos de 0,005 y 0,010 mg/Kg,
respectivamente. Teniendo en cuenta que para aceites esenciales no
están establecidos los LMRs ni en la legislación de la Unión Europea
ni en la legislación de Argentina, no se puede comparar con los
LMRs, pero se podrían considerar adecuados al observar los límites en
la fruta de la cual proceden.
Teniendo en cuenta estos resultados, se puede concluir que el
método desarrollado en este estudio, es adecuado para determinar el
nivel de residuos de tiabendazol en aceite esencial descerado de
naranja obtenido en la línea de producción, con un buen nivel de
exactitud y precisión.
Resultados y Discusión
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
169
IV.4. Estudio de la presencia de residuos de plaguicidas en frutas
enteras y en aceites esenciales y determinación de su correlación.
IV.4.1. Presencia de residuos de plaguicidas en frutas y aceites
esenciales descerados
En la tabla 28 se muestran los resultados obtenidos en el
análisis de clorpirifos, carbendazim, procloraz y tiabendazol, durante
las 3 temporadas de producción evaluadas. Así mismo, se muestran
los datos de persistencia relativa de los plaguicidas en los aceites
esenciales. Para el cálculo de la persistencia relativa de los residuos en
aceites esenciales descerados, se consideró que en la línea de
producción, por cada tonelada de fruta que entra en la línea de
producción se obtienen 0,2 a 0,4% de aceite esencial, considerándose
un valor medio de 0,3%.
Se puede observar que, tanto en las muestras de naranja como
en los aceites esenciales, se cuantificaron residuos de clorpirifos,
carbendazim, procloraz y tiabendazol. Del total de los 12 lotes
muestreados, solo uno de ellos (el lote J) estuvo exento de plaguicidas.
Para clorpirifos solo 3 lotes no indicaron presencia residual del
mismo, para carbendazim y procloraz solo cuatro lotes. Para todos
estos lotes mencionados no se procedió al análisis de la persistencia
relativa, como tampoco al análisis de correlación correspondiente.
Resultados y Discusión
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
170
Tabla 28. Valores medios de niveles residuales de plaguicidas expresados en mg/Kg
y desviación estándar (valores entre paréntesis) (n=9, α=0,05).
Temporada 2012, 2013 y 2014
PROCLORAZ
AÑO Nº DE LOTE FRUTA DE INGRESO ACEITE DESCERADO % DE PERSISTENCIA
2012
A 1,460(0,189)* 3,270(2,839) 0,67
B 1,420(0,247)* 2,550(0,620) 0,57
C ND* …….. ……
D 0,560(0,057)* 0,970(0,114) 0,52
2013
E ND* …….. ……
F 0,130(0,040)* 0,280(0,033) 0,65
G ND* …….. ……
H 0,600(0,284)* 2,000(0,989) 0,99
2014
I 0,980(0,098)* 3,130(0,236) 0,95
J ND* …….. ……
K 0,270(0,032)* 0,820(0,09) 0,90
L 0,172(0,287)* 0,440(0,545) 0,76
CLORPIRIFOS
AÑO Nº DE LOTE FRUTA DE INGRESO ACEITE DESCERADO % DE PERSISTENCIA
2012
A ND ND ……
B 0,045(0,002) 0,250(0,028) 1,66
C 0,055(0,013) 0,210(0,025) 1,26
D 0,076(0,004) 0,450(0,062) 1,79
2013
E 0,071(0,004) 0,410(0,021) 1,71
F 0,025(0,009) 0,140(0,034) 1,68
G 0,065(0,012) 0,310(0,037) 1,44
H 0,050(0,005) 0,280(0,029) 1,71
2014
I 0,061(0,003) 0,240(0,033) 1,20
J ND ND ……
K 0,034(0,002) 0,190(0,011) 1,64
L ND ND ……
CARBENDAZIM
AÑO Nº DE LOTE FRUTA DE INGRESO ACEITE DESCERADO % DE PERSISTENCIA
2012
A ND* ND ……
B ND* ND ……
C ND* ND ……
D 0,036(0,002)* 0,030(0,002) 0,25
2013
E 0,100(0,012)* 0,081(0,009) 0,24
F 0,006(0,0004)* ND ……
G 0,060(0,012)* 0,049(0,009) 0,24
H 0,038(0,009)* 0,031(0,007) 0,25
2014
I 0,024(0,003)* 0,027(0,004) 0,34
J ND* ND ……
K 0,015(0,004)* 0,040(0,012) 0,83
L 0,098(0,008)* 0,082(0,008) 0,25
Resultados y Discusión
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frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
171
TIABENDAZOL
AÑO Nº DE LOTE FRUTA DE INGRESO ACEITE DESCERADO % DE PERSISTENCIA
2012
A 0,082(0,015) 0,950(0,178) 3,47
B 0,012(0,009) 0,220(0,193) 5,45
C 0,005(0,001) 0,080(0,032) 4,80
D 0,006(0,013) 0,090(0,058) 4,15
2013
E 0,030(0,008) 0,472(0,116) 4,61
F 0,095(0,017) 1,080(0,209) 3,38
G 0,026(0,007) 0,416(0,110) 4,76
H 0,297(0,044) 4,130(0,646) 4,17
2014
I 0,007(0,001) 0,115(0,020) 4,93
J ND ND ……
K 0,014(0,005) 0,175(0,057) 3,57
L ND …….. ……
* Datos obtenidos por Martínez, H.J. (2016)
Los máximos valores medios de niveles residuales hallados
en fruta al ingreso a la industria y aceites descerados fueron
respectivamente: 1,46 mg/Kg (Martínez, 2016) y 3,27 mg/Kg para
procloraz, 0,076 mg/Kg y 0,45 mg/Kg para clorpirifos, 0,1 mg/Kg
(Martínez, 2016) y 0,082 mg/Kg para carbendazim, 0,29 mg/Kg y
4,13 mg/Kg para tiabendazol. Los valores máximos de persistencia
relativa obtenidos fueron 0,99% para procloraz, 1,79% para
clorpirifos, 0,83% para carbendazim y 5,45% para tiabendazol.
Los mínimos valores medios de niveles residuales hallados
en fruta a la entrada en la línea de producción y en aceites descerados
fueron respectivamente: 0,13 mg/Kg (Martínez, 2016) y 0,28 mg/Kg
para procloraz, 0,025 mg/Kg y 0,14 mg/Kg para clorpirifos, 0,006
mg/Kg (Martínez, 2016) y 0,027 mg/Kg para carbendazim, 0,005
mg/Kg y 0,08 mg/Kg para tiabendazol. Los valores mínimos de
persistencia relativa obtenidos fueron 0,52% para procloraz, 1,2%
para clorpirifos, 0,24% para carbendazim y 3,38% para tiabendazol.
Resultados y Discusión
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172
En cuanto al año de muestreo, considerando los valores
medios obtenidos para los 4 lotes de naranja en cada año, para
procloraz y clorpirifos (tabla 28), se obtuvieron valores similares en
los 3 años. Sin embargo, para carbendazim, en el año 2012 el valor
medio fue inferior a las dos anualidades siguientes, dado que solo se
detectó en uno de los lotes. En el caso de tiabendazol, el promedio
obtenido en 2014 fue considerablemente inferior al resto.
En el ANOVA realizado tomando como factor el lote, dentro
de cada año, se obtuvieron diferencias significativas (P-valor < 0,05)
para los 4 plaguicidas, tanto en frutas como en aceites, en los 3 años
evaluados. Estas diferencias significativas entre lotes demuestran la
variabilidad que hay en los residuos de plaguicidas, entre las
diferentes partidas de fruta que entran a la industria. De igual forma,
se observaron diferencias significativas entre los años evaluados en
todos los plaguicidas (datos no mostrados).
De los valores hallados para clorpirifos en fruta entera se
encuentran, en general, por debajo de los niveles obtenidos en
diversos trabajos (Gerard et al., 2000; Coscollá, 2003; INTA, 2011;
Kulczycki et al., 2012; Montti et al., 2013). Esto podría deberse a que
en los trabajos de los autores mencionados, los estudios fueron
realizados en fruta entera de empaque, lo que implica un menor
período para la degradación del plaguicida en fruta, en comparación
con fruta que llega a la industria.
Para los plaguicidas pertenecientes al grupo de los
benzimidazoles, tales como carbendazim, procloraz y tiabendazol, los
niveles encontrados en naranja se encuentran, en general, en los
Resultados y Discusión
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
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173
rangos publicados en diversos trabajos (Papadopoulou, 1991; Montti
et al., 1998; Di Muccio et al., 1999; Chaulet et al., 2000; Gerard et al.,
2000; Nakamura et al., 2010; Visciglio, 2011; Montti et al., 2013).
IV.4.2. Determinación de la correlación entre los niveles residuales de
plaguicidas en aceites esenciales y la fruta de la cual provienen
A partir de los resultados obtenidos para un total de 12 lotes
muestreados, correspondientes a las 3 temporadas de producción ya
comentadas, se realizó un análisis de comparación de 2 muestras
pareadas, con el fin de evaluar las diferencias significativas entre los
niveles residuales de plaguicidas obtenidos en frutas enteras y el nivel
de residuos obtenido en el aceite esencial colectado como su pareja.
El resumen estadístico para cada una de las muestras
pareadas incluye medidas de tendencia central, medidas de
variabilidad y medidas de forma. Los valores obtenidos del sesgo
estandarizado y la curtosis estandarizada, nuevamente fueron
utilizados para determinar si la muestra provenía de una distribución
normal. Como ya se ha comentado anteriormente, valores de estos
estadísticos fuera del rango de -2 a +2 indicarían desviaciones
significativas de la normalidad, lo que tendería a invalidar cualquier
prueba estadística con referencia a la desviación estándar.
Para el análisis de muestras pareadas de fruta entera y aceite
esencial en la determinación de residuos de procloraz, se obtuvieron
los datos que se muestran en la tabla 29. Los valores del sesgo
estandarizado y de curtosis estandarizada se encuentran dentro del
rango esperado para datos provenientes de una distribución normal.
Resultados y Discusión
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
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174
Tabla 29. Resumen estadístico para los niveles de residuos de probloraz, para el par
aceite-fruta.
Recuento 110
Promedio 0,387614
Desviación Estándar 1,56594
Coeficiente de Variación 403,995%
Mínimo -3,4
Máximo 4,29
Rango 7,69
Sesgo Estandarizado -0,338507
Curtosis Estandarizada 1,34916
Figura 45. Diagrama de cajas y bigotes para procloraz en el par muestral aceite-
fruta
Para el análisis de muestras pareadas en relación a los niveles
residuales de procloraz, los valores del sesgo estandarizado y de
curtosis estandarizada se encuentran dentro del rango esperado para
datos provenientes de una distribución normal.
Para el análisis de muestras pareadas de fruta entera y aceite
esencial en el análisis residual de clorpirifos, se obtuvieron los datos
que se muestran en la tabla 30.
PROCLORAZ
-3,4 -1,4 0,6 2,6 4,6
ACEITE-FRUTA
Resultados y Discusión
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175
Table 30. Resumen estadístico para los niveles de residuos de clorpirifos, para el par
aceite-fruta
Recuento 90
Promedio 0,2253
Desviación Estándar 0,0879725
Coeficiente de Variación 39,0468%
Mínimo 0,083
Máximo 0,468
Rango 0,385
Sesgo Estandarizado 2,94151
Curtosis Estandarizada -0,0814761
Figura 46. Diagrama de cajas y bigotes para clorpirifos en el par muestral aceite-
fruta
En este caso, los valores del sesgo estandarizado no se
encuentran dentro del rango esperado para datos provenientes una
distribución normal y el valor de curtosis estandarizada se encuentran
dentro del rango esperado para datos provenientes de una distribución
normal.
Para el análisis de muestras pareadas de fruta entera y aceite
esencial en el análisis residual de carbendazim, se obtuvieron los datos
que se muestran en la tabla 31.
CLORPIRIFOS
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
ACEITE-FRUTA
Resultados y Discusión
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176
Tabla 31. Resumen estadístico para los niveles de residuos de carbendazim, para el
par aceite-fruta
Recuento 74
Promedio -0,00421351
Desviación Estándar 0,0147346
Coeficiente de Variación -349,699%
Mínimo -0,03
Máximo 0,039
Rango 0,069
Sesgo Estandarizado 3,85211
Curtosis Estandarizada 2,06158
Figura 47. Diagrama de cajas y bigotes para carbendazim en el par muestral aceite-
fruta
Para el análisis de muestras pareadas en relación a los niveles
residuales de carbendazim, los valores del sesgo estandarizado y de
curtosis estandarizada no se encuentran dentro del rango esperado
para datos provenientes de una distribución normal.
Para el análisis de muestras pareadas de fruta entera y aceite
esencial en el análisis residual de tiabendazole, se obtuvieron los datos
que se muestran en la tabla 32.
Para el análisis de muestras pareadas en relación a los niveles
de residuos de tiabendazole, los valores del sesgo estandarizado y de
Resultados y Discusión
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
177
curtosis estandarizada no se encuentran dentro del rango esperado
para datos provenientes una distribución normal.
Tabla 32. Resumen estadístico para los niveles de residuos de tiabendazol, para el
par aceite-fruta
Recuento 110
Promedio 0,181995
Desviación Estándar 0,299866
Coeficiente de Variación 164,767%
Mínimo -0,31
Máximo 1,007
Rango 1,317
Sesgo Estandarizado 4,40478
Curtosis Estandarizada 2,12794
Figura 48. Diagrama de cajas y bigotes para tiabendazol en el par muestral aceite-
fruta
De acuerdo al análisis realizado anteriormente para cada uno
de los plaguicidas, se observa que los niveles de residuos de
plaguicidas presentaron una variabilidad considerable entre los
diferentes lotes muestreados, por lo que se procedió a determinar el
coeficiente de correlación para cada uno de los lotes por separado y
para cada uno de los plaguicidas.
Resultados y Discusión
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
178
Aquellos lotes que no indicaron presencia de niveles
residuales de plaguicidas fueron desestimados para la determinación
del coeficiente de correlación, sólo se consideraron aquellos que
manifestaron presencia de residuos en fruta entera y aceite esencial,
pudiéndose así conformar el par muestral para que sea factible la
correlación.
Los coeficientes de correlación obtenidos para cada caso se
detallan en la tabla 33.
Tabla 33. Coeficientes de correlación hallados entre los niveles de residuos de
plaguicidas de la fruta entera y los aceites esenciales de naranja Valencia.
Temporadas 2012, 2013 y 2014.
PROCLORAZ CLORPIRIFOS CARBENDAZIM TIABENDAZOL
AÑO Nº DE LOTE
CORRELACION CORRELACION CORRELACION CORRELACION
2012
A 0,7582 -------- -------- 0,9874
B 0,9118 0,9573 -------- 0,9461
C 0,7977 0,9861 -------- 0,8432
D 0,8891 0,9549 0,9437 0,7523
2013
E 0,9929 0,8131 0,9973 0,9221
F 0,8648 0,7376 0,8040 0,9547
G 0,9995 0,9727 0,9998 0,9899
H 0,9522 0,9987 0,9819 0,9555
2014
I 0,9216 1,0000 0,9969 -0,2379
J -------- -------- -------- --------
K 0,9728 0,9343 0,9777 0,9972
L 0,9001 -------- 0,3932 --------
En aquellos lotes que se determinó el coeficiente de
correlación, se puede observar que para todos los casos existe una
correlación altamente significativa. Para procloraz el índice de valor
medio del coeficiente de correlación es del orden de 0,90, para
clorpirifos de 0,93, para carbendazim de 0,88 y para tiabendazol de
Resultados y Discusión
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
179
0,81. El clorpirifos fue el plaguicida que mayor correlación presentó
entre los niveles residuales de fruta y aceite, mientras que el
tiabendazol fue el de menor.
CAPITULO VI
CONCLUSIONES
Conclusiones
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
183
V. CONCLUSIONES
En la determinación de clorpirifos, carbendazim, procloraz y
tiabendazol, tanto en naranjas como en aceites esenciales descerados,
es necesario emplear blancos de muestra fortificados para hacer la
calibración, dado que presentan efecto matriz.
Todos los métodos evaluados son lineales en el rango de
concentraciones estudiadas en las distintas matrices.
La exactitud medida en términos de recuperación presenta
valores comprendidos entre el 87% (tiabendazol en aceites esenciales)
y el 114% (clorpirifos en naranjas), lo que indica que todos los
métodos desarrollados son exactos. Asimismo, se ha demostrado que
los métodos son precisos, ya que los coeficientes de variación han sido
inferiores al 20% en todos los casos.
Los límites de cuantificación fueron 0,050 mg/Kg para
clorpirifos y 0,01 mg/Kg para tiabendazol, en naranjas; en aceites
esenciales, 0,01 mg/kg para procloraz, carbendazim y tiabendazol, y
0,05 mg/kg para clorpirifos. Los límites de detección y cuantificación
obtenidos son adecuados, teniendo en cuenta los límites máximos de
residuos (LMRs) establecidos en la legislación argentina y europea,
para naranjas.
Los residuos de los 2 plaguicidas evaluados en las muestras
de naranja que llegan a la industria presentaron valores máximos
inferiores a los LMRs establecidos en la legislación de Argentina y de
la Unión Europea.
Conclusiones
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
184
Se ha demostrado la persistencia de clorpirifos, carbendazim,
procloraz y tiabendazol, en los aceites esenciales descerados obtenidos
a partir de naranja, que está comprendida entre un 0,24% y un 5,45%.
Para los 4 plaguicidas evaluados se ha podido establecer una
correlación positiva entre los niveles presentes en la fruta y los valores
residuales obtenidos en los aceites esenciales.
El desarrollo y validación de los métodos de análisis de
clorpirifos, carbendazim, procloraz y tiabendazol, en muestras de
naranjas y aceites esenciales descerados, llevado a cabo en este
estudio, permite ofrecer una valiosa herramienta al sector industrial,
con la que determinar de forma exacta y precisa los niveles de
plaguicidas de los productos que adquieren, elaboran y/o
comercializan. Esto ayudará a la mejora de los procesos de control de
calidad, permitiendo seleccionar solo materias primas que cumplan
con los criterios exigidos por la legislación en materia de residuos, a la
vez que establecer estrategias apropiadas de comerialización, teniendo
en cuenta las diferencias de los LMRs existentes entre los distintos
mercados.
CAPITULO VI
REFERENCIAS
BIBLIOGRÁFICAS
Referencias Bibliográficas
Tesis doctoral: “Evolución de los residuos de plaguicidas en frutas cítricas
frescas. Incidencia sobre los aceites esenciales” – Prof. Hilda Rousserie
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