INTRODUCCION:El SIDA, se identificó por primera vez en 1981, es una enfermedad infecciosa inducida por un virus VIH y caracterizada por una inmunidad fuertemente deprimida. El principal determinante de la patogenicidad del virus es el tropismo por los linfocitos T y los monocitos, quien utiliza la molécula CD4 como receptor para ingresar e infectar las células. Una característica importante del VIH es que su replicación en algunas células parece restringida lo que da como resultado su mantenimiento en una forma latente (periodo de ventana). La infección latente permite que el genoma del VIH esté presente en las células T y los macrófagos, en ausencia de la expresión de las proteínas virales, lo que da como resultado células infectadas de manera persistente que permanecen invisibles para el sistema inmune del huésped.El SIDA representa un amplio espectro de afecciones clínicas. Habitualmente se produce cierto número de infecciones oportunistas y procesos malignos que constituyen el signo distintivo del síndrome, el más común es el Sarcoma de KaposiEl diagnóstico se establece por medio de la combinación del reconocimiento de un síndrome clínico, la demostración de anticuerpos anti VIH séricos por medio de ELISA y el Wester blot.El examen de ELISA es una de la pruebas más eficaces, rápida, efectiva y confiable para detectar el virus del VIH su nombre viene del término inglés "Enzyme-linked immunoabsorbent assay", que quiere decir “Ensayo inmunoenzimático ligado a enzimas". su sensibilidad y fiabilidad de esta prueba es alta, aunque no al cien por ciento. Eso significa que, en caso de un resultado positivo, el diagnóstico debe confirmarse mediante una segunda prueba. Por coincidencia, ELISA puede detectar otros anticuerpos que no tengan nada que ver con el VIH y que estén presentes en la muestra de sangre. Para identificar los anticuerpos como anticuerpos "reales" del VIH, se realiza una segunda prueba en la misma muestra de sangre mediante la técnica "Western Bloot". Esta prueba visualiza la reacción de los anticuerpos frente a proteínas estructurales independientes del VIHOtras pruebas de laboratorio para confirmar la presencia de anticuerpos del VIH, incluyen la inmunoelectrotransferencia o examen de Western Blot, la inmunofluorescencia y la radioinmnoprecipitación o RIPA."El periodo de ventana" o periodo de espera es el tiempo que una persona infectada tarda en desarrollar los anticuerpos al virus. Para el 97% aproximadamente de las personas infectadas, el periodo de ventana es de 3 meses. Después de 6 meses casi todas las personas que tengan el virus habrán desarrollado anticuerpos al mismo. Un resultado negativo 6 meses después del último riesgo es suficiente para descartar la posibilidad de infección. . El período de ventana con las últimas pruebas ELISA de cuarta generación varía de 10 a 14 días. Este periodo puede prolongarse máximo por 6 meses.

VIRUS VIH

II. COMPETENCIASObserva y reconoce el principio del inmunoanálisis enzimático (ELISA) para el diagnóstico del VIH.

MATERIAL Y PROCEDIMIENTOS:

PREPARACION DE LOS REACTIVOS:SOLUCION DE LAVADODiluir el Reactivo 2 (R2) al 1:20 en agua destilada para obtener una solución de lavado lista para su uso.1 ml. de Reactivo R2 en 19 ml. De agua destilada

SOLUCION DE TRABAJO: DEL CONJUNGADO 2Agitar con suma delicadeza el vial de conjugado liofilizado 2 (R7a) sobre la mesa de trabajo para eliminar cualquier sustancia del tapón de caucho.Con cuidado retirar el tapón y verter el contenido del vial diluyente del conjugado (R7b) en el vial del conjugado liofilizado R7a.Poner de nuevo el tapón y dejar que se asiente por 10 minutos ir, agitando por inversión de vez en cuando para facilitar su disolución.

SOLUCION DE DESARROLLO ENZIMATICO: (SOLUCION SUSTRATO)Diluir al 1:11 el cromogen (R9) en el tapón sustrato (R8). La estabilidad dura 6 horas en la oscuridad una vez preparada.

PROCEDIMIENTO DEL TEST:

Establecer con cuidado la distribución de las muestras y el plan de identificación.Preparar la solución de lavado diluidaPreparar la solución de trabajo del conjugado 2Sacar las bandejas y las tiras (R1) de la bolsa protectoraAplicar directamente, sin lavado previo de la placa y de forma sucesiva lo siguiente:25 uL de conjugado 1 (R6) en cada pocillo75 uL de control positivo Ag VIH (R5) en el pocillo A175 uL de control positivo Ab VIH (R4) en el pocillo B175 uL de control negativo (R3) en los pocillos C1, D1 y E175 uL de muestra en el pocillo G1Homogenizar la mezcla mediante un mínimo de 3 aspiraciones con una pipeta de 75 uL agitando la microplaca después del paso del pipeteado.

Cubrir la microplaca con película adhesiva. Apriete firmemente por todas partes de la placa para asegurar un buen precintado.Incubar la microplaca a 37°C por 1 horaQuitar la película adhesiva y realizar los lavados:Aspirar el contenido de los pocillos en un contenedor para productos biológicamente peligrosos (solución con lejía).Agregar en cada pocillo un mínimo de 0.370 ml de solución de lavado.Deje que se empaque al menos 30 segundos. Aspirar y eliminar de nuevo (Lavado)Repetir este procedimiento un mínimo de 3 veces (3 lavados)El volumen residual debe ser inferior a 10 uL (si es preciso secar la placa agitando de arriba abajo en papel secante)Distribuir rápidamente 100 uL de la solución de conjugado2 en todos los pocillos. El conjugado se debe agitar antes de su uso.Siempre que sea posible, cubrir la microplaca con una nueva película adhesiva e incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente (18 a 30°C).Retirar la película adhesiva y realizar 5 lavados como mínimo (paso 8)Distribuir rápidamente en cada pocillo 80uL de la solución sustrato recién preparada antes de su uso. Incubar en oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos. No se use la película adhesiva durante este paso.Agregar 100 uL de la solución de detección (R10) usando la misma secuencia y tasa de distribución que en la solución sustrato.

PRINCIPIO DEL TEST:

La Prueba de ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática. Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacción antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un substrato especifico que al actuar la enzima producirá un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro.ELISA.

Consta de las siguientes etapas: • Fijación al soporte insoluble de antígenos específicos para los anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los antígenos fijados deficientemente o no fijados. • Adición del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarán específicamente con los antígenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.

•Adición de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos específicos añadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antígenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. • Adición de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reacción si se desea. • Lectura visual o colorimétrica del producto final coloreado. Las técnicas de ELISA se realizan mediante la adición secuencial de todos los reactivos necesarios separados por etapas de lavado. Cada una de las operaciones puede realizarse manualmente con micropipetas o con equipamiento para la automatización de todas y cada una de las etapas. Esta completa automatización se justifica por la necesidad de procesar y analizar un gran número de muestras y necesitar una elevada repetibilidad de resultados

La distribución de la solución de detección, que no es coloreada, se puede controlar visualmente en este paso de la manipulación. Después de la adición de la solución de detección la coloración rosada del sustrato desaparece (en la muestra negativas) o se vuelve un color entre azul y amarillo (para las muestras positivas)

PROCEDIMIENTO

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS

Un resultado positivo significa: Que la persona es VIH-positiva. Que es portadora del virus y debe tomar precauciones para no transmitirle el virus

a alguien más.

Un resultado positivo NO significa: Que la persona tenga el SIDA. Que necesariamente vaya a desarrollar el SIDA. Que sea inmune al SIDA por tener los anticuerpos.

Un resultado negativo significa: Que no se encontraron anticuerpos al VIH en la muestra de sangre.

Un resultado negativo NO significa: Que la persona no tenga el HIV Que la persona sea inmune al VIH o SIDA. Que tenga resistencia a la infección. Que nunca vaya a desarrollar el SIDA.

Un resultado "indeterminado" de la prueba Western Blot (poco común) significa: Que todo el procedimiento de prueba debe repetirse con otra muestra de sangre,

normalmente varias semanas más tarde.

CONCLUSIONES.

Hemos observado y reconocido el principio del Inmunoanálisis enzimático (ELISA) para el diagnóstico del VIH.

DIAGNOSTICO DE LABORATORIO DE LA INFECCION POR VIH-1El diagnóstico de la infección por el VIH solo puede establecerse de modo definitivo por medios de laboratorio ya que las manifestaciones clínicas son inespecíficas en cualquier estadío de la enfermedad. Las pruebas de laboratorio utilizadas para reconocer las infecciones por retrovirus humanos pueden clasificarse en directas e indirectas (Figura 3). Según persigan demostrar la presencia del virus o de sus constituyentes (Proteínas y Ácidos nucleicos) o bien la respuesta inmunitaria (Humoral o celular) por parte del huésped.

FIGURA 3 Clasificación de los métodos de laboratorio para diagnóstico de infección por VIH.Métodos Directos

Cultivo Viral Detección de Ácidos Nucleicos: PCR, bDNA, NASBA. Antigenemia (p24).

Métodos IndirectosDetección de anticuerpos específicos.Pruebas Rápidas: Oral test.Pruebas de Screening: ELISA, Aglutinación, Inmunocromatografía.Pruebas de Confirmación y Suplementarias: WB,IFI.

Investigación de inmunidad celular específica.

Notas: bDNA (branched-DNA), ELISA (Enzimoinmunoanálisis), IFI (Inmunofluorescencia indirecta), WB (Western Blood), NASBA (Amplificación en la transcripción de ácidos nucleicos), PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa).

PRUEBAS SEROLÓGICASLa investigación de anticuerpos en suero es la metodología más frecuentemente utilizada para la identificación de los individuos de VIH. La presencia de anticuerpos anti-VIH lejos de reflejar una exposición erradicación inmune del virus en el pasado, indica más bien el estado de portador actual.Existen diferentes tipos de pruebas para la detección de anticuerpos frente al VIH. El diseño de algunas de ellas permite realizar gran número de análisis a la vez son las denominadas pruebas de Screening. En cambio, otras son de realización más compleja aunque proporcionan mayor especificidad se utilizan para la confirmación de la reactividad en una prueba inicial de Screening. La seropositividad define mediante la demostración de anticuerpos frente a las proteínas virales con reactividad repetida en las pruebas de Screening y además, con algunas de las pruebas de confirmación 1.

PRUEBAS DE SCREENINGEl enzimoinmunoanálisis (ELISA) es el método más utilizado como prueba de Screening los antígenos provienen del lisado viral de un cultivo (ELISA de primera generación) o bien corresponden a proteínas recombinadas (ELISA de segunda generación), que reproducen epitopos de virus, los EIA de segunda generación son más sensibles y , sobre todo, más específicos que los de segunda generación. Además, las pruebas de ELISA pueden estar diseñadas de modo indirecto o competitivo según el mecanismo por el que se reconoce la precisión de anticuerpos en la muestra problema. En general los ELISA indirectos son más sensibles y los ELISA competitivos son más específicos.

En los últimos años se han desarrollado nuevas técnicas de ELISA que son más sensibles y específicas que las ELISA iniciales. Utilizan como antígenos especiales, proteínas recombinantes o péptidos sintéticos de 10 a 40 aminoácidos específicos del VIH-1 (en ocasiones, en asociación con otros del VIH-2). Las dos técnicas son ELISA de tipo sándwich (Tercera generación) y ELISA de captura (Cuarta generación). Estas pueden detectar todas las subclases de anticuerpos y no solo la IgG. Esto explica su mayor sensibilidad para reconocer la primoinfección por VIH-1, cuando la IgM es el primer marcador de la seroconversión, así como para el diagnóstico de la infección pediátrica, que cursa con IgM e IgA solo si el niño está infectado. Además del ELISA de captura es un método de gran especificidad. Permitiendo la detección simultánea de antígeno y anticuerpos, con una media de 8 días antes que los de tercera generación.En la actualidad existen más de 130 pruebas comerciales para la detección de anticuerpos frente al VIH-1 en suero. En general las pruebas aprobadas para los bancos de sangre gozan de excelente sensibilidad superior al 99,5%.

PRUEBAS DE DETECCIÓN RAPIDA.Existen diversos métodos para la detección rápida de anticuerpos frente al VIH. Las pruebas de inmunoadherencia (dot-blot) son más frecuentes aunque también se han desarrollado ensayos de aglutinación. 2. En general todas ellas gozan de buena sensibilidad, especificidad y fundamentalmente acortan ventajas en aquellos lugares en donde los test diagnósticos habituales son de difícil incorporación. La gran mayoría tienen la capacidad de detectar las distintas variantes de VIH-1 y VIH-2, por lo que su uso en África y Sud-América cada vez es más extendido, especialmente para diagnósticos urgentes.La FDA aprobó hace pocos años la utilización de ensayos OralQuick con saliva para su distribución de venta libre en farmacias, este ensayo aporta la ventaja de que únicamente requiera la muestra de la saliva para su uso, sin embargo no se pude olvidar que un diagnóstico positivo tiene que ser confirmado por ELISAs especializados.

PRUEBAS DE CONFIRMACIONEl Western-Blood (WB) es el método más empleado para la confirmación de resultados obtenidos con las pruebas de Screening. Permite discriminar frente a qué antígenos virales se dirigen los anticuerpos presentes en la muestra problema, Otras metodologías de confirmación como la Inmunofluorescencia indirecta (IFI) presenta gran complejidad y gran subjetividad, lo que dificulta su utilización sistemática como pruebas de confirmación 1.En 1990 la OMS redacta la nomenclatura vigente de las bandas de proteínas del western blood y estableció los siguientes criterios para su interpretación: la positividad en el WB para VIH-1 requiere la presencia de al menos 2 bandas de la envoltura; la negatividad resulta de la ausencia de bandas y los restantes patrones se consideran indeterminados. (Fig. 5).

FIGURA 5. Causas de Wester Blood Indeterminado para VIH-1.

Infección por VIH-2 Seroconversión para el VIH-1. Pacientes en estadíos muy avanzados de la enfermedad. Niños de madres seropositivas. Reactividad inespecífica.

ALGORRITMOS DIAGNÓSTICOS PROPUESTOS PARA LA INFECCIÓN POR VIHUna prueba de ELISA reactiva en una ocasión para anticuerpos frente al VIH-1 debe ser repetida en la misma muestra antes de ser valorada como tal. Todas las muestras de ELISA repetidamente reactivas deben ser confirmadas con WB. Diversos estudios han demostrado que la sensibilidad y la especificidad del ELISA comercialmente son superiores al 98%, si bien, el número de falsos positivos en un grupo de bajo riesgo de infección (como los donantes) quizá no sea insignificante. Estos falsos positivos se han descrito en especial en individuos con enfermedades autoinmunes y en pacientes con historias de múltiples gestaciones o transfusiones, relacionados con la existencia de anticuerpos frente a algunos antígenos HLA de clase II. La utilización de pruebas de ELISA diseñados con antígenos recombinantes o péptidos sintéticos ha reducido de manera considerable las reacciones cruzadas y prácticamente en la actualidad una prueba de ELISA positivo es diagnóstico de infección por VIH.

En la Figura 6. Se recoge el algoritmo diagnóstico recomendado para el diagnóstico de la infección por el VIH, es necesario tener en cuenta el tipo de población estudiada, ya sea donantes de sangre o población de bajo recurso ya que se han descrito falsos positivos en el WB. Aunque dicha metodología es la más generalizada para la confirmación de la reactividad inicial en una prueba de Screening puede considerarse otro tipo de estrategias diagnósticas como la confirmación mediante LIA, en casos con resultados indeterminados.

En la Figura 7. El diagnóstico de la infección aguda por el VIH ha adquirido una especial relevancia según se ha ido avanzando en el conocimiento de la enfermedad. El conocer por un lado las características virológicas de las cepas (fundamentalmente la presencia de mutaciones de resistencia y el subtipo viral) que son responsables de las nuevas infecciones y por otro lado las ventajas que representa la instauración de terapia antiretroviral en este período ha hecho que se adopten nuevas estrategias diferentes a fin de diagnosticar estas infecciones. Estas incluyen además de la realización de viremia plasmática para los casos previos a la seroconversión la utilización de test de ELISA especiales y estándar para el diagnóstico de la enfermedad ante un accidente laboral o un contacto sexual de riesgo.

FIGURA 7. ALGORITMO DIAGNOSTICO DEL VIH EN LABORATORIO.

BIBLIOGRAFIA

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Koneman, E. (1999). Diagnóstico Microbiológico. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires- Argentina.