combinación con cromatografía de gases-detector
de ionización de la llama
Determination of mineral oils in olive oil by solid-
phase extraction combined with gas
chromatography-flame ionization detector
Curso académico 2018/2019
Fecha: Junio 2019
Dr. José Luis Martínez Vidal
Dr. Francisco Javier Arrebola Liébanas
Departamento de Química y Física
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante
extracción en fase
sólida en combinación con cromatografía de gases-detector de
ionización de la
llama
Memoria del Trabajo Fin de Grado en Química presentada por
María del Mar Rovira Cruz
Almería, 26 de junio de 2019
Fdo: María del Mar Rovira Cruz
Fdo: José Luis Martínez Vidal Fdo: Francisco Javier Arrebola
Liébanas
Agradecimientos
En primer lugar, agradecer a mi familia y amigos por el apoyo
durante todos estos años
y estos últimos meses durante la realización de este Trabajo Fin de
Grado.
Especial agradecimiento a Dr. Francisco Javier Arrebola y a José
Luis Hidalgo, por su
dedicación día a día, por el apoyo y la confianza depositada desde
el primer día. Y porque
a pesar de haber sido negativos muchos de los resultados, siempre
ha habido un clima
favorable que ha hecho que sigamos adelante con la
investigación.
Al Dr. José Luis Martin Vidal, por todos los conocimientos
aportados durante la
investigación ayudando a que este Trabajo Fin de Grado se hiciese
posible.
A todos los que forman parte del grupo de investigación de “Química
Analítica de
Contaminantes” por hacer que el laboratorio sea casi como una
segunda casa, haciendo
que este trabajo sea mucho más fácil.
MEMORIA
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
7
ÍNDICE
1.RESUMEN..........................................................................................................11
2.ABSTRACT
.........................................................................................................11
3.OBJETIVO
.........................................................................................................11
4.2 COMPUESTOS DE INTERÉS: MOSH Y MOAH
................................................. 14 4.2.1
Toxicidad
.................................................................................................................................
16 4.2.2 Fuentes de
contaminación......................................................................................................
17 4.2.3 Legislación
...............................................................................................................................
18
4.3 MÉTODO DE ANÁLISIS MOSH y MOAH
........................................................... 19
4.3.1 Extracción en fase sólida (SPE)
.............................................................................................
19 4.3.2 Determinación de MOSH Y MOAH: Cromatografía de gases
acoplada a detector de
ionización de llama (GC-FID)
........................................................................................................
21
4.4 VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS
...................................................... 26
5. MÉTODOS EXPERIMENTALES
......................................................................27
5.3 EXTRACCIÓN SPE Y SEPARACIÓN DE MOSH Y MOAH
................................ 30
5.4. DETERMINACIÓN DE MOSH Y MOAH POR GC-FID
..................................... 31
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
..........................................................................32
6.1 DESARROLLO DEL MÉTODO ANALITICO
...................................................... 32 6.1.1
Optimización de las condiciones cromatográficas para la
determinación de MOSH y
MOAH
..............................................................................................................................................
32 6.1.2 Optimización del método de extracción
...............................................................................
37
6.2 VALIDACIÓN DEL MÉTODO
..............................................................................
43
6.3 APLICACIÓN DEL MÉTODO
..............................................................................
44
7. CONCLUSIONES
..............................................................................................45
8. BIBLIOGRAFÍA
................................................................................................46
9.
ACRÓNIMOS.....................................................................................................48
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
8
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
9
Figura 2. Ejemplos de MOAH.
Figura 3. Etapas del proceso de SPE.
Figura 4. Tipos de envase de la fase estacionaria en SPE.
Figura 5. Esquema cromatógrafo de gases.
Figura 6. Esquema general de un inyector de GC.
Figura 7. Esquema de un inyector de tipo “splitless”.
Figura 8. Esquema de un inyector de grandes volúmenes.
Figura 9. Esquema FID.
Figura 10. Cromatogramas obtenidos para las distintas temperaturas
del inyector para el
mix de alcanos. La figura de arriba muestra el C16, la figura
central muestra el C26 y la
figura de abajo muestra el C38.
Figura 11. Cromatogramas obtenidos para las distintas temperaturas
del inyector para el
mix de patrones internos en aceite de oliva virgen extra.
Figura 12. Cromatogramas obtenidos para el estudio de la
temperatura de la rampa del
horno cromatografico para el mix de alcanos (azul, 15 ºC/in; rojo,
25 ºC/min; verde,
35 ºC/min; naranja, 50 ºC/min).
Figura 13. Cromatogramas obtenido para MOSH (cromatograma superior)
y MOAH
(cromatograma inferior) en aceite de oliva virgen extra.
Figura 14. Cromatogramas obtenidos para MOSH y MOAH,
respectivamente, en aceite
de girasol refinado.
Figura 15. Cromatogramas obtenidos para distintas cantidades de
muestra introducidas
en el cartucho y cantidad de muestra inyectada. Cromatograma
superior, C18 en el
análisis de MOSH; cromatograma central, colestano en el análisis de
MOSH;
cromatograma inferior, cromatograma completo en el análisis de
MOAH.
Figura 16. Cromatograma obtenido en el análisis de muestras
reales.
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
10
Tabla 1. Clasificación de los principales ácidos grasos
Tabla 2. Clasificación de los hidrocarburos de origen mineral en
función de su estructura
química
Tabla 3. Clasificación hidrocarburos altamente refinados de acuerdo
a los criterios
establecidos por la JECFA
Tabla 4. Análisis de distintos aceites usando un límite de
cuantificación del 0,5 mg/kg
Tabla 5. Compuestos presentes en el mix de patrones internos
Tabla 6. Compuestos presentes en el mix de PAH
Tabla 7. Comparación de la sensibilidad para las técnicas de
inyección splitless y LVI
Tabla 8. Sensibilidad del método en función de la temperatura del
detector FID
Tabla 9. Perfil de elución de colestano y TBB en columnas de 3,4,5
y 6 g de sílica
argentada al 1%. Área de pico cromatográfico (mV/s)
Tabla 10. Veracidad (R%) y precisión expresada como intradía e
interdía del método
analítico para MOSH
Tabla 11. Veracidad (R%) y precisión expresada como intradía e
interdía del método
analítico para MOAH
Tabla 12. Resultados obtenidos para MOSH y MOAH totales en muestras
de aceite de
oliva virgen extra reales
Tabla 13. Resultados obtenidos en el análisis intercomparativo de
MOSH en diferentes
tipos de muestras de aceite de oliva
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
11
1.RESUMEN
En el presente trabajo fin de grado se ha desarrollado y validado
un método de análisis
para la determinación de las fracciones de hidrocarburos saturados
(MOSH, Mineral Oil
Saturated Hydrocarbons) y aromáticos (MOAH, Mineral Oil Aromatic
Hydrocarbons)
de aceites minerales (MOH, Mineral Oil Hydrocarbons) que puedan
estar presentes como
contaminantes en aceite de oliva. Para su separación de la matriz
de la muestra se ha
utilizado extracción en fase sólida (SPE, Solid Phase Extraction) y
se han determinado
mediante cromatografía de gases con detector de ionización de la
llama (GC-FID, Gas
Chromatography - Flame Ionization Detector). El método ha sido
validado con valores
de recuperación promedio del 95,6% para MOSH y del 87,0% para MOAH.
El método
ha sido aplicado al análisis de muestras reales.
Palabras clave: MOSH, MOAH, aceite de oliva, SPE, GC/FID
2.ABSTRACT
In this final project an analytical method has been devoloped and
validated for
determining the fraction of saturated hydrocarbons (MOSH, Mineral
Oil Saturated
Hydrocarbons) and aromatic hydrocarbons (MOAH, Mineral Oil
Aromatic
Hydrocarbons) in mineral oils (MOH, Mineral Oil Hydrocarbons) that
could be present
as contaminants in olive oil. For its separation it has been
applied Solid Phase Extraction
(SPE) and they have been determined using Gas Cromatography with
Flame Ionization
Detector (GC-FID). The method has been validated with average
values of recovery of
95,6% for MOSH and values of recovery of 87,0% for MOAH. The method
has been
applied to the analysis of real samples.
Keywords: MOSH, MOAH, olive oil, SPE, GC/FID
3.OBJETIVO
El principal objetivo de este Trabajo Fin de Grado es el desarrollo
de una metodología
analítica para la determinación de aceites minerales en aceites de
oliva utilizando la
técnica analítica de cromatografía de gases para el análisis de
compuestos orgánicos.
Dado que los aceites minerales se pueden subclasificar atendiendo a
si son saturados o
aromáticos y deben ser determinados separadamente, la metodología
analítica que se
desarrolle debe ser capaz de separar y purificar dichos compuestos
de la matriz objeto de
estudio y diferenciarlos entre si. Por ello, se ha incluido en los
objetivos de este trabajo
la aplicación de los conocimientos adquiridos en extracción en fase
sólida y mejorar las
habilidades en purificación y separación en muestras
complejas.
A fin de conseguir el objetivo principal planteado, se pretende
también llevar a cabo las
siguientes actividades:
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
12
• Optimizar las variables del método instrumental para la
determinación mediante GC-
FID y con ello mejorar mis competencias en uso de técnicas
instrumentales
cromatográficas.
• Optimizar un método de extracción llevado a cabo mediante SPE que
fuera capaz de
separar y purificar en fracciones diferentes los MOSH y MOAH y con
ello mejorar mis
competencias en el tratamiento de muestras complejas como son los
aceites, los procesos
de extracción y si fuera necesario de purificación y
concentración.
• Validación del método mediante el cálculo de parámetro analíticos
como son la
veracidad (expresada como recuperación), precisión y límites de
cuantificación y con ello
mejorar mis competencias en cualimetría en Química Analítica.
• Aplicación del método al análisis de muestras reales y verificar
la aplicabilidad del
método analítico que se desarrolle.
4. INTRODUCCIÓN
4.1 ACEITES
El aceite es la fuente de grasa vegetal más saludable a la que
podemos acceder. Aunque
hoy en día el término grasa reciba a veces una connotación negativa
en la sociedad,
llegando incluso a plantearse hace unos años que no cumplía ninguna
función en el
organismo. La grasa es imprescindible para la vida, ya que ayuda a
satisfacer las
demandas de energía. Si bien se pueden clasificar desde diversos
puntos de vista, con
frecuencia se considera que existen dos tipos de grasas, la grasa
de origen vegetal y la
grasa de origen animal, siendo la de origen vegetal aquella más
saludable para el
organismo. El exceso de este nutriente puede desencadenar problemas
energéticos que
favorezcan la aparición de sobrepeso y otros problemas tales como
diversas enfermedades
cardiovasculares.
La longitud de la cadena de los ácidos grasos, junto al grado de
insaturación (número de
dobles enlaces presentes en la molécula), determinan las
propiedades físico-químicas y
los efectos metabólicos de las grasas. En función del número de
insaturaciones, existen
tres clases básicas de ácidos grasos, saturados, monoinsaturados y
poliinsaturados sobre
los que se informa en la Tabla 1.1
Tabla 1. Clasificación de los principales ácidos grasos.
Familias Ácido graso principal Fuentes
Saturados
vegetal, como coco…
aceite de oliva.
n-3 Eicosapentaenoico, EPA.
marinos
-C indica número de átomos de Carbono y n la localización del
primer doble enlace a
partir del grupo metilo-terminal.
* Número de insaturaciones en la molécula
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
13
Los aceites minerales son productos obtenidos de la destilación del
petróleo y están
formados mayormente por hidrocarburos.2 Existe gran cantidad de
usos de estos, como
aditivos alimentarios, en medicina, etc. Los hidrocarburos pueden
formarse de manera
natural por la acción de bacterias, hongos… pero también pueden
aparecer en el
procesado de algunos alimentos, como ocurre en el refinado de
aceites. El resultado es
que los alimentos que ingerimos diariamente pueden contener
hidrocarburos de este tipo
porque contengan algunos de ellos de manera natural o que su
presencia se deba a
aditivos, ya sea de manera indirecta, debido a contaminación
ambiental, o durante el
proceso de manipulación del alimento.
Los aceites minerales se encuentran formados en su mayoría por
hidrocarburos. Existen
tres tipos principales de hidrocarburos en aceites minerales. Tabla
2.
Tabla 2. Clasificación de los hidrocarburos de origen mineral en
función de su estructura
química.
Naftaleno,antraceno…
Algunos tipos de aceites comestible, antes de ser ofrecidos al
consumidor, sufren un
proceso conocido como refinado. El refinado del aceite de oliva
consiste en la
eliminación mediante procesos químicos y físicos de los olores y
sabores desagradables
de un aceite de oliva virgen de baja calidad, así como de la
rectificación de la acidez.3
4.1.1 Tipos de aceites
El aceite de oliva es un producto muy versátil, es por ello que
existen distintos tipos de
aceites de oliva dependiendo de los procesos que se llevan a cabo
una vez es obtenido a
partir del fruto del olivo.
A. Aceites de oliva vírgenes.
Aceites obtenidos a partir del fruto del olivo por procedimiento
mecánicos o
físicos, que no alteren al aceite, y sin sufrir tratamiento alguno
distinto del lavado,
decantación, centrifugado. Se excluye así a los aceites obtenidos
mediante
disolvente, o por procedimiento de reesterificación y de cualquier
mezcla con
aceites de otra naturaleza. Podemos clasificarlos en:
• Aceite de oliva virgen extra: aceite de oliva virgen con una
acidez libre,
expresa en ácido oleico, como máximo de 0,8 g/100 g.
• Aceite de oliva virgen: aceite de oliva virgen con una acidez
libre, expresa en
ácido oleico, como máximo 2 g/100 g.
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
14
• Aceite de oliva lampante: aceite de oliva virgen con una acidez
libre, expresa
en ácido oleico, superior a 2 g/100 g.
B. Aceite de oliva refinado
Aceite de oliva obtenido mediante el refinado de aceites de oliva
vírgenes, cuya
acidez libre, expresada en ácido oleico, no es superior al 0,3
g/100 g.
C. Aceite de oliva
Aceite de oliva formado por una mezcla de aceite de oliva refinado
y de aceites
de oliva vírgenes distintos del aceite lampante, cuya acidez libre,
expresa en ácido
oleico, no será superior a 1 g/100 g.
D. Aceite de orujo de oliva crudo
Aceite obtenido a partir del orujo de oliva mediante tratamiento
con disolvente o
por medios físicos, pudiendo coincidir con un aceite de oliva
lampante a
excepción de algunas características determinadas.
E. Aceite de orujo de oliva refinado
Aceite obtenido mediante refinado de aceite de orujo de oliva
crudo, cuya acidez
libre, expresada en acido oleico, no puede ser superior a 0,3 g/100
g.
F. Aceite de orujo de oliva
Aceite formado por una mezcla de aceite de orujo de oliva refinado
y de aceites
de oliva vírgenes distintos al lampante, cuya acidez libre,
expresada en ácido
oleico, no puede ser superior a 1 g/100 g.4
4.2 COMPUESTOS DE INTERÉS: MOSH Y MOAH
Los MOH forman un grupo amplio de compuestos y normalmente suelen
estar presentes
en forma de una mezcla de muchos hidrocarburos con diferentes
estructuras y tamaños
distintos. Son derivados principalmente del petróleo crudo pero
también pueden ser
sintetizados a partir de carbón, gas natural y biomasa. La
composición química de la
mayoría es desconocida. Es por ello que no se clasifican en función
de su identidad
química sino de sus propiedades físico-químicas. Esto da como
resultado productos de
composición muy distinta, pero con propiedades técnicas similares.5
En 1995, la JECFA
(Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives) clasificó los
MOH de alto
refinado en los aceites minerales de alta viscosidad y los
diferenció en tres clases: media
viscosidad, baja viscosidad y ceras. Esta clasificación se basa en
su masa molecular
media, viscosidad y número de carbonos al 5% de su punto de
destilación. En la Tabla 3
se muestra dicha clasificación en función a sus principales
propiedades:
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
15
Tabla 3. Clasificación de hidrocarburos altamente refinados de
acuerdo a los criterios
establecidos por la JECFA.6
Ceras ≥500 ≥11 ≥25
Los MOH aparecen en los alimentos como consecuencia de la
contaminación ambiental
o bien por la contaminación con lubricantes de maquinaria empleada
durante la
recolección, molturado o empaquetamiento.
Las Figuras 1 y 2 muestran algunos de los diferentes MOSH y MOAH
que se pueden
encontrar en una muestra de aceite de oliva como
contaminantes.
Como antes se ha expresado, los MOSH comprenden los hidrocarburos
de cadena abierta,
parafinas, hidrocarburos cíclicos y naftenos. Las parafinas se
distinguen de los naftenos
en que se pueden agrupar en n-alcanos lineales, aquellos con más de
20 átomos de
carbonos se encuentran formando ceras, y los hidrocarburos
ramificados, que pueden ser
líquidos. En cambio, los naftenos, contienen al menos un anillo
saturado, son altamente
alquilados y se originan a partir de aceite mineral o a partir de
la hidrogenación de
compuestos aromáticos.7
Los MOSH se acumulan en tejidos, nódulos linfáticos, bazo e incluso
pueden generar
micro granulomas.8 Su modo de acumularse se debe a su estructura y
masa molecular.
Figura 1. Distintos tipos de MOSH.
Los MOAH son compuestos aromáticos, contienen al menos un anillo
aromático,
incluyendo los compuestos poliaromáticos, pero hay que
diferenciarlos de los
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
16
hidrocarburos policíclicos aromáticos (PAH, Polycyclic Aromatic
Hydrocarbons), siendo
el más conocido el benzo(a)pireno, los cuales se forman a elevadas
temperaturas. Entre
las diferencias que se pueden establecer entre ellos, los PAH
suelen estar solamente
alquilados ligeramente mientras que, los MOAH están alquilados casi
el 100% de ellos.5
Consisten en un amplio número de compuestos y generan amplias
señales
cromatograficas, tantas que casi ninguna de sus señales
cromatográficas pueden ser
separadas correctamente formando una montaña compleja en los
cromatogramas.7
Además estos compuestos presentan un elevado riesgo ya que pueden
incluir compuestos
policíclicos cancerígenos y mutágenos.6 En las preparaciones
técnicas de MOH, el
contenido de MOAH suele ser minoritario.5
Figura 2. Ejemplos de MOAH.
4.2.1 Toxicidad
La EFSA, Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria, avisa del
potencial riesgo de los
MOAH5 y que por ello no deben estar presentes en los alimentos. Se
ha comprobado que
una presencia elevada de MOSH influye en la aparición de MOAH, por
lo que también
conviene limitarlos.
Los aceites minerales están compuestos de forma general por un
75-85% de MOSH y un
15-25% de MOAH. En el caso de los aceites minerales para uso
alimentario el contenido
de MOAH desciende por debajo de 3%.
La toxicidad del aceite mineral depende de la distribución de peso
molecular de los
hidrocarburos y de la presencia de MOAH, que representa la fracción
más tóxica. De
hecho, los aceites minerales obtenidos a partir de derivados del
petróleo, como son por
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
17
ejemplo los aceites de motor o aceites hidráulicos, presentan mayor
probabilidad de
contener MOAH y por ello son clasificados como cancerígenos para
los humanos. En
2012, la EFSA expresó que los MOSH pueden acumularse en tejidos y
formar micro
granulomas y que los MOAH pueden ser mutagenicos y cancerígenos,
provocando una
preocupación respecto a la cantidad máxima de ingesta de estos.
Dado que no se puede
definir una dosis segura para compuestos genéticamente tóxicos no
hay valores
establecidos para su tolerabilidad. Se estimó la exposición de MOSH
en el rango de 0,03
a 0,3 mg/kg al día, lo que significa que un adulto de 60 kg puede
estar expuesto a 18 mg
de MOSH por día, 6,6 g al año,9 si bien, el estudio de MOAH es
mucho más amplio
respecto a su toxicidad. En relación a los PAH, componentes
habituales de los MOAH,
su estructura química y el tamaño de las partículas sobre las que
se adsorben, determinan
el proceso de adsorción pulmonar. Estos compuestos incrementan su
toxicidad durante el
metabolismo a través de las heces y orina, proceso que se ha
relacionado con la aparición
de cáncer de colon.10
4.2.2 Fuentes de contaminación
Estos hidrocarburos, MOSH y MOAH, pueden estar presentes en los
alimentos a través
de diversas fuentes, ya sea por el uso intencionado de aditivos
alimentarios, o por
contaminación ambiental.
En concreto, las posibles fuentes de contaminación de aceites
minerales son:
• Materiales en contacto con alimentos: papel y cartón reciclados,
tintas de
impresión offset aplicadas al papel y cartón para envases de
alimentos, en aceites
minerales utilizados como aditivos en la fabricación de plásticos
en contacto con
alimentos.
ambientales producidas por aceite lubricante de los motores sin
catalizador
(principalmente diésel), aceite combustible sin quemar, los
residuos de
neumáticos y asfalto de la carretera.
• Contaminantes derivados del uso de aceites minerales en
maquinaria de cosecha:
gasóleo, aceite lubricante o aceites lubricantes para bombas.
• Los aditivos alimentarios, auxiliares tecnológicos y otros usos:
como agentes de
liberación para productos de panadería y productos del azúcar,
aceites para
tratamiento de alimentos, como el arroz, aceites minerales en
alimentación
animal.
Dependiendo de la fuente de contaminación, los hidrocarburos de los
aceites minerales,
MOH, pueden contener básicamente MOSH, como por ejemplo los MOH de
grado
alimentario (aceites blancos, que han sido tratados y que
prácticamente están libres de
MOAH), o pueden contener entre un 10-35% de MOAH, como es el caso
de los
lubricantes.
En los alimentos estudiados, las concentraciones medias más altas
de MOSH se
detectaron en la categoría “Pan y panecillos” (261 mg/kg) y
“cereales para consumo
humano” (principalmente representado por el arroz, 131 mg/kg). La
fracción de MOAH
solo se pudo determinar en unas pocas muestras.2
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
18
Asimismo se ha descrito la presencia natural baja de estas
sustancias en los aceites de
oliva vírgenes.11 En cambio, en aceites con mas de un refinado y en
los de orujo dicha
presencia puede ser apreciablemente mayor. En determinadas
ocasiones, la presencia
endógena de estos hidrocarburos puede llevarse a la propia aceituna
que se crezca de
manera contaminada o en hojas, siempre en concentraciones muy
bajas.
El contenido de PAH en las aceitunas depende de la contaminación
ambiental. Éstos
compuestos se depositan en la piel del fruto y se transfieren al
aceite durante la extracción
del mismo. La mayor fuente de contaminación ambiental de PAH en los
aceites de oliva
virgen procede de la exposición de las aceitunas a los escapes de
motores, por lo que se
prefiere modos de recolección y almacenamiento de aceituna
manuales.13
4.2.3 Legislación
En 2012, la Comisión Técnica de Contaminantes de la Cadena
Alimentaria (Contam) de
la EFSA llegó a la conclusión de que los posibles efectos sobre la
salud humana de los
grupos de sustancias de este tipo podían variar considerablemente.
Los MOAH, actuando
como agentes cancerígenos, mientras que, los MOSH pudiendo provocar
efectos nocivos
en el hígado.
Para garantizar la fiabilidad de los datos analíticos obtenidos,
antes de elaborar resultados
analíticos los Estados miembros deben garantizar la disponibilidad
de equipos de análisis
adecuados, métodos de análisis y adquirir la experiencia suficiente
en análisis de MOH,
tanto en alimento como en materiales en contacto con dichos
alimentos. La vigilancia
debe abarcar las grasas animales, pan, productos de panadería fina,
cereales para el
consumo humano, helados, pastas, aceites y muestras en contacto con
los alimentos
usados.14,15
Respecto a los límites legislados para los MOSH y MOAH de momento
no hay
legislación en la Unión Europea. Es por ello, que en la mayoría de
laboratorios de análisis
de MOH, es suficiente con analizar el aceite y asegurar una
contaminación menor de 50
mg/kg de MOH en la muestra.
En enero de 2017, la Comisión Europea adoptó una recomendación
según la cual los
Estados miembros debían controlar la presencia de MOH en los
alimentos y materiales
contaminados, Recomendación (UE) 2017/84 de la CE de 16 de enero
2017 sobre la
vigilancia de hidrocarburos de aceites minerales en alimentos y
objetos destinados a
entrar en contacto con alimentos. Fue en Alemania, en marzo de
2017, donde se llevó a
cabo la elaboración de una “Regulación nacional de aceite mineral”,
con la intención de
limitar la concentración de MOSH y MOAH en materiales en contacto
con alimentos. En
consecuencia no podrían comercializarse si superan un nivel máximo
de 24 mg/kg de
MOSH y 6 mg/kg de MOAH. Debido a las características de los MOAH,
la intención y
así lo demandan ya determinados países, es que el nivel máximo
contenido en alimentos
sea de 0,5 mg/kg.
Los mercados alemanes, los cuales solicitan frecuentemente
cuantificar a niveles de 0,5
mg/kg, ofertan técnicas acreditadas según la ISO 17025 por DAkkS
(Die Deutsche
Akkreditierungsstelle GmbH) la entidad alemana de acreditación
equivalente a la
española ENAC. En determinados laboratorios, se ha llevado a cabo
un estudio usando
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
19
como límite de cuantificación 0,5 mg/kg, obteniéndose los
siguientes resultados. Tabla
4.12
Tabla 4. Análisis de distintos aceites usando un límite de
cuantificación del 0,5 mg/kg.
Contenido en
*AOV, Aceite de Oliva Virgen.
Si el valor de cuantificación máximo finalmente establecido fuese
de 0,5 mg/kg resultaría
un problema para el sector del aceite, ya que la gran mayoría de
éstos presentan
contaminaciones de MOSH y MOAH por encima de este valor. Es por
ello, que hay que
realizar estudios sobre las fuentes de contaminación, medidas
necesarias para rebajar la
presencia de estas sustancias y establecer unos valores de
referencia.
4.3 MÉTODO DE ANÁLISIS MOSH y MOAH
La complejidad de estos compuestos hace imposible separarlos en
elementos individuales
y analizarlos, incluso cromatográficamente donde suelen producir
montañas
cromatográficas inseparables conformadas por los diferentes
hidrocarburos. El método
llevado a cabo consiste en medir la concentración de las fracciones
correspondientes a
hidrocarburos saturados y aromáticos, por separado. Por ello, la
determinación de MOSH
y MOAH se suele dar en resultados divididos en fracciones según el
número de átomos
de carbono del hidrocarburo. Esta división podría detectar la
fuente de contaminación que
tiene el producto. Las divisiones que se llevan a cabo son:
C16-C20, C20-C25, C25-C35,
C35-40 y C40-50. En los procesos de purificación previa normalmente
requeridos,
típicamente mediante sorbentes sólidos usados on-line u off-line
con GC, es el compuesto
colestano el marcador de inicio de los MOSH y el TBB
(1,3,5-tri-tert-butilbenceno) el
marcador del comienzo de los MOAH.
4.3.1 Extracción en fase sólida (SPE)
A mediados de los anos 70 se introduce un método alternativo de
extracción, llamado
extracción en fase sólida (SPE, Solid Phase Extraction) que es un
proceso cromatográfico
de líquidos desarrollado a baja o media presión y que consiste en
un dispositivo en forma
de jeringa en el cual se introduce un material sorbente (fase
estacionaria) que cumple la
función de retener una sustancia que esta contenida en un
disolvente determinado (fase
móvil). Por ello, la SPE comprende la interacción de tres
componentes descritos: el
material sorbente, el analito y el disolvente.16 A pesar de que sus
primeras aplicaciones
se llevaron a cabo hace unos cincuenta años, es en los últimos
tiempos cuando se está
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
20
llevando a cabo su desarrollo más notable, usándose como un enfoque
alternativo a la
extracción líquido-líquido (LLE, Liquid-Liquid Extraction). Además,
aunque su principal
objetivo ha sido para llevar a cabo la pre-concentración de
microcontaminantes
orgánicos, numerosos estudios han demostrado el gran potencial de
esta técnica para
estudios de especiación.16
El principio de la SPE es similar al de LLE, el cual implica una
división de solutos entre
dos fases líquidas inmiscibles. Sin embargo, la SPE implica la
separación entre una fase
líquida (o matriz de la muestra solvente con los analitos) y una
fase sólida o fase
estacionaria (material adsorbente). Se trata de una técnica que
evita el uso de grandes
cantidades de disolventes orgánicos en los pasos de pre-
concentración y extracción.
La SPE en fase normal hace referencia a un sistema en el cual el
material sorbente es más
polar que la fase móvil o la solución de la muestra. La SPE en fase
reversa se refiere a un
sistema en el cual el material sorbente es menos polar que la fase
móvil o la solución de
la muestra.17
El método de SPE consiste de tres a cuatro pasos consecutivos que
se esquematizan en la
Figura 3.
Figura 3. Etapas del proceso SPE.16
El primer paso, consiste en el acondicionamiento del sorbente
sólido usando un disolvente
apropiado seguidamente del disolvente que se va a usar con la
muestra. Este paso es
crucial, ya que permite la humectación del material de empaque,
elimina las posibles
impurezas y el aire presente en la columna. La naturaleza del
disolvente acondicionador
depende de la naturaleza del sorbente sólido.
El segundo paso, es el paso de la muestra a través de la fase
estacionaria, sorbente sólido,
produciéndose la concentración de éstos. La muestra puede ser
añadida por gravedad,
bombeo, aspirado por vacío o mediante sistemas automatizados. La
velocidad de flujo de
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
21
la muestra debe ser baja para permitir así la retención de los
analitos, pero no demasiado
baja para evitar una duración excesiva del proceso.
El tercer paso, opcional, consiste en el lavado de la fase
estacionaria con el disolvente de
la muestra para eliminar los componentes de la matriz que han sido
retenidos por el
sorbente sólido, sin desplazar a los analitos. En matrices acuosas,
es aconsejable una etapa
de secado, eliminando así un exceso de agua en el extracto
final.
El paso final consiste en la elución de los analitos de interés con
disolvente apropiado. El
volumen de disolvente se optimiza para que la recuperación
cuantitativa de los analitos
se logre con una dilución baja.16
Existen distintas formas de envasar la fase estacionaria, como son
microcolumnas,
cartuchos, barras de jeringa y discos. Figura 4.
Figura 4. Tipos de envases de la fase estacionaria.16
4.3.2 Determinación de MOSH Y MOAH: Cromatografía de gases acoplada
a
detector de ionización de llama (GC-FID)
La cromatografía de gases (GC, Gas Chromatography) es una técnica
muy extendida en
los laboratorios avanzados de análisis químico, cuyas primeras
aplicaciones se remontan
a principios de los años 40. En su comienzo, sus aplicaciones iban
dirigidas al control de
fracciones de petróleo, pero desde entonces, su desarrollo no ha
parado siendo hoy en día
una técnica con gran sensibilidad y una gran polivalencia.18
La GC esta basada en la separación de moléculas que presentan
diferencias en su
estructura química y por tanto en sus propiedades físico-químicas.
En este sentido, los
métodos de GC son muy eficaces cuando se aplican a muestras
orgánicas complejas, a
organometalicos y a sistemas bioquímicos formados por especies
volátiles o por especies
que pueden someterse a un proceso para producir sustancias
volátiles. Desde el punto de
vista cualitativo, la GC es una técnica más limitada que la mayoría
de los métodos
espectroscópicos. Por eso, una tendencia importante en este campo
ha sido combinar las
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
22
notables cualidades para la separación que tiene la GC con las
mejores propiedades de
identificación que poseen instrumentos como los espectrómetros de
masas, de infrarrojo
y de resonancia magnética nuclear.19
Las técnicas cromatográficas pueden dividirse en diferentes
categorías según las
características de la fase móvil y estacionaria. Entre sus
principales características
encontramos que la separación se realiza en columna, se trabaja por
elución, es capaz de
separar mezclas complejos o incluso solutos muy parecidos, es
rápida y con una cantidad
pequeña de muestra es capaz de proporcionar información cualitativa
y cuantitativa. Las
sustancias se separan por distribución entre una fase estacionaria,
puede ser sólida o
líquida, y la fase móvil, cuya principal función es transportar los
solutos. En GC esta fase
móvil es un gas inerte, comúnmente He, N2 o H2, la elección de uno
u otro dependerá de
la fase estacionaria y las características del detector que se
usará. En la Figura 5 se
muestra un esquema general de un cromatógrafo de gases:
Figura 5. Esquema general de un cromatógrafo de gases.20
Al cromatógrafo de gases se le pueden acoplar distintos sistemas de
detección, entre ellos
podemos mencionar el espectrómetro de masas, detector de ionización
de llama, etc. En
el presente estudio para la determinación de MOSH y MOAH, el
cromatógrafo de gases
empleado se encuentra equipado con un detector FID ya que la
espectrometría de masas
no suele ofrecer resultados adecuados cuantitativamente para este
tipo de aplicaciones,13
el cual se explica a continuación.
Existen distintos sistemas de introducción de la muestra en el
cromatógrafo. Todos los
dispositivos de inyección presentan la misma finalidad, vaporizar
la muestra e
introducirla en la corriente de gas portados que se dirige hacia la
columna. La evaporación
e introducción de las muestra en el sistema, se debe realizar
siguiendo una serie de
requisitos:
-La evaporación de la muestra debe ser lo más rápida posible.
-La evaporación debe realizarse sin discriminar ningún componente
de la muestra.
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
23
-La muestra debe llegar a la columna como una banda, lo más fina
posible.
Un inyector está formado por un bloque metálico, un conductor del
calor provisto de un
sistema de calentamiento, un termostato capaz de mantener su
temperatura constante y
aislamiento térmico adecuado. En la Figura 6 puede verse un esquema
general de un
inyector de GC.
Figura 6. Esquema general de un inyector de GC.20
En el inyector, el gas portador pasa de forma continua por el
sistema La muestra es
inyectada en el interior de la cámara por medio de una micro
jeringa a través de un septum
con capacidad de auto sellado en el momento que se retira la aguja.
Una vez inyectada la
muestra, ésta es capaz de evaporarse de manera casi instantánea
mezclándose con el gas
portador en la camara de mezcla, también llamado “liner”. Cuando se
evapora, es
arrastrada rápidamente por la corriente de gas portador en
dirección a la columna.
El sistema de inyección de un cromatógrafo juega un papel muy
importante. La
utilización de una técnica de inyección inadecuada puede llevar a
perder completamente
la capacidad de separación de una columna. Por ello, existen
distintos tipos de sistema de
inyección en función de la cantidad de volumen a inyectar, la
manera de inyección
(fraccionada o directa) y el tipo de columna que se va a usar
posteriormente.
Entre ellos podemos destacar el sistema de inyección “splitless” e
inyección de grandes
volúmenes (LVI, Large Volume Injection).
En la técnica de inyección ‘splitless’ la mayoría de la muestra
inyectada se dirige a la
columna, la cual se mantiene durante toda la inyección a una
temperatura inferior al punto
de ebullición del componente más volátil de la muestra. La
totalidad de la muestra
inyectada se acumula en la cabeza de la columna, actuando el
disolvente concentrado en
la columna a modo de trampa donde se concentran los componentes a
analizar.
Seguidamente, se abre el una válvula de purga con el fin de
eliminar a la atmosfera el
disolvente vaporizado que pudiera quedar en el inyector. La
utilización de la modalidad
‘splitless’ supone una ventaja ya que al no haber división de la
muestra, permite un
aumento notable de la sensibilidad con respecto a otras técnicas
que solo introducen en
la columna cromatográfica una pequeña fracción de la muestra
(split). Por otra parte, la
reconcentración de la muestra en la cabeza de la columna origina
pérdidas de eficacia
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
24
debidas a una inyección inadecuada.20 En la Figura 7 se observa un
esquema de un
inyector de GC operando en modo ‘splitless’.
Figura 7. Esquema de un inyector de tipo splitless.20
Por otro lado, la técnica de LVI es usada para el análisis de
componentes de la muestra
que han de ser determinados en niveles de concentración muy bajos.
La inyección de una
mayor cantidad de muestra incrementa la sensibilidad y reduce,
incluso puede llegar a
eliminar, las etapas previas necesarias para la concentración de la
muestra. En la Figura
8 se muestra el esquema general de un inyector empleado para
LVI:
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
25
Figura 8. Esquema de un inyector de grandes volúmenes.21
La cromatografía de gases acoplada a detector de ionización de
llama, GC-FID, es una
técnica analítica muy común cuyo uso está muy extendido en los
mercados
petroquímicos, farmacéuticos y de gas natural.
El FID es uno de los detectores más extensamente utilizado, y por
lo general, uno de los
más aplicables en GC. En un quemador el efluente de la columna se
mezcla con H2 y aire
para luego encenderse eléctricamente. La mayoría de los compuestos
orgánicos, cuando
se pirolizan a la temperatura de la llama producen iones y
electrones que pueden conducir
la electricidad a través de la llama.
El FID es además extremadamente sensible a las impurezas de
hidrocarburo del
suministro de hidrógeno y aire de la llama. Estas impurezas pueden
aumentar el ruido de
línea base y reducir la sensibilidad del detector. De ahí que sea
común la calibración
rutinaria del analizador mediante el uso de una mezcla de
calibración.20 La Figura 9
muestra un esquema de un detector FID:
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
26
Figura 9. Esquema FID.22
Su alta sensibilidad, la respuesta uniforme a los hidrocarburos y
el amplio rango lineal
han hecho del detector FID uno de los más usado en GC,
especialmente en el análisis de
aceites. El detector FID responde al número de átomos de carbono
que entra en él por
unidad de tiempo, por ello, es un detector sensible a la masa y no
a la concentración.
Grupos funcionales como carbonilo, alcohol o halógenos originan en
la llama pocos iones
o prácticamente ninguno. Además, este detector es insensible a los
gases no combustibles
como H2O, CO2, etc. Esto hace del FID uno de los detectores más
usados para el análisis
de la mayoría de los compuestos orgánicos. Sin embargo, para
determinar la respuesta
del FID con exactitud, se precisa de un enfoque integral de manera
que se pueda
desarrollar un sistema aplicable para predecir la respuesta. Hoy en
día se precisa de
instrumentación capaz de realizar mediciones de respuestas
altamente precisas para la
gran variedad de sustancia. Además, las predicciones de respuesta
podrían automatizarse
en sistemas de datos computerizados para facilitar en gran medida
el análisis de mezclas
orgánicas complejas y reducir así el requisito de analizar grandes
cantidades de estándar
auténticos.23
El detector FID posee una elevada sensibilidad de (10-13 g/s), un
gran intervalo de
respuesta lineal (107), un bajo ruido además de ser resistente y
fácil de utilizar. Este
detector ha sido utilizado para la determinación de contaminantes
emergentes como
productos de cuidado personal, compuestos orgánicos como son los
hidrocarburos,
plaguicidas, antidepresivos…24
4.4 VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS
La validación de un método analítico es un paso fundamental a la
hora de su desarrollo,
ya que hay que asegurar que los resultados obtenidos son correctos.
Por ello, es necesario
minimizar errores, conseguir resultados reproducibles y fiables,
además de evitar falsos
positivos o falsos negativos. Para poder validar un método es
necesario conocer si existe
una normativa en torno al método que queremos validar, por ejemplo,
un valor
paramétrico establecido para los analitos y la matriz objeto del
estudio analítico. La
validación puede llevarse a cabo por un único laboratorio o por un
conjunto de éstos.
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
27
Existen distintos organismos internacionales con programas de
validación como la Guía
Sante,25 la Guía de la Red Europea Eurachem26 y la Guía ISO
1702527. Los principales
parámetro para llevara a cabo la validación de un método son:
Precisión: Grado de concordancia entre un grupo de resultados
obtenidos al aplicar
repetitivamente el mismo método analítico a alícuotas distintas de
la misma muestra. La
precisión de un método se expresa en términos de desviación
estándar.
Selectividad/Especificidad: La especificidad es el método que da
una respuesta para un
único analito, mientras que, la selectividad hace referencia al
método que proporciona
resultados para un número de analitos pero con respuestas
diferencias entre sí.
Veracidad/Recuperaciones: Grado de concordancia entre el valor
medio y el valor
verdadero. La veracidad del método analítico se expresa en términos
de error o
recuperaciones en el caso de que se produzcan pérdidas del analito.
La recuperación
obtenida dependerá de la matriz de la muestra, tratamiento de la
muestra y concentración
del analito.
Linealidad y curva de calibración: Es la capacidad de un método de
proporcionar
resultados, señales analíticas, que son directamente proporcionales
a la concentración de
analito. La linealidad puede evaluarse de manera gráfica,
observando la gráfica en la cual
se representan las señales en función de la concentración de
analito, o matemática.
Rango: El rango es el intervalo entre la mayor y la menor
concentración que pueden ser
determinadas con precisión, exactitud y linealidad.
LOD (Límite de detección): Concentración más baja de analito en una
muestra que se
puede detectar pero no necesariamente cuantificar.
LOQ (Límite de cuantificación): Concentración más baja de analito
en una muestra que
puede cuantificarse con una adecuada precisión y exactitud.
34
5. MÉTODOS EXPERIMENTALES
5.1.1 Reactivos
• Tolueno suministrado por Panreac (Barcelona, ESPAÑA)
• Sílica argentada (99,8%) suministrada por Sigma-Aldrich (St.
Louis, MO, EEUU)
• Nitrato de plata (99%) suministrada por Sigma- Aldrich (St.
Louis, MO, EEUU)
• Diclorometano sumistrado por Sigma-Aldrich (St. Louis, MO,
EEUU)
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
28
• Mix de patrones internos empleados típicamente en el análisis de
MOSH y MOAH.
Este mix es una mezcla comercial suministrada por Restek
(Bellefonte, PA, EEUU) y que
contiene un conjunto de 9 patrones internos de hidrocarburos
alifáticos y aromáticos que
se indican en la Tabla 5. Los patrones se encontraban en
concentraciones que están
indicadas en dicha tabla.
Tabla 5 – Compuestos presentes en el mix de patrones
internos.
Sustancia Formula
n-tridecano C13 n-C13 150,7 g/mL
Biciclohexil C12H22 Cycy 300,6 g/mL
Colestano C27H48 Cho 600 g/mL
1-
metilnaftaleno
2-
metilnaftaleno
1,3,5-tri-tert-
butilbenceno
n-
pentilbenceno
C11H16 5B 301,1 g/mL
No existen patrones comerciales de MOSH y MOAH.28 Por ello, para
optimizar y validar
la metodología analítica que en el presente trabajo se propone, se
emplearon como
patrones analíticos los siguientes:
• Mix de alcanos lineales de C7-C40 (1000 μg/mL de cada uno de los
compuestos, n-
Hexano,1 mL/ampolla) suministrado por Sigma-Aldrich (St. Louis, MO,
EEUU). Se
empleó para validar el método de análisis de MOSH.
• C18 (99%) suministrado por Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EEUU).
Se empleó como
patrón interno de cuantificación de MOSH.
• Mix de hidrocarburos aromáticos policíclicos (2000 μg/mL de cada
uno de los
compuestos, Cloruro de metileno, 1 mL/ampolla) suministrado por
Sigma-Aldrich (St.
Louis, MO, EEUU). Se empleó para validar el método de análisis de
MOAH.
Este mix esta formado por 17 hidrocarburos aromáticos policíclicos.
En la Tabla 6
aparecen ordenados según su orden de elución y se indican sus
concentraciones.
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
29
Analito Pureza cromatografica
Dibenz(a,h)antraceno 99,6 2092,0
Benzo(g,h,i)perileno 99,3 2094,4
• Helio calidad 3x, aire comprimido puro sintético calidad 3x e
hidrógeno puro calidad
3x de Praxair (Madrid, ESPAÑA).
5.1.2 Materiales y equipos
• Columnas de vidrio con llave de vidrio, para llevar a cabo la
extracción en fase sólida,
marca Pobel (Madrid, ESPAÑA) (referencia: 34.02.12). Diámetro 10
mm, altura 200 mm
y capacidad 15 mL Dichas columnas presentan un fritado que impide
la salida de la sílica.
• Vortex de Heidolph (Schwabach, ALEMANIA).
• Pipetas automáticas de 10 - 100 µL,, 100 - 1000 µL y 1 - 5 mL
suministradas por Thermo
Scientific (Waltham, MA, EEUU).
• Pipetas Pasteur de vidrío suministradas por Dicsa (Almería,
ESPAÑA).
• Vasos de precipitado de 50 mL suministrados por Dicsa (Almería,
ESPAÑA).
• Rotavapor de Büchi, R-114 (Flawil, SUIZA).
• Granatario de Mettler Toledo (Greifensee, SUIZA).
• Matraces de fondo redondo suministrados por Dicsa (Almería,
ESPAÑA).
• Tubos de ensayo de 15 mL suministrados por Dicsa (Almería,
ESPAÑA).
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
30
• Matraces aforados de 10 mL suministrados por Dicsa (Almería,
ESPAÑA).
Para llevar a cabo los experimentos se empleó un cromatógrafo de
gases de Bruker
Corporation (Freemont, CA, EEUU) modelo Scion 456-GC equipado con
inyector de
splitless e inyector de LVI, control electrónico de flujo y
automuestreador tipo Combi-
PAL. Como columna cromatográfica se empleó una columna DB-1HT de 15
m x 0.32
mm x 0,10 m que permite trabajar entre -60ºC y +400ºC de Agilent
Technologies (Santa
Clara, CA, EEUU). El cromatógrafo estaba equipado con un detector
FID.
5.2 PREPARACIÓN DE DISOLUCIONES PATRÓN
Para llevar a cabo el análisis de MOSH y MOAH se precisa preparar
previamente tres
disoluciones patrón.
En primer lugar, preparamos 10 mL de disolución a una concentración
individual de cada
compuesto de 100 mg/L del mix de patrones internos y otra de C18.
Para ello, añadimos
335 µL del mix de patrones internos , que se encuentra a 3000 mg/l
en una ampolla de 1
mL. Y añadimos 2150 µL de C18, que se encuentra a 464 mg/l en 50
mL.
Se diluyó la disolución hasta enrasar el matraz usando tolueno como
disolvente de dicha
disolución. Esta disolución se prepara semanalmente, y es añadida
como control de
calidad de cada análisis, además permite cuantificar la fracción
MOSH debido a la
presencia de C18.
Se prepara también una disolución de 10 mL a una concentración
individual de 100 mg/L
de cada uno de los alcanos lineales, considerando desde C16 hasta
C40. Tomamos 1000
µL del patrón de alcanos lineales, a una concentración inicial de
1000 mg/l en 1 mL, y
enrasamos usando tolueno como disolvente.
Finalmente, se prepara una disolución de 10 mL a una concentración
de 100 mg/L de
PAH. Para ello, tomamos 500 µL de disolución de PAH a partir de una
disolución inicial
de 2000 mg/L en una ampolla de 1 mL. Diluimos con tolueno hasta
enrasar el matraz.
Todas estas disoluciones fueron conservadas en frigorífico a una
temperatura de 3 ºC,
además de ser etiquetadas con la fecha de preparación y las
iniciales del analista que la
preparó.
5.3 EXTRACCIÓN SPE Y SEPARACIÓN DE MOSH Y MOAH
Para la extracción de MOSH y MOAH en aceites minerales, se utilizó
un procedimiento
de extracción utilizando SPE off-line.
En primer lugar, se lleva a cabo la activación de la sílica
argentada. Para ello, se pesa 100
g de ésta y se activa a 600ºC durante 6 horas en una mufla. Una vez
enfriada, se añade a
la sílica activada 100 ml de una disolución acuosa de nitrato de
plata al 1% y se agita
durante 3 horas en un agitador rotatorio. La sílica argentada se
seca en la estufa a 125 ºC
durante 12 horas. Fue conservada en botella de vidrio topacio
cerrada y recubierta de
papel de aluminio para evitar su exposición a la luz solar durante
su almacenamiento.
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
31
Para preparar los cartuchos de SPE, se pesa 6 gramos de la sílica
argentada y se introduce
en la columna de vidrio con llave. Para acondicionar la columna,
añadimos 10 mL de
n-hexano. Agitamos durante 1 minuto la columna en el vortex para
eliminar burbujas de
aire que pueda haber en su interior ocluidas en el relleno.
Por otro lado, para preparar la muestra se pesan 0,5 g de muestra
de aceite y se le añaden
400 µL de disolvente (n-hexano:tolueno, 1:1 v/v) y 100 µL de la
disolución de patrones
internos y C18 a 100 mg/L. Tras homogeneizar convenientemente la
mezcla, se añaden a
la columna SPE un total de 500 µL.
Para llevar a cabo la elución de los MOSH, utilizamos 10 mL de
n-hexano, los cuales son
recogidos en un tubo de ensayo. Tras su elución completa, son
traspasados a un matraz
de fondo redondo. El disolvente es llevado a justa sequedad con una
temperatura de baño
de 32 ºC y una presión de 98 mbar. Una vez evaporado, redisolvemos
el residuo sólido
con 500 µL de n-hexano:tolueno (1:1 v/v) y 50 L se inyecta en el
cromatógrafo.
Para la elución de los MOAH del cartucho, utilizamos 15 mL de una
mezcla
n-hexano:tolueno:diclorometano (40:40:20 v/v). El eluato es
recogido en un tubo de
ensayo y evaporados en un rotavapor en las condiciones de presión y
temperatura antes
indicadas. Una vez evaporados, resolveremos el residuo sólido
utilizando 500 µL de
tolueno. En este caso, el disolvente es llevado a justa sequedad
con una temperatura de
baño de 32 ºC y una presión de 111 mbar.
Todo el proceso de extracción se lleva a cabo con material de
vidrio ya que se ha
observado que la utilización de algunos materiales plásticos puede
producir un
incremento significativo del ruido cromatográfico.
5.4. DETERMINACIÓN DE MOSH Y MOAH POR GC-FID
Para el análisis de MOSH y MOAH, se empleó el siguiente método
cromatográfico: se
utilizó un flujo de helio de 3 mL/min en columna que se mantuvo
constante durante todo
el análisis como gas portador. La muestra (50 L inyectados) se
volatilizaba en el inyector
LVI cuya temperatura inicial era 60 ºC (mantenida 1 min), luego se
calentaba a 200
ºC/min hasta 300 ºC (mantenida 10 min). La programación de la
válvula de división fue:
inicialmente abierta con una relación de división 30:1 pero nada
más realizar la
introducción de la muestra, se incrementó la relación de división
hasta 200:1 para facilitar
la evaporación de disolventes. Al minuto de análisis, se cerró la
válvula de división para
volatilizar los analitos y transferirlos a la columna
cromatográfica (2 min) y
posteriormente se volvió a abrir con una relación de división de
100:1 para limpiar el
inyector y evitar contaminación cruzada. La columna cromatográfica
inició su
programación térmica a 65 ºC (mantenida 10 min) y luego se calentó
a 24 ºC/min hasta
330 ºC (mantenida 15 min). El detector FID trabajó a 330 ºC con un
flujo auxiliar de 27,0
mL/min, hidrógeno de 35 mL/min y aire de 300 mL/min.
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
32
6.1.1 Optimización de las condiciones cromatográficas para la
determinación de
MOSH y MOAH
La técnica de inyección juega un papel importante en la
determinación de estos
compuestos en aceites comestibles. La mayoría de los métodos
publicados utilizan la
técnica de inyección en columna29 dado que, a pesar de que las
concentraciones que se
pueden encontrar de MOH en algunos aceites puede ser elevada (del
orden de varios
cientos de mg/kg), la sensibilidad de estas metodologías no es
suficientemente alta y
requiere ser mejorada a través de la introducción de una elevada
cantidad de muestra en
el instrumento. Dado que el instrumento empleado en el presente
trabajo no contaba con
dicho tipo de inyector, alternativamente se llevó a cabo un estudio
empleando las técnicas
de inyección disponibles y de mayor sensibilidad, esto es,
inyección splitless y LVI. Para
ello, se trabajó con una disolución patrón conteniendo los patrones
internos
proporcionados por Restek a una concentración de 300 µg/mL, excepto
colestano y
perileno que se encuentran a una concentración de 600 µg/mL, y
n-tridecano que se
encuentra a una concentración de 150 µg/mL. Dicho patrón contiene
un número
significativo de compuestos similares física y químicamente a los
MOSH y MOAH
objeto de estudio y son muy útiles para optimizar condiciones
experimentales con
compuestos de concentración conocida.
Para llevar a cabo la optimización del método se ensayó la
inyección de 10 µL en modo
splitless (aunque dicho volumen puede considerarse en el límite
para este tipo de técnica
pero intentando maximizar la sensibilidad de dicho modo de
inyección). Para ello, el
inyector se calentó a 330 ºC y se mantuvo la válvula de división
cerrada 2 min. Por otra
parte, se evaluó la técnica LVI inyectando 50 µL de la misma
disolución. En este caso,
se evaporó el disolvente a 65 ºC durante 1 min y luego se
volatilizó la muestra calentando
hasta 330 ºC (a razón de 200 ºC/min). Los mejores resultados, en
términos de sensibilidad,
se obtuvieron con la técnica de inyección LVI. En la Tabla 7 se
muestra el área de pico
obtenida para los compuestos del mix de patrones internos
estudiados:
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
33
Tabla 7. Comparación de la sensibilidad para las técnicas de
inyección splitless y LVI.
Sustancia
Perileno 5444 26776
n-pentilbenceno 2223 12223
En general, la sensibilidad del método se incrementó sensiblemente
al utilizar LVI con
respecto a la técnica de inyección splitless. Especialmente se
observó mayor mejora en
algunos de los compuestos de mayor volatilidad, por ejemplo,
n-undecano y n-tridecano
por lo que probablemente, la volatilización de compuestos más
volátiles se vea más
favorecida por la técnica de inyección de grandes volúmenes que
comenzaba la
volatilización en frío e iba incrementando la temperatura de manera
gradual hasta
alcanzar la temperatura máxima.
Como se acaba de comentar en base a los primeros datos
experimentales relativos a la
volatilización de la muestra, la volatilidad de hidrocarburos
analizados por GC puede
variar en función de parámetros como la temperatura de
volatilización y el tipo de
disolvente empleado para disolver la muestra. Algunos hidrocarburos
con número bajo
de carbonos, entre C7 y C15 pueden ser perdidos en mayor o menor
extensión por
volatilidad en el instrumento durante el proceso de eliminación del
disolvente. Por ello,
es importante seleccionar unos parámetros de volatilización
adecuados que minimicen o
eliminen dicha pérdida en el inyector. Dicho fenómeno ha sido
descrito por diversos
autores.30 También pueden ser potencialmente perdidos estos
compuestos por su elevada
volatilidad durante el proceso de evaporación en el rotavapor.
Dicha volatilidad en el
rotavapor fue minimizada ajustando cuidadosamente la evaporación
del disolvente antes
de la etapa cromatográfica. Las condiciones de temperatura y vacío
fueron ajustadas
acorde a las recomendaciones del fabricante del rotavapor a fin de
que la pérdida por
evaporación de los hidrocarburos más volátiles fuese mínima.
También era importante
ajustar la evaporación hasta justa sequedad a fin de ayudar a tal
fin y no exponer a sobre-
evaporación durante excesivo tiempo el residuo seco una vez
obtenido.
A fin de minimizar la evaporación de los hidrocarburos más ligeros
en el inyector
cromatográfico, se llevó a cabo un estudio de la sensibilidad del
método a dichos
hidrocarburos a diversas temperaturas de inyección. Para ello, se
empleó una disolución
de una mezcla de hidrocarburos alifáticos lineales que van desde C7
a C40 a una
concentración de 2 mg/mL. Dichos compuestos fueron evaporados en el
inyector a
diferentes temperaturas: 300, 325 y 350 ºC (se evaporó inicialmente
el disolvente a 65 ºC
durante 1 min y luego se volatilizó la muestra calentando hasta las
temperaturas
estudiadas a razón de 200 ºC/min). En la Figura 10 se pueden
observar los
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
34
cromatogramas obtenidos para algunos de los hidrocarburos. La
primera figura
corresponde con un hidrocarburo de bajo peso y mayor volatilidad,
C16, la segunda
corresponde a un hidrocarburo de medio peso, C26, y la ultima
corresponde a un
hidrocarburo de elevado peso y menor pérdida por volatilidad,
C38.
-300 ºC
-325 ºC
-350 ºC
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
35
Figura 10. Cromatogramas obtenido para las distintas temperaturas
del inyector para el
mix de alcanos. La figura de arriba muestra el C16, la figura
central muestra el C26 y la
figura de abajo muestra el C38.
Los mejores resultados en términos de sensibilidad se obtuvieron a
300 ºC para la mayoría
de los compuestos estudiados. A dicha temperatura se maximiza la
sensibilidad de
aquellos alcanos de elevado número de carbonos (C35-C40)
minimizando las pérdidas
por volatilidad de los alcanos de bajo número de carbonos
(C7-C15).
Para corroborar los resultados obtenidos, se realizó un análisis de
aceite de oliva virgen
extra fortificado a 50 mg/kg con el mix de patrones internos y
probamos estas tres últimas
temperaturas.
-300 ºC
-325 ºC
-350 ºC
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
36
Figura 11. Cromatogramas obtenidos para las distintas temperaturas
del inyector para
el mix de patrones internos en aceite de oliva virgen extra.
Los resultados obtenidos en aceite de oliva fueron similares a los
obtenidos con patrones
disueltos en disolvente. Por lo tanto, se seleccionó una
temperatura final de inyector de
300ºC.
A continuación, se optimizó la temperatura del detector. Para ello
se ensayaron
temperaturas que variaron desde 330 a 390ºC y se analizó la mezcla
de mix de patrones
internos a 2 mg/kg.
En la siguiente tabla se puede observar cómo varió la sensibilidad
del método analítico
en función de la temperatura del detector FID:
Tabla 8. Sensibilidad del método en función de la temperatura del
detector FID.
Sustancia 330ºC 360ºC 390ºC
n-undecano 16232 15443 11287
n-tridecano 7998 6556 3878
Biciclohexil 18765 16776 13349
Colestano 29870 15639 13876
1-metilnaftaleno 19871 16765 13349
2-metilnaftaleno 16785 14381 10981
Perileno 27876 23561 18987
n-pentilbenceno 11768 9873 5657
Los resultados indicaron que la mejor temperatura para el detector
fue 330ºC ya que a
temperaturas mayores se observó que los picos cromatográficos de
los compuestos
perdían intensidad llegando a suponer incluso una sustancial
pérdida de sensibilidad para
algunos de éstos (por ejemplo, n-pentilbenceno, n-tridecano,
colestano).
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
37
A continuación, se llevo a cabo la optimización de la temperatura
de la rampa del horno
cromatografico. Para ello, se utilizó la disolución de
hidrocarburos lineales desde C7 a
C40 a 2 mg/L. Las temperaturas ensayadas para el gradiente de
temperatura fueron: 15,
25, 35 y 50ºC/min. En la Figura 12 se observan los cromatogramas
obtenidos para dicho
estudio.
Figura 12. Cromatogramas obtenidos para el estudio de la
temperatura de la rampa del
horno cromatografico para el mix de alcanos (azul, 15ºC/min; rojo,
25ºC/min; verde,
35ºC/min; naranja, 50ºC/min).
En los cromatogramas se observan los típicos perfiles
cromatográficos que se obtienen
para hidrocarburos alifáticos de cadena lineal, normalmente
separados a tiempos de
retención muy similares. Con la rampa a mayor temperatura
conseguimos condensar el
cromatograma o, los patrones aparecen antes y de este modo, el
análisis se desarrolla de
manera más rápida, reduciendo el tiempo total de análisis. Podemos
observar que la
temperatura más adecuada para la rampa del horno cromatografico es
25ºC/min ya que
los compuestos aparecen con igual sensibilidad, no produciéndose
una perdida de
sensibilidad en los alcanos más pesados, como ocurre cuando la
rampa se encuentra a 35
o 50 ºC/min. Además, dado que los compuestos objeto de estudio van
a producir una
montaña de señales no separable cromatográficamente, la
sensibilidad del método
aumentará conforme más estrecha sea dicha montaña de
señales.31
6.1.2 Optimización del método de extracción
Los métodos de extracción acoplados on-line a un cromatógrafo de
gases requieren
acoplar instrumentalmente un cromatógrafo de líquidos de alta
presión que son costosos
y complejos en su optimización. Por ello, se diseñó el estudio
empleando cartuchos de
SPE off-line, que, si bien no permiten automatizar el proceso, son
mucho más económicos
y sencillos de optimizar. Para ello, se decidió utilizar un
sorbente basado en gel de sílice
a la que se le añade nitrato de plata para retener con mayor fuerza
compuestos con dobles
enlaces. Inicialmente, se planteó utilizar un 1% de nitrato de
plata. Se estudió la cantidad
de silica argentada necesaria para llevar a cabo la separación de
MOSH y MOAH
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
38
potencialmente presentes en una muestra de aceite. Se llevaron a
cabo diversos
experimentos usando 3, 4, 5 y 6 g de sílica argentada al 1%
empaquetada en una columna
de vidrio. Se cargó en la columna de sílica argentada 0,5 g de
aceite conteniendo 20 mg/kg
de cada uno de los compuestos presentes en el mix de patrones
internos. Dichos
compuestos presentan propiedades físicas y químicas muy similares a
las de los
compuestos objeto de estudio y su estudio puede ser extrapolable al
comportamiento de
MOSH y MOAH. Para la elución de los compuestos de interés, MOSH y
MOAH, se pasó
por la columna 20 mL de n-hexano que se recogieron en tubos de
ensayo en fracciones
de 1 mL y que se analizaron individualmente mediante GC-FID. Los
resultados
experimentalmente obtenidos, demostraron que la mejor separación
entre compuestos
MOSH y MOAH se obtuvo utilizando 6 g de sílica argentada al 1%.
Cantidades de
sorbente menores no eran capaces de separar adecuadamente los
compuestos de interés
entre si. Los compuestos que indican el corte entre las fracciones
de elución MOSH y
MOAH son colestano y TBB.29 El colestano fue eluído en las
fracciones de 6-8 mL
mientras que el TBB se eluía en las fracciones 10-11 mL. Estos
resultados evidenciaron
que se disponía de un margen de 2 mL para poder separar las
fracciones de MOSH y
MOAH en la extracción previa a la determinación GC-FID. En la Tabla
9 se observan
los perfiles de elución de dichos compuestos en función de la
cantidad de sorbente
empleada:
Tabla 9. Perfil de elución de colestano y TBB en columnas de 3, 4,
5 y 6 g de sílica
argentada al 1%. Área de pico cromatográfico (mV/s).
3 g 4 g 5 g 6 g
Fracción
(mL)
5
6
7
8
9
10
11
12
1732
-
-
-
-
A continuación, una vez conocida la cantidad de n-hexano necesaria
para eluir los MOSH
separadamente de los MOAH y a fin de acelerar la elución de estos
últimos compuestos,
se evaluó la mezcla de disolventes n-hexano:tolueno:diclorometano
(40:40:20 v/v) tal y
como se describe en bibliografía.32
Para conocer cuándo termina de ser eluída la fracción MOAH en el
cartucho SPE, se
utilizó como indicador el compuesto perileno (también incluido como
patrón interno en
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
39
el mix empleado) que ha sido descrito en bibliografía29 como
indicador para tal fin.
Además, dicho compuesto presenta un color verdoso que ayuda a
seguir su elución a
través de la columna de sílica argentada de color blanco a simple
vista.
La elución de estos compuestos (evidenciada por la elución del
perileno) se pudo llevar
a cabo con esta nueva mezcla de disolventes más rápido (15 mL) que
utilizando
exclusivamente n-hexano (30 mL).
A modo de ejemplo, en la Figura 13 se muestran los cromatogramas
obtenidos en las
condiciones experimentales seleccionadas tanto para MOSH como para
MOAH y en
donde se encontraban los compuestos del mix de patrones internos a
una concentración
de 10 mg/kg en aceite de oliva virgen extra.
Figura 13. Cromatogramas obtenido para MOSH (cromatograma superior)
y MOAH
(cromatograma inferior) en aceite de oliva virgen extra.
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
40
Como puede observarse al comparar los cromatogramas, los MOSH
nativos presentes en
la muestra de aceite de oliva se muestran como una montaña de
compuestos no separables
cromatográficamente. Dichos compuestos son técnicamente imposibles
de separar entre
si y de hecho, son descritos así con frecuencia en bibliografía33
como jorobas
cromatográficas imposibles de resolver.
Además, se observan una serie de picos cromatográficos que
sobresalen por encima de la
montaña de MOSH y que corresponden con compuestos presentes de
manera nativa en
las muestras de aceites. Dichos compuestos suelen ser alcanos de
origen natural,
mayoritariamente de número impar de carbonos. El cromatograma que
se obtiene para
MOAH es similar, con una montaña no separable cromatográficamente y
que eleva la
línea base y que corresponde con los MOAH presentes en la muestra.
También tiene
compuestos que están presentes de manera nativa en la muestra y que
son los picos
cromatográficos que sobresalen por encima de la joroba.
A la hora de establecer la cantidad de MOSH o MOAH presentes en la
muestra, hay que
averiguar por integración el área de la montaña de MOSH o MOAH más
los picos que
sobresalen por encima de ella y a continuación, integrar solamente
dichos picos que
sobresalen para sustraer su área a la del total antes calculada. El
software de gestión de
cromatogramas del instrumento empleado puede ser programado para
llevar estas
actividades de manera automatizada y obtener los resultados en el
formato deseado.
Con frecuencia, se utiliza aceite de girasol refinado para
establecer la influencia de
blancos en el proceso de medida de la señal analítica.31 En la
figura 14 se muestra el
blanco obtenido al analizar un aceite de girasol refinado a modo de
blanco tanto para
MOSH como para MOAH. La joroba cromatográfica que se obtiene
también debe ser
procesada como se ha descrito arriba y el valor obtenido
substraerse a los valores que se
obtienen al analizar las muestras.
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
41
Figura 14. Cromatogramas obtenidos para MOSH y MOAH,
respectivamente, en aceite
de girasol refinado.
También se evaluó la cantidad de muestra a ser utilizada y la
cantidad de muestra que se
inyecta. Cada muestra se preparó pesando 0,5 g de muestra de aceite
y añadiendo 100 µL
de patrón interno y 400 µL de disolvente (n-hexano:tolueno 1:1
v/v). Se realizaron 2
ensayos a 25 mg/kg de patrón, introduciendo en el cartucho de SPE
un total de 250 µL y
500 µL de la mezcla e inyectando en el cromatógrafo 25µL y 50 µL a
fin de evaluar si
con la citada cantidad de aceite se saturaba el sistema
cromatográfico. La Figura 15
muestra los resultados obtenidos con las dos cantidades de muestra
ensayadas.
-250 µl – 25 µl
-250 µl – 50 µl
-500 µl – 25 µl
-500 µl – 50 µl
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
42
Figura 15. Cromatogramas obtenido para distintas cantidades de
muestra introducidas en
el cartucho y cantidad de muestra inyectada. Cromatograma superior,
C18 en el análisis
de MOSH; cromatograma central, colestano en el análisis de MOSH;
cromatograma
inferior, cromatograma completo en el análisis de MOAH.
Los dos primeros cromatogramas corresponden a las señales obtenidas
para los
compuestos C18 y Colestano, respectivamente, compuestos de interés
en el análisis de
MOSH. Se muestran a modo de ejemplo como detalles del
comportamiento observado
durante el experimento. En ellos podemos ver que cuando
introducimos en el cartucho de
SPE 250 µL de muestra y inyectamos 25 µL y 50 µL no encontramos
prácticamente
diferencia. Mientras que, cuando introducimos 500 µL de muestra en
el cartucho y
inyectamos 25 µL y 50 µL observamos que si hay diferencia en la
sensibilidad del método
analítico observando que la mayor sensibilidad obtenida de entre
estas dos opciones es
cuando inyectamos 50 µL de muestra.
-250 µl – 25 µl
-250 µl – 50 µl
-500 µl – 25 µl
-500 µl – 50 µl
-250 µl – 25 µl
-250 µl – 50 µl
-500 µl – 25 µl
-500 µl – 50 µl
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
43
El último cromatograma, el correspondiente a un cromatograma
completo del análisis de
MOAH, en el cual podemos observar la misma tendencia, cuando
añadimos 500 µL en el
cartucho de SPE y inyectamos 50 µL es cuando obtenemos una mayor
sensibilidad. Por
ello, en los siguientes experimentos utilizamos estas condiciones
tanto de cantidad de
muestra como de cantidad de extracto inyectado.
6.2 VALIDACIÓN DEL MÉTODO
Una vez optimizada la metodología de análisis se procedió a su
validación con la finalidad
de conocer estadísticamente su comportamiento y validez analítica.
Los parámetros de
validación estudiados fueron: veracidad (expresada como porcentaje
de recuperación),
precisión intradía, precisión interdía y LOQ. No se evaluó
linealidad porque el método
de calibración fue mediante el uso de patrón interno.
Para evaluar la veracidad y precisión intradía del método, 5
alícuotas de 0,5 g de una
muestra de aceite de oliva virgen extra fueron fortificadas
añadiéndoles la cantidad
necesaria del mix de alcanos para que tuviesen una concentración
total final de los
mismos de 25 mg/kg (considerados desde C16 a C40) y del mix de PAH
para obtener la
misma concentración. Las muestras fueron extraídas y procesadas con
el método
propuesto y la cuantificación se realizó utilizando un patrón de
C18 que se añadía a 100
mg/kg (cuantificación de MOSH) y utilizando TBB que también se
añadía a una
concentración de 100 mg/kg (cuantificación de MOAH). La señal
cromatográfica
empleada para cuantificar los MOSH requería restar previamente la
señal de C18 del
blanco y la del mix de alcanos. El proceso fue repetido también a
una concentración de
estudio de 100 mg/kg. Los resultados se muestran en las siguientes
tablas:
Tabla 10. Veracidad (R%) y precisión expresada como intradía e
interdía del método
analítico para MOSH.
95,6 18,5 22,3 94,6 16,2 20,1
Tabla 11. Veracidad (R%) y precisión expresada como intradía e
interdía del método
analítico para MOAH.
Los datos experimentalmente obtenidos demuestran que la
recuperación promedio
obtenida tanto para MOSH como para MOAH se puede considerar
cuantitativa
(comprendida entre 87,0 y 95,6%) y las precisiones intradía fueron
en todo caso menores
de 18,5%. La precisión interdía se evaluó estudiando muestras
preparadas y analizadas
Determinación de aceites minerales en aceite de oliva mediante SPE
en combinación GC-FID
44
en 5 días consecutivos y como puede observarse en las Tablas 10 y
11, fue inferior al
22,3 % en todos los casos.
Para el cálculo del LOQ, se fortificó unas alícuotas (n=3) de una
muestra de aceite de
oliva virgen extra con una concentración total de alcanos
(considerados desde C16 a C40)
de 1 mg/kg y de PAH de 1 mg/kg. Los resultados de recuperación al
analizar dicha
concentración y tras restar el blanco fueron 92,4% para MOSH y
82,9% para MOAH con
una precisión de 20,3% y 17,4%, respectivamente. Los valores de
recuperación
obtenidos, así como la precisión intradía obtenida para dicha
concentración, nos ayudó a
establecer el LOQ del método propuesto en ese valor de
concentración.
6.3 APLICACIÓN DEL MÉTODO
A fin de evaluar la aplicabilidad del método analítico
desarrollado, se analizaron 5
muestras reales de aceites de oliva virgen extra obtenidos en
supermercados locales. Los
resultados obtenidos fueron los mostrados en la Tabla 12:
Tabla 12. Resultados obtenidos para MOSH y MOAH totales en muestras
de aceite de
oliva virgen extra reales.
1
2
3
4
5
30,8
28,4
8,3
19,4
29,5
2,9
3,1
<LOQ
2,8
3,5
Adicionalmente, se analizaron 3 muestras de aceite de oliva
suministradas por un
laboratorio especializado en el análisis de aceites y grasas de la
provincia de Jaén a modo
de ejercicio intercomparatorio. Solo pudieron compararse los
resultados obtenidos para
la determinación de MOSH ya que el laboratorio de Jaén no analizó
los MOAH. El
laboratorio con el que se realizó el ejercicio de intercomparación
indicó que una de las
muestras era aceite de oliva virgen extra (referencia 11574), otra
era aceite de oliva
refinado (referencia 14920) y la tercera aceite de orujo de oliva
refinado (referencia
14921). Los resultados se muestran en la Tabla 13:
Tabla 13. Resultados obtenidos en el análisis intercomparativo de
MOSH en diferentes
tipos de muestras de aceite