ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS DE ORINA

Coordinadores:

D a n i e l P i n e d a T e n o r

Á n g e l e s

C a b e z a s M a r t í n e z

G u a d a l u p e R u i z M a r t í n

Editado por LABCAM (Asociación Castellano-Manchega de Análisis Clínicos)

ANÁLISIS DE LAS

MUESTRAS DE ORINA

El Laboratorio Clínico 3

ISBN: 978-84-615-5915-2 Título: El Laboratorio Clínico 3: Análisis de las Muestras de orina. Editor: LABCAM (Asociación Castellano-Manchega de Análisis Clínicos) Distribuye: LABCAM, AEBM, AEFA y SEQC. Copyright 2011 Los editores se reservan todos los derechos. Ninguna parte de esta publicación puede ser reproducida, transmitida en ninguna forma o medio alguno, electrónico o mecánico, incluyendo fotocopias, grabaciones o cualquier sistema de recuperación de almacenaje de información sin autorización por escrito de los editores.

Coordinadores

Daniel Pineda Tenor

Ángeles Cabezas Martínez

Guadalupe Ruiz Martín

Autores

Virginia Adamoli Vidal

Carolina Andrés Fernández

Andrea Agarrado Roldan

Miriam Alonso Diñeiro

David Antón Martínez

Alicia Beteta López

Sonia Bocharan Ocaña

Elena Buces González

Ángeles Cabezas Martínez

Julián Carretero Gómez

Eva Casado Valentinetti

Belén Colino Galián

Beatriz Del Río Merchán

María del Sagrario Díaz Merino

Maria Esteso Perona

Ainoha García Claver

Carmen García del Castillo

Silvia García Segovia

María Teresa Gil Ruiz

Simón Gómez-Biedma Gutiérrez

Montserrat Guerri Cebollada

Gracia Hernández Poveda

Oscar Herráez Carrera

Herminio López-Escribano

Pilar Megía Galiano

María del Monte Jarabo Bueno

Juan Ángel Jiménez García

Emilio José Laserna Mendieta

Gabriel López de la Osa

Soledad Martínez Huedo

Vanesa Martínez Madrid

María Jesús Maza Castillo

Laura Moreno Parrado

Mª Consuelo Olmeda Herreros

Rocio Palma Fernández

Daniel Pineda Tenor

José Antonio Piqueras Argüello

Aurelio Pons Castillo

Raquel Ramos Corral

Juan Antonio Recio Montealegre

Laura Rincón de Pablo

Laura Rodelgo Jiménez

Guadalupe Ruiz Martín

Miriam Sagredo Del Río

Alberto Sánchez Solla

Alfonso Santa María Sánchez

Irene Sanz Lobo

Sandra Serrano Martínez

Esther Simarro Rueda Francisco Javier Simón Lucas

Jesús Timón Zapata

Laura Trapero Mendoza

Noelia Trapiella Pereiro

Lorena Vega Prado

Fidel Velasco Peña

Ana María Velasco Romero

Joaquín Vera Hernández

El Laboratorio Clínico III: Análisis de las Muestras de Orina

Índice 1.- Histología del tracto urinario. Formación de la orina. Regulación de la fisiología renal …………………………… 5

David Antón Martínez, Virginia Adamoli Vidal, Carolina Andrés Fernández, Laura Moreno Parrado.

2.- Preanalítica de las muestras de orina …………………………………………………………………………………. 39 Raquel Ramos Corral, Guadalupe Ruiz Martín, Sandra Serrano Martínez.

3.- Análisis físico-químico de la orina de una micción …………………………………………………………………… 55 Joaquín Vera Hernández, Simón Gómez-Biedma Gutiérrez, Mª Consuelo Olmeda Herreros.

4.- Estudio de los elementos formes de la orina …………………………………………………………………………. 90

Juan Ángel Jiménez García, Francisco Javier Simón Lucas, Guadalupe Ruiz Martín. 5.- Estudio diferencial de la proteinuria. Microalbuminuria. Proteinogramas. Inmunofijaciones…………………… 119

José Antonio Piqueras Argüello, Belén Colino Galián, María Jesús Maza Castillo. 6.- Litiasis Renal. Estudio metabólico. Técnicas de análisis de cálculos urinarios………………………………….. 129

Sandra Serrano Martínez, Vanesa Martínez Madrid. 7.- Determinaciones urgentes en orina. Tóxicos en orina. Implicaciones legales…………………………………… 159

Beatriz Del Río Merchán, Silvia García Segovia, Oscar Herráez Carrera, María del Monte Jarabo Bueno, Miriam Sagredo Del Río.

8.- Función renal. Aclaramiento de creatinina y fórmulas de estimación del filtrado glomerular…………………... 189

Andrea Agarrado Roldan, Sonia Bocharan Ocaña, Elena Buces González, Laura Rincón de Pablo. 9.- Detección urinaria de enfermedades metabólicas hereditarias……………………………………………………. 203

Ángeles Cabezas Martínez, Julián Carretero Gómez, Raquel Ramos Corral, Daniel Pineda Tenor. 10.- Porfirias……………………………………………………………………………………………………………….… 226

Daniel Pineda Tenor, Ángeles Cabezas Martínez, Julián Carretero Gómez, Emilio José Laserna Mendieta, Jesús Timón Zapata.

11.- Marcadores tumorales en orina: ácido 5-hidroxiindolacético, catecolaminas y sus metabolitos……………... 239 Aurelio Pons Castillo, Gracia Hernández Poveda, Maria Esteso Perona, Esther Simarro.

12.- Equilibrio hidroeléctrico y trastornos osmóticos……………………………………………………………………. 259 Alberto Sánchez Solla, María del Sagrario Díaz Merino.

13.- Metabolismo de los hidratos de carbono…………………………………………………………………………… 273

Eva Casado Valentinetti, Montserrat Guerri Cebollada, Fidel Velasco Peña, Carmen García del Castillo, Pilar Megía Galiano.

14.- Elementos traza en orina……………………………………………………………………………………………... 286

Laura Rodelgo Jiménez, Ainoha García Claver, Juan Antonio Recio Montealegre. 15.- Determinaciones hormonales en orina: cortisol, hidroxi y cetoesteroides y β-HCG …………………………... 313

Emilio José Laserna Mendieta, Rocío Palma Fernández, Jesús Timón Zapata, Daniel Pineda Tenor. 16.- Marcadores de remodelado óseo……………………………………………………………………………………. 330

Ana María Velasco Romero, Herminio López-Escribano, Noelia Trapiella Pereiro, Miriam Alonso Diñeiro, Irene Sanz Lobo.

17.- Determinaciones microbiológicas en orina…………………………………………………………………………. 341

Lorena Vega Prado, Alicia Beteta López, Soledad Martínez Huedo, María Teresa Gil Ruiz. 18.- Determinaciones en orina de uso limitado y pruebas obsoletas…………………………………………………. 349

Laura Trapero Mendoza, Alfonso Santa María Sánchez, Gabriel López de la Osa.


203

1.- Acidemias orgánicas y aminoacidopatías 1.1.- Introducción

En 1908, Garrod acuñó la expresión error congénito del metabolismo (ECM) para describir un grupo de

enfermedades (alcaptonuria, pentosuria benigna, albinismo y cistinuria) causadas aparentemente por un defecto

puntual en el metabolismo de sustancias simples como aminoácidos o monosacáridos. Observó que estas

enfermedades se transmitían siguiendo las leyes de Mendel con un patrón de herencia autosómica recesiva y que

eran relativamente benignas. El descubrimiento en 1934 de la fenilcetonuria supuso un cambio en el concepto de

ECM. La fenilcetonuria está causada por un defecto en la conversión de fenilalanina a tirosina en el hígado, su

herencia es autosómica recesiva, pero la enfermedad dista mucho de ser benigna, y está asociada a una forma

severa de retraso mental. Actualmente, el número de desórdenes atribuidos a un defecto puntual, hereditario, del

metabolismo, excede los 500. Aunque individualmente su prevalencia es muy baja, en conjunto suponen un

porcentaje significativo de enfermedades, sobre todo en niños1.

Los ECM son el resultado de mutaciones en la secuencia de bases del DNA que codifica la secuencia específica

de aminoácidos de una proteína enzimática. El defecto en la enzima que deriva del gen alterado, se refleja en la

disminución o ausencia de su actividad biológica, lo que bloquea la ruta metabólica del sustrato enzimático, que

bien se acumula, o se metaboliza por rutas alternativas. Como consecuencia los productos de la vía principal no

se forman o lo hacen en cantidades inferiores mientras que los de las vías alternativas están presentes en

cantidades mayores de lo habitual.

Las acidemias orgánicas son un grupo heterogéneo de ECM caracterizados bioquímicamente por el acúmulo de

ácidos orgánicos en orina y, en menor medida, en otros fluidos corporales. Su origen está en la producción en

cantidades excesivas o la no degradación adecuada de dichos ácidos, que secundariamente ocasionan

desajustes en los procesos bioquímicos intracelulares. La incidencia global de estas enfermedades varía desde 1

por cada 10000 recién nacidos a 1 por cada 300002.

Hay otros ECM en los que también se acumulan y excretan en orina ácidos orgánicos, como son los defectos en la

oxidación de los ácidos grasos, las alteraciones en el metabolismo de los aminoácidos o las acidemias lácticas.

Las alteraciones en el metabolismo de los aminoácidos y ácidos orgánicos son, con escasas excepciones,

enfermedades congénitas que se heredan con carácter autonómico recesivo: en un individuo homocigoto, la

proteína crítica con la secuencia correcta de aminoácidos, no será producida; en un heterocigoto, la actividad

enzimática estará disminuida, y el bloqueo en la vía metabólica será sólo parcial. La patogenia dependerá de la

actividad enzimática residual.

Detección Urinaria de Enfermedades Metabólicas Hereditarias.

Tema 9

Ángeles Cabezas Martínez, Julián Carretero Gómez, Raquel Ramos Corral, Daniel Pineda Tenor.

Tema 9. Detección Urinaria de Enfermedades Metabólicas Hereditarias

204

1.2.- Manifestaciones clínicas

En condiciones normales, los ácidos orgánicos se metabolizan a productos no ácidos y se excretan por la orina.

La patogenia de estas alteraciones está relacionada tanto con el exceso en la producción de metabolitos tóxicos

como con la disminución en la producción y utilización de los sustratos energéticos, que conlleva el acúmulo de

ácidos orgánicos.

Los síntomas de las acidemias orgánicas son relativamente inespecíficos. La agrupación sintomática de

manifestaciones digestivas (rechazo del alimento, vómitos) y neurológicas (hipotonía, convulsiones, alteración del

nivel de consciencia) en ausencia de otra explicación clínica evidente, debe sugerir una acidemia orgánica3. En

algunas entidades se encuentra un olor característico y evolutivamente, retraso ponderal. La severidad y edad de

presentación varía en relación a la naturaleza del déficit enzimático. Existen tres formas clínicas de presentación:

- Neonatal severa, la más frecuente.

- Crónica intermitente de comienzo tardío.

- Crónica lentamente progresiva.

1.2.1- Acidosis metabólica

En la mayoría de las condiciones que producen acidosis metabólica se observa un anión GAP elevado. Una

acidosis metabólica con anión GAP normal, se reduce prácticamente a diarrea o acidosis tubular renal. Entre los

ECM, los que se asocian principalmente a acidosis metabólica son las acidemias orgánicas. Además de los ácidos

orgánicos específicos en cada caso, el lactato aparece con frecuencia elevado como resultado de la interferencia

con el metabolismo de la coenzima A (Figura 1).

Figura 1. Diagrama de flujo para la evaluación de la acidosis metabólica en niños.


205

1.2.2- Encefalopatía aguda

Las acidemias orgánicas, defectos del ciclo de la urea y algunas alteraciones del metabolismo de los aminoácidos,

debutan con síntomas de encefalopatía aguda. Estos síntomas son el resultado de los efectos tóxicos de los

metabolitos que se acumulan en el sistema nervioso central, que durante la gestación son eliminados a través de

la placenta. El intervalo desde el nacimiento hasta la aparición de los síntomas clínicos varía de horas a meses.

Los hallazgos iniciales suelen ser letargia y anorexia. Si no se trata, la letargia puede progresar a coma. Pueden

aparecer convulsiones y disminución del tono muscular. A veces, el primer síntoma observado es apnea o distress

respiratorio.

1.2.3- Hiperamoniemia

Se deben determinar niveles de amonio en plasma a todo niño con vómitos sin causa evidente, letargia u otras

evidencias de encefalopatía. Se observa hiperamoniemia en un número limitado de condiciones, entre ellas, los

ECM, incluyendo los defectos del ciclo de la urea y la mayoría de las acidemias orgánicas. El grado de daño

neurológico y retraso del crecimiento observado en los niños afectos depende de la duración del coma

hiperamoniémico neonatal. (Figura 2)

Figura 2. Diagnóstico diferencial de las distintas condiciones asociadas con hiperamoniemia neonatal. OTC:

ornitina transcarbamilass; CPS: carbamoil fosfato sintetasa.


206

1.2.4- Hipoglucemia

Los defectos en la oxidación de los ácidos grasos se pueden presentar como hipoglucemia. Los niños afectados

tienen disminuida la capacidad de usar la grasa almacenada como energía durante periodos de ayuno. Además

de desarrollar hipoglucemia, también está alterada la producción de acetil-CoA y cuerpos cetónicos. La

hipoglucemia puede aparecer sola o acompañada de hiperamoniemia, acidosis metabólica y aumento de las

transaminasas.

1.3.- Entidades clínicas

Son numerosas las enfermedades congénitas del metabolismo que cursan con aciduria orgánica4 (Tabla 1).

Tabla 1.- Patologías que cursan con aciduria orgánica. Modificada del Programa de Cribado Neonatal en España4.

Entre ellas las más frecuentes son las que se describen a continuación:

1.3.1- Acidemia Propiónica (OMIM #606054)

Deficiencia en la actividad de la propionil-CoA carboxilasa (Figura 3), enzima mitocondrial que cataliza el paso

de propionil-CoA a metilmalonil-CoA. Este enzima requiere biotina como cofactor5. Existen dos formas clínicas:

- Sensible a biotina, ligada a defectos en la biosíntesis de este cofactor, que conlleva asociados déficit de

otras carboxilasas.

- Resistente a biotina. Déficit aislado de propionil-CoA carboxilasa.

Patologías asociadas al metabolismo de los aminoácidos Hiperfenilalaninemia/Fenilcetonuria Defecto de la síntesis del cofactor Tetrahidrobiopterina Defecto de la regeneración del cofactor Tetrahidrobiopterina Enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce Tirosinemia Aciduria arginosuccínica Citrulinemia Homocistinuria Patologías asociadas al metabolismo de los ácidos orgánicos Acidemia glutárica tipo I Acidemia isovalérica Aciduria 3-OH-3-metilglutárica Deficiencia de β-cetotiolasa Acidemia metilmalónica Acidemia propiónica Aciduria metilglutacónica Deficiencia de isobutiril-CoA deshidrogenasa Metilcrotonilglicinuria Metilbutirilglicinuria Patologías asociadas a la β-oxidación de los ácidos grasos Deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena media Deficiencia primaria de carnitina Deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena larga Deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena muy larga Deficiencia de carnitina palmitoil transferasa Aciduria glutárica tipo II Deficiencia de acil-CoA deshidrogenasa de cadena corta


207

Alteraciones bioquímicas: aumento de las concentraciones en sangre y orina de ácido propiónico libre y de los

metabolitos producidos en su oxidación alternativa: 3-OH-propiónico, propionilcarnitina y metilcitrato.

1.3.2- Acidemia Metilmalónica. (OMIM #251000)

Deficiencia en la actividad de la metilmalonil-CoA mutasa (Figura 3), enzima que cataliza el paso de

metilmalonil-CoA a succinil-CoA, que es el paso final de la vía propiónico-metilmalónico5. La enzima requiere

adenosilcobalamina (B12) como cofactor.

Alteraciones bioquímicas: acúmulo intracelular de metilmalonil-CoA y presencia en plasma y orina de ácido

metilmalónico. Por la inhibición secundaria de la piruvato carboxilasa, se acumulan propionil-CoA y sus

metabolitos: ácido propiónico, 3-OH-propiónico, propionilcarnitina y metilcitrato.

Figura 3.- Metabolismo de los aminoácidos ramificados. (1: Deshidrogenasa de los α-cetoácidos ramificados. 2: Isovaleril-CoA-deshidrogenasa. 3: β-metilcrotonil-CoA-carboxilasa. 4: 3-metilglutaconil-CoA-hidratasa. 5: Hidroximetilglutaril-CoA-liasa. 6: 3-cetoliasa. 7: 3-hidroxiisobutiril-CoA-desacilasa. 8: Metilmalonil-semialdehido-deshidrogenasa. 9: Propionil-CoA-carboxilasa. 10: Metilmalonil-CoA-mutasa.)


208

1.3.3- Déficit múltiple de carboxilasas. (OMIM # 253260)

La biotina actúa como grupo prostético en varias carboxilasas (acetil-CoA carboxilasa, propionil-CoA carboxilasa,

piruvato carboxilasa, metilcrotonil-CoA carboxilasa), convirtiéndolas en formas activas (holoenzimas). Deficiencias

en la actividad enzimática de la holocarboxilasa sintetasa y la biotinidasa, ambas implicadas en el metabolismo de

la biotina, ocasionan secundariamente un déficit de estas enzimas5.

Alteraciones bioquímicas: el metabolito más característico en orina es el 3-OH-isovalérico. También aparecen

propiónico, 3-OH-propiónico, 3-metil-crotonilglicina y metilcitrato.

1.3.4- Acidemia Isovalérica (OMIM #243500)

Se debe a una deficiencia en la actividad de la isovaleril-CoA deshidrogenasa (Figura 3) enzima que cataliza el

paso de isovaleril-CoA a metilcrotonil- CoA en la vía de la descarboxilación oxidativa de la leucina5.

Alteraciones bioquímicas: acúmulo intracelular de isovaleril-CoA con aparición en líquidos biológicos de ácido

isovalérico (característico olor a pies sudados de la orina) y sus metabolitos, producidos en vías alternativas:

isovalerilglicina, isovalerilcarnitina y 3-OH-valérico.

1.3.5- Enfermedad de la orina con olor a jarabe de arce (OMIM #248600)

Se debe a una deficiencia en la actividad del complejo multienzimático deshidrogenasa de los α-cetoácidos

ramificados (Figura 3), producidos por transaminación en el paso inicial del catabolismo de leucina, isoleucina y

valina. Su nombre se debe a que la orina de estos pacientes tiene un olor característico a jarabe de arce o azúcar

quemado5.

Alteraciones bioquímicas: aumento en todos los fluidos corporales (plasma, orina y LCR) de los aminoácidos

ramificados precursores, en especial leucina y aloisoleucina (patognomónico de la enfermedad), y los

correspondientes α-cetoácidos: α-cetoisocaproico, α-ceto-β-metil-valérico y α-cetoisovalérico (responsable del olor

dulce de la orina de estos pacientes).

1.3.6- Deficiencias en la β-oxidación mitocondrial de los ácidos grasos (OMIM #201450)

Los ácidos grasos de cadena larga están implicados en una amplia variedad de procesos celulares, como la

síntesis de fosfolípidos, señalización celular o permeabilidad de la membrana. Pero la función más crítica es el

mantenimiento de la producción de energía durante el ayuno o en periodos de mayor demanda energética, vía β-

oxidación mitocondrial6.

Una vez movilizados desde el tejido adiposo, los ácidos grasos son captados por el hígado y las células

musculares a través de un sistema de transporte activo. Tras la activación a sus respectivos ésteres son

transportados al interior de la mitocondria, dónde una serie de enzimas convierten temporalmente los acil-CoA en

acilcarnitinas. Los ácidos grasos de cadena media y corta entran en la mitocondria de manera independiente al

"ciclo de la carnitina".

Los ácidos grasos son oxidados hasta su producto final, acetil-CoA, en un ciclo de reacciones secuenciales

mediadas por enzimas homólogos que se caracterizan por su afinidad por sustratos de longitud de cadena

diferente: muy larga, larga, media y corta. Cada ciclo del recorrido produce una molécula de acetil-CoA y un ácido

graso con dos átomos menos de carbono. En el músculo, el acetil-CoA es directamente utilizado como sustrato


209

energético, mientras que en el hígado se utiliza para la síntesis de cuerpos cetónicos, que sirven para

proporcionar energía a otros tejidos cuando se agotan las reservas de glucosa.

Los defectos hereditarios en la oxidación de los ácidos grasos pueden aparecer a cualquier edad, desde el

nacimiento a la edad adulta, llevando a una descompensación metabólica después de un periodo de inadecuada

ingesta calórica o tras una enfermedad. La deficiencia de la acil-CoA deshidrogenasa de cadena media es la

alteración más frecuente. Su principal característica clínica es la hipoglucemia no cetósica relacionada con el

ayuno. La primera aproximación diagnóstica consiste en el estudio de los ácidos orgánicos en orina, ácidos grasos

libres y carnitina plasmática. Las pruebas de laboratorio pueden no ser concluyentes si las muestras de sangre y

orina no se recogen durante el periodo de descompensación aguda. Una vez establecido el diagnóstico, el

pronóstico suele ser excelente: basta con instaurar una dieta rica en hidratos de carbono y evitar el ayuno.

1.4.- Tratamiento

Ante un cuadro de deterioro metabólico con sospecha de error congénito del metabolismo, aún sin diagnóstico

establecido, es necesario iniciar un protocolo de tratamiento de emergencia7. El objetivo es reducir en lo posible

las secuelas neurológicas de estos desórdenes:

- Hidratación.

- Corrección lenta de la acidosis con bicarbonato.

- Suspender el aporte proteico para evitar la producción de sustratos patológicos.

- Mantener un aporte calórico suficiente para evitar el catabolismo.

- Eliminar los metabolitos tóxicos que se acumulan: diuresis forzada, exanguinotransfusión, hemofiltración o

diálisis.

Una vez que se ha establecido el diagnóstico:

- Aporte proteico modificado para evitar en lo posible el acúmulo de metabolitos tóxicos.

- Mantener un aporte calórico suficiente para favorecer el anabolismo permitiendo un desarrollo y

crecimiento normales.

- Ingesta proteica limitada con restricción de aminoácidos precursores.

Los controles bioquímicos deben perseguir dos objetivos:

- Valoración del estado nutricional.

- Valoración de la estabilidad metabólica de la enfermedad: equilibrio ácido-base, glucemia y cuerpos

cetónicos en orina.

1.5.- Diagnóstico de laboratorio

El diagnóstico depende tanto del reconocimiento de los signos y síntomas clínicos de la enfermedad como de la

caracterización de la naturaleza química de estos desórdenes8. Debe establecerse rápidamente, antes de que el

daño causado sea permanente. Sin embargo, estas enfermedades son poco comunes y algunos factores dificultan

este diagnóstico:

- Signos y síntomas inespecíficos.


210

- Presentación como casos aislados.

- Baja prevalencia. Previamente se descartan otras condiciones más frecuentes.

- Escaso conocimiento de signos o síntomas que pueden ser clave para su reconocimiento.

- Algunos trastornos sólo producen anomalías intermitentes y las muestras de sangre y orina pueden ser

irrelevantes si no se han tomado en la fase aguda de la enfermedad.

Inicialmente, el síntoma más relevante es la tendencia a acidosis metabólica con anión GAP aumentado. El color y

olor de la orina ofrecen con frecuencia pistas importantes: a azúcar quemado en la enfermedad de la orina con

olor a jarabe de arce o a pies sudados en la acidemia isovalérica.

El diagnóstico específico se realizará al identificar los metabolitos anormales en plasma y orina; las muestras

deben recogerse en la fase aguda y antes de comenzar cualquier tratamiento. El diagnóstico definitivo se basa en

el estudio enzimático y molecular.

1- Primer nivel de diagnóstico: analítica básica de orientación. Hallazgos más frecuentes:

a. Acidosis metabólica con anión GAP superior a 20 meq/L orienta a una acidemia orgánica.

b. Hiperamoniemia, especialmente en acidemia propiónica, metilmalónica e isovalérica.

c. Ácido láctico moderadamente elevado. Si está muy elevado, orienta hacia acidosis láctica.

d. Presencia de cetonas y sustancias reductoras en orina.

2- Segundo nivel de diagnóstico: determinación de metabolitos patológicos.

a. Perfil de ácidos orgánicos en orina, específico de cada entidad.

b. Aminoácidos en plasma y orina.

c. Cuerpos cetónicos en plasma.

d. Carnitina libre en plasma (disminuye al ser consumida como detoxificante).

e. Perfil de acilcarnitinas en orina (aumentan).

3- Tercer nivel: diagnóstico enzimático y análisis molecular.

1.5.1.- Ácidos orgánicos en orina

En 1966, el Dr. Tanaka abrió el camino para caracterizar las bases clínicas, bioquímicas y moleculares de un

trastorno en el metabolismo de la leucina causado por un déficit en el enzima isovaleril-CoA deshidrogenasa.

Reconoció la importancia diagnóstica del perfil de aminoácidos en orina y desarrollo una de las primeras

aplicaciones de la espectrometría de masas al estudio de los errores congénitos del metabolismo2,6.

La orina humana contiene numerosos ácidos orgánicos y otros metabolitos en concentraciones muy variadas. En

la orina de un paciente con deficiencia de una enzima o un cofactor enzimático, el sustrato de ese enzima o los

metabolitos formados debido a la activación de vías metabólicas secundarias, se incrementa de forma muy

acusada.

Los ECM pueden diagnosticarse en muchos casos gracias a la presencia de estos metabolitos en la orina, tales

como ácidos orgánicos, aminoácidos, acilglicinas o acilcarnitinas. Muchas enfermedades metabólicas muestran


211

una presentación clínica similar, por lo que el diagnóstico definitivo sólo puede realizarse mediante el análisis de

fluidos biológicos.

Los ácidos orgánicos son compuestos solubles en agua que contienen uno o más grupos carboxilo y otros grupos

funcionales (no amino). Se forman en el metabolismo intermedio de la mayoría de los componentes orgánicos

celulares: aminoácidos, lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos y esteroides.

Debido a su relativamente bajo peso molecular, su solubilidad y otras características físicas, la mayoría de los

ácidos orgánicos se excretan en la orina, siendo éste el espécimen de elección para su determinación, mientras

que la metodología universalmente aceptada es la cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas

(GC/MS), que une el elevado poder de resolución de la cromatografía con la sensibilidad y capacidad analítica de

la espectrometría de masas.

En menos del 5% de las enfermedades metabólicas hereditarias la detección se basa en programas de cribado

poblacional en el periodo neonatal4,8. Los criterios de la OMS para que una enfermedad entre en un programa de

cribado neonatal son:

- Severa morbilidad y mortalidad si la enfermedad no se diagnostica en el periodo neonatal.

- La intervención médica a tiempo reduce significativamente la morbilidad, mortalidad y discapacidades

asociadas.

- Prevalencia mayor a 1 caso por 10000 recién nacidos.

- Existe un ensayo analítico sensible, específico y de coste apropiado.

Las muestras de orina impregnada en papel de filtro resultan muy útiles para los programas de screening

poblacional.

Para la correcta interpretación de los resultados del screening, es importante reconocer la variación normal del

patrón de aminoácidos en orina en función de la edad, dieta y medicación. Por ejemplo, los niños menores de 6

meses excretan grandes cantidades de prolina, hidroxiprolina y glicina, patrón anormal en individuos mayores. Los

neonatos excretan mayor cantidad de etilmalonato, α-cetoglutarato y compuestos intermedios del ciclo del ácido

cítrico que los niños mayores9.

La espectrometría de masas en tándem (MS/MS), se está utilizando con éxito en los programas de cribado

neonatal, debido a la rapidez del análisis y la facilidad en la preparación de la muestra. Sin embargo, el análisis de

ácidos orgánicos por GC/MSD es un procedimiento lento y costoso, que sólo se utiliza para el cribado selectivo en

pacientes previamente sintomáticos o para confirmar un resultado positivo en el screening.

El espécimen de elección es orina de una micción recogida sin conservantes. El paciente no requiere preparación

especial. Las muestras deben tomarse en la fase aguda de la sintomatología; en caso contrario pueden no revelar

anormalidades diagnósticas. Es recomendable solicitar una serie de información adjunta: edad, fecha y hora de la

recogida, motivo de la solicitud, situación clínica del paciente.

Los ácidos orgánicos deben ser extraídos de la orina mediante una extracción líquido/líquido después de añadir a

la muestra un estándar interno y una pequeña cantidad de ácido (HCL) para conseguir un pH inferior a 2.

Se añade un solvente orgánico (acetato de etilo, éter) y se mezcla vigorosamente. Los ácidos orgánicos,

protonados a pH ácido, pasarán a la fase orgánica de la mezcla. La fase crítica del proceso es la extracción, por lo


212

que se debe repetir 3 ó 4 veces para aumentar el rendimiento. La mezcla de fases orgánicas, convenientemente

homogeneizada, se deseca con sulfato sódico anhidro y se evapora en un baño en corriente de nitrógeno10, 11.

La mayoría de los ácidos que se encuentran en los fluidos biológicos no son volátiles, por lo que tras la

evaporación debemos transformarlos en derivados volátiles a la temperatura del inyector, para que puedan entrar

en la columna y ser separados sin pérdidas importantes. Este proceso es la derivatización y se suele emplear

BSTFA (N,O-bis(trimethylsilyl) trifluoroacetamide) obteniendo así trimetilsilil derivados. Tras la separación

cromatográfica, la detección se realiza en un espectrómetro de masas, comparando el espectro con una librería

almacenada de espectros conocidos.

El análisis de ácidos orgánicos ha sido facilitado por el enorme desarrollo del software acoplado a los

analizadores: la mayoría de espectrómetros de masas incorporan librerías de espectros de ácidos orgánicos y

herramientas para la cuantificación automática de cientos de componentes. Es posible la cuantificación,

comparando con una curva de calibración de compuestos puros.

1.5.2.- Aminoácidos en orina

Durante casi 100 años, la detección de aminoácidos en fluidos biológicos se basó en su reacción con la ninhidrina:

el producto formado puede visualizarse en papel de filtro o medir su absorbancia entre 400 y 600 nm.

Actualmente, la técnica más empleada es la cromatografía.

Los aminoácidos son, por definición, ácidos mono o dicarboxílicos de bajo peso molecular, con uno o dos grupos

amino. El grupo carboxilo pierde un protón con facilidad, quedando cargado negativamente. Por otro lado, el grupo

amino, con un par de electrones libres en el átomo de nitrógeno, tiende a unir un protón, quedando cargado

positivamente. El resultado neto es una sustancia neutra, bipolar, extremadamente hidrófila. Los aminoácidos con

dos grupos carboxilo o dos grupos amino, se comportan de manera diferente; no son neutros, pueden ser ácidos o

básicos. Todos los aminoácidos tienen un punto isoeléctrico diferente. Estas diferencias en la polaridad

constituyen la base de su separación cromatográfica: los aminoácidos neutros aparecen en la parte media del

cromatograma y los aminoácidos básicos eluyen más tarde. También influye en la polaridad la longitud de la

cadena alifática de la molécula; a medida que aumenta ésta, disminuye la polaridad, retrasándose la elución6,12.

El espécimen de elección para el estudio de los desórdenes del metabolismo de los aminoácidos es una muestra

de plasma en ayunas y una muestra de orina de 24 horas, que debe ser recogida con una sustancia

bacteriostática (cloroformo, tolueno) para preservar los aminoácidos.

La metodología empleada por su rapidez, reproducibilidad y sensibilidad es la cromatografía: HPLC con una

columna de fase reversa y un detector de fluorescencia (longitud de onda de excitación = 330 nm; emisión = 450

nm.) Se alcanza una buena separación a 21º C. Otras técnicas utilizadas para la cuantificación de aminoácidos

son la cromatografía de intercambio iónico y la de gases.

Los aminoácidos son componentes preciosos para el organismo humano, por lo que las pérdidas urinarias son

mínimas, debido a un eficiente sistema de reabsorción tubular renal. Los valores de referencia de los aminoácidos

en orina muestran una disminución bastante marcada desde el periodo neonatal a la madurez, debido

fundamentalmente a la maduración del sistema de reabsorción tubular, pero también al aumento de la masa

muscular con la edad, lo que conduce a un aumento de la creatinina. Debemos tener en cuenta las grandes

variaciones en la composición de la orina, debidas a la dieta y a fármacos.


213

1.5.2.- Perfil de acilcarnitinas

El perfil de acilcarnitinas juega un papel muy importante tanto en el diagnóstico prenatal como en el screening

neonatal de errores congénitos del metabolismo. La carnitina y sus ésteres están presentes en condiciones

fisiológicas en todos los fluidos biológicos. Se analizaron por primera vez con fines diagnósticos en la orina,

aunque actualmente el espécimen de elección es plasma o suero para el diagnóstico y sangre u orina impregnada

en papel para los programas de screening poblacional.

La carnitina juega un papel muy importante en el transporte de los ácidos grasos a través de la membrana y hacia

el interior de la mitocondria donde se produce la β-oxidación. Las alteraciones en las distintas etapas de este

metabolismo, por ejemplo el déficit de alguna enzima implicada, producirá la acumulación de compuestos Acil

CoA. Éstos son transformados por la carnitín palmitoil transferasa en acilcarnitinas que son transportadas fuera de

la mitocondria provocando el aumento de estos metabolitos en sangre o bien excretándose a traves de la orina13.

La determinación de la concentración de acilcarnitinas se realiza por espectrometría de masas en tándem con

ionización por electrospray (ESI-MS/MS), la cual permite detectar compuestos específicos en muestras complejas,

evitando en muchos casos la necesidad de una separación cromatográfica previa. La aplicación de esta técnica al

análisis de muestras de orina impregnada en papel permite completar y ampliar la información obtenida mediante

el análisis de acilcarnitinas en sangre14.

2.- Mucopolisacaridosis

2.1- Introducción

Las mucopolisacaridosis (MPS) son un grupo de trastornos de la degradación lisosomal de los

glucosaminoglicanos (GAGs) y se caracterizan por la deficiencia/ausencia de alguno de los enzimas implicados en

la degradación de estos compuestos. Estas deficiencias enzimáticas conducen al depósito intralisosomal

progresivo de GAGs en diferentes tejidos, lo que explica el carácter multisistémico de estas patologías, y la

excreción de altas cantidades en orina de dichos compuestos. Las MPS, se presentan con una frecuencia

aproximada de 1 caso en 10000 a 1800015 recién nacidos vivos y son de herencia autosómica recesiva, salvo la

MPS II o enfermedad de Hunter, que se hereda ligada al cromosoma X. Las características clínicas más

frecuentes son la presencia de rasgos faciales toscos, macrocefalia, opacidades cornéales, disostosis múltiple,

talla baja, valvulopatía mitro aórtica, hepatoesplenomegalia, hernias umbilicales e inguinales, con o sin retraso del

desarrollo psicomotor y con un deterioro neurológico progresivo. Salvo para las formas menos severas de MPS I,

hasta ahora no hay un tratamiento efectivo para estas patologías, por lo que el daño sistémico progresivo produce

la muerte entre los fines de la primera y de la cuarta década de la vida.

2.2- GAGs y tipos de MPS

Los GAGs (anteriormente denominados mucopolisacáridos), son heteropolisacáridos ubicuos polianiónicos,

estructuralmente complejos, que se componen de unidades de disacáridos formados por una hexosamina y un

ácido hexurónico. Estos compuestos se encuentran unidos covalentemente a un núcleo proteico formando los

proteoglucanos16 y se distribuyen en diferentes tejidos (hueso, cartílago, córnea,…) y fluidos biológicos (líquido

sinovial, humor vítreo) con una función tanto estructural como protectora. Aunque todos los GAGs se componen

de unidades de disacáridos que se repiten, hay variaciones estructurales dentro de estas subunidades, ya que

durante su proceso de biosíntesis pueden sufrir reacciones de sulfatación, epimerización y acetilación. La ruptura


214

inicial de los proteoglucanos rinde los GAGs, que son degradados en los lisosomas a partir del extremo no

reductor de la molécula mediante la acción secuencial de glucosidasas, desacetilasas y sulfatasas. La mayoría de

los componentes de los proteoglucanos son reciclados, pero pequeñas cantidades de los GAGs parcialmente

degradados son excretados en la orina. La deficiencia de alguna de las enzimas anteriormente comentadas

conduce a la acumulación de los GAGs en los lisosomas y a la excreción de altas cantidades en orina, dando

lugar a una disfunción celular, tisular y orgánica. El debut de los síntomas, la extensión y la severidad de la

enfermedad, varía ampliamente entre los once defectos enzimáticos que conducen a los distintos tipos de MPS

(Tabla 2). El diagnóstico de este tipo de trastornos puede ser problemático ya que sus fenotipos pueden solaparse

entre las distintas MPS y con otras enfermedades de almacenamiento, como la mucolipidosis I, II y III,

manosidosis, fucosidosis y la deficiencia múltiple de sulfatasas17,18. Además, diversas condiciones caracterizadas

por organomegalia y/o macrocefalia junto con retraso en el desarrollo pueden confundirse con las MPS.

Tabla 2. Tipos de Mucopolisacaridosis. (DS: dermatán sulfato. HS: heparán sulfato. KS: queratán sulfato. HA: ácido hialurónico).

Los principales GAGs son el condroitín sulfato, dermatán sulfato, heparán sulfato, queratán sulfato y la heparina.

Cuantitativamente, el más importante es el condroitín sulfato, el cual, se encuentra en los huesos, cartílagos y

válvulas cardíacas. Se compone de unidades alternantes de ácido glucurónico y N-acetilgalactosamina. La N-

acetilgalactosamina puede estar sulfatada en la posición 4 (condroitín sulfato tipo A) o en la 6 (condroitín sulfato

tipo C) (Figura 4).

Tipo MPS

Epónimo Deficiencia Material de almacenamiento

I Hurler/Scheie α-L-iduronidasa DS, HS II Hunter Iduronato-2-sulfatasa DS, HS

III A Sanfilippo A Heparán-N-sulfatasa (sulfamidasa) HS III B Sanfilippo B α-N-acetil-glusosaminidasa HS III C Sanfilippo C α-glucosaminida-N-acetiltransferasa HS III D Sanfilippo C N-acetilglucosamina-6-sulfatasa HS IV A Morquio A N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa KS, condroitín 6-

sulfato IV B Morquio B β-galactosidasa KS VI Maroteaux-Lamy N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa DS, condroitín 4-

sulfato VII Sly β-glucuronidasa DS, HS, condroitín

4-, 6-sulfato IX Natowicz Hialuronidasa HA


215

O

OHO

HOOH

2OCO

O

NHAc

O OH

O

O

OH

2OC

HO

N-Acetilgalactosamina-4-sulfatasaMPS VI

N-Acetilgalactosamina -6-sulfatasaMPS IVA

β-D-GlucuronidasaMPS VII

Ácido glucurónico N-Acetilgalactosamina Ácido glucurónico N-Acetilgalactosamina

O3S

O

O

OH

NHAc

OSO3

Figura 4. Estructura del Condroitín sulfato. Déficits enzimáticos implicados en las distintas MPS.

En el dermatán sulfato el disacárido básico está formado por ácido-L-idurónico y N-acetilgalactosamina-4-sulfato,

aunque también se puede encontrar N-acetilgalactosamina-6-sulfato (Figura 5); además pueden existir cantidades

variables de ácido glucurónico por epimerización del ácido idurónico en el carbono 5, el cuál puede estar sulfatado

en el carbono 2; se encuentra en la piel, en el cartílago de las articulaciones, los vasos sanguíneos y válvulas del

corazón.

El queratán sulfato suele estar presente en tejidos avasculares de difícil oxigenación como la córnea o discos

intervertebrales y el disacárido básico es la D-galactosa y la N-acetilglucosamina-6-sulfato (Figura 6).

Ácido idurónico N-Acetilgalactosamina Ácido glucurónico N-Acetilgalactosamina

MPS Iα-L-Iduronidasa

MPS VIN-Acetilgalactosamina-4-sulfatasa

O

O

O

NHAc

OHO

O

NHAc

O OH

O

O3S

Iduronato-2-sulfatasaMPS II MPS VII

β-D-Glucuronidasa

HO

2OC

OH

O

O

3OS

CO2

HO

HO O

SO3

Figura 5. Estructura del Dermatán sulfato. Déficits enzimáticos implicados en las distintas MPS.


216

OH

O

OHOH

O

O

HOOH

O

OHOSO3

O

NHAc

OSO3

HO OO

NHAcHO

OSO3

O

Galactosa N-acetilglucosamina Galactosa N-acetilglucosamina

β-galactosidasa MPS IVB

N-acetilgalactosamina-6-sulfatasaMPS IVA

Figura 6. Estructura del Queratán sulfato. Déficits enzimáticos implicados en las distintas MPS.

En cuanto al heparán sulfato, éste se halla compuesto por un ácido urónico que bien puede ser glucurónico o

idurónico, con frecuencia sulfatado en la posición 2 y una glucosamina que puede estar sulfatada en posición 3 o 6

y además, puede estar sulfatada, acetilada o sin sustituir en la posición N (Figura 7). Se encuentra sobre todo en

la matriz extracelular y en la superficie celular. Hay que destacar que cuando el grupo amino de la glucosamina se

halla sulfatado y es degradado por su correspondiente enzima, rinde el grupo amino libre, el cual, aún no puede

ser escindido y debe ser acetilado por una acetiltransferasa para que pueda ser degradado.

MPS IIIduronato-2-sulfatasa

OHO

HOOSO3

O

CO2

O

NHAcHO

O

OH

α−L-iduronidasa MPS I

N-acetilglucosamina-6-sulfatasaMPS IIID

1-Heparán sulfamidasa MPS IIIA2-α-glucosaminida N-acetiltransferasa MPS IIIC

α−N-acetilglucosaminidasaMPS IIIB

β-glucuronidasaMPS VII

Ácido idurónico N-sulfo-D-glucosamina Ácido glucurónico N-acetilglucosamina

O

NHSO3

HO

O

OO

OHHO

OSO3

2OC

Figura 7. Estructura del Heparán sulfato. Déficits enzimáticos implicados en las distintas MPS.

Las MPS se clasifican como tipos del I a IX ya que la MPS V (anteriormente síndrome de Scheie, es

genéticamente idéntica a la MPS I, a pesar de su diferente fenotipo) y la MPS VIII ya no son reconocidas.

2.2.1.- MPS I

La mucopolisacaridosis tipo I (OMIM #252800) es un trastorno autosómico recesivo causado por la deficiencia de

la hidrolasa lisosomal α-L-iduronidasa, la cual es necesaria para la degradación del dermatán y heparán sulfato

(Figura 5 y 7). En la forma severa (síndrome de Hurler, MPS IH) los principales síntomas son las deformidades

esqueléticas y el retraso en el desarrollo motor y mental. El examen radiológico esquelético revela un patrón

característico denominado disostosis múltiple. Los pacientes con la forma adulta (síndrome Scheie, MPS IS) son

de altura casi normal y no sufren retraso mental. Los síntomas típicos son contracturas articulares, opacidades

cornéales, síndrome del túnel carpiano y leves cambios esqueléticos. En la mayoría de los casos, el corazón se ve

también afectado por el depósito. Algunos pacientes con un déficit de α-L-iduronidasa muestran síntomas


217

intermedios entre los síndromes de Hurler y Scheie (síndrome de Hurler-Scheie MPS IH-S). Además del

tratamiento paliativo, es posible el transplante de médula ósea y la terapia de reemplazo enzimático (Laronidasa,

Aldurazyme), que en ensayos clínicos se ha visto que induce una mejora de la función pulmonar y de la movilidad

articular; ésta última opción está indicada en pacientes sin manifestaciones neurológicas19.

2.2.2.-MPS II

La mucopolisacaridosis tipo II (OMIM #309900), también conocida como síndrome de Hunter, es causada por la

deficiencia de la iduronato-2-sulfatasa, la cual da lugar al almacenamiento de heparán y dermatán sulfato (Figura 5 y 7). De herencia ligada al cromosoma X, también se ha observado en pacientes de sexo femenino20. Puede

presentarse tanto en formas leves como en severas. Las severas comparten características con el síndrome de

Hurler como facies toscas, hepatoesplenomegalia, trastornos cardiovasculares, disostosis con enanismo y

sordera. Sin embargo, el síndrome de Hunter se diferencia por su debut más tardío, un curso clínico más lento y la

ausencia de opacidad corneal21. La forma grave suele ponerse de manifiesto en los dos primeros años de la vida y

siempre conlleva un retraso mental moderado-grave, junto con un deterioro progresivo que da lugar al

fallecimiento del paciente en la segunda década de la vida. En la forma leve no existe deficiencia mental, o ésta es

mínima, y el pronóstico de vida alcanza la edad adulta, por lo que en algunos casos se hacen más evidentes los

problemas óseos, cardíacos o respiratorios22. En cuanto al tratamiento además de las medidas paliativas y el

transplante de médula, también está disponible el tratamiento enzimático sustitutivo (Idursulfasa, Elaprasa) 21.

2.2.3.-MPS III

La mucopolisacaridosis tipo III o enfermedad de Sanfilippo, se caracteriza porque presenta cuatro variantes

causadas por diferentes deficiencias enzimáticas pero con similares características clínicas, que dan lugar a la

acumulación de heparán sulfato (Figura 7). Los responsables de los distintos subtipos de MPS III son: la heparán

sulfamidasa en la MPS IIIA (OMIM #252900), la α-N-acetilglucosaminidasa para la MPS IIIB (OMIM #252920), la

acetil CoA: α -glucosaminida N-acetiltransferasa, para la MPS IIIC (OMIM #252930), y la N-acetilglucosamina-6-

sulfato sulfatasa para la MPS IIID (OMIM #252940). La MPS III se caracteriza principalmente por afectación del

sistema nervioso central, pudiendo estar presentes las características clínicas de las MPS aunque en menor

extensión que en otras formas. Los primeros síntomas aparecen entre los 2 y los 6 años de edad, con un deterioro

mental y alteraciones del comportamiento (hiperquinesia, agresividad) 23 y un dimorfismo muy leve. Se han

descrito algunos casos de formas atenuadas. Los trastornos del sueño son también comunes. El único tratamiento

disponible es sintomático, y el trasplante de médula ósea está contraindicado ya que no retrasa el deterioro mental

incluso en pacientes trasplantados presintomáticamente. Las posibilidades de terapia de sustitución enzimática

están bajo investigación en modelos animales.

2.2.4.-MPS IV

También conocida como síndrome de Morquio presenta 2 formas: la MPS IVA (OMIM #253000) debida a un déficit

de N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa y la MPS IVB (OMIM #253010) debida a un déficit de β-galactosidasa. La

deficiencia en cualquiera de las dos enzimas conduce a un acúmulo del queratán sulfato (Figura 4 y 6) y a

anomalías de los huesos de la cabeza, tórax, manos, rodillas y columna dorsal; en general los pacientes no suelen

presentar discapacidad intelectual. Las anomalías esqueléticas en la forma IVB son generalmente más leves que

en la IVA. Además en la MPS IVA también puede existir acúmulo de condroitín-6-sulfato (Figura 4). En el

síndrome de Morquio también puede presentarse una opacidad corneal leve, hepatoesplenomegalia y afectación


218

de las válvulas cardíacas; algunos pacientes desarrollan una sordera progresiva y puede observarse hipoplasia

dental en MPS IVA aunque no en la MPS IVB. Ambos tipos de MPS IV pueden presentar formas suaves o severas

dependiendo de la actividad enzimática residual. En las severas el crecimiento es mínimo tras los 6-7 años de

edad, y la muerte suele tener lugar en la tercera o cuarta década de la vida24. Los pacientes con formas leves

pueden alcanzar hasta la séptima década.

2.2.5.-MPS VI

También denominada síndrome de Maroteaux Lamy (OMIM #253200) se caracteriza por una deficiencia en la

enzima arilsulfatasa B, también llamada N-acetilgalactosamina-4-sulfatasa, que conduce a un acúmulo de

dermatán sulfato y condroitín 4-sulfato (Figura 4 y 5). En general, el retraso del crecimiento ocurre a partir de los

dos a tres años de la edad, con tosquedad de los rasgos faciales y anomalías en los huesos de manos y de

columna dorsal. También puede existir rigidez articular; la inteligencia no suele afectarse. Este síndrome puede

presentarse en una forma leve, intermedia o severa. La forma severa suele presentarse entre los 1-6 años de

edad con facies toscas, trastornos esqueléticos severos, problemas articulares, enfermedad respiratoria y

anormalidades cardíacas. Aunque la inteligencia usualmente es normal, pueden existir trastornos visuales y

auditivos o hidrocefalia, que pueden conducir a un retraso en el desarrollo. La muerte suele producirse en la

tercera década de la vida24. La forma leve es similar al síndrome de Scheie, excepto que los pacientes con MPS VI

presentan talla baja. Actualmente está disponible un tratamiento basado en terapia enzimática sustitutiva

(Galsulfasa, Naglazyme) 25, por lo que es importante un diagnóstico temprano.

2.2.6.-MPS VII

Denominada síndrome de Sly (OMIM #253220), está causado por la deficiencia de β-D-glucuronidasa que da lugar

a la acumulación de heparán, dermatán y condroitín sulfato (Figuras 4, 5 y 7). Su presentación clínica suele ser

muy variable, aunque las características y complicaciones clínicas pueden ser similares a la MPS I. Existen formas

prenatales con hidropsis fetalis no inmune26, formas neonatales severas con dimorfismo, hernias,

hepatoesplenomegalia, disostosis, hipotonía severa y alteraciones neurológicas que en última instancia conducen

a retraso mental profundo y estatura baja en caso de supervivencia. Finalmente, existen también formas muy

leves que se descubren durante la adolescencia o la edad adulta. Aparte del tratamiento sintomático, los

tratamientos específicos (transplante de médula ósea alogénico, terapia de reemplazo enzimático, y terapia

génica) sólo se han probado en modelos animales.

2.2.7.-MPS IX

Es un trastorno extremadamente raro (OMIM #601492) producido por la deficiencia de hialuronidasa (síndrome de

Natowicz) que conduce al acúmulo de ácido hialurónico. Las manifestaciones clínicas son comunes a las otras

MPS e incluyen estatura corta, dismorfias craneofaciales leves y algunas alteraciones específicas como son la

presencia de masas rodeando los tejidos blandos que limitan el movimiento de las articulaciones. Hasta ahora sólo

un paciente ha sido caracterizado clínicamente27.


219

2.3- Diagnóstico y pruebas de laboratorio.

La diagnosis de las MPS debería basarse en unos firmes hallazgos clínicos antes de iniciar las pruebas

bioquímicas, ya que existen diversas patologías que podrían conducir a cambios en la excreción de GAGs como:

cáncer28, cistitis intersticial29, litiasis renal30, diabetes mellitus31, glomerulonefritis crónica32, e insuficiencia renal

crónica33. Ante una sospecha de MPS, en primer lugar se lleva a cabo un test de screening cualitativo o

cuantitativo para la detección de una excreción aumentada de GAGs en orina. A continuación, si el test resulta

positivo, hay que conocer el patrón de GAGs excretados, bien por una electroforesis, bien por una cromatografía

en capa fina (TLC). Conocido el patrón de excreción de GAGs, ya se podría sugerir el tipo de MPS; en base a este

patrón, hay que confirmar la deficiencia enzimática34, bien en leucocitos de sangre periférica, bien en cultivo de

fibroblastos. En este punto, en base a unos hallazgos clínicos y a una deficiencia enzimática confirmada, ya se

puede realizar el diagnóstico de MPS; actualmente también se puede realizar la detección de mutaciones que

provoquen dicha deficiencia.

En la bibliografía se pueden encontrar diversos test de screening para la determinación de GAGs en orina, como

son, la precipitación con cloruro de cetilpiridinio, en donde los mucopolisacaridos se precipitan en presencia de

una sal de amonio cuaternario y posteriormente se determinan por turbidimetría35; el test de azul Alcián36, en

donde los GAGs forman un complejo insoluble con el colorante, dicho complejo se separa, posteriormente se

disocia , y entonces los GAGs son cuantificados espectrofotométricamente; el test de ácido urónico-carbazol37, el

cuál mide el contenido en ácido urónico en presencia de carbazol de los GAGs que previamente han sido

hidrolizados en presencia de un ácido (este test puede producir resultados falsos negativos para la MPS IV, ya

que el queratán sulfato no posee ácidos urónicos en su estructura, Figura 6); el test de Berry38, quizás hasta hace

poco, el más utilizado debido a su sencillez; por último, el test de azul de dimetilmetileno39,40, probablemente el

más usado en la actualidad.

2.3.1.-Test de Berry

También denominado como test de puntos o manchas (Berry spot) proporciona una rápida evaluación cualitativa

de GAGs en orina. Básicamente, los GAGs reaccionan con azul de toluidina (colorante catiónico) (Figura 8) para

dar lugar a un compuesto de color rosa. La orina es aplicada sobre papel de filtro, se deja secar y el papel es

introducido en la solución de colorante durante 2 minutos. Después que el papel se ha secado, éste es lavado con

ácido acético y agua desionizada y el resultado es interpretado. El espécimen que se recoge es orina de una

micción de primera hora de la mañana, ya que está relativamente concentrada; las orinas diluidas pueden dar

falsos negativos especialmente en trastornos con una menor excreción de GAGs, tales como la MPS III y IV. Entre

las desventajas de este método se encuentra el hecho de que proporciona resultados cualitativos y que no se

corrigen con el contenido de creatinina. Este hecho puede dar lugar a resultados falsos positivos y negativos. Por

ejemplo, las muestras neonatales pueden dar falsos positivos debido a una excreción elevada de GAGs que es

normal durante este periodo. En individuos normales las concentraciones de GAGs en orina son más altas al

nacimiento, caen sustancialmente durante los primeros meses de edad y declinan progresivamente durante la

niñez y adolescencia. Este inconveniente se ve superado por los métodos de screening cuantitativos que utilizan

intervalos de referencia establecidos por edad. Además, las MPS con moderada excreción de GAGs como la III y

IV pueden proporcionar resultados falsos negativos41. Por tanto, algunos autores no recomiendan el screening de

GAGs con métodos tipo Berry o spot tests42


220

N

S

CH3 CH3

CH3

CH3

H3C

CH3

Cl

Azul de dimetilmetileno Azul de toluidina

N

S NCH3

CH3

H3C

H2N

Cl

Figura 8. Colorantes catiónicos usados en la determinación de GAGs

2.3.2.-Test de azul de dimetilmetileno (DMB)

Actualmente es el test de screening más utilizado debido a su alta sensibilidad43,44. En él, los GAGs presentes en

la orina forman un complejo con el DMB (Figura 8), que puede ser leído espectrofotométricamente a 520 nm. Hay

que tener en cuenta que la absorbancia del complejo GAGs-DMB no es estable en el tiempo, por lo que las

condiciones de ensayo deben ser fuertemente estandarizadas45. Los resultados se expresan corregidos por la

concentración de creatinina (mg/gramo creatinina o mg/mmol creatinina). El espécimen de elección es orina de

una micción de primera hora de la mañana, permaneciendo los GAGs estables a temperatura ambiente durante

diez días46. Existen distintas modificaciones de este test para intentar evitar la interferencia de otros polianiones47

y proteínas48,49, sin embargo, los actuales ensayos no consideran la interferencia de otros componentes como los

diversos pigmentos urinarios y distintas sales como, fosfatos, sulfatos, pirofosfatos y citratos. Para evitar este tipo

de interferencias se pueden usar procedimientos como el desalado mediante diálisis y/o someter el espécimen a

una cromatografía de intercambio iónico50, aunque no se suelen realizar debido a su alto consumo de tiempo. Es

muy importante establecer intervalos de referencia dependientes de la edad según la versión del método que se

utilice, ya que durante las primeras semanas/meses de vida, existen importantes variaciones en la excreción de

GAGs. Existen autores que informan que el test de DMB no es fiable51, o no es apropiado como método de

screening, ya que muestras de individuos normales proporcionaron resultados falsos positivos y orinas de

individuos afectos de MPS dieron falsos negativos. En este caso particular el test de DMB fue adaptado a un

analizador automático Cobas Fara. Por contra, Mabe et al43 alcanza una sensibilidad del 100% con el test de DMB

y del 93.6% con el test de Berry; para la especificidad consigue un 74.5% con el DMB y un 53.9% con el de

Berry. Pacientes con una excesiva destrucción del tejido conectivo (lupus eritematoso, artritis reumatoide,

síndrome de Marfán) pueden dar resultados positivos en este tipo de test. De igual modo, los falsos negativos

también son inevitables, especialmente en casos de MPS III y IV, por lo que ante un DMB negativo y una fuerte

sospecha de MPS se debería llevar a cabo una TLC o una electroforesis para conocer el patrón de secreción de

GAGs.

2.3.3.-Cromatografía en capa fina (TLC)

El fraccionamiento de los GAGs por cromatografía o electroforesis debe realizarse en caso de un screening

positivo, o cuando los síntomas y/o signos clínicos sean sugestivos de MPS a pesar de una excreción normal de

los GAGs. En la TLC, el espécimen de elección es orina de una micción de primera hora de la mañana y la

cromatografía se suele desarrollar en una placa de celulosa. Los GAGs se precipitan en presencia de cloruro de

cetilpiridinio y a continuación el precipitado se resuspende en una solución acuosa de LiCl y se mezcla con etanol.

A partir de esta disolución se aplican las muestras sobre una placa de celulosa, y se corren en presencia de


221

distintos disolventes con cantidades decrecientes de etanol (hasta seis disoluciones que van desde etanol al 70%

hasta el 10%). Los GAGs se separan gracias a la diferente solubilidad de sus sales cálcicas en las distintas

concentraciones de etanol. Terminada la cromatografía, los GAGs se tiñen en presencia de azul Alcián. En la MPS

I y II, se observa una excreción aumentada de dermatán y heparán sulfato; en la MPS III es el heparán sulfato el

que se incrementa, mientras que en la MPS IV se observa una fuerte banda correspondiente al queratán sulfato.

La MPS VI muestra un ligero incremento en la excreción de dermatán sulfato que también puede observarse en la

variante Scheie de la MPS I52.

2.3.4.-Electroforesis

Los GAGs son separados por electroforesis (EF) proporcionando distintos patrones para las diferentes MPS.

Como en los anteriores tests el espécimen de elección es una orina de una micción de primera hora de la mañana.

En general, la EF se lleva a cabo sobre un soporte de acetato de celulosa y en presencia de un buffer de acetato

de bario. Con este buffer, la EF depende en mayor medida de la estructura de los GAGs, mientras que el grado

de sulfatación es de menor importancia. Normalmente se lleva a cabo una EF unidimensional, ya que aunque es

de menor resolución que la bidimensional, ésta es más fácil de evaluar y permite la valoración de varios pacientes

en un solo run. La EF bidimensional puede llevarse a cabo para confirmar resultados anormales y para ayudar en

la diagnosis de la MPS IV (síndrome de Morquio) y de la MPS VII (síndrome de Sly), las cuales pueden ser difíciles

de detectar mediante la EF unidimensional51. La precipitación de los GAGs puede llevarse a cabo como en la TLC

con cloruro de cetilpiridinio, pero también puede realizarse con azul alcián; a continuación, el precipitado se

redisuelve en agua desionizada y las muestras se aplican sobre la membrana de acetato de celulosa y son

sometidas a EF. Terminada la EF, la membrana es teñida con azul alcián y desteñida con ácido acético, pudiendo

ser evaluada mediante densitometría. Los patrones de bandas que se originan durante la EF se evalúan respecto

a una mezcla estándar. El dermatán sulfato por ejemplo proporciona dos bandas una de las cuales puede

solaparse con el ácido hialurónico. La presencia anormal de dermatán y heparán sulfato es indicativa de MPS I ó

MPS II, mientras que una prominente banda de heparán sulfato nos indicaría MPS III. Una elevada excreción de

queratán sulfato sería sugestiva de MPS IV. En cualquier caso, el patrón de GAGs proporcionado bien por TLC,

bien por EF, permite la elección adecuada de los correspondientes análisis enzimáticos que confirmarían la

MPS52.

3.- Bibliografía

1- Scriver CR, Beaudet AL, Sly WS, editores. The metabolic and molecular bases of inherited diseases. 6a

ed. New York: McGraw-Hill; 1995.

2- Piero Rinaldo. Organic Acids. En: Blau N, Duran M, Gibson KM, editors. Laboratory guide to the

methods in biochemical genetics. 2a Edition. Verlag Berlin Heidelberg: Springer;2008. 137-165.

3- Barbara K, Burton MD. Inborn errors of metabolism in infancy: a guide to diagnosis. Pediatrics [serie en

internet].1998.102(6):[9 p]. Disponible en:http://www.pediatrics.org/cgi/content/full/102/6/e69.

4- Programas de cribado neonatal en España: Actualización y propuestas de futuro. Documento de

consenso redactado bajo los auspicios de: AECOM (Asociación Española para el estudio de Errores

Congénitos del Metabolismo). AEP-SEIM (Asociación Española de Pediatría, Sección de Errores

Innatos del Metabolismo). SEQC-DP (Sociedad Española de Química Clínica y Patología Molecular,

Comisión de Diagnóstico Perinatal). [actualizado 31 May 2009; citado 1 May 2011]. Disponible


222

en:http://www.seqc.es/es/Publicaciones/2/18/Programas_de_cribado_neonatal_en_Espana:_actualizaci

on_y_propuestas_de_futuro/

5- Letohay DC, Clarke JTR. Organic Acidurias and relates abnormalities. Critical Reviews in Clinical

Laboratory Sciences. 1995.32:377-429.

6- Rinaldo P, Hahn S, Matern D. Inborn errors of amino acid, organic acid and fatty acid metabolism. En:

Tietz Texbook of clinical chemistry and molecular diagnostics. Fourth edition. St. Louis, Missouri:

Elsevier-Saunders 2006.2207-47.

7- Lluch Fernández MD. Tratamiento y seguimiento clínico-bioquímico de las principales acidemias

orgánicas. Pediatr Integral. 2002.6:687-98.

8- Pampols T. Diagnóstico de las enfermedades metabólicas hereditarias. Educación continuada en el

laboratorio clínico. 2005.8:63-72.

9- Shih VE. Detection of hereditary metabolic disorders involving amino acids and organic acids. Clinical

Biochemistry. 1991.24:301-09.

10- Tanaka K, West-Dull A, Hine DG, Lynn TB, Lowe T. Gas-Chromatographic Method of Analysis for

Urinary Organic Acids. II. Description of the Procedure,and Its Application to Diagnosis of Patients with

Organic Acidurias. Clinical Chemistry. 1980.26:1847-53.

11- Duez P, Kumps A, Mardens I. GC-MS profiling of urinary organic acids evaluated as a quantitative

method. Clinical Chemistry. 1996.42:1609-15.

12- Duran M. Amino Acids. En: Blau N, Duran M, Gibson KM, editores. Laboratory guide to the methods in

biochemical genetics. 2a ed. Verlag Berlin Heidelberg: Springer. 2008.53-89.

13- Cocho de Juan J.A, Castiñeiras Ramos D.E, Bóveda Fontán M.D, Colon Mejeras C, Fraga Bermúdez

J.M. Cribado neonatal de los errores congénitos del metabolismo. En: Sanjurjo P, Baldellou P, editores.

Diagnóstico y tratamiento de las enfermedades metabólicas hereditarias. 3Ed. Madrid: Ediciones

Ergón. 2009.43-62.

14- Rebollido M, Cocho J.A., Castiñeiras D.E., Bóveda M.D., Fraga J.M. Aplicación de la Espectrometría de

Masas en Tándem al análisis de aminoácidos, acilcarnitinas, acilglicinas y ácidos orgánicos en

muestras de orina en papel. Química Clínica. 2006.25:64-74.

15- Neufeld EF, Muenzer J. The mucopolysaccharidosis. In: Scriver Ch, Beaudet A, Sly W, Valle D, editors.

The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Diseases. 8Ed. New York: McGraw-Hill; 2001.3421-52.

16- Kjéllen L, Lindahl U. Proteoglycans: structure and interactions. Ann Rev Biochem. 1991;60:443-75.

17- Sardiello M, Annunziata I, Roma G, Ballabio A. Sulfatases and sulfatase modifying factors: an exclusive

and promiscuous relationship. Hum Mol Genet. 2005;14:3203-17.

18- Wraith JE. The mucopolysaccharidoses: a clinical review and guide to management. Arch Dis Child.

1995.72:263-7.

19- Wraith JE, Clarke LA, Beck M et al.Enzyme replacement therapy for mucopolysaccharidosis I: a

randomized, doubleblinded, placebo-controlled, multinational study of recombinant human alpha-L-

iduronidase (laronidase). J Pediatr. 2004.144:581-8.


223

20- Tuschl K, Gal A, Paschke E, Kircher S, Bodamer O. Mucopolysaccharidosis type ii in females: case

report and review of literature. Pediatr Neurol. 2004.32:270-2.

21- Wraith JE, Scarpa M, Beck M, et al. Mucopolysaccharidosis type II (Hunter syndrome): a clinical review

and recommendations for treatment in the era of enzyme replacement therapy. Eur J Pediatr.

2008.167:267-77

22- Martín R, Beck M, Eng C, Giugliani R, Harmatz P, Muñoz V, et al. Recognition and diagnosis of

mucopolysaccharidosis type II. Pediatrics. 2008.121:377-86.

23- Meyer A, Kossow K, Gal A, et al. Scoring evaluation of the natural course of mucopolysaccharidosis

type IIIA (Sanfilippo syndrome type A). Pediatrics. [serie en internet]. 2007 Nov [citado 1 May

2011];120(5):e1255-61. Disponible en: http://pediatrics.aappublications.org/cgi/reprint/120/5/e1255.

24- Wappner RS. Lysosomal storage disorders. En: McMillan JA, DeAngelis, CD, Feigin RD, Warshaw JB,

editores. Oski's Pediatrics. Principles and Practice. 4a ed. Philadelphia: Lippincott.2006.2199.

25- Harmatz P, Whitley CB, Waber L et al. Enzyme replacement therapy in mucopolysaccharidosis VI

(Maroteaux-Lamy syndrome). J Pediatr. 2004.144:574-80.

26- Stone DL, Sidransky E. Hydrops fetalis: lysosomal storage disorders in extremis. Adv Pediatr.

1999.46:409-40.

27- Natowicz MR, Short MP, Wang Y et al. Clinical and biochemical manifestations of hyaluronidase

deficiency. N Engl J Med. 1996.335:1029-33.

28- Martins JRM, Gadelha MEC, Fonseca SM, et al. Patients with head and neck tumors excrete a

chondroitin sulfate with a low degree of sulfation: a new tool for diagnosis and follow-up of cancer

therapy. Otolaryngol Head Neck Surg. 2000.122:115-8.

29- Akçay T, Konokoglu D. Glycosaminoglycan excretion in interstitial cystitis. Int Urol Nephrol

1999.31:431–5.

30- Michelacci YM, Glashan RQ, Schor N. Urinary excretion of glycosaminoglycans in normal and stone

forming subjects. Kidney Int. 1989.36:1022–8.

31- Cadaval RAM, Kohlman O, Michelacci YM. Urinary excretion of glycosaminoglycans and albumin in

experimental diabetes mellitus. Glycobiology. 2000.10:185–92.

32- De Muro P, Faedda R, Satta A, et al. Urinary glycosaminoglycan composition in chronic

glomerulonephritis. J Nephrol. 2005.18:154–60.

33- Michelacci YM, Cadaval RAM, Rovigatti RM, Kohlman O. Renal and urinary glycosaminoglycans in an

experimental model of chronic renal failure in rats. Exp Nephrol. 2001.9:40-8.

34- Blau N, Hoffmann GE, Leonard J, Clarke JTR. The mucopolysaccharidoses. In: Schöder G, editor.

Physician's guide to the laboratory diagnosis of metabolic diseases. Heidelberg, Germany: Springer;

2008.195-203.

35- Manley G, Hawksworth J. Diagnosis of Hurler's syndrome in the hospital laboratory and the

determination of its genetic type. Arch Dis Child. 1996.41:91-6.


224

36- Whiteman P. The quantitative determination of glycosaminoglycans in urine with Alcian Blue 8GX.

Biochem J .1973.131:351-7.

37- Di Ferrante NM. The measurement of urinary mucopolysaccharidoses. Anal Biochem. 1967.21:98-106.

38- Berry HK. Screening for mucopolysaccharide disorders with the Berry spot test. Clin Biochem.

1987.20:365-71.

39- Whitley CB, Ridnour MD, Draper KA, Dutton CM, Neglia JP. Diagnostic test for mucopolysaccharidosis:

I. Direct method for quantifying excessive urinary glycosaminoglycan excretion. Clin Chem.

1989.35:374- 9.

40- de Jong JG, Wevers RA, Laarakkers C, Poorthuis BJ. Dimethylmethylene blue-based

spectrophotometry of glycosaminoglycans in untreated urine: a rapid screening procedure for

mucopolysaccharidosis. Clin Chem. 1989. 35:1472-77.

41- Chih-Kuang C, Shuan-Pei L, Shyue-Jye L, Tuen-Jen W. MPS screening methods, the Berry Spot and

acid turbidity tests, cause a high incidence of false-negative results in Sanfilippo and Morquio

syndromes. J Clin Lab Anal. 2002.16:253-58.

42- de Jong JG, Hasselman JJ, van Landeghem AA, Vader HL, Wevers RA. The spot test is not a reliable

screening procedure for mucopolysaccharidoses. Clin Chem. 1991.37:572-5.

43- Mabe P, Valiente A, Soto V, Cornejo V, Raimann E. Evaluation of reliability for urine

mucopolysaccharidosis screening by dimethylmethylene blue and Berry spot tests. Clin Chim Acta.

2004.345:135-40.

44- De Jong JGN, Heijs WM, Wevers RA.Mucopolysaccharidoses screening: dimethylene blue versus

Alcian blue. Ann Clin Biochem.1994.31:267-271.

45- Panin G, Naia S, Dall'Amico R, et al. Simple spectrophotometric quantification of urinary excretion of

glycosaminoglycan sulphates. Clin Chem. 1986.32:2073-6.

46- Andrade F, Prieto JA, Elorz J, Martín S, Sanjurjo P, Aldámiz-Echevarría L. Stability of urinary

glycosaminoglycans in patients with mucopolysaccharidoses. Clin Chim Acta. 2008.388:73-7.

47- Farndale RW, Buttle DJ, Barrett AJ. Improved quantitation and discrimination of sulfated

glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue. Biochim Biophys Acta. 1986.883:173-7.

48- de Jong JGN, Wevers RA, Liebrandvansambeek R. Measuring urinary glycosaminoglycans in the

presence of protein-an improved screening procedure for mucopolysaccharidoses based on

dimethylmethylene blue. Clin Chem. 1992.38:803-7.

49- Piraud M, Maire I, Mathieu M. Pitfalls of screening for mucopolysaccharidoses by the dimethylene blue

test. Clin Chem.1993.39:163-4.

50- de Lima CR, Baccarin RY, Michelacci YM. Reliability of 1,9-dimethylmethylene blue tests in comparison

to agarose gel electrophoresis for quantification of urinary glycosaminoglycans. Clin Chem Acta.

2007;378:206-15.


225

51- Gray G, Claridge P, Jenkinson L, Green A. Quantitation of urinary glycosaminoglycans using

dimethylene blue as a screening technique for the diagnosis of mucopolysaccharidoses: an evaluation.

Ann Clin Biochem. 2007.44:360–3.

52- Blau, Nenad; Duran, Marinus; Gibson, K. Michael. Laboratory Guide to the Methods in Biochemical

Genetics. 2ed. Verlag Berlin Heidelberg: Springer. 2008.299-305.

ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS DE ORINA

Documents

Transcript of ANÁLISIS DE LAS MUESTRAS DE ORINA