M. en C. Armando Lemos PastranaDepartamento de Microbiología

Escuela Nacional de Ciencias BiológicasIPN

MicroscopiaContenido

1. Historia2. Estructura de un microscopio compuesto3. Principios de microscopia4. Microscopios compuestos

• de campo claro• de campo obscuro• de contraste de fases• de fluorescencia• confocal

5. Microscopios electrónicos

• de transmisión• de barrido• de efecto túnel• de fuerza atómica

Historia del microscopio

El primer microscopio se atribuye a Zaccharias y Hans Janssen en 1590, consistía de dos tubos dentro de otro,en uno de los extremos una tenía una lente biconvexa,

que correspondía al ocular y una plano convexa en elotro extremo que correspondía al objetivo.

En 1670, Roberto Hooke diseñó uno de los microscopiosmás elegantes de esta época, el cual ilustra sutratado “Micrographia”, uno de los primeros documentos sobre microscopia e imágenes.

Antoni van Leewenhoek, fue un comerciante de telas, quien se dedicaba a tallar lentes,

convirtiéndose en un científico aficionado. El fue la primera persona que pudo observar a las

bacterias con un microscopio simple, organismos que no habían sido vistos con los microscopioscompuestos de la época que no tenían el poder

de resolución de su microscopio.

Historia del microscopio

En el siglo XVII, los diseñadores Británicoselaboraron diferentes versiones del microscopiode trípode, basado en el microscopio de Edmund Culpeper, que era un instrumento defácil uso y con mecanismos precisos de enfoque.

Durante el siglo XX, la tecnologíautilizada en la elaboración de losmicroscopios llega a su clímax, lacalidad de las lentes y las opcionesen el manejo y utilidades de losequipos han permitido un avanceenorme en las ciencias biológicas.

En el siglo XIX hubo un enormeavance en la tecnología de losmicroscopios, las lentes eran demuy buena calidad, los sistemasmecánicos incorporan los tornillosmacro y micrométricos e inicia lamicrofotografía.

Estructura de un microscopiocompuesto de campo brillante

Componentes principales

Oculares

Tubo de microscopio

Brazo

Objetivos

Platina Carro de platina

CondensadorTornillo de platina

Tornillos macro ymicrométricoFuente luminosa

Pie o base

Estructura de un microscopio Sistema óptico

Condensador

El condensador de un microscopio permite dirigir el haz de luz hacia el espécimen que se desea observar. Existen dos tipos de condensador, el más común es el de Abbe, el cual no corrige ninguna forma de aberración óptica. El segundo tipo es el condensador acromáticoque corrige tanto la aberración cromática como la esférica. De estos dos tipos de condenador existen variantes en cuanto al uso que se le va a dar, para campo obscuro, para contraste de fases, fluorescencia, etc. Todos los condensadores tienen grabada su apertura numérica, la cual debe de ser igual o ligeramente mayor a la apertura numérica de los objetivos, de no ser así la resolución con el objetivo no será total. En la mayoría de los condensadores se puede usar aceite entre la lente del condensador y la preparación, para usar la totalidad de la apertura numérica.

En forma general un condensador básico consta de tres partes:

Lente frontal

Diafragma de iris del condensador

Lente auxiliar

Sistema ópticoEstructura de un microscopio

Objetivos.

Los objetivos son las lentes más cercanas al espécimen que se desea observar y se encuentran montados en el revolver. Los objetivos generalmente encontrados en microscopios de enseñanza son los objetivos acromáticos, cuales están corregidos para aberración esférica y aberración cromática en dos colores. Otro tipo de lente son los objetivos apocromáticos, los cuales tienen corregida la aberración cromática para los tres colores (verde, rojo y azul) y una corrección mayor en la aberración esférica. Los objetivos semiapocromáticos tienen una corrección intermedia entre los dos tipos anteriores.

Los tres tipos de objetivo se elaboran con un sistema compensatorio de lentes que evitan la curvatura del campo, dando como resultado una imagen plana y se les conoce con el nombre de plano objetivos.

Sistema ópticoEstructura de un microscopio

A 40X PLAN0.65

160 / 0.17

Acromático

Distancia entreobjetivo y ocularen mm.

Grosor del cubreobjetos (0.17 mm)

Anillo de identificación de aumentosamarillo 10Xazul claro 40Xblanco 100X

oil

Medio de inmersión*negro aceitenaranja glicerinablanco aguarojo aceite, agua o glicerina

Aumentos

Imagen planaApertura numérica

*Únicamente en los objetivos en que se requiere

Los objetivos de buena calidad tienen grabado en la pared del barril varios datos que nos permiten conocer las características de cada una de las lentes.

Sistema ópticoEstructura de un microscopio

Oculares.

El ocular es el juego de lentes a través de los cuales observamos en el microscopio, cuya función es la de ser un sistema de lentes de proyección. Existen tres tipos de oculares, el más común es el Huygenian, que se usa generalmente con objetivos acromáticos, y que permite observar con el uso de anteojos. El segundo tipo es el ocular de compensación que se usa con objetivos apocromáticos y de campo plano, logrando imágenes de calidad superior. Eltercer tipo es el ocular de fotografía que permite proyectar imágenes planas a una película de una cámara, este tipo se considera el más fino de los oculares.

Corrector de dioptrías

10X /20 Permite el uso de anteojos

Campo del ocular

Aumento del ocular

Los oculares tienen en grabado en el barril información sobre las características de esa lente.

Sistema ópticoEstructura de un microscopio

Diámetro del campo visual.

Este valor nos permite apreciar el tamaño de los organismos observados y se calcula dividiendo la cifra del campo del ocular entre el aumento del objetivo, el resultado obtenido está expresado en micrómetros. Conociendo el diámetro, es posible calcular el tamaño aproximado de un espécimen.

Diámetro del Campo visual = 20 / 100 = 0.2 mm = 200 µm

50 µm

200 µm

El tamaño aproximado del espécimen es 25 µm

100 µm

Diámetro del Campo visual

Sistema ópticoEstructura de un microscopio

Aumento total.

Para los microscopios en los cuales el factor del tubo del microscopio es igual a 1X, el aumento total se obtiene multiplicando el valor de aumento del ocular por el del objetivo.

Aumento total = 10x (del ocular) x 100x (del objetivo) = 1000x

Si el tubo del microscopio tiene un factor diferente a 1x, como puede ser 0.8x, 1.25X, 1.6X ó 2X, el resultado anterior se multiplica por el factor correspondiente obteniéndose el aumento total. Para los factores anteriores los aumentos serían:800x, 1250x, 1600x y 2000x respectivamente.

Estructura de un microscopio Sistema mecánico

El sistema mecánico de un microscopio está formado por el pie o base, el brazo, la platina, el tubo, el tornillo del condensador y los tornillos macro y micrométricos. Los componentes marcados son partes del sistema que tienen influencia en el enfoque, la resolución, el aumento total y la localización del espécimen.

El tubo del microscopio que permite el paso de luz del objetivo hacia el ocular tiene grabado un número que se le conoce con el nombre de factor del tubo. La mayoría de los microscopios este valor es de 1X, pero existen microscopios en que este valor varía (0.8X, 1.25X, 1.6X ó 2X, cuando este es el caso el aumento total es diferente para cada combinación de ocular-objetivo usada.

El tornillo del condensador, permite acercar o alejar la lente frontal, con lo cual podemosvariar la iluminación del objeto observado, pero también alteraremos el contraste en la imagen.

Los tornillos macro y micrométricos, permiten el enfoque de la preparación, correspondiendo al tornillo micrométrico el enfoque fino, pudiendo determinar la profundidad de foco dependiendo del objetivo usado.

Sobre la platina se colocan las preparaciones y con sus tornillos respectivos se busca la imagen. Anotando los valores de referencia de las regletas horizontal y vertical, es posible mover la preparación y localizar fácilmente la imagen ajustando los valores obtenidos previamente.

Principios de microscopia

Un microscopio es un instrumento que nos permite observar objetos que no pueden ser observados a simple vista. Por la forma de iluminación de los objetos a observar, los microscopios los podemos clasificar en dos categorías. Cuando la iluminación es a través de la preparación que se desea Observar, se le denomina iluminación diascópica y cuando la iluminación se hace sobre el objeto se le conoce como iluminación episcópica.

Dos tipos de microscopios con iluminación diascópica. A la izquierda, uno de tipo invertido, utilizado en la observación de cultivo de tejidos o de especimenes que reptan o se localizan en el fondo de una preparación; y a la derecha, uno de tipo estándar que se utiliza para la observación de preparaciones húmedas y fijas.

Microscopios con iluminación episcópica, llamados estereoscópicos, se utilizan para la observación de especimenes de más de 50 micrómetros, así como de organismos vivos.

Apertura numéricaPrincipios de microscopia

La calidad de una lente se establece básicamente con el valor denominado apertura numérica(AN), que depende del diámetro de la lente, la distancia de trabajo y el índice de refracción. En lentes de calidad este valor siempre esta grabado en un lado del barril del objetivo. Para determinar este valor se hace uso de la siguiente fórmula:

AN = n sen θ

donde n es el índice de refracción y θ el ángulo que se forma al incidir la luz en un objeto a la altura de trabajo.

18 mm10 mm

θ

θ

θ

10 mm

θ = 60oθ = 48o35´ θ = 60o

NA = 0.75 NA = 0.866 NA = 0.866

Con la apertura numérica se puede conocer el aumento efectivo de un objetivo, es decir el número de veces que se puede aumentar un objeto. Esto se logra multiplicando la apertura numérica por mil.

Valores para objetivos acromáticosAumento de lente 4x 10x 40x 100xApertura numérica 0.10 0.25 0.65 1.30Aumento efectivo 100 veces 250 veces 650 veces 1300 veces

Principios de microscopia Poder de resolución

La calidad de un microscopio se basa en su poder de resolución, es decir en la capacidad de discernir la observación de detalles finos, esta resolución está dada por la distancia mínima (d) en que dos objetos se observan como dos entidades separadas con una combinación de ocular-objetivo dada y se calcula con la siguiente fórmula:

d = 0.5 λ/ AN ó d= λ/2AN

donde λ es la longitud de onda de la luz utilizada y AN es la apertura numérica del objetivo.

Valores para objetivos acromáticos

Aumento del objetivo 4X 10X 40X 100X

Apertura numérica 0.1 0.25 0.65 1.30

Poder de Resolución

(micrometros) 3.05 1.22 0.47 0.24

AberracionesPrincipios de microscopia

Las aberraciones son imperfecciones de las lentes que modifican substancialmente el poder de resolución. Estas aberraciones pueden ser de forma cromática, esférica o por curvatura de campo.

La aberración cromática es la imposibilidad de la lente para enfocar los diferentes colores en el mismo punto.

Azul Verde Rojo

La aberración esférica es el resultado de la refracción de luz en otros puntos diferentes al centro, el resultado es que cuando se observa una imagen se observa un halo difuso a su alrededor.

La aberración por curvatura de campo no enfoca en una superficie plana sino esférica, esto da como resultado que cuando se enfoca el centro se desenfoca la orilla y viceversa.

Principios de microscopia ContrasteSe entiende por contraste al número de sombras que se pueden observar en una imagen. Así por ejemplo imágenes de alto contraste sólo tienen dos colores blanco y negro, sin matices de gris. A mayor número de sombras habrá menor contraste, pero esto permite mayor información al poner de manifiesto otras estructuras, esta última característica se le denomina intervalo dinámico. En las imágenes a color se considera que a mayor número de colores y con menor número de matices tendremos un mayor contraste. En los microscopios de campo claro el contraste y la resolución inversamente proporcionales, por lo tanto a mayor contraste menor resolución, por lo tanto se requiere aplicar un colorante o dos, para obtener un mejor contraste. Asimismo, a mayor iluminación menor contraste y a menor iluminación mayor contraste. Por lo tanto, el enfoque correcto requiere la correcta combinación de contraste, resolución e iluminación.

A B CMicrofotografías de la observación de una amiba con tres condiciones de contraste. A, bajo contraste; B, contraste normal; C, alto contraste.

Profundidad de campoPrincipios de microscopia

Se entiende por profundidad de campo el área visible entre el frente y el fondo de un espécimen y cuyos componentes tienen un enfoque aceptable. Esta profundidad de foco depende de la apertura numérica del objetivo; a menor apertura numérica la profundidad de foco es mayor y a mayor apertura numérica menor profundidad de campo.

Aumento de la lente Apertura numérica Profundidad de campo

(micrómetros)

4x 0.1 50.7

10x 0.25 8.11

40x 0.65 1.2

100x 1.30 0.3

Para calcular la profundidad de campo de cada uno de los objetivos de un microscopio se utiliza la siguiente fórmula:

DPC = λ / NA2

DPC = distancia de la profundidad de campo expresada en micrómetrosλ = longitud de onda de la luz utilizada expresada en micrómetros (luz verde 0.507 µm)

NA = apertura numérica

Microscopios compuestos Microscopio de campo claro

El microscopio de campo claro es el instrumento de más uso en el trabajo de rutina. Aún cuando se puede usar para hacer observaciones tanto de especímenes en preparaciones en fresco como teñidas, muchas de las estructuras internas del organismo no son visibles a menos que se usen tinciones selectivas.

La parte fundamental para realizar una observación adecuada es el tipo de iluminación. En la iluminación crítica la fuente de luz se enfoca por medio del condensador en el plano del espécimen, esto produce una gran cantidad de iluminación, la cual no es uniforme en todo el campo visual, lo que no permite una observación adecuada.

La llamada iluminación Kohler es un método para ajustar la iluminación en un microscopio compuesto. Este ajuste permite una iluminación uniforme de calidad en todo el campo, al enfocar el campo a la apertura mínima del condensador sobre el plano del espécimen. Para observaciones que requieren el máximo potencial de un microscopio es necesario realizar la iluminación Koeler con regularidad.

Microscopio de campo claroMicroscopios compuestos

Técnica de iluminación Kohler:

b Seleccionar el objetivo lupa. Bajar el diafragma. Colocar la muestra y enfocar.

b Seleccionar el objetivo de observación, y enfocar el espécimen.

b Cerrar la abertura del condensador. Algunos microscopios lo tienen en su base.

b Subir el diafragma hasta hacer nítido el borde del campo. Se observara en el campo visual un halo rojo o azul. Mover el condensador al punto donde se combinenambos colores o el más cercano al azul.

b Después de este ajuste puede cambiar de objetivo, pero sin mover el condensador.

b Abrir el diafragma hasta cubrir todo el campo, sin mover el condensador.

b Colocar un filtro azul

b Ajuste el nivel de intensidad luminosa, en el punto en que no sea molesta al observador.

b En el caso de microscopios binoculares, ajustar la distancia interpupilar.

b Ajustar las dioptrías a los ojos del observador.

b Enfocar con el tornillo micrométrico.

b Contrastar con el diafragma iris.

Microscopios compuestos Microscopio de campo claroImágenes

Staphylococcus aureus

Streptococcus sp.

Bacteria Gram +, en muestra de esputo Nocardia en una biopsia de pulmón

Microscopio de campo obscuroMicroscopios compuestos

Microscopio de campo obscuro

Este tipo de microscopio, presenta un condensador especial que bloquea los rayos luminosos centrales y deja pasar los periféricos, que se reflejan en la cara interna del condensador, de esta forma el espécimen se ilumina con los rayos laterales que son reflejados observando un objeto fuertemente iluminado sobre un fondo obscuro. Para evitar que penetren en el objetivo los rayos tangenciales que emergen del condensador, se utiliza un diafragma en el objetivo o un objetivo de abertura numérica inferior a 1,1.

Es útil para observar límites y movimientos de pequeños especimenes no teñidos y sobre todo puede ser usado en muestras en fresco. Principalmente se ha usado para observar muestras de organismos que se tiñen con dificultad, como es el caso de Treponemapallidum y otras espiroquetas

Microscopios compuestos Microscopio de campo obscuro

IMAGENES

Fotografía de Borrelia en campoobscuro

Fotografía de Chlamidia en Campo obscuro

Microscopio de contraste de fasesMicroscopios compuestos

El conocimiento relativo al contraste de fases data de 1892, pero su aplicación práctica se inicia a partir del primer cuarto del siglo XX. El microscopio de contraste de fases es un sistema para obtener mayores contrastes en especímenes translúcidos sin la ayuda de tinciones.

El fundamento de este microscopio radica en el hecho de que la luz al atravesar medios de diferente densidad modifica su longitud de onda y amplitud originales. El índice de refracción mide el grado de modificación de la luz al pasar por medios translúcidos de diferente densidad. El propósito del contraste de fases es tomar ventaja de los cambios de fase de la luz con respecto al medio o de los diferentes índices de refracción de los organelos o estructuras del especimen. Si a un organismo, conformado de diferentes estructuras (cada una con diferente índice de refracción y espesor), se le incide una onda luminosa, esta modificará su dirección y amplitud, de acuerdo a las capas que este atravesando. Estos cambios que se presentan en un microscopio de campo claro no son perceptibles al ojo humano, por lo que se requiere la utilización de instrumentos ópticos para hacerlos evidentes.

Microscopia de contraste de fasesMicroscopios compuestos

Las diferencias básicas de un microscopio de contraste de fases con uno de campo claro son: el condensador es diferente ya que en su interior se encuentra un diafragma anular. El objetivo también es diferente, ya que dentro de estos se encuentra también un diafragma de fase, cuya estructura cubre las zonas claras del diafragma del condensador. Este juego permite un retraso de 1/4 de la longitud de onda, lo que lo hace perceptible al ojo humano.

El condensador y los objetivos de contraste de fases están marcados como pH, lo que indica que son para usar contraste de fases.

Este tipo de microscopio, permite ver organismos vivos sin teñir y poder diferenciar estructuras.

Microscopios compuestos Microscopia de contraste de fases

IMAGENES

Fotografía de una bacteria filamentosa del azufre

Arriba: Fotografía del alga Spirogyra,mostrando sus cloroplastos espirales.

Abajo: Diatomea Stephanodiscus, donde los cloroplastos se observan

rojosFotografía del hongo del género Aspergillus

a c

b d

Paramecio observado en varios microscopios compuestos. a, campo brillante; b, campo obscuro;c, contraste de fases; d, contraste de interferencia diferencial.

Microscopio de fluorescenciaMicroscopios compuestos

La fluorescencia es la emisión de luz de una substancia cuando ésta es estimulada por longitudes de onda corta, como puede ser la luz ultravioleta (LUV) (360 nM), que al incidir en una substancia con la capacidad de fluorescer, emite luz visible (555 nM), lo que permite observarla.

En el interior de un organismo existen substancias como porfirinas, clorofilas, citocromos, algunas vitaminas, etc, que al excitarse con longitudes de onda corta, emiten espontáneamente luz visible, a este fenómeno se le llama fluorescencia primaria o autofluorescencia.

Cuando se desea observar substancias u objetos que no tienen fluorescencia primaria es necesario unir substancias fluorescentes o fluoróforos como los derivados amino, carboxi e isotiocianato de fluoresceina, la rodamina B, entre otras. A este tipo de fluorescencia se le conoce como fluorescencia secundaria. Para observaciones más específicas, los fluoróforos se pueden conjugar o unir a anticuerpos o a sondas de DNA que reconocen secuencias de RNA o DNA específicos. Esto permite observar estructuras blanco fluorescentes después de la unión del anticuerpo o sonda.

El microscopio de fluorescencia presenta las siguientes diferencias con un microscopio de campo claro: su fuente luminosa es una lámpara de luz ultravioleta. Un condensador con un filtro de excitación que retiene todas aquellas longitudes de onda que no excitan a la substancia fluorescente y un filtro supresor selectivo que retiene toda aquella luz ultravioleta que no fue absorbida por la substancia fluorescente para evitar daño al ojo. Además, es necesario que las lentes por las que va a atravesar la LUV o absorban esta radiación, por lo que se fabrican de materiales como el cuarzo.

Microscopio de fluorescenciaMicroscopios compuestosIMAGENES

Células muscularesEl hongo Candida albicans formandotubo germinativo

Embrión de erizo de mar en mitósis

Microscopio confocalMicroscopios compuestos

La microscopia confocal nos permite observar células vivas, permitiendo la observación de actividades fisiologicas “in vivo”.

Todos los microscopios confocales utilizan el láser por sus propiedades de intensidad lumínica, selección de longitud de onda y uniformidad (emisión continua). Los más frecuentes son los producidos por lámparas de argón (488 y 514 nm), krypton (568 y 6647 nm) y helio-neón (543 y 633nm) para iluminar en el espectro de la luz visible. La iluminación ultravioleta (UV) está incorporada sólo en algunos equipos, ya que requiere un láser especial de argón o de helio-cadmio y, cromáticas significativas cuando transmite luz ultravioleta.

La mayor parte de los microscopios confocales comercialmente se suministran con el software necesario para el procesamiento de la imagen digital. Son importantes las opciones que permiten mejorar la calidad de la imagen mediante la reducción del ruido de fondo (aplicando filtros para las intensidades bajas de fluorescencia) o incrementando el contraste de la imagen digital.

Microscopios compuestos Microscopio confocal

Imagen tridimensional de un liquen obtenida conmicroscopia confocal, en la parte superior se observan las algas que conforman esta simbiosis y en la parteinferior la hifas del hongo.

Microscopios electrónicos Microscopio electrónico de transmisión

En este microscopio se utilizan electrones en vez de rayos de luz, y como lentes funcionan unos electroimanes. Cuando los electrones pasan a través de la preparación algunos son difractados creando entonces una imagen que se hace visible en una pantalla sensible a los electrones. La longitud de onda de la radiación de los electrones es mucho más pequeña que la de la luz visible y, como el poder resolutivo de un microscopio es inversamente proporcional a la longitud de onda utilizada. La resolución y aumentos totales obtenida con el microscopio electrónico es mucho mayor que la conseguida con el microscopio óptico.

Con el microscopio óptico ordinario o el de contraste de fases las estructuras más pequeñas que pueden observarse tienen unos 0,2 µm, con el microscopio electrónico pueden verse fácilmente objetos de 0,001 µm con 300,000 aumentos. Con el microscopio electrónico es posible ver muchas estructuras. Sin embargo, a causa de la naturaleza de este instrumento sólo pueden examinarse objetos muy delgados: para observar estructuras internas, incluso una sola bacteria, ésta es demasiado gruesa para ser observada directamente, por lo que se requiere hacer cortescon un ultramicrotomo.

Microscopio de transmisiónMicroscopios electrónicosIMAGENES

Huevo del nemátodo Heterodera avenaeinfectado por el hongo Verticillum. Se

observan las hifas del hongo (h), tanto en el exterior como en el interior de la cubierta del huevo (c). La fotografía A,

muestra el canal de penetración (p).

Fotografía de las placas basales del flagelo de Rhodobactersphaeroides, utilizando la técnica de sombreado.

Microscopio de barridoMicroscopios electrónicos

En el microscopio electrónico de barrido, se utiliza una fuente de rayos catódicos, que por medio de un campo magnético nos permite enfocar el haz de electrones sobre la muestra a analizar y de esta forma obtener una imagen tridimensional. Con este microscopio se pueden alcanzar hasta 200.000 aumentos.

Von Ardenne, en 1938, construyó el primer Microscopio Electrónico de Barrido (MEB); posteriormente, en Inglaterra, se construyó el primer MEB Ambiental, con el cual se pueden observar muestras hidratadas.

En el microscopio electrónico de barrido, la muestra se coloca en una cámara al alto vacío con controles de posición en las tres dimensiones.

El haz de electrones se produce en la parte superior del microscopio por medio del calentamiento de un filamento metálico con un voltaje de 10 a 30 KV. El rayo de electrones primarios sigue un recorrido a través de la columna de vacío del microscopio, siendo modificado por un conjunto de bobinas deflectoras (campos magnéticos). Primero atraviesa las lentes condensadoras o electromagnéticas que le permiten ser reenfocado o centrado hacia la muestra. Posteriormente, el diámetro del haz de electrones puede ser modificado al pasar por las lentes objetivas que controlan la cantidad de electrones en el interior. Cuando los electrones primarios golpean la muestra, son emitidos electrones secundarios que son atraídos por un colector, donde se aceleran y se dirigen al escintilador. Una vez ahí la energía cinética es convertida en señales luminosas de mayor o de menor luminosidad. Esta luz es dirigida a un amplificador donde se convierte en señal eléctrica, la cual pasa a una pantalla de observación donde la imagen es formada línea por línea y punto por punto, y ésta puede ser vista en tercera dimensión.

Microscopio de barridoMicroscopios electrónicos

El MEB consta de las siguientes partes: 1. Cañón de electrones (e-). 2. Filamento de tungsteno o de hexaboruro

de lantano-LaB6. 3. Ánodo. 4. Columna en vacío. 5. Lentes condensadores (centran y dirigen

el rayo de electrones). 6. Lentes Objetivas (controlan la cantidad

de electrones del haz). 7. Detectores para colectar y medir

electrones (producción de imagen). 8. Bobinas de barrido (obligan al haz a

barrer la muestra). 9. Control de aumento. 10. Generador de barrido. 11. Colector de electrones (electrones se

atraen y se aceleran). 12. Escintilador (convierte la energía

cinética de los e- en luz visible). 13. Amplificador. 14. Pantalla (imagen). 15. Bombas de vacío.

Microscopio de barridoMicroscopios electrónicosIMAGENES

Las imágenes que se obtienen por microscopía electrónica son inicialmente en blanco y negro,sin embargo pueden ser digitalizadas y modificadas para convertirlas en colores falsos.

Cabeza del mosco Aedes aegypti

Escolex de Taenia solium

Microscopio de barridoMicroscopios electrónicosIMAGENES

Globulos rojos humanosStaphylococcus aureus

Bacteriofagos de Escherichia coli Cabeza de hormiga

Los responsables de los embarazos no deseados

Micrografía de una cianobacteria procesada por congelación y fractura y obsevada por microscopía electrónica de barrido.

Microscopios electrónicosMicroscopio de efecto túnel

Dentro de la microscopia, dos nuevos tipos de microscopio han sido diseñados y se les cataloga dentro de la microscopia de proximidad, las cuales reúnen un conjunto de técnicas que no utilizan lentes, ni radiación como pueden ser rayos X o electrones, etc, para obtener imágenes de gran resolución. Las dos técnicas más relevantes son la microscopia de efecto túnel y microscopia de fuerza atómica.

La aplicación de criterios racionales de diseño ha recibido un fuerte impulso con el desarrollo de técnicas tales como la microscopia de fuerza atómica (AFM, acrónimo de Atomic Force Microscopy) y la microscopia de efecto túnel (STM, acrónimo de Scanning Tunnel Microscopy), dos procedimientos que permiten conocer la topografía y la organización de las moléculas en la superficie de un material con una resolución de nanómetros (esto es, de una milésima de millonésima de metro), lo que hace posible caracterizar la superficie de un material a escala atómica. Esta información, junto al conocimiento de cuáles son los procesos biológicos que se estimulan como consecuencia de la estructura química y la topografía de cada biomaterial, ha llevado al desarrollo de una nueva generación de biomateriales cuyo diseño se basa en la observación del ordenamiento estructural de su superficie. También, en el reconocimiento en ella de sitios precisos donde tienen lugar las reacciones que definen la respuesta biológica y en general, del estudio de cómo el ensamble de moléculas en una superficie es capaz de desencadenar y controlar diferentes reacciones en la materia viva.

Principio del microscopio de efecto tunel. El efecto de una punta que se aproxima alobjeto produce alteraciones cuánticas detectables.

Imágenes de microscopía de efecto túnel mostrando la red atómica del Grafito Periódico Altamente Orientado (HOPG). La imagen de la izquierda muestra la topografía, y la de la derecha es un mapa de fuerza normal. Estas imágenes fueron tomadas al aire. El tamaño de imagen es 3nm x 3nm. Tomadas porDang Xueming, LNM, Departamento de Física de la Materia Condensada, UAM.

Imagen de microscopía de efecto túnel de DNA

Microscopios electrónicos Microscopio de fuerza atómica

El SPM es el nombre general utilizado para los microscopios que observan superficies con una gran ampliación, por medio de un "barrido" sobre la muestra, el cual es realizada con un micro-sensor, conocido como tip.

El SPM incluye las técnicas de STM (scanning tunelling microscope) y de AFM (atom force microscope).Con el modo STM, un flujo de corriente entre el sensory la muestra es detectado como interacción. En el caso de AFM, se detecta una fuerza.

Un control preciso del barrido es realizado en las tres direcciones (X, Y e Z), a través de un sistema piezoeléctrico. Normalmente, el sistema piezoeléctrico desplaza la muestra en el plan X y Y, utilizando un método previamente programado, siendo que la superficie de la muestra es trazada por la distancia delsensor con relación a la muestra (la cual es mantenida siempre constante), siendo registrada según la interacción antes descrita.

La señal generada por el eje Z durante el análisis corresponde a cada punto de coordenada (ejes X y Y), alimentando una computadora.

Esta combinación genera una imagen topográfica (tridimensional) de la superficie de la muestra.

Esquema del microscopio de fuerza atómica. Una punta integrada entra en contacto con el objeto como un escaner piezoeléctrico (derecha). Un rayo laser es reflejado desde la punta en mobvimiento y, las deflecciones son detectadas por el detector fotodiodo. Las imágenes topológicas son integradas mediante control electrónico y computacional.

Microscopio de fuerza atómicaMicroscopios electrónicos

Flagelos de Vibrio alginolyticus

Estomas de Zelkova

Esmalte de diente corroído por ácido

Microscopio de fuerza atómicaMicroscopios electrónicos

Pseudomonas

Virus de la vid

Eritrocito

Micrografía de Saccharomyces cerevisiae observada con microscopía de fuerza atómica. Nótese la Cicatriz que deja la gena al separarse.

Micrografía de los detalles de la superficie de Escherichia coli. La superficie en apariencia rugosa corresponde al arreglo de los lipopolisacáridos de la membrana externa.

Bibliografía

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El primer microscopio

Los primeros microbiólogos

Jorge Ortigoza

El microscopio simple