Avances Avances moleculares moleculares
aplicados a la aplicados a la clclínicaínicaDr. Denis Landaverde Dr. Denis Landaverde
RecinosRecinos
Oncólogo MédicoOncólogo Médico
Msc. Genética y Biología Msc. Genética y Biología MolecularMolecular
Métodos Diagnóstico Métodos Diagnóstico MolecularesMoleculares
PCRPCR RT-QPCRRT-QPCR FISHFISH MicroarreglosMicroarreglos BioinformáticaBioinformática
Dogma Central de Dogma Central de la Biología la Biología MolecularMolecular
A GU U A G C U A G C
ADN
ARN
Transcripción
T C A T C G A T C GA
T CA A T C G A T C G
A GU U A G C U A G C
ADN
ARNm
Met
U A1
C A U2
Ile
C
Traducción
mensajero
ARNttransfer
Ribosoma
U A G C U A G C
ADN
ARNm
ARNt
Met Ile
A U2
C U3
Asp
G A
T CA A T C G A T C G
A GU
A T C G A T C G
U A G C U A G C
ADN
ARNm
ProteínaMet Ile Asp
T CA
A GU
A T C G A T C G
U
A
GC
U
A
G
C
ADN
ARNm
Degradación
T CA
A
GU
Juang RH (2004) BCbasics
ADN
ADN es reemplazado por el ARN volviéndose el principal material genético
ARN permite la biosíntesis protéica
Versión final del mecanismo genético celular
Procariota Eucariotaproteinas
cap5’ 3’
cola
ARNm maduro
ADN
5’3’proceso
ARNm
ribosomaARNm
proteinas
Juang RH (2004) BCbasics
PCRPCR
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
PCR es básicamente una técnica de amplificación del DNA.
PCR
amplificación
DNA
(molecule sencilla)
Muchasmoleculas
Síntesis por DNA polimerasaSíntesis por DNA polimerasa
--A T G C A T G C A T G C * * A T G C A T G C A T G C * *
A C G-T
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
Cortos primers de DNA específicos hibridizan con la cadena que tiene que ser copiada
5’ 3’
Síntesis por DNA polimerasaSíntesis por DNA polimerasa
--A T G C A T G C A T G C * *A T G C A T G C A T G C * *
A C G T-T
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
5’ 3’
Síntesis por DNA polimerasaSíntesis por DNA polimerasa
--A T G C A T G C A T G C * *A T G C A T G C A T G C * *
A C G T-T A5’ 3’
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
Síntesis por DNA polimerasaSíntesis por DNA polimerasa
--A T G C A T G C A T G C * *A T G C A T G C A T G C * *
A C G T-T A C
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
5’ 3’
Síntesis por DNA polimerasaSíntesis por DNA polimerasa
--A T G C A T G C A T G C * *A T G C A T G C A T G C * *
A C G T-T A C G
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
5’ 3’
Síntesis por DNA polimerasaSíntesis por DNA polimerasa
--A T G C A T G C A T G C * *A T G C A T G C A T G C * *
A C G T-T A C G T
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
5’ 3’
Síntesis por DNA polimerasaSíntesis por DNA polimerasa
--A T G C A T G C A T G C * *A T G C A T G C A T G C * *
A C G T-T A C G T A
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
5’ 3’
Despues del primer periodo de sintesis de DNA, tenemos copiada una cadena de DNA
Primer 1 Extensión de la cadena
Cadena original de DNA
¿Cómo produce este proceso una AMPLIFICACIÓN?
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (~100°C)
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (~100°C)
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (~100°C)Luego, usando un segundo primer, se copia la nueva cadena con la DNA polimerasa
Al mismo tiempo, la cadena original se copia nuevamente, dado que hay un rexceso de Primer 1
2
1
Ahora tenemos dos copias de la molécula original
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura
Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias
Reacción en cadena de la polimerasa - PCR
Fusión95°C
Hibridización50-60ºC
Extensión deLa cadena
75ºC
Primer Ciclo
2do Ciclo95ºC
50 - 60ºC75ºC
Múltiples ciclos darán un incremento exponencial en el número de copias
Hay 7 componentes Hay 7 componentes esenciales en el proceso esenciales en el proceso
standard de PCRstandard de PCR ADN polimerasa termoestableADN polimerasa termoestable Oligonucleotidos iniciadores Oligonucleotidos iniciadores
(“primers”)(“primers”) Desoxiribonucleótidos trifosfatados Desoxiribonucleótidos trifosfatados
(dNTPs)(dNTPs) Cationes divalentesCationes divalentes Buffer (para mantener el pH)Buffer (para mantener el pH) Cationes divalentesCationes divalentes ADN molde (Templado)ADN molde (Templado)
RT-QPCRRT-QPCR
Intrones y Exones en Células Eucariotas
ARNm
ADN
5’ 3’
cap
ColaPoly A
exon exonexonintron intron
ARNmaduro
Procesado
Transcripción
Empalme
promotor
3’ 5’
En el núcleo
Codón inicio Codón terminacion
Al citoplasma
Intron Borrado
Juang RH (2004) BCbasics
El ADNc es transcrito en forma reversa del ARNm
ARNm maduro
Cola poly A5’ 3’
TTTTRetroTranscripción
CCC
3’ 5’
3’5’ 3’GGG
ADN Polimerasa
ARN hidrolisis
5’
3’ 5’
Para amplificar copias de cDNA de RNAPara amplificar copias de cDNA de RNA Es especialmente útil cuando solo se dispone Es especialmente útil cuando solo se dispone
de pequeñas cantidades de RNAde pequeñas cantidades de RNA Frecuentemente usada para amplificar genes Frecuentemente usada para amplificar genes
específicos (como cDNAs) si algo de su específicos (como cDNAs) si algo de su secuencia es conocidasecuencia es conocida
Requiere primer “antisense” y un DNA Requiere primer “antisense” y un DNA polimerasa dependendinte de RNApolimerasa dependendinte de RNA
Puede ser usada para construir bibliotecas de Puede ser usada para construir bibliotecas de cDNAcDNA
RT-PCR = PCR con RT-PCR = PCR con transcriptasa reversatranscriptasa reversa
RT-PCRRT-PCR
AAAAAAAAAA-3’TTTTTTTTTT-5’
Transcripción reversa
PCR usando GSP+GSP1
AAAAAAAAAA-3’TTTTTTTTTT-5’
mRNA(sense)
Primer Antisense:oligo(dT)o
1ra cadena cDNA
GSP1 (sense)
GSP (antisense)
GSP1
GSP
Requiere el conocimiento de la secuencia para diseñar GSP and GSP1
Cariotipo/CitogeneticaCariotipo/Citogenetica
1 2 3 4 5
6 7 8 10 119 12
13 14 15 16 17 18
19 20 21 22X Y
Anomalía Citogenética de la LMC: Anomalía Citogenética de la LMC:
el cromosoma Filadelfiael cromosoma Filadelfia
bcr-abl
ablProteína de fusión con actividad
tirosin kinasa
22
bcr
Ph (or 22q-)
99 q+
1
p210Bcr-Abl
p185Bcr-Abl2-11
2-11
Cromosoma 9
c-bcr
Cromosoma 22
c-abl
2-11
Exones
Intronas
Puntos de fractura CML
Puntos de fractura LLA
Translocación (9;22) Estructura del gen bcr-abl
Pasternak G, et al. J Cancer Res Clin Oncol. 1998;124:643-660.Melo JV. Blood. 1996;88:2375-2384.
El Cromosoma Filadelfia El Cromosoma Filadelfia y el Gen y el Gen bcr-ablbcr-abl
Fluorescence in situ Fluorescence in situ HybridizationHybridization
Fluorescence in situ Fluorescence in situ Hybridization (FISH)Hybridization (FISH)
FISH – es FISH – es un proceso en el un proceso en el cual se pintan las cual se pintan las cromosomas o porciones de cromosomas o porciones de los mismos con moléculas los mismos con moléculas flourescentesflourescentes
Fluorescence in situ Fluorescence in situ Hybridization (FISH)Hybridization (FISH)
Identifica anormalidades Identifica anormalidades cromosómicas.cromosómicas.
Ayuda para el análisis de Ayuda para el análisis de aberraciones estructurales, aberraciones estructurales, determinación de ploidías, mapeo determinación de ploidías, mapeo de genes, de genes, etc.etc.
Fluorescence in situ Fluorescence in situ Hybridization (FISH)Hybridization (FISH)
Usado para identificar la Usado para identificar la presencia y localización de una presencia y localización de una resión de AND o ARN con resión de AND o ARN con preservación morfológica de preservación morfológica de preparados de cromosomas en preparados de cromosomas en células fijadas o secciones de células fijadas o secciones de tejido.tejido.
FISH ProFISH Procedimientocedimiento
DesnaturDesnaturalizar los alizar los cromosomascromosomas
HibridaHibridaciónción Marcado FlourescenteMarcado Flourescente ExamiExaminar las láminas en la nar las láminas en la
oscuridad.oscuridad.
FISH ProcedimientoFISH Procedimiento
MicroarreglosMicroarreglos
Los MicroarraysLos Microarrays
Son dispositivos miniaturizados capaces de Son dispositivos miniaturizados capaces de realizar un experimento de hibridacirealizar un experimento de hibridación ón múltiple.múltiple.
En la actualidad, existen microarrays que En la actualidad, existen microarrays que contienen secuencias de todos los genes de un contienen secuencias de todos los genes de un organismo.organismo.
Se emplean para estudiar si existen genes Se emplean para estudiar si existen genes comunes entre muestras, o sobre todo, para comunes entre muestras, o sobre todo, para estudiar la estudiar la expresión expresión de genes globalmente.de genes globalmente.
A continuaciA continuación, veremos una imagen de un ón, veremos una imagen de un microarray.microarray.
Tamaño de un Tamaño de un MicroarrayMicroarray
Un microarray contiene miles de Un microarray contiene miles de puntos, cada uno correspondiente a puntos, cada uno correspondiente a una secuencia especuna secuencia específica para un ífica para un gen, compuesta de unos 25 gen, compuesta de unos 25 nucleótidos.nucleótidos.
Sin embargo, el tamaño del Sin embargo, el tamaño del dispositivo entero es el mismo que el dispositivo entero es el mismo que el de un portaobjetos normal.de un portaobjetos normal.
Muestrade ADN
Cada mancha contiene ADN conocido
Biochip
Schena (2000) Microarray Biochip Technology, p. A31
ADN complementario hibridizado
Señal aparente
Biochip Basado en Hibridizacion
A microarray analysis machine
An example of red, green and yellow spots.
BioinformáticaBioinformática
BioinformáticaBioinformáticaDefinición intuitivaDefinición intuitiva
Conjunto de herramientas Conjunto de herramientas informáticainformáticas que sugieren s que sugieren
soluciones a problemas soluciones a problemas biobiológicoslógicos
BioinformáticaBioinformática es la aplicación de es la aplicación de los ordenadores y los métodos los ordenadores y los métodos informáticos en el análisis de datos informáticos en el análisis de datos experimentales y simulación de los experimentales y simulación de los sistemas biológicossistemas biológicos
Una definición mucho más global es:Una definición mucho más global es: Bioinformática es la aplicación del Bioinformática es la aplicación del
desarrollo de la computación y las desarrollo de la computación y las matemáticas que permite la matemáticas que permite la administración, análisis y comprensión de administración, análisis y comprensión de datos para resolver preguntas biológicas. datos para resolver preguntas biológicas. (con conexiones a medi-, quimio-, neuro-, (con conexiones a medi-, quimio-, neuro-, etc. informática). Modificado de: Center etc. informática). Modificado de: Center for Research on Innovation and for Research on Innovation and Competition (Harvey & Mc. Meekin, Competition (Harvey & Mc. Meekin, 2002). 2002).
Bases de datosBases de datos Existen Existen basesbases de datos primarias, que de datos primarias, que
contienen información directa de la contienen información directa de la secuencia, estructura o patrón de expresión secuencia, estructura o patrón de expresión de de ADNADN o o proteínaproteína, y secundarias, que , y secundarias, que contienen datos e hipótesis derivados del contienen datos e hipótesis derivados del análisis de las bases de datos primarias, análisis de las bases de datos primarias, como mutaciones, relaciones evolutivas, como mutaciones, relaciones evolutivas, agrupación por familias o funciones, agrupación por familias o funciones, implicación en enfermedades, etc.implicación en enfermedades, etc.
De De nucleótidosnucleótidos
La colaboración de las tres bases de datos más importantes hace posible La colaboración de las tres bases de datos más importantes hace posible acceder a casi toda la información de secuencias de acceder a casi toda la información de secuencias de ADNADN desde desde cualquiera de sus tres sedes:cualquiera de sus tres sedes:
EMBL-BANKEMBL-BANK en el Instituto europeo de Bioinformática ( en el Instituto europeo de Bioinformática (EBIEBI) ) Enlace externo: Enlace externo: EMBL-BANKEMBL-BANK
DNA Data Bank of JapanDNA Data Bank of Japan ( (DDBJDDBJ) en el Centro de Información Biológica () en el Centro de Información Biológica (CIBCIB) )
Enlace externo: Enlace externo: DDBJDDBJ GenBankGenBank en el Centro Nacional de Información Biotecnológica ( en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBINCBI) )
Enlace externo: Enlace externo: GenBankGenBank EntrezEntrez NucleotideNucleotide Si bien son mantenidas por distintos organismos en distintos paises, Si bien son mantenidas por distintos organismos en distintos paises,
existe una coordinación entre las distintas bases. Una secuencia enviada a existe una coordinación entre las distintas bases. Una secuencia enviada a cualquiera de las bases se verá reflejada en las otras dos en cualquiera de las bases se verá reflejada en las otras dos en aproximadamente una semana, ya que esa es la frecuencia de aproximadamente una semana, ya que esa es la frecuencia de actualización entre las distintas bases genéticas. Por este motivo es actualización entre las distintas bases genéticas. Por este motivo es indistinto que base se use para enviar nuevas secuencias, aunque indistinto que base se use para enviar nuevas secuencias, aunque normalmente los europeos utilizan normalmente los europeos utilizan EMBL-BANKEMBL-BANK y los americanos y los americanos GenBankGenBank..
De De proteínasproteínas Bases de datos de secuencias de Bases de datos de secuencias de aminoácidosaminoácidos.. SwissprotSwissprot contiene secuencias anotadas o comentadas, es decir, cada contiene secuencias anotadas o comentadas, es decir, cada
secuencia ha sido revisada, documentada y enlazada a otras bases de secuencia ha sido revisada, documentada y enlazada a otras bases de datos. datos.
Enlace externo: Enlace externo: SwissprotSwissprot en el EBI en el EBI, , SwissprotSwissprot en en ExpasyExpasy TrEMBLTrEMBL por por Translation of EMBL Nucleotide Sequence DatabaseTranslation of EMBL Nucleotide Sequence Database incluye incluye
la traducción de todas las secuencias codificantes derivadas del (la traducción de todas las secuencias codificantes derivadas del (EMBL-BANKEMBL-BANK) y que todavía no han podido ser anotadas en ) y que todavía no han podido ser anotadas en SwissprotSwissprot. .
Enlace externo: Enlace externo: TrEMBLTrEMBL PIRPIR por por Protein Information ResourceProtein Information Resource está dividida en cuatro sub-bases está dividida en cuatro sub-bases
que tienen un nivel de anotación decreciente. que tienen un nivel de anotación decreciente. Enlace externo: Enlace externo: PIRPIR
ENZYMEENZYME enlaza la clasificación de actividades enyimáticas completa a las enlaza la clasificación de actividades enyimáticas completa a las secuencias de secuencias de SwissprotSwissprot. .
Enlace externo: Enlace externo: ENZYMEENZYME PROSITEPROSITE contiene información sobre la estructura secundaria de contiene información sobre la estructura secundaria de
proteínas, familias, dominios, etc. proteínas, familias, dominios, etc. Enlace externo: Enlace externo: PROSITEPROSITE
INTERPROINTERPRO integra la información de diversas bases de datos de integra la información de diversas bases de datos de estructura secundaria como PROSITE, proporcionando enlaces a otras estructura secundaria como PROSITE, proporcionando enlaces a otras bases de datos e información más extensa. bases de datos e información más extensa.
Enlace externo: INTERPRO Enlace externo: INTERPRO PDBPDB por por Protein Data BankProtein Data Bank es la base de datos de estructura terciaria 3-D es la base de datos de estructura terciaria 3-D
de proteínas que han sido cristalizadas. de proteínas que han sido cristalizadas. Enlace externo: PDBEnlace externo: PDB
COX-2 ADA
XOFKBP
De genomasDe genomas EnsemblEnsembl integra genomas eucariotas grandes, integra genomas eucariotas grandes,
por el momemto contiene genoma humano, por el momemto contiene genoma humano, ratón, rata, fugu, zebrafish, mosquito, ratón, rata, fugu, zebrafish, mosquito, Drosophila, Drosophila, C. elegansC. elegans, y , y C. briggsaeC. briggsae. . Enlace externo: Ensembl Enlace externo: Ensembl
Genomes serverGenomes server y y TIGRTIGR son portales con son portales con información o enlaces de todos los genomas información o enlaces de todos los genomas secuenciados por el momento, desde virus a secuenciados por el momento, desde virus a humanos. humanos. Enlace externo: Genome Server Enlace externo: Genome Server Enlace externo: TIGR Enlace externo: TIGR
WormbaseWormbase es el portal del genoma de gusano es el portal del genoma de gusano C. C. eleganselegans. . Enlace externo: Wormbase Enlace externo: Wormbase
FlybaseFlybase es el portal de la mosca del vinagre es el portal de la mosca del vinagre Drosophila melanogasterDrosophila melanogaster. . Enlace externo: FlybaseEnlace externo: Flybase
FEBRUARY 2001:
Consorcio Público
Celera Genomics NOVIEMBRE 2001 :
Ohio State University
Secuencia DNA Secuencia Proteína
Estructura 3DReconocimiento Molecular
Identificación genes
Comparación de secuenciasPredicción funcional, 3D
Mecánica clásicaDinámica MolecularDocking
Para recordarPara recordar
La bioinformática “sugiere” soluciones. La La bioinformática “sugiere” soluciones. La comprobación experimental es necesaria.comprobación experimental es necesaria.
La bioinformática puede “ahorrar La bioinformática puede “ahorrar trabajo”, comprobando teorías trabajo”, comprobando teorías in silicoin silico
La bioinformática permite hacer La bioinformática permite hacer experimentos imposibles.experimentos imposibles.
Aplicación en OncologíaAplicación en Oncología
PCR: p53, cmyc, PTEN, PCR: p53, cmyc, PTEN, QPCR: LMC, LLAQPCR: LMC, LLA Secuenciación: búsqueda de Secuenciación: búsqueda de
mutaciones Genes BRCA1 y BRCA2mutaciones Genes BRCA1 y BRCA2 FISH: Her2, Myc, EGFR, P53FISH: Her2, Myc, EGFR, P53 Microarreglos: Mamaprint aprobado Microarreglos: Mamaprint aprobado
por FDApor FDA
Sigamos Sigamos adelante…..adelante…..
GraciasGracias
BibliografíaBibliografía
www.agendia.comwww.agendia.com ASCO Educational Book ISSN ASCO Educational Book ISSN
15488748 43rd Annual Meeting June 15488748 43rd Annual Meeting June 1-5, 2007 Chicago.1-5, 2007 Chicago.
Molecular Biology of The Cell, Albert Molecular Biology of The Cell, Albert et al, Fourth edition. 2002. Garland et al, Fourth edition. 2002. Garland ScienceScience
Molecular and Cellular Biology. Molecular and Cellular Biology. Lodish et al. 5th Whfreeman. 2005.Lodish et al. 5th Whfreeman. 2005.
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