UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE SINALOA

Unidad Académica de Ingeniería en Biotecnología

PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UN ANTÍGENO

RECOMBINANTE PRODUCIDO EN LEVADURA

Rosa Laura Cárdenas López

Tesina presentada como requisito parcial para optar al título de:

Licenciado en Ingeniería en Biotecnología

Director de tesina

Dra. Norma Adriana Valdez Cruz

INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS UNAM

Co director de tesina

Dra. Noemí García Magallanes

UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE SINALOA

Mazatlán, Sinaloa, Diciembre del 2015

ii

iii

El presente trabajo se realizó en el Laboratorio de la Dra. Norma Adriana Valdez

Cruz, con el apoyo de los proyectos de CONACyT 220795, 178528, 181895 y el

Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica

DGAPA IN208415; PAPITT 209113, 210013. Los experimentos fueron llevados a

cabo en el Instituto de Investigaciones Biomédicas, en los laboratorios C-036 (a

cargo de la Dra. Valdez Cruz), así como en la Unidad de Bioprocesos (a cargo del

Dr. Mauricio Alberto Trujillo Roldán) del Departamento de Biotecnología y

Biología Molecular. Los experimentos fueron desarrollados particularmente, con

el apoyo del proyecto DAGAPA-IN208415.

Este trabajo fue asesorado por el siguiente Comité Tutoral:

Dra. Norma Adriana Valdez Cruz, Director.

Dra. Noemí García Magallanes, Codirector.

M. en C. Iliana Hetzabet Zazueta Ojeda, Secretario.

iv

DEDICATORIA

A mis padres Laura y Ramiro,

Quienes han sido mi gran ejemplo a seguir..

A quienes siempre estaré eternamente agradecida por todos sus maravillosos,

incondicionales y amorosos consejos. Por siempre confiar en mí y en mi potencial, por

apoyarme y consentirme cada día y en cada momento de mi vida.

A mi Little bro, Ramiro Jr. Gracias por hacer mis días más ligeros, por soportarme y

enseñarme siempre, te quiero mucho.

Los amo intensamente. Sin ustedes no sería lo que soy.

Mi mayor meta en esta vida es ser feliz y hacer feliz a los que me rodean…

v

AGRADECIMIENTOS

A mi tutora:

Dra. Norma Adriana Valdez Cruz

Por la asesoría, tiempo y consejos brindados durante el lapso de realización de mi

proyecto de tesina.

A mi asesora:

Dra. Noemí García Magallanes

Por las valiosas aportaciones, enseñanzas y consejos a lo largo de mi carrera, así

como en el presente proyecto.

Además, deseo expresar mi gratitud a Daniel Juárez López y Carlos Giroshi

Bando, del Instituto de Investigaciones Biomédicas-UNAM, por sus oportunas

sugerencias y aportaciones al presente trabajo.

vi

ÍNDICE GENERAL

Página

ÍNDICE DE FIGURAS viii

ÍNDICE DE TABLAS ix

RESUMEN x

ABSTRACT xi

INTRODUCCIÓN 12

ANTECEDENTES 14

Antígenos de Mycobacterium tuberculosis 14

Glicosilación en Pichia pastoris 15

Producción del antígeno recombinante 16

Purificación de proteínas 16

OBJETIVOS 19

General 19

Específicos 19

MATERIALES Y MÉTODOS 20

Cinética de crecimiento e inducción de P. pastoris 20

Acumulación de biomasa determinada por peso seco 20

Precipitación de proteínas 21

Determinación de la concentración de proteínas 21

Purificación de proteína 22

Primera purificación – FPLC 22

Hibridación Dot-Blot 23

Purificación en cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) en

fase reversa 23

Electroforesis SDS-PAGE 24

vii

RESULTADOS Y DISCUSIÓN 25

Crecimiento de P. pastoris C2, e inducción para la producción del AR 25

Purificación de proteína en FPLC 27

Búsqueda del antígeno recombinante por Dot-Blot 28

Electroforesis SDS-PAGE 28

CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS 31

BIBLIOGRAFÍA 32

ANEXOS 35

viii

ÍNDICE DE FIGURAS

Página

Figura 1. Curvas de crecimiento de P. pastoris C2 en medio BMGY. Los experimentos

fueron realizados por triplicado y cada punto representa la desviación estándar. a)

Curva de crecimiento a escala lineal y b) Curva de crecimiento a escala logarítmica. 25

Figura 2. Curvas de crecimiento de P. pastoris C2 en medio BMMY. Los

experimentos fueron realizados por triplicado y cada punto representa la desviación

estándar. La adición de metanol al 1% se realizó a las 3, 9, 15, 21, 27, 33, 36, 41, 59 y

63 h. a) Curva de crecimiento a escala lineal y b) Curva de crecimiento a escala

logarítmica. 26

Figura 3. Biomasa determinada en peso seco de P. pastoris a 60ºC, durante 63 h de

cultivo en medio BMMY. Los experimentos fueron realizados por triplicado y se

muestra en cada punto la desviación estándar. 27

Figura 4. Separación por exclusión molecular del sobrenadante obtenido en la cinética

inducida con metanol. Se usó la columna Sephacryl S-100 HR para péptidos o

biomoléculas con un peso molecular de 1-100 kDa. El componente de importancia se

obtuvo a los 42 min. La separación proteica fue seguida con absorbancia a 280 nm. 27

Figura 5. Visualización de fracción de interés (fracción 1) en Digidoc. En cada

cuadrante se colocaron 5μl de muestra. Cuadrantes: A1 y A2= fracción 1, B1 y B2=

fracción 2 y C1= control + 5μl de muestra sin purificar. 28

Figura 6. a) Electroforesis SDS-PAGE al 12.5% Carriles: 1=marcador de peso

molecular, 2=proteína total del sobrenadante. b) Electroforesis SDS-PAGE al 12.5%.

Se cargaron 42 μg de cada muestra (cuantificada en Nanodrop). Carriles: 1= marcador

de peso molecular, 2 y 3 =fracción 1, 4 y 5= fracción 2 de la purificación en FPLC por

duplicado y 6 y 7= proteína total del sobrenadante dializada. 29

Figura 7.Western Blot del antígeno recombinante utilizando un ab específico. 29

ix

ÍNDICE DE TABLAS

Página

Tabla 1. Comparación de la concentración de la biomasa máxima alcanzada y

velocidad específica de crecimiento de la cepa de P. pastoris cultivadas en dos medios

con diferente fuente de carbono. 26

Tabla 2. Posición de muestras en cada cuadrante de la membrana PVDF. 28

x

RESUMEN

La tuberculosis pulmonar es una enfermedad infecciosa crónica causada

principalmente por el agente Mycobacterium tuberculosis. La actual vacuna BCG

protege contra dicha infección de un 0 al 80% de los casos, así mismo, el test de

tuberculina genera falsos positivos y/o negativos; es por ello, que la opción de

desarrollar nuevos métodos de prevención utilizando antígenos recombinantes es una

alternativa. En el presente trabajo, se llevó a cabo la producción de un antígeno

secretado por M. tuberculosis en la levadura Pichia pastoris puesto que esta, ha sido

ampliamente utilizada como sistema de expresión de proteínas recombinantes. Aquí se

analizó la producción de un antígeno recombinante a partir de una clona generada en

el laboratorio, inducible por metanol en medio BMMY. El antígeno fue purificado en

FPLC y mediante cromatografía líquida de alta eficiencia en fase reversa y analizada

mediante SDS/PAGE y Western blot. Estos resultados muestran que la levadura P.

pastoris pudiera ser un buen hospedero alternativo para la expresión de antígenos

recombinantes de M. tuberculosis.

Palabras clave: Mycobacterium tuberculosis, Pichia pastoris, vacuna, antígenos

recombinantes.

xi

ABSTRACT

Pulmonary tuberculosis is a chronic infectious disease caused mainly by

Mycobacterium tuberculosis agent. Actual vaccine BCG confers protection against the

infection from 0 to 80% of cases, in the same way, the tuberculin test generates false

positive/negative; It is for this reason that the option of developing new prevention

methods using recombinant antigens is an appropriate alternative. In this work, we

carried out the production of an antigen secreted by M. tuberculosis in Pichia pastoris

yeast because; it has been widely used as an expression system for recombinant

proteins. Here the production of a recombinant antigen was analyze from a clone

generated in the laboratory, inducible by methanol in culture media BMMY. The

recombinant antigen was purify by FPLC, reverse phase high-resolution liquid

chromatography, and analyzed by SDS-PAGE and Western blot. These results show

that the yeast P. pastoris may be a good alternative host for the expression of

recombinant antigens from M. tuberculosis.

Keywords: Mycobacterium tuberculosis, Pichia pastoris, vaccine, recombinant

antigen.

12

INTRODUCCIÓN

Un antígeno es una molécula que al entrar en contacto con otro organismo genera una

respuesta inmune, dando lugar a la producción de macromoléculas denominadas

anticuerpos para neutralizar el antígeno (respuesta inmune humoral) o induce a la

proliferación de células sensibilizadas (respuesta inmune celular), con las que

reacciona específicamente (MacCallum et al., 1996)

Mycobacterium tuberculosis es la primer causa de muerte a nivel mundial causada por

un organismo infeccioso (en segundo lugar está el VIH-SIDA). Esta micobacteria

produce una variedad de antígenos con potencial clínico para utilizarse en el diseño y

mejoramiento de vacunas y/o pruebas de serodiagnóstico, ya que la vacuna solo protege

de un 0-80% de los casos y el diagnóstico se vuelve impreciso por la presencia de otras

micobacterias en el ambiente. Dentro de los antígenos que secreta M. Tuberculosis se

encuentran 85A, 85B, 85C (Ronning, et al., 2004), PirG (Rv3810), secuencia

polimórfica-GC repetitiva (PE-PGRS; Rv3367), y proteína repetitiva prolina treonina

(PTRP) (Rv0538), tienen múltiples repeticiones en tándem de secuencias de

aminoácidos únicas y tienen características de superficie o proteínas secretadas, MtrA

(Rv3246c) (Singh et al., 2001), 38 kDa (RV0934) (Kunnath-Velayudhan et al., 2010),

45-47 kDa (Rv1860) (el cual tiene potencial inmunodominante como una vacuna

contra la tuberculosis (Laqueyrerie et al., 1995), por mencionar solo algunos.

Recientemente, se ha centrado particular interés en la producción y purificación de

antígenos recombinantes de M. tuberculosis utilizando sistemas bacterianos y

levaduras.

La producción de proteínas con potencial clínico en células de organismos como

bacterias y levaduras, utilizando tecnología recombinante es una alternativa muy

prometedora que permite continuar ensayos clínicos y que pueden concluir en el diseño

de tratamiento a diversas enfermedades y síndromes que afectan hoy en día (Córdoba,

Algecira et.al. 2003).

13

Una de las ventajas de emplear antígenos proteicos para realizar inmunodiagnósticos

es que éstos pueden producirse mediante la tecnología del ADN recombinante, lo que

permite su expresión y purificación a gran escala, con el consiguiente abaratamiento

de los costos de la prueba.

La primer levadura utilizada para la producción de proteínas recombinantes fue

Saccharomyces cerevisiae como reemplazo de la bacteria Escherichia coli debido a

que esta última, por ser bacteria, presenta limitaciones en cuanto a la inhabilidad de

realizar modificaciones postraduccionales como la glicosilación. Sin embargo, S.

cerevisiae glicosila proteínas de una manera muy diferente a las células humanas y

produce proteínas bastante antigénicas. Otro sistema de expresión es Pichia pastoris,

que es un microorganismo eucariota unicelular, fácil de manipular y cultivar. Además

tiene la maquinaria enzimática para realizar modificaciones postraduccionales, tales

como procesamiento proteolítico, plegado, formación de enlaces disulfuro y

glicosilación (Cregg et al., 2000)

La utilización de P. pastoris como sistema de producción de proteínas recombinantes

en bioprocesos permite producir proteínas postraduccionalmente modificadas y

similares a las nativas (Viader-Salvadó et al, 2009). Sin embargo, como en todo

bioproceso, la obtención de proteína recombinante requiere la separación y purificación

de los antígenos.

La importancia de obtener y purificar estas proteínas es el poder continuar con los

ensayos inmunogénicos y posiblemente utilizarla como componente de un kit de

diagnóstico multiantigénico para tuberculosis con alta eficiencia (Macauley-Patrick

et.al., 2005) ya que el método de diagnóstico actual conocido como la prueba cutánea

de la tuberculina (DTH) tiende a ser inespecífico ya que puede generar falsos positivos

y/o negativos (Palma-Nicolás y Bocanegra-García, 2007).

14

ANTECEDENTES

Antígenos de Mycobacterium tuberculosis

Actualmente, entre los antígenos secretados de M. tuberculosis y que han sido descritos

como inductores de la secreción de mediadores asociados a protección contra la

infección por M. tuberculosis están las proteínas de 10, 6, 27 y 38 kDa, por inducir la

producción de IFN-γ, TNF-α y óxido nítrico, todos estos relacionados con una

respuesta inmunitaria protectora (Araujo Z. et.al. 2008).

Particularmente la lipo-glico-proteína de 38 kDa, (Braibant et al., 2000), se puede

encontrar tanto intracelularmente como secretada en el sobrenadante de cultivo

extracelular (Young y Garbe, 1991). En M. tuberculosis, tres operones de dicho

antígeno se han identificado, lo que probablemente constituye una adaptación

bioquímica sutil de este microorganismo para su crecimiento y supervivencia bajo

diferentes condiciones de limitación de fosfato durante su ciclo infeccioso (Cole, et al.

1998).

Entre las especies de micobacterias, este antígeno se encuentra sólo presente en M.

tuberculosis y M. bovis, siendo su concentración en el primero 10 veces superior. La

secuencia de aminoácidos del antígeno posee un 30% de homología con una proteína

(PhoS) relacionada con la fijación y el transporte de fósforo en Escherichia coli, la cual

se incrementa durante la disminución de fosfato en el citoplasma (Araujo et al., 2008).

Además según Araujo y colaboradores (2008), se sabe que posee diferentes epítopes

localizados en la porción central de la molécula y en el carboxilo terminal, los cuales

son capaces de inducir la proliferación de clones de células T específicos para M.

tuberculosis, aunque algunos pueden tener reactividad cruzada.

Dicha proteína se ha empleado como antígeno para métodos inmunológicos de

detección de anticuerpos circulantes en pacientes (serodiagnóstico), debido a que

alcanza el 80% de sensibilidad en pacientes con baciloscopias positivas. Se dice

también que este análisis constituye una alternativa muy importante para diagnosticar

15

la Tuberculosis activa, y dependiendo de la clase de inmunoglobulina que sea detectada

(IgG o IgM) se podrá indicar si el proceso infeccioso se encuentra o no en curso (Palma-

Nicolás y Bocanegra-García, 2007)

Así mismo, según Palma y Bocanegra (2007) para ampliar la sensibilidad y

especificidad que se alcanzan con los antígenos puros se propuso utilizar una mezcla

de varios antígenos inmunodominantes con el fin de cubrir toda la gama de respuestas

que se dan entre los individuos de una población consiguiendo una sensibilidad del

90%.

Glicosilación en Pichia pastoris

Tanto en bacterias como en eucariotes suceden modificaciones postraduccionales,

como por ejemplo la glicosilación. Existen varios tipos de glicoproteínas, de las cuales

dos son las más abundantes: las N-glicoproteínas y las O-glicoproteínas (Voet et.al.,

2007). Particularmente, la N-glicosilación en eucariotes se inicia en el retículo

endoplásmico con la transferencia de una unidad de enlace lipídico-oligosacárido de

residuos de manosa y N-acetilglucosamina (Córdoba et.al. 2003). A diferencia de los

N-oligosacáridos, los O-oligosacáridos se sintetizan de manera postraduccional, es

decir, la adición serial de unidades de monosacáridos inicia cuando la síntesis de la

cadena polipeptídica ha finalizado (Voet et.al., 2007)

La estructura de oligosacáridos de la invertasa producida en S. cerevisiae y P. pastoris

fue determinada y comparada con la estructura de oligosacáridos de mamíferos

(Tschopp et al., 1987).

P. pastoris tiene los mecanismos para adicionar O- y N-oligosacáridos a las proteínas

secretadas. Los glicanos de la invertasa secretada por P. pastoris no tienen el residuo

de α 1-3 manosa característica en O- glicosilación de S. cerevisiae, el cual se ha

asociado con antigenicidad en las glicoproteínas producidas en ésta levadura (Córdoba

et.al. 2003) y, por tanto, las hace no aptas para producir sustancias de uso terapéutico.

16

En lo que confiere a los N-oligosacáridos, la ventaja de P. pastoris sobre S. cerevisiae

está en la glicosilación que realiza, pues ésta se parece más a la que hacen las células

humanas.

En P. pastoris, la O-glicosilación depende de genes que codifican para

manosiltransferasas, particularmente la Pmt1 y Pmt2 (Nett et.al, 2013). La O-

manosilación se inicia en el retículo endoplásmico utilizando la Manosil-P-Dolicol

como donador de glicanos; por lo general, las levaduras no agregan ácidos siálicos

terminales a los glicanos, pero usan los fosfatos, piruvato o ácido glucorónico para

impartir cargas negativas o para acidificar la proteína (Gemmill y Trimble, 1999).

Además según Gemill y Trimble (1999) la levadura puede realizar dichas

modificaciones del grupo hidroxilo del residuo treonina o serina sin que exista un sitio

consenso como tal.

Producción del antígeno recombinante

Koichi Ogata (1969) descubrió la habilidad que poseen las levaduras de consumir

metanol como su única fuente de carbono, es por ello que se toma en cuenta al inducir

el medio con metanol para lograr una buena producción de antígenos recombinantes.

Años más tarde (2000) Lin Cereghino y colaboradores aseguraron que P. pastoris

creció en un medio que consiste en una fuente pura de carbono (glicerol o metanol),

biotina, sales, trazas de elementos, agua y no secreta alta cantidad de proteínas

endógenas; por consiguiente las proteínas heterólogas secretadas pueden ser

identificadas fácilmente. Es por ello que la producción del antígeno recombinante

estudiado aquí fue producido en éstas levaduras.

Purificación de proteínas

Las proteínas se pueden separar y purificar gracias a las propiedades que posee cada

una como lo son el tamaño, la carga y las propiedades de unión (McMaster, 2007). El

primer paso para purificar las proteínas es romper las células para poder liberarlas, esto

posible utilizando centrifugación diferencial, seguida por el fraccionamiento donde el

17

extracto se somete a tratamientos que separan las proteínas por tamaño o carga. Otros

métodos de separación de proteínas es la diálisis la cual separa a las proteínas de los

disolventes haciendo uso de una membrana semipermeable la cual permite el

intercambio de sal y solución tampón pero no de las proteínas.

Dentro de los métodos más potentes para el fraccionamiento de proteínas se utilizan la

cromatografía en columna que aprovecha las diferencias de carga, tamaño y afinidad

de unión; donde se introduce en una columna un material sólido poroso de propiedades

químicas adecuadas (fase estacionaria) y se hace pasar a través del mismo una solución

tamponada (fase móvil); por ejemplo, en la cromatografía de intercambio catiónico la

matriz solida tiene grupos cargados negativamente, mientras que en la fase móvil las

proteínas con carga positiva neta migran más lento que aquellas con carga negativa

neta debido a la interacción que existe con la fase estacionaria, cabe destacar que las

hay inversas conocidas como cromatografía de intercambio aniónico, ambas formando

parte de las cromatografías de intercambio iónico (Nelson y Cox, 2005).

En cuanto a la cromatografía de exclusión molecular se separan las proteínas según su

tamaño (Nelson y Cox, 2005), la matriz de la columna es un polímero entrecruzado con

poros de un tamaño seleccionado en donde las proteínas de mayor tamaño se desplazan

más rápido que las de menor tamaño ya que son muy grandes como para penetrar en

los poros de las partículas y siguen una ruta más directa para eluir, en cambio las

pequeñas si penetran en los poros y retardan su tiempo de elución.

La cromatografía de afinidad separa las proteínas según su especificidad de unión, las

proteínas retenidas en la columna son las que se unen específicamente a un ligando

unido covalentemente a las partículas, una vez que se han lavado las proteínas que no

se unen a través de la columna, la proteína de interés que se encuentra unida, se eluye

por medio de una solución que contiene ligando libre (Nelson y Cox, 2005).

Al hablar de la cromatografía líquida de alta eficiencia, estamos hablando de un

refinamiento moderno de los métodos cromatográficos en el cual se utilizan bombas de

18

alta presión que aceleran el movimiento de las moléculas de proteína en la columna,

(McMaster, 2007).

En general, la purificación de proteínas se ha realizado utilizando diferentes técnicas

cromatográficas, que permiten su separación según su naturaleza bioquímica, como por

ejemplo FPLC (cromatografía líquida rápida de proteínas) y HPLC (cromatografía

líquida de alta eficiencia). FPLC está optimizado para correr macromoléculas

biológicas en columnas de agarosa o poliméricos monobásicos. Incluye un excelente

rendimiento y vida útil de las columnas, posee inherencia frente a las concentraciones

muy altas de sal, la disponibilidad de inyección automatizada inteligente y válvulas de

selección de disolvente, y programación sencilla del sistema. (Aguilar M-I, 2004)

RP-HPLC (cromatografía líquida de alta eficiencia en fase reversa) es una técnica

eficiente para la separación de péptidos y proteínas a causa de una excelente resolución

que se puede lograr una amplia gama de condiciones cromatográficas para moléculas

muy estrechamente relacionadas (McMaster, 2007).

La selectividad de esta técnica puede ser manipulada a través de cambios en las

características de la fase móvil, las recuperaciones son generalmente altas y, por lo

tanto presenta una alta productividad y la excelente reproducibilidad de separaciones

repetitivas llevadas a cabo durante un largo período de tiempo (Aguilar M-I, 2004).

19

OBJETIVOS

General

Purificar y caracterizar un antígeno recombinante de M. tuberculosis a partir de

sobrenadantes de cultivos de la levadura de expresión Pichia pastoris.

Específicos

Caracterizar la producción del antígeno recombinante después de su inducción

con metanol.

Separar el antígeno recombinante mediante exclusión molecular.

Purificar el antígeno recombinante mediante cromatografía de alta resolución.

20

MATERIALES Y MÉTODOS:

CINÉTICA DE CRECIMIENTO E INDUCCIÓN DE P. pastoris

El material biológico utilizado fue Pichia X33 para las transformaciones con el vector

que contienen el gen codificante para el antígeno recombinante (propiedad del lab 036

IIB/UNAM).

La cinética de crecimiento de P. pastoris se realizó en dos medios, BMGY y BMMY,

el primero contenía extracto de levadura (5g), peptona (10g) y glicerol (5mL) como

fuente de carbono BMGY/Zeocina (200μg/mL), el otro medio solo se diferenciaba en

que no contenía glicerol sino metanol (0.5%) como fuente de carbono y energía, las

condiciones de cultivo fueron 150 rpm a 30ºC (C25 Incubator Shaker, New Brusnwick

Scientific).

Una vez inoculados 50 mL del medio BMGY en matraz bafleado de 250 mL, se

tomaron muestras de 1mL cada 3 h para determinar el crecimiento mediante densidad

óptica (D.O. 600 nm), una vez en estado de crecimiento exponencial, se procedió a

centrifugar el medio a 10,000 rpm por 20 min a 10ºC. Posteriormente, el pellet obtenido

se resuspendió en 10 mL de medio BMMY y se inoculó a 1 D.O. 600 nm los siguientes

matraces de BMMY para continuar con la cinética de crecimiento. Estos matraces se

mantuvieron a 30ºC y 150 rpm durante 63 h. La toma de muestra se realizó a las 0, 3,

9, 15, 21, 27, 33, 36, 41, 59 y 63 h con 1 mL para determinar densidad óptica, biomasa

y cuantificar proteína total de sobrenadante en cada punto. La biomasa se calculó en

peso seco con el pellet obtenido de 1 mL de muestra y secado a 60ºC durante 24 h.

ACUMULACIÓN DE BIOMASA DETERMINADA POR PESO SECO

La acumulación de biomasa se calculó por peso seco, donde se pesaron cada tubo

eppendorf antes de guardar en él 1 mL de muestra de las 0 a las 63 h. Posteriormente,

se centrifugaron los tubos a 8000 rpm por 10 min y se decantó el sobrenadante en

21

nuevos tubos, mientras que el pellet se llevó a secar a 60ºC por 24 h. Una vez totalmente

seco, se procedió a pesar el tubo con biomasa y al restarle el peso de cada tubo en

particular obtuvo la biomasa a la hora de toma de muestra.

PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS

Las proteínas del sobrenadante del medio de cultivo de P. pastoris fueron precipitadas

con TCA- Acetona al 30%. Para ello se tomaron 500 mL de sobrenadante y se le

agregaron 500 mL de TCA-Acetona. Se incubaron 24 h a -20ºC, y se centrifugaron a

velocidad máxima por 15 min a 10ºC. El sobrenadante fue retirado y posteriormente al

precipitado se le agregaron 5 mL de acetona al 80% y la mezcla fue centrifugada

nuevamente por 20 min. Después de retirarle el sobrenadante se hicieron dos lavados

con 5 mL de etanol al 70% y se centrifugó nuevamente a 10ºC por 20 min. Para terminar

la precipitación de las proteínas, la solución se secó en la incubadora 37ºC por 15 min

y al final se resuspendió el pellet en 4 mL de buffer PBS con inhibidor de proteasas.

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEINAS

Las proteínas totales del sobrenadante de la precipitación con TCA- Acetona fueron

cuantificadas por el método de Bradford sobre diluciones apropiadas de muestra.

Este método consiste en medir la concentración de la proteína involucrando la unión

del colorante Azul Coomasie G-250 con aminoácidos básicos (especialmente arginina)

y aromáticos, provocando en éstas un cambio en el máximo de absorción de 465 a 595

nm (García y Vázquez, 1998).

Para ello se realizaron diluciones de la muestra 1:10 y el stock de BSA (200 mg/mL),

se procedió a realizar la curva patrón en agua, y se colocaron directo en la placa: primer

pocillo: 45 μL H2O + 15 μL BSA, del segundo hasta el séptimo pocillo: 30 μL H2O +

30 μL BSA y en el último pocillo se colocaron 10 μL H2O. En cuanto a la curva de las

22

muestras se cargaron por duplicado 10 μL de la muestra diluida + 200 μL Bradford

directamente en la placa. Después, se procedió a leer la absorbancia a 595 nm de cada

una de las muestras.

PURIFICACIÓN DE PROTEÍNA

Para la purificación de la proteína se utilizaron dos tipos de cromatografía liquida,

cromatografía de exclusión molecular, y una cromatografía líquida de alta resolución

en fase reversa (RP- HPLC) basada en la separación por hidrofobicidad de las mismas.

En esta segunda purificación la separación dependió de la unión de la molécula de

soluto de la fase móvil a los ligandos hidrófobos inmovilizados unidos a la fase

estacionaria hidrofóbica.

Los equipos utilizados para las purificaciones fueron el Bio-Rad para FPLC y el

Shimadzu Solvent Delivery Module LC-20AT Prominence para RP- HPLC.

PRIMERA PURIFICACIÓN – FPLC

Para la purificación por exclusión molecular se utilizó una columna Sephacryl S-100

HR con un peso molecular de 1-100 kDa, dicha columna se empacó y se compactó

empleando dos flujos, el primero de 1 mL/min durante 2 h y el segundo flujo de 2.5

mL/min por 1 h, utilizando como buffer de equilibrio Fosfato de Sodio 0.05 M/ NaCl

0.15 M pH 7.2. Durante toda la corrida, se cuidó el flujo de 1 mL/min aproximando al

19 %, el volumen, rango de sensibilidad y el registro en papel de la absorbancia a 280

nm del blanco (6 cm/h) y de la muestra (12 cm/h).

23

HIBRIDACIÓN DOT-BLOT

La hibridación dot-blot se realizó después de la purificación en FPLC para conocer la

fracción en la que se obtuvo la proteína y poder proceder a la segunda purificación de

la misma.

Esta técnica consistió en la activación de la membrana PVDF con metanol por 1 min a

temperatura ambiente, posteriormente se le retiró el metanol y se le adicionó 10 mL de

TBS 1X por 3 min para equilibrar la membrana con el buffer, se retiró el buffer y en

cada uno de los cuadrantes se colocaron 5 μL de la muestra a analizar. Se dejó secar la

membrana y posteriormente se llevó a cabo su bloqueo en TBS con leche al 5% por 30

min, se retiró y recuperó la solución y se le agregaron 15 mL de TBS 1X y se incubó

por 10 min a temperatura ambiente. Después se agregó el primer anticuerpo específico

anti antígeno recombinante (0.2 μg/mL) y se dejó incubando por 2 h, posteriormente

se realizaron 3 lavados con TBS 1X + tween 20 al 0.05 % por 10 min cada uno, se

retiró sobrenadante y se colocó el segundo anticuerpo a la misma concentración del

anterior y se hicieron otros 3 lavados para posteriormente revelar la membrana. Para el

revelado se ocupó el kit de quimioluminiscencia (SuperSignal™ West Pico

Chemiluminescent Substrate). Para ello se ocuparon 300 μL de la solución A y 300 μL

de la solución B y además se colocaron 10 μL de la solución A del SuperSignal™ West

Femto Maximum Sensitivity Substrate. Una vez colocadas las soluciones encima de la

membrana se mezclaron y se mojó muy bien toda la superficie de la misma con la

solución y finalmente se colocó en el Digidoc para digitalizar la imagen de la

membrana.

PURIFICACIÓN EN CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN

(HPLC) EN FASE REVERSA

En esta cromatografía se utilizó la columna Symmetry300 C4 Waters, la cual muestra

un excelente rendimiento para separar simultáneamente péptidos hidrofílicos e

24

hidrofóbicos, así como péptidos neutros y sumamente básico, además ofrece un mejor

rendimiento en condiciones de carga de masas altas y bajas. Dicha columna tiene un

diámetro interno de 4.6 mm y una longitud de 50 mm.

Los reactivos utilizados fueron agua Milli-Q, Buffer A: 0.1% (v/v) TFA en agua y

Buffer B: 100% CH3CN + 0.1% (v/v) TFA.

Las cantidades utilizadas de soluciones fueron 1 mL/min de 0.1% TFA en agua por 5

min, aplicando un gradiente de 0% hasta 85% de TFA al 0.1% en Acetonitrilo desde

los 5 a los 90 min y por ultimo 1 mL/min de 100% CH3CN.

Se conectó el protector y la columna al sistema de suministro de solvente 100% buffer

A y se equilibró bajo las condiciones iniciales con un caudal de 1 mL/min. Una vez

que se obtuvo la línea de base estable, se procedió a inyectar agua Milli-Q + TFA 0.1%

por medio del inyector automático con un flujo de 0.4 mL/min y se usó un gradiente

lineal de 0 a 100 % de buffer B durante 30 min para eluir los 50 μL de muestra.

Conforme avanzó el gradiente se pudieron observar los picos donde se encontraba la

proteína de interés mediante los dos canales de detección de longitud de onda a 220 nm

y 280 nm, se recolectó la fracción en tubos para su posterior uso.

ELECTROFORESIS SDS-PAGE

Las fracciones se dializaron y resuspendieron en H2O Milli Q y posteriormente se

realizó un gel SDS-PAGE al 12.5% y Western Blot del antígeno recombinante

purificado para observar las proteínas obtenidas y verificar su pureza, así como de la

cantidad con la que se cuenta, para el gel se colocaron 5 μg de muestra y se utilizó el

anticuerpo específico para el antígeno recombinante.

25

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

CRECIMIENTO DE P. pastoris C2, E INDUCCIÓN PARA PRODUCIR AR

La colonia 2 (C2) de P. pastoris transformada con pAJVT fue crecida en dos medios

de cultivo. En la primera etapa de crecimiento se utilizó el medio BMGY durante 36 h

para obtener suficiente biomasa (Figura 1) y en la segunda etapa se utilizó el medio

BMMY con metanol para inducir la producción de proteína recombinante durante 63

h (Figura 2).

a) b)

Figura 1. Curvas de crecimiento de P. pastoris C2 en medio BMGY. Los experimentos fueron

realizados por triplicado y cada punto representa la desviación estándar. a) Curva de

crecimiento a escala lineal y b) Curva de crecimiento a escala logarítmica.

En la segunda etapa de crecimiento se añadió metanol al 1% al medio BMMY, el

inóculo proveniente de la primera etapa fue lavado y colocado a una D.O. 600 nm de 1.0

U.A., la cinética se llevó a cabo durante 63 h (Figura 2).

26

a) b)

Figura 2. Curvas de crecimiento de P. pastoris C2 en medio BMMY. a) Curva de crecimiento

a escala lineal y b) Curva de crecimiento a escala logarítmica. Los experimentos fueron

realizados por triplicado y cada punto representa la desviación estándar. La adición de metanol

al 1% se realizó a las 3, 9, 15, 21, 27, 33, 36, 41, 59 y 63 h.

La velocidad específica de crecimiento (μ) para ambas etapas (medio BMGY y

BMMY) se determinó calculando la pendiente de la fase exponencial de la cinética de

crecimiento en escala log (Figuras 1b y 2b), tal como se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1. Comparación de la concentración de la biomasa máxima alcanzada en el medio

BMMY y velocidad específica de crecimiento de la cepa de P. pastoris cultivadas en dos

medios con diferente fuente de carbono.

Cepa Biomasa máx BMMY (gL-1) μ BMGY (h-1) μ BMMY (h-1)

C2 19.9 ± 0.00 0.37 ± 0.013 0.139 ± 0.018

La acumulación de biomasa se calculó por peso seco a lo largo de la cinética en el

cultivo BMMY (Figura 3), y se observa que se alcanzó una biomasa máxima de 19.9

gL-1 a las 63 h de cultivo.

27

Figura 3. Biomasa determinada en peso seco de P. pastoris a 60ºC, durante 63 h de cultivo en

medio BMMY. Los experimentos fueron realizados por triplicado y se muestra en cada punto

la desviación estándar.

PURIFICACIÓN DE PROTEÍNA

En la figura 4, se presentan los resultados de la primera separación del sobrenadante

obtenido en la cinética inducida con metanol en FPLC Sephacryl S-100. Se observó la

separación de la fracción soluble de los cultivos en al menos dos fracciones.

Figura 4. Separación por exclusión molecular del sobrenadante obtenido en la cinética

inducida con metanol. Se usó la columna Sephacryl S-100 HR para péptidos o biomoléculas

con un peso molecular de 1-100 kDa. El componente de importancia se obtuvo alrededor de

los 42 min. La separación proteica fue seguida con absorbancia a 280 nm.

Fracción 1

Fracción 2

28

Una vez observadas las dos fracciones se procedió a verificar cual contenía a la proteína

de interés, para ello se realizó un dot-blot.

BÚSQUEDA DEL ANTÍGENO RECOMBINANTE POR DOT-BLOT

En la tabla 2, se esquematiza la posición de cada fracción en la membrana así como el

control y en la figura 5, la visualización de la misma en el Digidoc.

Tabla 2. Posición de muestras en cada cuadrante de la membrana PVDF.

A B C

1 Fracción 1 Fracción 2 Control + 5 μL de

muestra sin purificar

2 Fracción 1 Fracción 2 -----

Figura 5. Visualización de fracción de interés (fracción 1) en Digidoc. En cada cuadrante se

colocaron 5 μL de muestra. Cuadrantes: A1 y A2= fracción 1, B1 y B2= fracción 2 y C1=

control + 5 μL de muestra sin purificar.

ELECTROFORESIS SDS-PAGE

En la Figura 6, se puede observar la electroforesis SDS-PAGE al 12.5% con el AR

purificado por FPLC, así como también las diferentes muestras obtenidas a lo largo de

la obtención y purificación del AR. Y en la Figura 7, se observa el Western Blot del

antígeno recombinante utilizando un anticuerpo específico.

1

2

A B C

29

a) b)

Figura 6. a) Electroforesis SDS-PAGE al 12.5% Carriles: 1=marcador de peso molecular,

2=proteína total del sobrenadante. b) Electroforesis SDS-PAGE al 12.5%. Se cargaron 42 μg

de cada muestra (cuantificada en Nanodrop). Carriles: 1= marcador de peso molecular, 2 y 3

=fracción 1, 4 y 5= fracción 2 de la purificación en FPLC por duplicado y 6 y 7= proteína total

del sobrenadante dializada.

Figura 7. Western Blot de la fracción 1 del antígeno recombinante utilizando un

anticuerpo específico.

kDa

70

55

40

35

25

30

P. pastoris es una levadura cuyo potencial para producir proteínas de uso terapéutico

es alto, debido a sus tiempos de cultivo, su manejo industrial y su bajo costo de

producción.

Referente al crecimiento de P. pastoris en medio con glicerol se ha reportado

anteriormente una velocidad específica de crecimiento de 0.26 h-1 en matraz agitado

con medio basal de sales (Chiruvolu et al., 1998), sin embargo, en el presente trabajo

se obtuvo una μ de 0.37 h-1, por lo tanto se le atribuye dicha velocidad al matraz

bafleado que incrementa la transferencia de oxígeno al medio en comparación con los

matraces Erlenmeyer.

En cuanto al crecimiento e inducción con metanol en el medio BMMY se obtuvo una

μ de 0.139 h-1 coincidiendo con lo reportado en 1990 por Brierley y colaboradores,

donde obtuvieron una μ de 14 h-1.

En los geles presentados observamos un cambio conforme avanzaron los métodos de

purificación del antígeno recombinante. Es importante mencionar que tanto la

precipitación con TCA-Acetona al 30% como la diálisis, nos permitieron la separación

de la proteína de interés, eliminando residuos u otras partículas que se obtuvieron junto

con ella del sobrenadante del cultivo.

Aunque se logró la purificación del antígeno recombinante por FPLC y se comprobó

que fracción contenía a la proteína de interés por medio de un dot-blot y un western-

blot, es necesario el realizar la purificación por RP-HPLC debido a que aún se pueden

observar otras bandas que no pertenecen a la proteína de interés.

31

CONCLUSIONES

Se logró purificar mediante FPLC, así como el caracterizar la producción del antígeno

recombinante de M. tuberculosis después de la inducción del sobrenadante con metanol

en la levadura de expresión Pichia pastoris, donde se comprobó que el medio BMMY

favorece la producción del antígeno recombinante el cual se acumula conforme avanza

el tiempo de cultivo.

Los resultados obtenidos nos dan la posibilidad de emplear el sistema de expresión P.

pastoris, en bioprocesos de alta producción de antígenos recombinantes con el objetivo

de desarrollar una alternativa de diagnóstico eficiente para tuberculosis.

PERSPECTIVAS

Purificar el antígeno recombinante por HPLC en fase reversa, así como evaluar

los mejores parámetros de purificación (tiempo de elución) para esta proteína.

Desarrollar estrategias para mejorar la productividad de la proteína, tal como

un diseño de bioproceso donde se logre alcanzar una D.O. mayor a la obtenida

en este trabajo.

32

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35

ANEXOS

TABLA I

Características de los principales métodos de apoyo diagnóstico en tuberculosis

Prueba Tiempo requerido Principales inconvenientes Valor diagnóstico

Baciloscopia 3 días (3 muestras) Sensibilidad baja y ninguna

especificidad

No

Cultivo convencional 4-6 semanas El tiempo que requiere Sí

Reacción en cadena de la

polimerasa

3-4 h Coste elevado Sí

Inmunodiagnóstico 4-6 h No hay antígenos adecuados No

Figura Anexo. Características de los principales métodos de apoyo diagnostico en tb. Tomado de:

Palma-Nicolás jp et al. Estrategias innovadoras para el diagnóstico y seguimiento de los pacientes

tuberculosis. Arch Bronconeumol. 2007;43(4):225-32

Table 1. Proteins associated with active TB

Protein ID* Annotation*

Rv3881c

Rv1860

Rv0934

Secreted antigen EspB

Secreted glycoprotein 45-47

kDa antigen/MPT32

Glycolipoprotein 38kDa

antigen/PstS1

Figura Anexo. Proteínas con actividad asociadas a TB. Tomado de: Kunnath-Velayudhan et al.

Dynamic antibody responses to the Mycobacterium tuberculosis proteome.PNAS.107 (33):14703-8.

36

Figura Anexo. Equipo de FPLC, purificador de proteína con columna Sephacryl S-100 HR.