SELEX (evolución sistemática de ligandos por
enriquecimiento exponencial)
Tuerk and Gold (1990)Ellington y Szostak (1990)
ssDNA ssRNA
Bibliotecas de oligonucleótidos
(10*13)
Premio Nobel- Medicina 2009
Carol Greider Jack Szostak Elizabeth Blackburn
"for the discovery of how chromosomes are protected by telomeres and the enzyme telomerase".
Primera terapia en base a RNA “other small structural RNAs could be exploited as a new approach for inhibiting proteins and enzymes”
• Factor de von Willebrand (vWF)• Factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF)• Factor de crecimiento endotelial-vascular (VEGF)• E-selectina• Antígeno de membrana especifico de próstata (PSMA)• Factor nuclear kB (NFkB)• Tenacina-C
Primeros usos de los aptámeros
• Peptidos biologicamente activos y proteinas solubles
(Jellinek et al., 1993, Ruckman et al., 1998, Williams et al., 1996, Proske et al., 2002)
• Se unen a nucleótidos (Sassanfar and Szostak, 1993, Meli et al., 2002)
• Blancos complejos como receptores de membrana y vasos sanguíneos
(Ulrich et al. 1998, Blank et al. 2001)
Debilidades de los aptámeros
Corta vida media debido a la degradación de nucleasas
presentes en el suero
5’ 3’
Extremos 5’ y 3’ son susceptibles a exonucleasas
¿Es ahora el momento?
• Mejoras químicas en la síntesis de oligonucleótidos aumentan su estabilidad y su farmacocinética.
(Trujillo et al., 2007, Ni et al., 2011)
Estructura 3D única Kd= nM ó pM
Anticuerpos químicos
• También llamados “Anticuerpos químicos” • Mas eficientes que los ligandos e inhibidores
naturales
Como resolver las limitaciones de los aptámeros
• Los aptámeros pueden ser optimizados para la actividad y persistencia fisiológica durante la selección o durante la relación estructura-actividad y estudios de química medica realizados después de su descubrimiento
• La adición de conjugados como polietinel-glicol o colesterol puede incrementar su vida media (horas/días vs minutos)
• Modificaciones químicas incorporadas a los azucares o enlaces fosfodiester inter-nucleótido potencia su resistencia a nucleasas
• La protección por propiedad intelectual están a punto de expirar
Keefe, AD. Et al. 2010
Degradación de los aptámeros
Alarga la vida media de los aptámeros
Protegen al aptámero de la degradación por endo y
exonucleasas
Lakhin, AV et. al, 2013
Excreción de los aptámeros por filtración renal
Los aptámeros tienen entre 5-
15 kDa
PEG
PEG o colesterol aumentan entre
20-40 kDa
30-50kDa
Control de la duración de la acción
• Degradación
• Participación en procesos metabólicos
• Excreción renal
• Etc…
Los antídotos pueden ser una solución para controlar la duración
de la acción terapéutica
Interacción del aptámero con blancos intracelulares
Transfección de células con un vector de expresión
que tiene promotor U6
Transfección de células con un vector de expresión que tiene promotor tRNA
Intrámeros (concentración del aptámero
a nivel intracelular)
PSMA
Generación de aptámeros usando proteínas no purificadas
Cell-SELEX
Aptámeros específicos contra proteínas no
conocidas
Biomarcadores, diferenciación de células
tumorales…etc
Reacciones cruzadas
DNA polimerasa β DNA polimerasa κ
La adición de pasos de selección negativa con moléculas estructuralmente similares disminuye
enormemente las reacciones cruzadas
Pool de RNAs
Generación automática de aptámeros
• CE-SELEX: electroforesis capilar (una ronda) • NECEEM: electroforesis capilar sin equilibrio de
mezclas en equilibrio (1-2 días)
CE-SELEX NECEEM-SELEX
Hernández, FJ. Hincapié, JA. 2011
Aptámeros en fase clínica
* f – 2'-fluoronucleotide, m – 2'-O-methylnucleotide y se adicionó PEG 40kDa
Infecciones parasitarias
Alta prevalencia en países subdesarrollados
Alta resistencia a los antiparasitarios y muchos
efectos secundarios
Bajo costo y facilidad para su aplicación
Leishmaniasis
L.infantum
H2A y H3
KMP-11•Baja actividad biológica
•Dificultad para llegar a la proteína blanco
(Bhattacharyya et al., 2002). (Moreno et al., 2003).
Leishmaniasisvisceral
Pubmed 3.000 artículo “aptamer” 10 son en parásitos
Tripanosomiasis
T.brucei
EnfermedadDel sueño
VSG
(Lorger et al., 2003) Degradación en suero
(Ulr
ich
et a
l. 2
004
)
Proteína variante
ISGsSELEX in vivoSon engullidos a
los lisosomas
T.cruzi
Células de riñón de mono
LLC-MK
70%
reducción
(Alves and Colli, 2008)
Malaria
Plasmodium sppmalaria
P.falciparum
(Niles et al., 2009)
Hemozoína(Hematina + proteínas)
PfEMP1
(Barfod et al., 2009)
Promisorios para ser
probados in vivo
Intrámeros
B52Splicing
WT y sobre-exp.
Drosophila melanogasterIntrámero especifico contra
B52
D.Melanogaster B52WT
D.Melanogaster B52Shi, H. et al 1999
Conclusiones
• Pueden usarse tanto en diagnóstico como en terapéutica y como biomarcadores
• Cada tipo celular difiere de otro por las moléculas que expone en la superficie celular
• Se puede interferir a diferentes niveles en el crecimiento, viabilidad y proliferación de los parásitos
• Los aptámeros obtenidos in vitro deben ser validados in vivo
• Poderosa herramienta para el estudio de la función de proteínas y esclarecimiento de funciones en grandes maquinarias proteicas
• Pueden hacerse modificaciones que mejoren la técnica con las herramientas que tenemos a mano
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