UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE SINALOA
Unidad Académica de Ingeniería en Biotecnología
PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UN ANTÍGENO
RECOMBINANTE PRODUCIDO EN LEVADURA
Rosa Laura Cárdenas López
Tesina presentada como requisito parcial para optar al título de:
Licenciado en Ingeniería en Biotecnología
Director de tesina
Dra. Norma Adriana Valdez Cruz
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS UNAM
Co director de tesina
Dra. Noemí García Magallanes
UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE SINALOA
Mazatlán, Sinaloa, Diciembre del 2015
ii
iii
El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de la Dra. Norma Adriana Valdez
Cruz, con el apoyo de los proyectos de CONACyT 220795, 178528, 181895 y el
Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica
DGAPA IN208415; PAPITT 209113, 210013. Los experimentos fueron llevados a
cabo en el Instituto de Investigaciones Biomédicas, en los laboratorios C-036 (a
cargo de la Dra. Valdez Cruz), así como en la Unidad de Bioprocesos (a cargo del
Dr. Mauricio Alberto Trujillo Roldán) del Departamento de Biotecnología y
Biología Molecular. Los experimentos fueron desarrollados particularmente, con
el apoyo del proyecto DAGAPA-IN208415.
Este trabajo fue asesorado por el siguiente Comité Tutoral:
Dra. Norma Adriana Valdez Cruz, Director.
Dra. Noemí García Magallanes, Codirector.
M. en C. Iliana Hetzabet Zazueta Ojeda, Secretario.
iv
DEDICATORIA
A mis padres Laura y Ramiro,
Quienes han sido mi gran ejemplo a seguir..
A quienes siempre estaré eternamente agradecida por todos sus maravillosos,
incondicionales y amorosos consejos. Por siempre confiar en mí y en mi potencial, por
apoyarme y consentirme cada día y en cada momento de mi vida.
A mi Little bro, Ramiro Jr. Gracias por hacer mis días más ligeros, por soportarme y
enseñarme siempre, te quiero mucho.
Los amo intensamente. Sin ustedes no sería lo que soy.
Mi mayor meta en esta vida es ser feliz y hacer feliz a los que me rodean…
v
AGRADECIMIENTOS
A mi tutora:
Dra. Norma Adriana Valdez Cruz
Por la asesoría, tiempo y consejos brindados durante el lapso de realización de mi
proyecto de tesina.
A mi asesora:
Dra. Noemí García Magallanes
Por las valiosas aportaciones, enseñanzas y consejos a lo largo de mi carrera, así
como en el presente proyecto.
Además, deseo expresar mi gratitud a Daniel Juárez López y Carlos Giroshi
Bando, del Instituto de Investigaciones Biomédicas-UNAM, por sus oportunas
sugerencias y aportaciones al presente trabajo.
vi
ÍNDICE GENERAL
Página
ÍNDICE DE FIGURAS viii
ÍNDICE DE TABLAS ix
RESUMEN x
ABSTRACT xi
INTRODUCCIÓN 12
ANTECEDENTES 14
Antígenos de Mycobacterium tuberculosis 14
Glicosilación en Pichia pastoris 15
Producción del antígeno recombinante 16
Purificación de proteínas 16
OBJETIVOS 19
General 19
Específicos 19
MATERIALES Y MÉTODOS 20
Cinética de crecimiento e inducción de P. pastoris 20
Acumulación de biomasa determinada por peso seco 20
Precipitación de proteínas 21
Determinación de la concentración de proteínas 21
Purificación de proteína 22
Primera purificación – FPLC 22
Hibridación Dot-Blot 23
Purificación en cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en
fase reversa 23
Electroforesis SDS-PAGE 24
vii
RESULTADOS Y DISCUSIÓN 25
Crecimiento de P. pastoris C2, e inducción para la producción del AR 25
Purificación de proteína en FPLC 27
Búsqueda del antígeno recombinante por Dot-Blot 28
Electroforesis SDS-PAGE 28
CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS 31
BIBLIOGRAFÍA 32
ANEXOS 35
viii
ÍNDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1. Curvas de crecimiento de P. pastoris C2 en medio BMGY. Los experimentos
fueron realizados por triplicado y cada punto representa la desviación estándar. a)
Curva de crecimiento a escala lineal y b) Curva de crecimiento a escala logarítmica. 25
Figura 2. Curvas de crecimiento de P. pastoris C2 en medio BMMY. Los
experimentos fueron realizados por triplicado y cada punto representa la desviación
estándar. La adición de metanol al 1% se realizó a las 3, 9, 15, 21, 27, 33, 36, 41, 59 y
63 h. a) Curva de crecimiento a escala lineal y b) Curva de crecimiento a escala
logarítmica. 26
Figura 3. Biomasa determinada en peso seco de P. pastoris a 60ºC, durante 63 h de
cultivo en medio BMMY. Los experimentos fueron realizados por triplicado y se
muestra en cada punto la desviación estándar. 27
Figura 4. Separación por exclusión molecular del sobrenadante obtenido en la cinética
inducida con metanol. Se usó la columna Sephacryl S-100 HR para péptidos o
biomoléculas con un peso molecular de 1-100 kDa. El componente de importancia se
obtuvo a los 42 min. La separación proteica fue seguida con absorbancia a 280 nm. 27
Figura 5. Visualización de fracción de interés (fracción 1) en Digidoc. En cada
cuadrante se colocaron 5μl de muestra. Cuadrantes: A1 y A2= fracción 1, B1 y B2=
fracción 2 y C1= control + 5μl de muestra sin purificar. 28
Figura 6. a) Electroforesis SDS-PAGE al 12.5% Carriles: 1=marcador de peso
molecular, 2=proteína total del sobrenadante. b) Electroforesis SDS-PAGE al 12.5%.
Se cargaron 42 μg de cada muestra (cuantificada en Nanodrop). Carriles: 1= marcador
de peso molecular, 2 y 3 =fracción 1, 4 y 5= fracción 2 de la purificación en FPLC por
duplicado y 6 y 7= proteína total del sobrenadante dializada. 29
Figura 7.Western Blot del antígeno recombinante utilizando un ab específico. 29
ix
ÍNDICE DE TABLAS
Página
Tabla 1. Comparación de la concentración de la biomasa máxima alcanzada y
velocidad específica de crecimiento de la cepa de P. pastoris cultivadas en dos medios
con diferente fuente de carbono. 26
Tabla 2. Posición de muestras en cada cuadrante de la membrana PVDF. 28
x
RESUMEN
La tuberculosis pulmonar es una enfermedad infecciosa crónica causada
principalmente por el agente Mycobacterium tuberculosis. La actual vacuna BCG
protege contra dicha infección de un 0 al 80% de los casos, así mismo, el test de
tuberculina genera falsos positivos y/o negativos; es por ello, que la opción de
desarrollar nuevos métodos de prevención utilizando antígenos recombinantes es una
alternativa. En el presente trabajo, se llevó a cabo la producción de un antígeno
secretado por M. tuberculosis en la levadura Pichia pastoris puesto que esta, ha sido
ampliamente utilizada como sistema de expresión de proteínas recombinantes. Aquí se
analizó la producción de un antígeno recombinante a partir de una clona generada en
el laboratorio, inducible por metanol en medio BMMY. El antígeno fue purificado en
FPLC y mediante cromatografía líquida de alta eficiencia en fase reversa y analizada
mediante SDS/PAGE y Western blot. Estos resultados muestran que la levadura P.
pastoris pudiera ser un buen hospedero alternativo para la expresión de antígenos
recombinantes de M. tuberculosis.
Palabras clave: Mycobacterium tuberculosis, Pichia pastoris, vacuna, antígenos
recombinantes.
xi
ABSTRACT
Pulmonary tuberculosis is a chronic infectious disease caused mainly by
Mycobacterium tuberculosis agent. Actual vaccine BCG confers protection against the
infection from 0 to 80% of cases, in the same way, the tuberculin test generates false
positive/negative; It is for this reason that the option of developing new prevention
methods using recombinant antigens is an appropriate alternative. In this work, we
carried out the production of an antigen secreted by M. tuberculosis in Pichia pastoris
yeast because; it has been widely used as an expression system for recombinant
proteins. Here the production of a recombinant antigen was analyze from a clone
generated in the laboratory, inducible by methanol in culture media BMMY. The
recombinant antigen was purify by FPLC, reverse phase high-resolution liquid
chromatography, and analyzed by SDS-PAGE and Western blot. These results show
that the yeast P. pastoris may be a good alternative host for the expression of
recombinant antigens from M. tuberculosis.
Keywords: Mycobacterium tuberculosis, Pichia pastoris, vaccine, recombinant
antigen.
12
INTRODUCCIÓN
Un antígeno es una molécula que al entrar en contacto con otro organismo genera una
respuesta inmune, dando lugar a la producción de macromoléculas denominadas
anticuerpos para neutralizar el antígeno (respuesta inmune humoral) o induce a la
proliferación de células sensibilizadas (respuesta inmune celular), con las que
reacciona específicamente (MacCallum et al., 1996)
Mycobacterium tuberculosis es la primer causa de muerte a nivel mundial causada por
un organismo infeccioso (en segundo lugar está el VIH-SIDA). Esta micobacteria
produce una variedad de antígenos con potencial clínico para utilizarse en el diseño y
mejoramiento de vacunas y/o pruebas de serodiagnóstico, ya que la vacuna solo protege
de un 0-80% de los casos y el diagnóstico se vuelve impreciso por la presencia de otras
micobacterias en el ambiente. Dentro de los antígenos que secreta M. Tuberculosis se
encuentran 85A, 85B, 85C (Ronning, et al., 2004), PirG (Rv3810), secuencia
polimórfica-GC repetitiva (PE-PGRS; Rv3367), y proteína repetitiva prolina treonina
(PTRP) (Rv0538), tienen múltiples repeticiones en tándem de secuencias de
aminoácidos únicas y tienen características de superficie o proteínas secretadas, MtrA
(Rv3246c) (Singh et al., 2001), 38 kDa (RV0934) (Kunnath-Velayudhan et al., 2010),
45-47 kDa (Rv1860) (el cual tiene potencial inmunodominante como una vacuna
contra la tuberculosis (Laqueyrerie et al., 1995), por mencionar solo algunos.
Recientemente, se ha centrado particular interés en la producción y purificación de
antígenos recombinantes de M. tuberculosis utilizando sistemas bacterianos y
levaduras.
La producción de proteínas con potencial clínico en células de organismos como
bacterias y levaduras, utilizando tecnología recombinante es una alternativa muy
prometedora que permite continuar ensayos clínicos y que pueden concluir en el diseño
de tratamiento a diversas enfermedades y síndromes que afectan hoy en día (Córdoba,
Algecira et.al. 2003).
13
Una de las ventajas de emplear antígenos proteicos para realizar inmunodiagnósticos
es que éstos pueden producirse mediante la tecnología del ADN recombinante, lo que
permite su expresión y purificación a gran escala, con el consiguiente abaratamiento
de los costos de la prueba.
La primer levadura utilizada para la producción de proteínas recombinantes fue
Saccharomyces cerevisiae como reemplazo de la bacteria Escherichia coli debido a
que esta última, por ser bacteria, presenta limitaciones en cuanto a la inhabilidad de
realizar modificaciones postraduccionales como la glicosilación. Sin embargo, S.
cerevisiae glicosila proteínas de una manera muy diferente a las células humanas y
produce proteínas bastante antigénicas. Otro sistema de expresión es Pichia pastoris,
que es un microorganismo eucariota unicelular, fácil de manipular y cultivar. Además
tiene la maquinaria enzimática para realizar modificaciones postraduccionales, tales
como procesamiento proteolítico, plegado, formación de enlaces disulfuro y
glicosilación (Cregg et al., 2000)
La utilización de P. pastoris como sistema de producción de proteínas recombinantes
en bioprocesos permite producir proteínas postraduccionalmente modificadas y
similares a las nativas (Viader-Salvadó et al, 2009). Sin embargo, como en todo
bioproceso, la obtención de proteína recombinante requiere la separación y purificación
de los antígenos.
La importancia de obtener y purificar estas proteínas es el poder continuar con los
ensayos inmunogénicos y posiblemente utilizarla como componente de un kit de
diagnóstico multiantigénico para tuberculosis con alta eficiencia (Macauley-Patrick
et.al., 2005) ya que el método de diagnóstico actual conocido como la prueba cutánea
de la tuberculina (DTH) tiende a ser inespecífico ya que puede generar falsos positivos
y/o negativos (Palma-Nicolás y Bocanegra-García, 2007).
14
ANTECEDENTES
Antígenos de Mycobacterium tuberculosis
Actualmente, entre los antígenos secretados de M. tuberculosis y que han sido descritos
como inductores de la secreción de mediadores asociados a protección contra la
infección por M. tuberculosis están las proteínas de 10, 6, 27 y 38 kDa, por inducir la
producción de IFN-γ, TNF-α y óxido nítrico, todos estos relacionados con una
respuesta inmunitaria protectora (Araujo Z. et.al. 2008).
Particularmente la lipo-glico-proteína de 38 kDa, (Braibant et al., 2000), se puede
encontrar tanto intracelularmente como secretada en el sobrenadante de cultivo
extracelular (Young y Garbe, 1991). En M. tuberculosis, tres operones de dicho
antígeno se han identificado, lo que probablemente constituye una adaptación
bioquímica sutil de este microorganismo para su crecimiento y supervivencia bajo
diferentes condiciones de limitación de fosfato durante su ciclo infeccioso (Cole, et al.
1998).
Entre las especies de micobacterias, este antígeno se encuentra sólo presente en M.
tuberculosis y M. bovis, siendo su concentración en el primero 10 veces superior. La
secuencia de aminoácidos del antígeno posee un 30% de homología con una proteína
(PhoS) relacionada con la fijación y el transporte de fósforo en Escherichia coli, la cual
se incrementa durante la disminución de fosfato en el citoplasma (Araujo et al., 2008).
Además según Araujo y colaboradores (2008), se sabe que posee diferentes epítopes
localizados en la porción central de la molécula y en el carboxilo terminal, los cuales
son capaces de inducir la proliferación de clones de células T específicos para M.
tuberculosis, aunque algunos pueden tener reactividad cruzada.
Dicha proteína se ha empleado como antígeno para métodos inmunológicos de
detección de anticuerpos circulantes en pacientes (serodiagnóstico), debido a que
alcanza el 80% de sensibilidad en pacientes con baciloscopias positivas. Se dice
también que este análisis constituye una alternativa muy importante para diagnosticar
15
la Tuberculosis activa, y dependiendo de la clase de inmunoglobulina que sea detectada
(IgG o IgM) se podrá indicar si el proceso infeccioso se encuentra o no en curso (Palma-
Nicolás y Bocanegra-García, 2007)
Así mismo, según Palma y Bocanegra (2007) para ampliar la sensibilidad y
especificidad que se alcanzan con los antígenos puros se propuso utilizar una mezcla
de varios antígenos inmunodominantes con el fin de cubrir toda la gama de respuestas
que se dan entre los individuos de una población consiguiendo una sensibilidad del
90%.
Glicosilación en Pichia pastoris
Tanto en bacterias como en eucariotes suceden modificaciones postraduccionales,
como por ejemplo la glicosilación. Existen varios tipos de glicoproteínas, de las cuales
dos son las más abundantes: las N-glicoproteínas y las O-glicoproteínas (Voet et.al.,
2007). Particularmente, la N-glicosilación en eucariotes se inicia en el retículo
endoplásmico con la transferencia de una unidad de enlace lipídico-oligosacárido de
residuos de manosa y N-acetilglucosamina (Córdoba et.al. 2003). A diferencia de los
N-oligosacáridos, los O-oligosacáridos se sintetizan de manera postraduccional, es
decir, la adición serial de unidades de monosacáridos inicia cuando la síntesis de la
cadena polipeptídica ha finalizado (Voet et.al., 2007)
La estructura de oligosacáridos de la invertasa producida en S. cerevisiae y P. pastoris
fue determinada y comparada con la estructura de oligosacáridos de mamíferos
(Tschopp et al., 1987).
P. pastoris tiene los mecanismos para adicionar O- y N-oligosacáridos a las proteínas
secretadas. Los glicanos de la invertasa secretada por P. pastoris no tienen el residuo
de α 1-3 manosa característica en O- glicosilación de S. cerevisiae, el cual se ha
asociado con antigenicidad en las glicoproteínas producidas en ésta levadura (Córdoba
et.al. 2003) y, por tanto, las hace no aptas para producir sustancias de uso terapéutico.
16
En lo que confiere a los N-oligosacáridos, la ventaja de P. pastoris sobre S. cerevisiae
está en la glicosilación que realiza, pues ésta se parece más a la que hacen las células
humanas.
En P. pastoris, la O-glicosilación depende de genes que codifican para
manosiltransferasas, particularmente la Pmt1 y Pmt2 (Nett et.al, 2013). La O-
manosilación se inicia en el retículo endoplásmico utilizando la Manosil-P-Dolicol
como donador de glicanos; por lo general, las levaduras no agregan ácidos siálicos
terminales a los glicanos, pero usan los fosfatos, piruvato o ácido glucorónico para
impartir cargas negativas o para acidificar la proteína (Gemmill y Trimble, 1999).
Además según Gemill y Trimble (1999) la levadura puede realizar dichas
modificaciones del grupo hidroxilo del residuo treonina o serina sin que exista un sitio
consenso como tal.
Producción del antígeno recombinante
Koichi Ogata (1969) descubrió la habilidad que poseen las levaduras de consumir
metanol como su única fuente de carbono, es por ello que se toma en cuenta al inducir
el medio con metanol para lograr una buena producción de antígenos recombinantes.
Años más tarde (2000) Lin Cereghino y colaboradores aseguraron que P. pastoris
creció en un medio que consiste en una fuente pura de carbono (glicerol o metanol),
biotina, sales, trazas de elementos, agua y no secreta alta cantidad de proteínas
endógenas; por consiguiente las proteínas heterólogas secretadas pueden ser
identificadas fácilmente. Es por ello que la producción del antígeno recombinante
estudiado aquí fue producido en éstas levaduras.
Purificación de proteínas
Las proteínas se pueden separar y purificar gracias a las propiedades que posee cada
una como lo son el tamaño, la carga y las propiedades de unión (McMaster, 2007). El
primer paso para purificar las proteínas es romper las células para poder liberarlas, esto
posible utilizando centrifugación diferencial, seguida por el fraccionamiento donde el
17
extracto se somete a tratamientos que separan las proteínas por tamaño o carga. Otros
métodos de separación de proteínas es la diálisis la cual separa a las proteínas de los
disolventes haciendo uso de una membrana semipermeable la cual permite el
intercambio de sal y solución tampón pero no de las proteínas.
Dentro de los métodos más potentes para el fraccionamiento de proteínas se utilizan la
cromatografía en columna que aprovecha las diferencias de carga, tamaño y afinidad
de unión; donde se introduce en una columna un material sólido poroso de propiedades
químicas adecuadas (fase estacionaria) y se hace pasar a través del mismo una solución
tamponada (fase móvil); por ejemplo, en la cromatografía de intercambio catiónico la
matriz solida tiene grupos cargados negativamente, mientras que en la fase móvil las
proteínas con carga positiva neta migran más lento que aquellas con carga negativa
neta debido a la interacción que existe con la fase estacionaria, cabe destacar que las
hay inversas conocidas como cromatografía de intercambio aniónico, ambas formando
parte de las cromatografías de intercambio iónico (Nelson y Cox, 2005).
En cuanto a la cromatografía de exclusión molecular se separan las proteínas según su
tamaño (Nelson y Cox, 2005), la matriz de la columna es un polímero entrecruzado con
poros de un tamaño seleccionado en donde las proteínas de mayor tamaño se desplazan
más rápido que las de menor tamaño ya que son muy grandes como para penetrar en
los poros de las partículas y siguen una ruta más directa para eluir, en cambio las
pequeñas si penetran en los poros y retardan su tiempo de elución.
La cromatografía de afinidad separa las proteínas según su especificidad de unión, las
proteínas retenidas en la columna son las que se unen específicamente a un ligando
unido covalentemente a las partículas, una vez que se han lavado las proteínas que no
se unen a través de la columna, la proteína de interés que se encuentra unida, se eluye
por medio de una solución que contiene ligando libre (Nelson y Cox, 2005).
Al hablar de la cromatografía líquida de alta eficiencia, estamos hablando de un
refinamiento moderno de los métodos cromatográficos en el cual se utilizan bombas de
18
alta presión que aceleran el movimiento de las moléculas de proteína en la columna,
(McMaster, 2007).
En general, la purificación de proteínas se ha realizado utilizando diferentes técnicas
cromatográficas, que permiten su separación según su naturaleza bioquímica, como por
ejemplo FPLC (cromatografía líquida rápida de proteínas) y HPLC (cromatografía
líquida de alta eficiencia). FPLC está optimizado para correr macromoléculas
biológicas en columnas de agarosa o poliméricos monobásicos. Incluye un excelente
rendimiento y vida útil de las columnas, posee inherencia frente a las concentraciones
muy altas de sal, la disponibilidad de inyección automatizada inteligente y válvulas de
selección de disolvente, y programación sencilla del sistema. (Aguilar M-I, 2004)
RP-HPLC (cromatografía líquida de alta eficiencia en fase reversa) es una técnica
eficiente para la separación de péptidos y proteínas a causa de una excelente resolución
que se puede lograr una amplia gama de condiciones cromatográficas para moléculas
muy estrechamente relacionadas (McMaster, 2007).
La selectividad de esta técnica puede ser manipulada a través de cambios en las
características de la fase móvil, las recuperaciones son generalmente altas y, por lo
tanto presenta una alta productividad y la excelente reproducibilidad de separaciones
repetitivas llevadas a cabo durante un largo período de tiempo (Aguilar M-I, 2004).
19
OBJETIVOS
General
Purificar y caracterizar un antígeno recombinante de M. tuberculosis a partir de
sobrenadantes de cultivos de la levadura de expresión Pichia pastoris.
Específicos
Caracterizar la producción del antígeno recombinante después de su inducción
con metanol.
Separar el antígeno recombinante mediante exclusión molecular.
Purificar el antígeno recombinante mediante cromatografía de alta resolución.
20
MATERIALES Y MÉTODOS:
CINÉTICA DE CRECIMIENTO E INDUCCIÓN DE P. pastoris
El material biológico utilizado fue Pichia X33 para las transformaciones con el vector
que contienen el gen codificante para el antígeno recombinante (propiedad del lab 036
IIB/UNAM).
La cinética de crecimiento de P. pastoris se realizó en dos medios, BMGY y BMMY,
el primero contenía extracto de levadura (5g), peptona (10g) y glicerol (5mL) como
fuente de carbono BMGY/Zeocina (200μg/mL), el otro medio solo se diferenciaba en
que no contenía glicerol sino metanol (0.5%) como fuente de carbono y energía, las
condiciones de cultivo fueron 150 rpm a 30ºC (C25 Incubator Shaker, New Brusnwick
Scientific).
Una vez inoculados 50 mL del medio BMGY en matraz bafleado de 250 mL, se
tomaron muestras de 1mL cada 3 h para determinar el crecimiento mediante densidad
óptica (D.O. 600 nm), una vez en estado de crecimiento exponencial, se procedió a
centrifugar el medio a 10,000 rpm por 20 min a 10ºC. Posteriormente, el pellet obtenido
se resuspendió en 10 mL de medio BMMY y se inoculó a 1 D.O. 600 nm los siguientes
matraces de BMMY para continuar con la cinética de crecimiento. Estos matraces se
mantuvieron a 30ºC y 150 rpm durante 63 h. La toma de muestra se realizó a las 0, 3,
9, 15, 21, 27, 33, 36, 41, 59 y 63 h con 1 mL para determinar densidad óptica, biomasa
y cuantificar proteína total de sobrenadante en cada punto. La biomasa se calculó en
peso seco con el pellet obtenido de 1 mL de muestra y secado a 60ºC durante 24 h.
ACUMULACIÓN DE BIOMASA DETERMINADA POR PESO SECO
La acumulación de biomasa se calculó por peso seco, donde se pesaron cada tubo
eppendorf antes de guardar en él 1 mL de muestra de las 0 a las 63 h. Posteriormente,
se centrifugaron los tubos a 8000 rpm por 10 min y se decantó el sobrenadante en
21
nuevos tubos, mientras que el pellet se llevó a secar a 60ºC por 24 h. Una vez totalmente
seco, se procedió a pesar el tubo con biomasa y al restarle el peso de cada tubo en
particular obtuvo la biomasa a la hora de toma de muestra.
PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS
Las proteínas del sobrenadante del medio de cultivo de P. pastoris fueron precipitadas
con TCA- Acetona al 30%. Para ello se tomaron 500 mL de sobrenadante y se le
agregaron 500 mL de TCA-Acetona. Se incubaron 24 h a -20ºC, y se centrifugaron a
velocidad máxima por 15 min a 10ºC. El sobrenadante fue retirado y posteriormente al
precipitado se le agregaron 5 mL de acetona al 80% y la mezcla fue centrifugada
nuevamente por 20 min. Después de retirarle el sobrenadante se hicieron dos lavados
con 5 mL de etanol al 70% y se centrifugó nuevamente a 10ºC por 20 min. Para terminar
la precipitación de las proteínas, la solución se secó en la incubadora 37ºC por 15 min
y al final se resuspendió el pellet en 4 mL de buffer PBS con inhibidor de proteasas.
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEINAS
Las proteínas totales del sobrenadante de la precipitación con TCA- Acetona fueron
cuantificadas por el método de Bradford sobre diluciones apropiadas de muestra.
Este método consiste en medir la concentración de la proteína involucrando la unión
del colorante Azul Coomasie G-250 con aminoácidos básicos (especialmente arginina)
y aromáticos, provocando en éstas un cambio en el máximo de absorción de 465 a 595
nm (García y Vázquez, 1998).
Para ello se realizaron diluciones de la muestra 1:10 y el stock de BSA (200 mg/mL),
se procedió a realizar la curva patrón en agua, y se colocaron directo en la placa: primer
pocillo: 45 μL H2O + 15 μL BSA, del segundo hasta el séptimo pocillo: 30 μL H2O +
30 μL BSA y en el último pocillo se colocaron 10 μL H2O. En cuanto a la curva de las
22
muestras se cargaron por duplicado 10 μL de la muestra diluida + 200 μL Bradford
directamente en la placa. Después, se procedió a leer la absorbancia a 595 nm de cada
una de las muestras.
PURIFICACIÓN DE PROTEÍNA
Para la purificación de la proteína se utilizaron dos tipos de cromatografía liquida,
cromatografía de exclusión molecular, y una cromatografía líquida de alta resolución
en fase reversa (RP- HPLC) basada en la separación por hidrofobicidad de las mismas.
En esta segunda purificación la separación dependió de la unión de la molécula de
soluto de la fase móvil a los ligandos hidrófobos inmovilizados unidos a la fase
estacionaria hidrofóbica.
Los equipos utilizados para las purificaciones fueron el Bio-Rad para FPLC y el
Shimadzu Solvent Delivery Module LC-20AT Prominence para RP- HPLC.
PRIMERA PURIFICACIÓN – FPLC
Para la purificación por exclusión molecular se utilizó una columna Sephacryl S-100
HR con un peso molecular de 1-100 kDa, dicha columna se empacó y se compactó
empleando dos flujos, el primero de 1 mL/min durante 2 h y el segundo flujo de 2.5
mL/min por 1 h, utilizando como buffer de equilibrio Fosfato de Sodio 0.05 M/ NaCl
0.15 M pH 7.2. Durante toda la corrida, se cuidó el flujo de 1 mL/min aproximando al
19 %, el volumen, rango de sensibilidad y el registro en papel de la absorbancia a 280
nm del blanco (6 cm/h) y de la muestra (12 cm/h).
23
HIBRIDACIÓN DOT-BLOT
La hibridación dot-blot se realizó después de la purificación en FPLC para conocer la
fracción en la que se obtuvo la proteína y poder proceder a la segunda purificación de
la misma.
Esta técnica consistió en la activación de la membrana PVDF con metanol por 1 min a
temperatura ambiente, posteriormente se le retiró el metanol y se le adicionó 10 mL de
TBS 1X por 3 min para equilibrar la membrana con el buffer, se retiró el buffer y en
cada uno de los cuadrantes se colocaron 5 μL de la muestra a analizar. Se dejó secar la
membrana y posteriormente se llevó a cabo su bloqueo en TBS con leche al 5% por 30
min, se retiró y recuperó la solución y se le agregaron 15 mL de TBS 1X y se incubó
por 10 min a temperatura ambiente. Después se agregó el primer anticuerpo específico
anti antígeno recombinante (0.2 μg/mL) y se dejó incubando por 2 h, posteriormente
se realizaron 3 lavados con TBS 1X + tween 20 al 0.05 % por 10 min cada uno, se
retiró sobrenadante y se colocó el segundo anticuerpo a la misma concentración del
anterior y se hicieron otros 3 lavados para posteriormente revelar la membrana. Para el
revelado se ocupó el kit de quimioluminiscencia (SuperSignal™ West Pico
Chemiluminescent Substrate). Para ello se ocuparon 300 μL de la solución A y 300 μL
de la solución B y además se colocaron 10 μL de la solución A del SuperSignal™ West
Femto Maximum Sensitivity Substrate. Una vez colocadas las soluciones encima de la
membrana se mezclaron y se mojó muy bien toda la superficie de la misma con la
solución y finalmente se colocó en el Digidoc para digitalizar la imagen de la
membrana.
PURIFICACIÓN EN CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
(HPLC) EN FASE REVERSA
En esta cromatografía se utilizó la columna Symmetry300 C4 Waters, la cual muestra
un excelente rendimiento para separar simultáneamente péptidos hidrofílicos e
24
hidrofóbicos, así como péptidos neutros y sumamente básico, además ofrece un mejor
rendimiento en condiciones de carga de masas altas y bajas. Dicha columna tiene un
diámetro interno de 4.6 mm y una longitud de 50 mm.
Los reactivos utilizados fueron agua Milli-Q, Buffer A: 0.1% (v/v) TFA en agua y
Buffer B: 100% CH3CN + 0.1% (v/v) TFA.
Las cantidades utilizadas de soluciones fueron 1 mL/min de 0.1% TFA en agua por 5
min, aplicando un gradiente de 0% hasta 85% de TFA al 0.1% en Acetonitrilo desde
los 5 a los 90 min y por ultimo 1 mL/min de 100% CH3CN.
Se conectó el protector y la columna al sistema de suministro de solvente 100% buffer
A y se equilibró bajo las condiciones iniciales con un caudal de 1 mL/min. Una vez
que se obtuvo la línea de base estable, se procedió a inyectar agua Milli-Q + TFA 0.1%
por medio del inyector automático con un flujo de 0.4 mL/min y se usó un gradiente
lineal de 0 a 100 % de buffer B durante 30 min para eluir los 50 μL de muestra.
Conforme avanzó el gradiente se pudieron observar los picos donde se encontraba la
proteína de interés mediante los dos canales de detección de longitud de onda a 220 nm
y 280 nm, se recolectó la fracción en tubos para su posterior uso.
ELECTROFORESIS SDS-PAGE
Las fracciones se dializaron y resuspendieron en H2O Milli Q y posteriormente se
realizó un gel SDS-PAGE al 12.5% y Western Blot del antígeno recombinante
purificado para observar las proteínas obtenidas y verificar su pureza, así como de la
cantidad con la que se cuenta, para el gel se colocaron 5 μg de muestra y se utilizó el
anticuerpo específico para el antígeno recombinante.
25
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
CRECIMIENTO DE P. pastoris C2, E INDUCCIÓN PARA PRODUCIR AR
La colonia 2 (C2) de P. pastoris transformada con pAJVT fue crecida en dos medios
de cultivo. En la primera etapa de crecimiento se utilizó el medio BMGY durante 36 h
para obtener suficiente biomasa (Figura 1) y en la segunda etapa se utilizó el medio
BMMY con metanol para inducir la producción de proteína recombinante durante 63
h (Figura 2).
a) b)
Figura 1. Curvas de crecimiento de P. pastoris C2 en medio BMGY. Los experimentos fueron
realizados por triplicado y cada punto representa la desviación estándar. a) Curva de
crecimiento a escala lineal y b) Curva de crecimiento a escala logarítmica.
En la segunda etapa de crecimiento se añadió metanol al 1% al medio BMMY, el
inóculo proveniente de la primera etapa fue lavado y colocado a una D.O. 600 nm de 1.0
U.A., la cinética se llevó a cabo durante 63 h (Figura 2).
26
a) b)
Figura 2. Curvas de crecimiento de P. pastoris C2 en medio BMMY. a) Curva de crecimiento
a escala lineal y b) Curva de crecimiento a escala logarítmica. Los experimentos fueron
realizados por triplicado y cada punto representa la desviación estándar. La adición de metanol
al 1% se realizó a las 3, 9, 15, 21, 27, 33, 36, 41, 59 y 63 h.
La velocidad específica de crecimiento (μ) para ambas etapas (medio BMGY y
BMMY) se determinó calculando la pendiente de la fase exponencial de la cinética de
crecimiento en escala log (Figuras 1b y 2b), tal como se muestra en la Tabla 1.
Tabla 1. Comparación de la concentración de la biomasa máxima alcanzada en el medio
BMMY y velocidad específica de crecimiento de la cepa de P. pastoris cultivadas en dos
medios con diferente fuente de carbono.
Cepa Biomasa máx BMMY (gL-1) μ BMGY (h-1) μ BMMY (h-1)
C2 19.9 ± 0.00 0.37 ± 0.013 0.139 ± 0.018
La acumulación de biomasa se calculó por peso seco a lo largo de la cinética en el
cultivo BMMY (Figura 3), y se observa que se alcanzó una biomasa máxima de 19.9
gL-1 a las 63 h de cultivo.
27
Figura 3. Biomasa determinada en peso seco de P. pastoris a 60ºC, durante 63 h de cultivo en
medio BMMY. Los experimentos fueron realizados por triplicado y se muestra en cada punto
la desviación estándar.
PURIFICACIÓN DE PROTEÍNA
En la figura 4, se presentan los resultados de la primera separación del sobrenadante
obtenido en la cinética inducida con metanol en FPLC Sephacryl S-100. Se observó la
separación de la fracción soluble de los cultivos en al menos dos fracciones.
Figura 4. Separación por exclusión molecular del sobrenadante obtenido en la cinética
inducida con metanol. Se usó la columna Sephacryl S-100 HR para péptidos o biomoléculas
con un peso molecular de 1-100 kDa. El componente de importancia se obtuvo alrededor de
los 42 min. La separación proteica fue seguida con absorbancia a 280 nm.
Fracción 1
Fracción 2
28
Una vez observadas las dos fracciones se procedió a verificar cual contenía a la proteína
de interés, para ello se realizó un dot-blot.
BÚSQUEDA DEL ANTÍGENO RECOMBINANTE POR DOT-BLOT
En la tabla 2, se esquematiza la posición de cada fracción en la membrana así como el
control y en la figura 5, la visualización de la misma en el Digidoc.
Tabla 2. Posición de muestras en cada cuadrante de la membrana PVDF.
A B C
1 Fracción 1 Fracción 2 Control + 5 μL de
muestra sin purificar
2 Fracción 1 Fracción 2 -----
Figura 5. Visualización de fracción de interés (fracción 1) en Digidoc. En cada cuadrante se
colocaron 5 μL de muestra. Cuadrantes: A1 y A2= fracción 1, B1 y B2= fracción 2 y C1=
control + 5 μL de muestra sin purificar.
ELECTROFORESIS SDS-PAGE
En la Figura 6, se puede observar la electroforesis SDS-PAGE al 12.5% con el AR
purificado por FPLC, así como también las diferentes muestras obtenidas a lo largo de
la obtención y purificación del AR. Y en la Figura 7, se observa el Western Blot del
antígeno recombinante utilizando un anticuerpo específico.
1
2
A B C
29
a) b)
Figura 6. a) Electroforesis SDS-PAGE al 12.5% Carriles: 1=marcador de peso molecular,
2=proteína total del sobrenadante. b) Electroforesis SDS-PAGE al 12.5%. Se cargaron 42 μg
de cada muestra (cuantificada en Nanodrop). Carriles: 1= marcador de peso molecular, 2 y 3
=fracción 1, 4 y 5= fracción 2 de la purificación en FPLC por duplicado y 6 y 7= proteína total
del sobrenadante dializada.
Figura 7. Western Blot de la fracción 1 del antígeno recombinante utilizando un
anticuerpo específico.
kDa
70
55
40
35
25
30
P. pastoris es una levadura cuyo potencial para producir proteínas de uso terapéutico
es alto, debido a sus tiempos de cultivo, su manejo industrial y su bajo costo de
producción.
Referente al crecimiento de P. pastoris en medio con glicerol se ha reportado
anteriormente una velocidad específica de crecimiento de 0.26 h-1 en matraz agitado
con medio basal de sales (Chiruvolu et al., 1998), sin embargo, en el presente trabajo
se obtuvo una μ de 0.37 h-1, por lo tanto se le atribuye dicha velocidad al matraz
bafleado que incrementa la transferencia de oxígeno al medio en comparación con los
matraces Erlenmeyer.
En cuanto al crecimiento e inducción con metanol en el medio BMMY se obtuvo una
μ de 0.139 h-1 coincidiendo con lo reportado en 1990 por Brierley y colaboradores,
donde obtuvieron una μ de 14 h-1.
En los geles presentados observamos un cambio conforme avanzaron los métodos de
purificación del antígeno recombinante. Es importante mencionar que tanto la
precipitación con TCA-Acetona al 30% como la diálisis, nos permitieron la separación
de la proteína de interés, eliminando residuos u otras partículas que se obtuvieron junto
con ella del sobrenadante del cultivo.
Aunque se logró la purificación del antígeno recombinante por FPLC y se comprobó
que fracción contenía a la proteína de interés por medio de un dot-blot y un western-
blot, es necesario el realizar la purificación por RP-HPLC debido a que aún se pueden
observar otras bandas que no pertenecen a la proteína de interés.
31
CONCLUSIONES
Se logró purificar mediante FPLC, así como el caracterizar la producción del antígeno
recombinante de M. tuberculosis después de la inducción del sobrenadante con metanol
en la levadura de expresión Pichia pastoris, donde se comprobó que el medio BMMY
favorece la producción del antígeno recombinante el cual se acumula conforme avanza
el tiempo de cultivo.
Los resultados obtenidos nos dan la posibilidad de emplear el sistema de expresión P.
pastoris, en bioprocesos de alta producción de antígenos recombinantes con el objetivo
de desarrollar una alternativa de diagnóstico eficiente para tuberculosis.
PERSPECTIVAS
Purificar el antígeno recombinante por HPLC en fase reversa, así como evaluar
los mejores parámetros de purificación (tiempo de elución) para esta proteína.
Desarrollar estrategias para mejorar la productividad de la proteína, tal como
un diseño de bioproceso donde se logre alcanzar una D.O. mayor a la obtenida
en este trabajo.
32
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35
ANEXOS
TABLA I
Características de los principales métodos de apoyo diagnóstico en tuberculosis
Prueba Tiempo requerido Principales inconvenientes Valor diagnóstico
Baciloscopia 3 días (3 muestras) Sensibilidad baja y ninguna
especificidad
No
Cultivo convencional 4-6 semanas El tiempo que requiere Sí
Reacción en cadena de la
polimerasa
3-4 h Coste elevado Sí
Inmunodiagnóstico 4-6 h No hay antígenos adecuados No
Figura Anexo. Características de los principales métodos de apoyo diagnostico en tb. Tomado de:
Palma-Nicolás jp et al. Estrategias innovadoras para el diagnóstico y seguimiento de los pacientes
tuberculosis. Arch Bronconeumol. 2007;43(4):225-32
Table 1. Proteins associated with active TB
Protein ID* Annotation*
Rv3881c
Rv1860
Rv0934
Secreted antigen EspB
Secreted glycoprotein 45-47
kDa antigen/MPT32
Glycolipoprotein 38kDa
antigen/PstS1
Figura Anexo. Proteínas con actividad asociadas a TB. Tomado de: Kunnath-Velayudhan et al.
Dynamic antibody responses to the Mycobacterium tuberculosis proteome.PNAS.107 (33):14703-8.
36
Figura Anexo. Equipo de FPLC, purificador de proteína con columna Sephacryl S-100 HR.
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