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KAREN P MARTÍNEZ MARCIALES MICROBIÓLOGA DE ALIMENTOS

CLAUDA DIAZ MICROBIÓLOGA INDUSTRIAL

CLAUDIA MONTEJO

COORDINADORA DE BACTERIOLOGÍA Y LABORATORIO CLÍNICO

Fecha Julio 31 de 2011 Fecha Julio 31 de 2011 Fecha Agosto de 2011

GUIA DE LABORATORIO

Unidad de Formación

Versión: 002 Fecha: Julio de 2.011 Manual de calidad

Código: UC-BAC-ALI-GL001 CONTROL Y SEGURIDAD

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MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO

CONTROL Y SEGURIDAD

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PRESENTACIÓN

Referirse a Control y Seguridad alimentaria, es hacer un enlace directo con la Microbiología de los alimentos, teniendo en cuenta que es un campo de estudio muy dinámico que se desarrolla con rapidez, debido a los continuos brotes de enfermedades de origen alimentario, el temor a la contaminación intencional de las fuentes de alimentos y, por supuesto, el renovado interés en los efectos benéficos de las bacterias productoras de ácido láctico. Con excepción de algunos alimentos estériles, todos los demás albergan uno o más tipos de microorganismos. Algunos de éstos tienen funciones deseables en la comida, como en la producción de alimentos fermentados naturalmente, en tanto que otros causan descomposición de la comida y enfermedades de origen alimentario. Para estudiar el papel de los microorganismos en los alimentos y controlarlos cuando sea necesario, es importante aislarlos en un cultivo puro y estudiar sus características morfológicas, fisiológicas, bioquímicas y genéticas. El objetivo general de las Prácticas de Control y seguridad alimentaria es que el estudiante de 7 semestre de Bacteriología y Laboratorio Clínico, se inicie en el conocimiento de la Microbiología de los alimentos, en las características morfológicas, fisiológicas, y nutrición de los microorganismos, además de adquirir las habilidades necesarias para las diversas prácticas de Laboratorio, protocolos, entre otros. Este Manual está dirigido a los estudiantes que iniciaran su experiencia en el manejo de los microorganismos relacionados con los alimentos, por lo que se considera de suma importancia incluir en la primera parte, una lista de recomendaciones relacionadas con las reglas generales de Laboratorio, y los principales procedimientos que el estudiante deberá aprender para que manipule en forma adecuada los microorganismos patógenos de los alimentos, y así se logre garantizar su seguridad y la de sus compañeros. Este manual contiene 12 prácticas de Laboratorio, diseñadas de manera tal que el estudiante se relacione gradualmente con todos los procedimientos, desde la aplicación de las Buenas Prácticas de Laboratorio, toma de muestras, diluciones, hasta la fase analítica de los alimentos, recuento, lectura e interpretación y presentación de los resultados, que hace parte del Plan de estudios de Bacteriología y Laboratorio Clínico de la Universidad de Santander, sede Cúcuta. Se presenta la guía de presentación de resultados, la cual contiene los aspectos básicos de un artículo de investigación, con miras a la preparación y motivación de los




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estudiantes a participar en diversos procesos que conlleven a la propuesta de ideas de investigación dentro del marco de temas de Control y seguridad alimentaria. En cada práctica se incluye los objetivos, fundamento, materiales y equipos, reactivos y medios de cultivo a emplear, procedimientos descritos paso a paso, de los cuales, algunos se complementan con cuadros, figuras y esquemas. Para cada práctica de Laboratorio, se propone una consulta, que el estudiante deberá resolver, recurriendo al material bibliográfico sugerido al final del manual. Se considera que este Manual de Guías de Laboratorio, puede ser de gran utilidad para docentes, y estudiantes , está diseñado de acuerdo a la infraestructura del Laboratorio, y a la programación semestral de la asignatura, que tiene una intensidad de 3 horas de práctica y 1 hora de lectura e interpretación.

Dra. Karen P. Martínez Marciales Microbióloga con énfasis en Alimentos

Auditora de Calidad ISO 17025. E. Especialización en Protección de alimentos

Docente Investigador UDES –sede Cúcuta.




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RECOMENDACIONES PARA LOS ESTUDIANTES

Reglas obligatorias

1. Durante todas las prácticas de laboratorio, se deberá ingresar al Laboratorio, con la bata ya puesta, la cual debe estar cerrada, y solo se quitara una vez se termine y se salga del laboratorio

2. El cabello deberá estar siempre recogido, y se prohíbe el uso de todo tipo de accesorios, tales como, pulseras, anillos, reloj, aretes, entre otros.

3. Se prohíbe el uso del celular, salvo el caso de un suceso extremo, que deberá ser informado a la docente.

4. Se deberá hacer lavado de manos, antes, durante y después de cada practica. 5. Evitar la acumulación y disposición de material u objetos no relacionados con la

práctica, sobre el mesón de trabajo, colocar todos los objetos personales en el sitio que indique la docente.

6. No entrar y salir sin antes informar al docente o haber concluido el horario o sesión completa de la práctica.

Procedimientos de Laboratorio

1. Antes y después de cada practica, los estudiantes deberán limpiar y desinfectar los mesones de trabajo, así como se deberá dejar completamente limpios todos los equipos y utensilios, empleados, como por ejemplo balanzas, licuadoras, entre otros.

2. En el momento del uso del mechero, este no debe estar cercano a los microscopios, ni de objetos personales, o cuadernos de apuntes.

3. Todos los materiales de desechos y restos de alimentos, deberán ser dispuestos en los lugares y/ o recipientes que se tienen para tal fin.

4. En caso de una eventualidad, informar de inmediato a la docente, y tratar de conservar la calma en todo momento.




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Material indispensable para el desarrollo de las Practicas

1. Bata de laboratorio limpia, preferiblemente manga larga, y en buen estado.

2. Gorro o malla, tapabocas, guantes.

3. El presente manual, y la lectura de cada práctica previa a la sesión de clase.

4. Libreta de apuntes, cuaderno para el desarrollo y presentación de las consultas.

5. Paño para limpieza, gel antibacterial o jabón líquido antibacterial, toallas

desechables para el secado de las manos.

6. Marcador indeleble o sharpies.

7. Tijeras, fósforos, cinta de enmascarar.

8. Bolsas ziplok, pilas o gel de refrigeración, cava de icopor o de plástico, debidamente rotuladas.




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Informe de Laboratorio Para la asignatura de Control y Seguridad alimentaria del Programa de Bacteriología y Laboratorio Clínico, se tendrá en cuenta en la presentación de los informes las siguientes pautas:

1. Titulo ( debe ser lo más corto y claro posible ) máximo 8 palabras, si se incluye el nombre de un microorganismos, este debe ir en cursiva, utilizar los verbos adecuados.

2. Autores: apellidos, nombre, direcciones electrónicas, programa. 3. Resumen (máximo 250 palabras ) se incluye en este párrafo de redacción que

se realizo, el objetivo como se realizo, metodología, cuáles fueron los resultados obtenidos, y conclusiones. Recuerda que aquí se plasma la motivación al lector, y la importancia del tema.

4. Palabras claves: mínimo cinco 5. Introducción: se redacta de lo general a lo específico, teniendo en cuenta

referencias internacionales, hasta locales. Una función importante de la introducción es establecer la importancia de su informe.

6. Materiales y métodos: se describe el diseño experimental técnicas de investigación, análisis estadísticos utilizados en el estudio. Debe contener la información suficiente como para que el lector comprenda lo realizado y que a la vez sea breve.

7. Resultados y discusión: se pueden presentar en tablas y gráficos. 8. Conclusiones 9. Bibliografía. Citar fuentes de manera correcta de acuerdo a las normas. 10. Anexos. Fotos, folletos, entre otros.

Tener en cuenta la presentación en letra arial No 10, para títulos y subtítulos 14.




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GENERALIDADES DE LOS ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS DE LOS ALIMENTOS Y AGUAS.

Los productos alimenticios y el agua en general poseen una carga microbiana natural propia del alimento como tal o que fue adquirida durante su elaboración y manipulación. Para lograr determinar si esa concentración microbiana esta dentro de los parámetros normales o sea que no posee una contaminación alta por microorganismos propios o patógenos, es importante desarrollar un criterio Microbiológico para determinar los limites Microbiológicos que debe cumplir el producto de acuerdo a un plan de muestreo. CRITERIO MICROBIOLÓGICO Un criterio Microbiológico es un valor Microbiológico (numero de microorganismos por gramo o mililitro ) Está compuesto por: - Un informe de los microorganismos relacionados o sus toxinas - Los métodos analíticos para su detección y cuantificación. - Un plan definido del número de muestras de campo que serán tomadas y el

tamaño de unidad de muestra. - Limites Microbiológicos en los alimentos - Nivel de unidades de muestra que conforman el límite Microbiológico. APLICACIÓN DE UN CRITERIO MICROBIOLÓGICO: Este puede darse en tres categorías: NORMA MICROBIOLÓGICA: La cual puede ser obligatoria. Este es un límite

Microbiológico incorporado a una ley o decreto que rige para los alimentos y es dictado por el MINISTERIO DE PROTECCIÓN SOCIAL Y EL INVIMA.

ESPECIFICACIÓN MICROBIOLÓGICA: es la que puede ser incorporada en un

código de naturaleza preventiva, el cual es utilizado para aumentar la seguridad que proporciona el código relacionado con la higiene.




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GUÍA MICROBIOLÓGICA: Es la que puede ser usada en caso de no existir una norma o especificación Microbiológica para un alimento en particular.

En Colombia, las normas INVIMA (Instituto Nacional de Vigilancia y Control de medicamentos y alimentos) establecidas para diversos grupos de alimentos, fijan los criterios microbiológicos tanto con carácter de recomendación como obligatorio, para evaluar la inocuidad de un alimento dado, según los lineamientos de la Comisión Internacional de Especificaciones Microbiológicas para los Alimentos (ICMSF). Esta comisión (no gubernamental) proporciona asesoramiento científico en cuestiones de interés microbiológico, con influencia en el comercio internacional de alimentos (1).

No obstante en su amplia utilización, los criterios microbiológicos y también los planes de muestreo no son entendidos completamente, especialmente en cuanto a su base estadística (2). Tampoco es tarea fácil interpretar los resultados de los análisis microbiológicos cuando se contrastan con la normativa.

El objetivo de este apartado del Manual de Control y Seguridad alimentaria, es facilitar la interpretación de resultados de los análisis microbiológicos practicados a alimentos, cuando se contrastan con las normativas fijadas en los planes de atributos de dos y tres clases. En el desarrollo de esta revisión, se presentan algunos términos y definiciones necesarios para entender los mismos y también se explica en qué consisten los planes de captación de muestras.

DEFINICIONES

Criterio microbiológico: El criterio microbiológico define la aceptabilidad de un producto y/o ingrediente alimentario en base a la presencia o ausencia, o el número de microorganismos (y/o sus toxinas) por unidad de masa, volumen, área o lote (3).

El criterio microbiológico contempla además, los métodos de ensayo para la detección o cuantificación del o de los microorganismos, el plan que define el número de muestras del lote a ser analizadas; y el número de unidades de muestras defectuosas (4).

Un criterio microbiológico forma parte de una norma técnica, ley o reglamento técnico para controlar alimentos y/o ingredientes alimentarios. Incluye los requisitos microbiológicos obligatorios y los requisitos microbiológicos recomendados.




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Requisito microbiológico obligatorio: Es el cumplimiento de los límites establecidos

para un microorganismo o grupo de microorganismos que debe ser analizado. El incumplimiento de estos límites para el número de muestras analizadas constituye una violación de la norma, ley o reglamento técnico y estará sujeta a penalización por parte del organismo competente. Generalmente considera microorganismos patógenos de importancia para la salud pública y en algunos casos debe considerar microorganismos no patógenos, pero relevantes como indicadores o como responsables de deterioro en un alimento en particular y de acuerdo con su tecnología (4).

Requisito microbiológico recomendado: Es un microorganismo o grupo de microorganismos que debe ser analizado, aunque no rutinariamente, y el incumplimiento de los límites establecidos para el número de muestras analizadas sirve para alertar al responsable del producto sobre la necesidad de identificar y corregir los factores causantes del problema (4).

Valor n = Es el número de unidades de muestra (paquetes, envases, botellas, etc.) de un lote que se deben examinar para satisfacer un plan de muestreo dado.

Valor c = Es la cantidad máxima de unidades que se permite excedan el criterio microbiológico m. Cuando este número se excede, el lote se rechaza, aunque obligatoriamente no tenga que destruirse (5).

Valor m = Es el número máximo de unidades formadoras de colonias (UFC) o número más probable (NMP) sobre gramo o mililitro de alimento. En los planes de atributos de dos clases separa los alimentos en aceptables (valores iguales o inferiores a m) o inaceptables (valores superiores a m). En un plan de tres clases, m separa los productos de buena calidad (valores < m) de los aceptados marginalmente (valores > m). En las situaciones de presencia/ausencia de los planes de dos clases, es común asignar el valor m = 0. Para los planes de tres clases, el valor m es un valor superior a 0. Los valores m están asociados a las buenas prácticas de manufactura (6).

Valor M = Es una cantidad de unidades formadoras de colonias (UFC) o número más probable (NMP) sobre gramo o mililitro de alimento que se usa para separar la calidad marginalmente aceptable de la inaceptable. M se utiliza en los planes de tres clases. Cifras mayores a M, en cualquiera de las unidades analizadas, son inaceptables y están relacionadas con riesgo sanitario, indicadores sanitarios o con un deterioro potencial (7). El valor de M debe ser tan alto que su presencia constituya un peligro

definitivo o un deterioro evidente.




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CONTROL MICROBIOLÓGICO DE LOS ALIMENTOS

El control microbiológico de los alimentos consiste en comprobar aspectos tales como estado de frescura, capacidad de conservación, condiciones de higiene en la producción y presencia de microorganismos patógenos (8).

Larrañaga y col. también establecen que para conocer la calidad de un lote de alimentos o controlar un proceso, se debe evaluar un determinado número de unidades de ese lote. Es a partir de los resultados obtenidos de esa muestra que se infiere sobre la calidad higiénico-sanitaria del lote.

Lote

Se denomina así a la cantidad de alimentos fabricados y manejados en condiciones uniformes. En la práctica se trata usualmente de alimentos pertenecientes a una misma partida o, en el caso de un procedimiento continuo de fabricación, los elaborados en un período de tiempo limitado, en un solo lugar por un mismo personal. Los fabricantes suelen utilizar códigos para identificar los diferentes lotes (5).

Plan o programa de muestreo

Define el procedimiento de captación de muestras y fija a priori los criterios de decisión (aceptación o rechazo del lote), basándose en el análisis de un número preestablecido de unidades de muestra mediante métodos especificados (9). Para esto es imprescindible que las unidades de muestra seleccionadas sean representativas del lote al que pertenecen y, además, que se tomen al azar, es decir de forma aleatoria, para que tengan todas la misma probabilidad de ser elegidas como componentes de la muestra (8).

Muestra representativa

Es aquella cuyas características son tan similares como sea posible, a las del lote de donde procede, es decir, en la muestra elegida han de estar representados, y en la misma proporción, todos los posibles subgrupos que componen la población total. Si las muestras no son apropiadamente recolectadas y manejadas de una forma aséptica, o no son representativas del lote muestreado, los resultados del laboratorio no tendrán sentido.

El objetivo de la toma de muestra es suministrar información sobre las características microbianas de los alimentos, que teniendo en cuenta criterios previamente




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convenidos, puedan ser útiles para la aceptación o rechazo de los lotes. Dicho objetivo determinará los detalles del procedimiento tales como tamaño de muestra, frecuencia, punto de recogida y la hora de la toma de muestra (10).

También es imprescindible que el alimento, en el momento de su análisis, presente las mismas condiciones microbiológicas que tenía al ser muestreado (11).

PLANES DE MUESTREO

Son utilizados para comprobar el "status" microbiológico de un alimento, su acatamiento a las exigencias de seguridad y su elaboración siguiendo las buenas prácticas higiénicas durante y después de su manufactura (7). Existen dos tipos de planes de muestreo. Uno es el plan de variables, en los que los recuentos de los microorganismos investigados siguen una distribución logarítmica normal. Esta información generalmente es del conocimiento de los encargados de las plantas de producción de alimentos. El otro plan es el de atributos y se utiliza cuando se desconoce la distribución previa de los microorganismos en un alimento.

Planes de atributos

Se aplican cuando no se cuenta con información acerca de los antecedentes del producto alimenticio y por tanto no se puede realizar un plan de muestreo que dependa de la distribución de la frecuencia de los microorganismos en los lotes del alimento. Los planes de muestreo de atributos se clasifican como de dos y tres clases, dependiendo de si se puede permitir o no la presencia de una muestra positiva en cualquiera de las unidades de muestra (12).

Este tipo de planes de atributos está recomendado para la aceptación de productos alimenticios que llegan a puertos de entrada o sitios parecidos (5), pues es común en esos lugares que al recibir partidas de alimentos, los mismos no traigan consigo información sobre la forma cómo fue procesado el alimento o ésta sea insuficiente.

Idealmente, el control microbiológico de los alimentos se debe hacer en la etapa de producción, proceso o preparación para el consumo. Sin embargo, en muchos alimentos que se comercializan internacionalmente no existe el conocimiento del control de la fuente o de las condiciones existentes durante el procesamiento y manejo de esos alimentos. Por lo tanto, existe la necesidad de aplicar algún criterio para evaluar la aceptabilidad de los alimentos en el puerto de entrada de alimentos importados (13).




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Los planes de muestreo de atributos también implican el concepto de "elección de caso o categoría", que se basa en el riesgo microbiológico (12). El "caso o categoría" es la clasificación de los planes de muestreo que va del 1 (el menos crítico) al 15 (el más estricto).

La elección del caso y por lo tanto del plan de muestreo, depende de la gravedad relativa del peligro para la inocuidad alimentaria o para la salud del consumidor, en función de los microorganismos implicados y de la posibilidad de destrucción, supervivencia o multiplicación de los microorganismos durante la manipulación normal del alimento.

Programas de atributos de dos clases (aceptación o rechazo)

En este tipo de programa, las pruebas microbiológicas están encaminadas a comprobar la presencia o ausencia de un microorganismo, generalmente patógeno, o puede ser un recuento en placa para comprobar si es inferior o superior a un nivel crítico.

Ejemplo: Salmonella en 25 g: n = 5 c = 0 m = 0

Esto en la práctica significa que se eligen cinco unidades de muestra (n = 5) aleatoriamente de un mismo lote, para realizarles cinco análisis de detección de Salmonella. Para decidir la aceptación del lote en cuestión, se consideran los resultados. En ninguna de las unidades (c = 0) debe detectarse Salmonella (m = 0).

Otro ejemplo de programa de dos clases sería: Coliformes fecales (NMP/g): n = 5 c = 2 m = 11 Lo que indica este ejemplo es que se deben analizar cinco unidades del producto escogido aleatoriamente. Si en dos unidades de muestra o menos (c = 2) se detecta hasta 11 NMP/g de coliformes, el lote se acepta respecto a esta característica. Pero si en tres o más se detecta presencia en cantidades mayores a 11 NMP/g, no se estaría acatando el criterio microbiológico, se incumpliría con la norma correspondiente y, por tanto, se rechazaría el lote (9).

Programa de atributos de tres clases

El diseño conveniente de los planes de muestreo de tres clases considera la inevitable variabilidad tecnológica, así como la severidad deseada con la cual recuentos bacterianos altos encontrados en una unidad de muestra pueden conducir a rechazar un lote, aun cuando cumpla las condiciones de buenas prácticas de manufactura (14).




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En este programa se dan unos criterios microbiológicos que permiten dividir la calidad del lote de alimentos en tres categorías o clases de atributos: aceptable, provisionalmente aceptable o marginal y rechazable. Se utilizan generalmente con los microorganismos indicadores de higiene (7).

Para ello, se eligen dos niveles de recuentos (m y M).

Si el recuento de cualquier unidad de muestra es superior a M, el lote de alimentos no es aceptable.

Tampoco es aceptable el lote si existen más unidades que las estipuladas en c, presentando recuentos entre m y M.

La tercera opción es aceptar el lote marginalmente, cuando igual o menor cantidad de unidades especificadas en c, tienen recuentos mayores que el valor m pero menores o iguales al valor M.

Y la última alternativa es aceptar el lote cuando todas las unidades de muestra tienen valores microbiológicos inferiores a m.




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Laboratorio No 01

Tema: NORMAS DE BIOSEGURIDAD- BPL- TOMA DE MUESTRAS

OBJETIVOS

Familiarizar al estudiante con la correcta interpretación y aplicación constante

de las BPL. Tener en cuenta las condiciones adecuadas para la toma de muestra Reconocer la importancia de las normas de bioseguridad

NORMAS DE BIOSEGURIDAD

Son un conjunto de medidas preventivas destinadas a proteger la salud de los que allí se desempeñan frente a los riesgos propios derivados de la actividad, para evitar accidentes y contaminaciones tanto dentro de su ámbito de trabajo, como hacia el exterior. El elemento clave es la actitud proactiva hacia la seguridad y la información que permita reconocer y combatir los riesgos presentes en el laboratorio. Será fundamental la realización meticulosa de cada técnica, pues ninguna medida, ni siquiera un equipo excelente puede sustituir el orden y el cuidado con que se trabaja.

NORMAS A TENER EN CUENTA

Utilizar bata manga larga, limpia y cerrada. Mantener el cabello recogido, y protegido mediante gorro o malla. Utilizar el tapabocas correctamente. Lavar sus manos antes, durante y al finalizar el trabajo. Uso de calzado cerrado. Trabajar con orden, limpieza y sin prisa. Circular por el laboratorio con precaución, sin interrumpir a los que están

trabajando.

Colocar la señal de riesgo biológico en todos los laboratorios en los que se manipulen agentes de los grupos 2, 3 ó 4.

Nunca utilizar un equipo de trabajo sin conocer su funcionamiento. Antes de iniciar un procedimiento asegurarse de que el montaje está en perfectas condiciones.

Tomar los tubos de ensayo con pinzas o con los dedos (nunca con las manos). El vidrio caliente no se diferencia del frío.

Evitar que trabaje una sola persona en el laboratorio, especialmente cuando se realicen operaciones de riesgo, y utilizar vitrina, siempre que sea posible.




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Revisar periódicamente la ventilación general, la instalación eléctrica y la de

gases del laboratorio y mantenerlas siempre en perfectas condiciones.

Cuando sea preciso manipular productos que puedan originar emanaciones de sustancias peligrosas u olores desagradables, hacerlo bajo campana extractora, provista de filtros adecuados y someterla a un programa de mantenimiento preventivo acorde a sus características.

Realizar periódicamente un inventario de los reactivos para controlar sus existencias y caducidad y mantener las cantidades mínimas imprescindibles.

No utilizar frigoríficos domésticos en el laboratorio. No comer, beber, fumar, usar cosméticos o guardar alimentos o bebidas en el

laboratorio No pipetear con la boca. Utilizar pipeteador. Utilizar los POES recomendados para cada tipo de trabajo. Etiquetar adecuadamente los productos preparados en el laboratorio y no

reutilizar los envases para otros productos.

Dejar en completo orden y aseo el Laboratorio de Microbiología de Alimentos. Recoger los reactivos, equipos, etc. al terminar el trabajo.

En el mesón de trabajo solo debe estar: materiales de la práctica, guías,

apuntes.

BUENAS PRACTICAS DE LABORATORIO- GOOD LABORATORY PRACTICE

Las Buenas Prácticas de Laboratorio son un sistema de calidad que involucra a la

organización de un laboratorio de investigación. Dicho sistema establece las condiciones bajo las cuales se planifican, realizan, controlan, registran, archivan e informan los estudios realizados por un laboratorio. Estas reglas son promulgadas por organismos como la Organization for Economic Cooperation and Development (OCDE), o la Food and Drug Administration (FDA) Incluyo dos definiciones ampliamente aceptadas:

http://www.fda.gov/oc/spanish/




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OCDE: AOAC:

"Las BPL es todo lo relacionado con

el proceso de organización y las condiciones técnicas bajo las cuales los estudios de laboratorio se han planificado, realizado, controlado, registrado e informado".

"Las BPL son un conjunto de reglas,

procedimientos operativos y prácticos establecidas por una determinada organización para asegurar la calidad y la rectitud de los resultados generados por un laboratorio".

Cuál es el propósito de las BPL? Asegurar la calidad de los datos en los estudios realizados, cuestión de vital importancia ya que constituye la base de su aceptación entre distintos organizaciones y países. Dentro de este contexto las Buenas Prácticas de Laboratorio son un conjunto de

reglas, procedimientos operativos y prácticas establecidas y promulgadas por un determinado organismo, que se consideran obligatorias y buscan asegurar la calidad e integridad de los datos producidos en determinados tipos de investigaciones o estudios.

TOMA DE MUESTRAS

Un protocolo de análisis de alimentos correcto debe considerar :

La heterogeneidad de la presencia de microorganismos en los alimentos.

El proceso de transporte de las muestras del sitio de recolección al laboratorio evitando la multiplicación de los microorganismos presentes o la inactivación de algún microorganismo y;

Que es necesario detectar bacterias de la flora normal del alimento. La finalidad de una toma de muestra es obtener una parte representativa del producto, para luego someterlo a un determinado ensayo microbiológico y conseguir resultados fiables sobre su estado, es necesario que el producto en el momento del análisis, reúna las mismas condiciones microbiológicas que tenga al ser muestreado.

http://www.oecd.org/

http://www.aoac.org/




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CONDICIONES GENERALES BIOSEGURIDAD:

Una vez ingresa el profesional a realizar la toma de muestra este debe tener un equipo completo de protección personal así: uniforme antifluidos o bata cerrada y limpia, (si lo amerita el uso de: guantes, gorro, tapabocas, y en caso de riesgo de salpicaduras se empleara mascarilla facial.)

No se permite comer, beber, fumar en el momento de toma de muestra. Se exige el uso de calzado cerrado. Se debe realizar lavado de manos antes y después de realizar el

procedimiento. El personal antes llevar a cabo la toma de muestra debe conocer el manual de

bioseguridad del laboratorio. El tiempo permisible entre la captación de la muestra y el análisis

microbiológico no debe ser mayor de 24 horas. Durante la toma de muestra y el transporte, la muestra NO debe ser expuesta

al sol, ni a temperaturas superiores de 4º C . EQUIPOS Y UTENSILIOS Para la toma de muestras de alimentos sólidos, es necesario contar con la cava, las pilas de hielo completamente congeladas que permitan el transporte de las muestras a una temperatura no mayor de 4ºC, bolsas estériles con sellado hermético, baja lenguas o cuchillos estériles, termómetro para registrar la temperatura. Equipo de apoyo: cinta, fósforos, mecheros, algodón, tijeras, marcadores de punta fina, lapicero. PREPARACION DE LOS RECURSOS PARA LA TOMA DE MUESTRA : TOMA DE MUESTRA PARA ALIMENTOS SÓLIDOS Materiales

Cava Bolsas estériles , con sello de seguridad Termómetro Mechero , fósforos Pilas de hielo Cuchillo y bajalenguas estéril




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Procedimiento: ENTIENDASE POR ALIMENTO SÓLIDO: PROTEINA CRUDA O COCIDA, PAN, GALLETAS, ENSALADAS, ARROZ, Y CUALQUIER TIPO DE ALIMENTO EN GENERAL.

Acérquese al área en donde debe tomar la muestra según lo indicado por el sitio de toma de muestra.

Tome la temperatura del alimento a ensayar. Destape el cuchillo estéril o bajalenguas y proceda a tomar la muestra,

calculando una toma de mínimo de 200 gramos. (aunque también es recomendable tomar la muestra con los mismos implementos con los que cuenta el establecimiento )

Introduzca rápidamente la muestra dentro de la bolsa estéril. Marque inmediatamente la muestra Lleve a la cava Llene completamente el acta de toma de muestra, teniendo en cuenta de

anotar el nombre del manipulador que preparo el alimento. Si es posible anote las condiciones higiénicas sanitarias que usted observa en

el momento de la toma para facilitar la interpretación de los resultados. Transporte al laboratorio en el menor tiempo posible a una temperatura no

mayor de 4ºC. Una vez en el laboratorio refrigere la muestra hasta el momento en que se va a

analizar. TOMA DE MUESTRA PARA ALIMENTOS LIQUIDOS Materiales

Cava Bolsas estériles, con sello de seguridad o frascos de vidrio estériles. Termómetro Mechero , fósforos Pilas de hielo

Procedimiento: ENTIENDASE POR ALIMENTO LIQUIDO: LECHE, JUGOS, CAFÉ, CHOCOLATE, BEBIDAS ENVASADAS, ETC..

Acérquese al área en donde debe tomar la muestra según lo indicado por el sitio de toma de muestra.




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Tome la temperatura del alimento a ensayar. Asegúrese de que tome un mínimo de 100 ml de muestra Introduzca rápidamente la muestra dentro de la bolsa estéril. Marque inmediatamente la muestra Lleve a la cava Llene completamente el acta de toma de muestra, teniendo en cuenta de

anotar el nombre del manipulador que preparo el alimento, si es un jugo, preguntar si tiene azúcar, hielo, y cual es la fruta con la que se preparo, además de preguntar la procedencia del agua empleada en la preparación.

Si es posible anote las condiciones higiénicas sanitarias que usted observa en el momento de la toma para facilitar la interpretación de los resultados.

Transporte al laboratorio en el menor tiempo posible. Una vez en el laboratorio refrigere la muestra hasta el momento en que se va a

analizar. TOMA DE MUESTRAS CON HISOPOS En las superficies de contacto: Se pasan los hisopos por las areas seleccionadas,

primero en forma horizontal y luego vertical, e inmediatamente se coloca el hisopo en el tubo. En las manos: se pasan los hisopos en toda la superficie de manos, en las palmas y

entre los dedos, e inmediatamente se coloca el hisopo en el tubo. En la nariz: se coloca el hisopo en uno de los orificios de la nariz y se hace un movimiento circular que permita contactar el hisopo con la mucosa de la nariz, e inmediatamente se coloca el hisopo en el tubo. REGISTRO DE LA MUESTRA. Todas las muestras se cerrarán mediante precinto numerado, cuyos números se asentarán en una planilla habilitada al efecto donde se consigne el día, la hora, contenido, condiciones de la muestra y volumen total del lote o partida que representa. La planilla será firmada por el que extrae la muestra, el representante y testigo si correspondiera. ACONDICIONAMIENTO, REMISIÓN Y RECIBO DE LA MUESTRA. La preparación de la muestra, su manipulación y transporte, deberá efectuarse de tal




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manera que impida su ruptura, alteración o contaminación, y se asegure que la muestra examinada por el laboratorio es la misma y está en las mismas condiciones originales de la recogida y documentada por la persona que efectúo el muestreo. En el laboratorio se deberá registrar el número de orden interno que se adjudique a la muestra; la firma del los estudiantes que la procesan con la fecha y hora correspondiente. Si la muestra no cumpliera con las condiciones generales y/o particulares para cada caso, será rechazada, debiendo igualmente registrarse en el laboratorio el ingreso de la misma y las causas del rechazo.

CONSULTA

1. Elabore un formato de acta de toma de muestras (creatividad, se deberá diseñar un dibujo que distinga a cada grupo de trabajo, y un logo, lo que se usara durante todo el semestre) Favor tener en cuenta, que datos deben ir del sitio, de la muestra, y las condiciones que van a interferir en el resultado del análisis de la muestra. 2. Elabore un glosario de 20 términos relacionados con la práctica realizada. 3. Describa mediante un esquema, como se debe tomar correctamente la muestra de: Carne cruda, agua de llave o grifo. 4. Que es un autoclave? Cuál es la forma forma correcta de manejarlo. 5. Elabore un cuadro con 5 errores en la toma de muestra y sus consecuencias.

BIBLIOGRAFIA

http://www.microbiologiadealimentos.com/ http://gestion-y-calidad.blogspot.com/search/label/BUENAS%20PR%C3%81CTICAS%20-%20LABORATORIO. http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/higieneyseguridad.htm http://blogs.clarin.com/blogfiles/fundacion-agustina-lerena/CienciasNaturales1.12ManualparalaTomadeMuestrasdeAlimentos.pdf

http://gestion-y-calidad.blogspot.com/search/label/BUENAS%20PR%C3%81CTICAS%20-%20LABORATORIO



http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/higieneyseguridad.htm

http://blogs.clarin.com/blogfiles/fundacion-agustina-lerena/CienciasNaturales1.12ManualparalaTomadeMuestrasdeAlimentos.pdf

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Laboratorio No 02

Tema: PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO EN MICROBIOLOGÍA

Objetivo

Conocer los diferentes conceptos sobre la preparación de medios de cultivo como soporte para diferentes análisis microbiológicos.

Indicar los diferentes pasos para la preparación de los medios de cultivo teniendo en cuenta los métodos de esterilización adecuados.

Preparar los medios de cultivo adecuadamente teniendo en cuenta sus ingredientes y los cálculos apropiados para todo el proceso.

Fundamento

Uno de los procedimientos mas importantes para la identificación de microorganismos en el laboratorio es la siembra en medios de cultivo como base para la propagación de colonias que nos puedan contribuir para el análisis e identificación de bacterias, mohos y levaduras. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno adecuadas, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentación de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se añaden para promover el crecimiento de los microorganismos menos resistentes Muchas bacterias son indistinguibles morfológicamente por su gran parecidos y en ocasiones se tiñen igual, por esta razón no se pueden identificar solo en el microscopio, por lo tanto se estudian sus características bioquímicas sembrándolas en diferentes medios de cultivo especiales que contienen productos que inhiben el crecimiento de la mayoría de microorganismos excepto de la especie que deseamos averiguar. También se añaden colorantes que actúan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formación de ácido o como inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es rojo en pH básico y amarillo en pH ácido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayoría de las bacterias Gram-positivas).




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CONDICIONES GENERALES PARA EL CULTIVO DE MICROORGANISMOS

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio.

1- Disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica ha de contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones químicas que tengan lugar. Actualmente, la forma más extendida de aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente asequible de nitrógeno y carbón ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen utilizar directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los aminoácidos y otros compuestos más simples de nitrógeno presentes en la peptona.

Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade a muchos medios sustancias como suero, sangre, líquido ascítico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamínica. Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades metabólicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.

2- Consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio deshidratado podemos agregar agua destilado para que se disuelvan los componentes y se forme un medio líquido, solido o semisólido.

Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los medios sólidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está ampliamente extendido en el laboratorio.

3- Presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases

Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera con tensión de oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin oxígeno ambiental.




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En un punto intermedio, los microorganismos microaerófilicos crecen mejor en condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.

4- Condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que preveer el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar así que se deseque el medio.

5- Luz ambiental

La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso de los microorganismos fotosintéticos.

6- pH

La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales.

7- Temperatura

Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre 15 y 43ºC. Otros como los psicrófilos crecen a 0ºC y los termófilos a 80ºC o incluso a temperaturas superiores (hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más cortos, alrededor de 37ºC, y los saprofitos tienen rangos más amplios.

8- Esterilidad del medio

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especímenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante).




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TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

Atendiendo a su estado físico:

1. Líquidos 2. semisólidos 3. sólidos

Atendiendo a su utilidad práctica:

1. Medios para aislamientos primarios:

Para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad de organismos difíciles de hacer crecer. A menudo están enriquecidos con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre, Schaeadler, etc.)

Selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se añaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Variando las sustancia añadidas, se varía el tipo y grado de selectividad (Mac Conkey, Kanamicina-Vancomicina)

Enriquecidos: ralentizan/suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con Vitamina K).

Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales que satisfacen requerimientos de grupos específicos de bacterias, ayudando a su identificación.

2. Medios para identificación:

Diferenciales: formulaciones especiales en las que se estudian las peculiaridades fisiológicas (nutrición y respiración sobre todo) específicas de las bacterias. Seleccionando los medios adecuados se puede llegar a la identificación de casi cualquier bacteria (Oxidación-Fermentación), a través de baterías bioquímicas.

Materiales y Equipos

ITEM TIPO DESCRIPCIÓN

01 MAT Cajas de petri grande

02 MAT Cajas de petri pequeñas

03 MAT Tubos de ensayo 9 ml

04 MAT Erlenmeyer

05 MAT Pipeta 10 ml

06 MAT Papel filtro




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07 EQUI Balanza

08 EQUI Estufa o mechero Reactivos

ÍTEM DESCRIPCIÓN

01 Medios de cultivo deshidratados: Agua peptona, Agar Baird Parker, Agar Sabouraud,

Agar Plate count, Agar Mossel, etc.

02 Agua destilada para diluir el medio deshidratado.

Procedimiento

PASO DESCRIPCIÓN

1 Leer cuidadosamente las instrucciones de preparación del medio de cultivo asignado.

2 Pesar la cantidad exacta del medio deshidratado o las porciones correctas de cada uno de los ingredientes. Cerrar inmediatamente el frasco de medio de cultivo.

3 Disolver la porción pesada de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Si es necesario calentar se debe tener cuidado de no sobrecalentar.

4 Ajustar el pH final de cada lote de medio preparado, preferiblemente a temperatura ambiente (25ºC). Para ello se debe tomar una alícuota de 50 mL, medir el pH y de ser necesario ajustar al pH indicado utilizando HCl 0,1N o NaOH 0,1N.

5 Distribuir el medio de cultivo de acuerdo a las indicaciones señaladas.

6 Identificar el lote de medio de cultivo preparado indicando su nombre, distribución y fecha de preparación.

7 Esterilizar de inmediato el medio de cultivo siguiendo las instrucciones señaladas Si se presenta algún inconveniente, antes de su esterilización, el medio se puede almacenar por un periodo máximo de 12 horas bajo refrigeración. Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado es esencial que se efectúen controles para confirmar que el medio es satisfactorio y cumple con el propósito de uso deseado. Por ello se deben realizar pruebas para verificar la esterilidad, pH, capacidad de promoción de crecimiento, etc.

Consulta

1. Realice un cuadro comparativo de los diferentes medios de cultivo, sus componentes y que

microorganismos se logran identificar con s respectivo uso. 2. Organice un listado de medios de cultivos líquidos, semisólidos y sólidos utilizados

comúnmente en el laboratorio de microbiología de alimentos. 3. Que medios de cultivo se esterilizan y cuáles no? ¿Por qué se esterilizan? Y otros porque no




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Bibliografía

Los medios de cultivo en microbiología. http://www.danival.org/600%20microbio/6000notasmicro/medioscult/medios_110_algunos.html

Medios de cultivo. Rev. 03-10-10. http://microbiologiadealimentos.com/

Manual de medios de cultivo en microbiología. http://www.scribd.com/doc/8614571/ManualdeMediosdeCultivo




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Laboratorio No 03

Tema :PREPARACIÓN DE DILUCIONES, RECUENTO DE AEROBIOS MESOFILOS, BACTERIAS PSICROFILAS, Y TERMOFILAS.

OBJETIVOS

Preparar una muestra de alimento para su análisis microbiológico.

Adquirir destreza en el procedimiento de realizar diluciones progresivas de la muestra para poder realizar recuentos microbianos con una población exacta de dicha muestra.

Reconocer la importancia del análisis de bacterias mesofilas, psicrofilas y termófilas

FUNDAMENTO

El análisis de los alimento para determinar la existencia, tipo y número de microorganismos es básico para la microbiología de alimentos. Sin embargo ninguno de los métodos utilizados habitualmente permite determinar el número exacto de microorganismos que existe en un determinado alimento. Los recuentos de microorganismos viables se basan en el número de colonias que se desarrollan en placas previamente inoculadas con una cantidad conocida de alimento e incubadas en unas condiciones ambientales determinadas. Estos recuentos no pueden considerarse como recuentos totales ya que solo son susceptibles del contaje aquellos microorganismos capaces de crecer en las condiciones establecidas. Se puede conseguir una amplia gama de condiciones variando la temperatura, la atmósfera, la composición del medio y el tiempo de incubación. DILUCIONES Si se sospecha que una muestra tiene una gran cantidad de microorganismos por ml o gr, la muestra se diluye. Al diluir lamuestra antes de hacer la prueba, se evita que las placas tengan exceso de colonias, permitiendo obtener diluciones con un número de colonias entre 25 y 250 Ufc/ml o gr. El plan de dilución que más frecuentemente se utiliza envuelve diluir la muestra por un factor de 10. La muestra se diluye con una solución salina estéril, 0.85% NaCl o de 0.1% peptona. Usualmente en este laboratorio se utilizan botellas de dilución con un volumen de 90 ó 99 ml. Los métodos básicos utilizados para investigar el número total de microorganismos:

Recuento en placa (SPC) para la determinación del número de células

viables

Método del número más probable (MPN) de gérmenes como cálculo

estadístico del número de células viables




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Técnicas de reducción de colorantes para el cálculo del número de células

viables con capacidad reductora.

Recuento microscópico directo (DMC) tanto para células viables como

para las no viables. El recuento en placa es el método más utilizado para la determinación del número de células viables o unidades formadoras de colonias en un alimento. LOS RECUENTOS TOTALES DEBEN HACERSE EN FUNCIÓN DE UNO DE LOS SIGUIENTES FACTORES:

Método de muestreo utilizado.

Distribución de los microorganismos en la muestra.

Naturaleza de la microflora del alimento.

Naturaleza del alimento.

Antecedentes del alimento.

Adecuada nutricion del medio de cultivo.

Temperatura y medio de incubación.

pH, aw, potencial de oxidación reducción del medio.

Tipo de diluyente utilizado.

Número relativo de microorganismos en la muestra. El intervalo de temperaturas en el que crecen los microorganismos es muy amplio: – 34º C a > 90º C. En función de esto se encuadra a los microorganismos en tres grupos:

Los que crecen bien a 7º C o por debajo de esta temperatura se le denominan psicrófilos

Los que crecen entre 20 – 30º C, con una temperatura óptima de crecimiento está entre 30 – 40º C se le denominan mesófilos

Los que crecen por encima de los 45º C se le denominan termófilos.

. Este recuento se considera como indicador del grado de contaminación de los alimentos en cualquier etapa del proceso de producción, también se utiliza como indicador de la vida útil de un producto. es utilizado para determinar si la limpieza, desinfección y el control de la temperatura durante los procesos de tratamiento industrial, transporte y almacenamiento se han realizado de forma adecuada . Un recuento bajo de aerobios mesófilos no implica o no asegura la ausencia de patógenos o sus toxinas.




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Este recuento NOSE HACE en productos terminados, ni productos fermentados, ya que por la manufactura de ese tipo de productos, el recuento no sería representativo.

MATERIALES Y EQUIPOS

Descripción

Pipetas estériles de 1 ml.

Cajas de petri estériles.

Incubadora de 37ºC +/- 2ºC, 55ºC. Refrigerador 7ºC.

Agar PLATE COUNT.

PROCEDIMIENTO

Descripción

Este método se basa en la siembra en profundidad en un medio de cultivo definido, vertido en una placa de Petri, con una cantidad determinada de muestra si el producto a examinar es líquido, o con una cantidad determinada de suspensión madre en el caso de otros productos. En las mismas condiciones, siembra de las diluciones decimales obtenidas de la muestra o de la suspensión madre. El recuento podrá ser realizado utilizando un sembrador espiral (NF V08-100) Incubación a 30º C, en aerobiosis durante 72 horas. A partir del número de colonias obtenidas en las placas de Petri escogidas, calcular el número de microorganismos por mililitro o por gramo de muestra. INCUBACION:

MESOFILAS: 35ºC por 24 a 48 horas

PSICROFILAS: 7ºC POR 7 a dias.

TERMOFILAS: 55ºC POR 24 a 48 horas.

CONSULTA

1. Mencione 5 ejemplos de cada una de las bacterias mencionadas en la práctica

y diga en que tipo de alimentos las podemos encontrar.

2. Elabore el grafico donde se muestre claramente la forma de realizar diluciones de un alimento sólido y de un alimento liquido.

2. Realice un cuadro comparativo sobre la fundamentación, composición y preparación de:

Agua peptona al 1 y 2 %

Agar plate count.




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BIBLIOGRAFÍA

http://www.ispch.cl/lab_amb/serv_lab/aerobios_micro.html http://www.cps.unizar.es/calidad/docs/guia.pdf http://www.microbiologiadealimentos.com/

http://www.cps.unizar.es/calidad/docs/guia.pdf




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Laboratorio No 04

Tema: RECUENTO DE COLIFORMES EN ALIMENTOS

Objetivos

Comprender y realizar adecuadamente la determinación de Coliformes totales a partir de productos de origen animal o vegetal.

Diferenciar las técnicas de NMP y vertido en placa para recuento de coliformes.

Analizar correctamente los resultados que se obtengan en cada prueba.

Fundamento

Los coliformes resisten la presencia de bilis en el medio de cultivo; cuando se desarrollan en ABRV, el ácido producido por la fermentación de la lactosa, ocasiona el vire del indicador rojo neutro y la precipitación de las sales biliares por lo que las colonias son color rojo oscuro y generalmente están rodeadas de un halo de sales biliares precipitadas, de color rojo claro o rosa. La posibilidad de contar las colonias se fundamenta en su dispersión y separación. El medio chromocult es un agar selectivo para el crecimiento de coliformes totales y E. coli en muestras de aguas y alimentos, por la acción conjunta de las peptonas selectivas, piruvato y tampón de fosfatos que garantiza un rápido crecimiento también de coliformes con daños sublaterales. NOTAS

Cuando se utiliza el medio de agar bilis rojo violeta (ABRV) para la cuenta en placa de coliformes, debe considerarse lo siguiente: • Si el alimento contiene mono o disacáridos en altas concentraciones, éstos pueden ser fermentados por otro grupo de microorganismos, generando colonias semejantes a las de coliformes. • El medio no debe esterilizarse ni sobrecalentarse por lo que se debe utilizar antes de 3 h. a partir de su preparación; en cuanto se disuelva el agar se debe colocar en baño de agua a 45 °C para mantenerlo fundido, hasta el momento de utilizarlo. • Debe ponerse una sobrecapa de medio una vez que las placas vertidas han solidificado, para favorecer las condiciones de microaerobiosis, más adecuadas para los coliformes. • El sobrecalentamiento del medio y las variaciones en las condiciones de incubación, especialmente la incubación prolongada, pueden ocasionar la formación de colonias rojas de cocos Gram positivos. • El rango estadístico para tener confiabilidad en el aspecto cuantitativo (De sensibilidad del método) es de 15 a 150 UFC por placa.




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• El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se vierten los medios de cultivo en las cajas con las muestras de diluciones, no debe exceder de 20 minutos. Materiales y Equipos

Ítem Tipo Descripción

01 MAT .Cuchillo-cuchara. .Pipetas de 1ml y 10 ml. .Asa bacteriológica. .Bolsas de polipropileno. .Gradilla. .Tubos de ensayo. .Cajas de petri. .Algodón y alcohol 70% .Asa de hockey. .Pipeteador. .Erlenmeyer. MEDIOS DE CULTIVO .Agar bilis verde brillante lactosa con campana de Durham. .Agar Chromocult .Agar EMB .Agua peptona 0.1% .Agua triptona.

02

EQU

.Homogenizador. .Incubadora. .Balanza

Reactivos

Ítem Descripción

03 Coloración de Gram

Reactivo de Kovacs

Procedimiento

Paso Descripción

SIEMBRA EN CHROMOCULT




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Siembra por placa profunda:

1. Desinfectar con alcohol al 70% toda el área de trabajo y el recipiente que contiene la muestra a analizar.

2. Pesar la muestra y preparar las diluciones como lo establece la técnica de preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico.

3. Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que la inoculación y la adición de medio de cultivo se puedan realizar cómoda y libremente. Marcar las bases de las cajas con los datos pertinentes antes de colocar el inoculo.

4. Inocular por duplicado, 1.0 mL de la dilución correspondiente en cada caja, mediante pipeta estéril y verter de 18.0 a 20.0 mL del medio Chromocult fundido y mantenido a 45 ± 1.0°C en baño de agua. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el momento en que se vierte el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.

5. Mezclar cuidadosamente el inoculo con el medio, mediante seis movimientos de derecha a izquierda, seis movimientos en el sentido de las manecillas del reloj, seis movimientos en el sentido contrario al de las manecillas del reloj y seis de atrás para adelante, sobre una superficie lisa y nivelada. Permitir que la mezcla solidifique dejando las cajas Petri sobre una superficie horizontal fría.

6. Solidificado el medio invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35°C, durante 24 ± 2 h.

7. Después de este periodo, contar las colonias con el contador de colonias. Las colonias típicas son de color rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un halo de precipitación debido a las sales biliares, el cual es de color rojo claro o rosa, la morfología colonial es semejante a lentes biconvexos con un diámetro de 0.5 a 2.0 mm.

Siembra por superficie


2. Pesar la muestra y preparar las diluciones como lo establece la técnica de preparación y dilución de muestras de alimentos para su análisis microbiológico.

3. Distribuir las cajas estériles en la mesa de trabajo de manera que al adicionar la correspondiente dilución en el agar Chromocult ya solidificado no ocurran accidentes. Marcar las bases de las cajas con los datos pertinentes antes de colocar el inoculo.

4. Inocular por duplicado, 0.1 mL de la dilución correspondiente en cada caja, mediante pipeta estéril.

5. Inmediatamente distribuir el vertido con el asa de hockey por todo el medio.




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6. Colocarlas en la incubadora a 35°C, durante 24 ± 2 h.

7. Después de este periodo, contar las colonias con el contador de colonias. Las colonias típicas son de color rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un halo de precipitación debido a las sales biliares, el cual es de color rojo claro o rosa, la morfología colonial es semejante a lentes biconvexos con un diámetro de 0.5 a 2.0 mm.

PROCEDIMIENTO DE COLIFORMES TOTALES (NMP)


2. Pesar 10 g o medir 10 ml de la muestra y realizar tres o más diluciones de igual forma que para el recuento en placa.

3. Sembrar por triplicado 1 ml de cada una de las diluciones en tubos que contengan 10 ml de Bilis verde brillante lactosa con tubos Durham preparados a concentración simple.

4. Mezclar en incubar por 24-48 horas a 35-37ªC.

5. Leer a las 24 horas los tubos positivos, los negativos reincubarlos otras 24 horas.

6. Repicar mediante una asada todos los tubos positivos al agar EMB e incubar por 24 horas a 35-37ªC.

7. Anotar todos los tubos positivos que fueron confirmados por crecimiento característico en agar EMB (colonias con brillo verde metálico).

8. Buscar en la tabla estandarizada el resultado de NMP.

9. Expresar el resultado como NMP de Coliformes Totales = No. de bacterias / g ó ml.

PROCEDIMIENTO DE COLIFORMES FECALES O TEST DE MAC- KENZI.

1. Subcultivar todos los tubos positivos de coliformes totales en caldo Bilis verde brillante lactosa y agua triptona o medio SIM.

2. Incubar por 24-48 horas a 44.5ªC en baño serológico cuidando que el nivel del agua cubra el contenido de los tubos.

3. Leer los tubos positivos de la siguiente forma: caldo Bilis verde brillante lactosa: se lee por turbidez y gas. Medio SIM o agua de triptona: Se adicionan 5 gotas del reactivo de Kovacs y se lee por formación de un anillo rojo en la superficie del medio. Para que la prueba sea considerada positiva deben estar ambos tubos positivos.

4. Anotar todos los tubos positivos y buscar en la tabla del NMP.

5. Expresar el resultado como NMP de Coliformes Fecales = No. de bacterias / g ó ml.




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Consulta

1. A que se debe el color verde metálico de las colonias de E. coli en agar EMB. 2. En la técnica del NMP que se tiene en cuenta para diferenciar coliformes

totales , de fecales y de E. coli.

Bibliografía

.http://www.slideshare.net/bado/guas-microbiologa-de-alimentos.

.Camacho, A., M. Giles, A. Ortegón, M. Palao, B.Serrano y O. Velázquez. 2009. Técnicas para el Análisis Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México.




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Laboratorio No 05

Tema: RECUENTO DE Staphylococcus aureus Y MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS

Objetivos

Realizar recuento de Staphylococcus coagulasa positiva a partir de alimentos

de origen animal o vegetal.

Reconocer e interpretar con habilidad el crecimiento de Staphylococcus aureus

en los medios empleados.

Realizar recuento de mohos y levaduras en productos de origen animal y vegetal.

Fundamento

La intoxicación estafilocócica se produce por el consumo de alimentos en los que se ha multiplicado S.aureus, produciendo toxinas muy termorresistentes, activas por vía oral, que se encuentran ya preformadas en el alimento (Escobar, 1994, p 94). Los estafilococos enterotoxigénicos pueden encontrarse, por lo tanto, ya en los alimentos en el momento de su obtención, en especial en los de origen animal, o bien llegar posteriormente a ellos a partir principalmente de los manipuladores. Un alto porcentaje de personas sanas son portadoras de S.aureus en fosas nasales y faringe, también se encuentran en la piel, cuero cabelludo y, sobre todo en procesos cutáneos (acné, furúnculos, heridas infectadas) Los mohos y las levaduras están ampliamente distribuidos en la naturaleza, por lo tanto se pueden encontrar como carga normal de los alimentos con bajo pH y Aw, alto contenido de sólidos como sal o azúcar, temperaturas bajas de almacenamiento o presencia de antibióticos, pues son capaces de desarrollarse en las condiciones más adversas (Escobar, 1994, p 198). Estos microorganismos pueden utilizar sustratos complejos como: pectinas, hidratos de carbono, ácidos orgánicos, proteínas, lípidos, etc. Frecuentemente los mohos y levaduras son responsables del mal olor, sabor, decoloración o pigmentación de la superficie de los alimentos, son los grandes alteradores de frutas, hortalizas, leguminosas, tubérculos y granos.

RECUENTO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS



MAT Medios de cultivo




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Agua peptona 0.1% Agar Baird –Parker Plasma fresco Infusión cerebro corazón Cuchillos-cucharas Pipetas 1 y 10mL Asa bacteriológica Bolsas de polipropileno Gradilla Tubos de ensayo Cajas de petri Placa petrifilm

02 EQU Balanza

Homogenizador

Incubadora

Reactivos

Ítem Descripción

0.1 Coloración de gram

0.2 Agar azul de O-Toluidina

0.3 Algodón y alcohol al 70% 36

Procedimiento

Paso

1. Preparar las muestras y realizar las diferentes diluciones.

2. Marcar tres cajas de petri que contienen agar Baird-Parker con fecha, muestra, dilución y No. del grupo.

3. Marcar dos cajas de petri que contienen agar Baird-Parker, una como control del medio y otra como control del diluyente

4. Adicionar 0.1 ml de cada una de las diluciones y 0.1 ml del diluyente en las cajas marcadas respectivamente que contienen el medio Baird- Parker.

5. Extender con una varilla la muestra sobre toda la superficie del medio, hasta que la superficie quede seca.

6. Incubar por 24-48 horas a 35-37ªC.

7. Seleccionar las cajas que contengan entre 20 a 200 colonias y contarlas colonias características (negras, lustrosas, convexas,




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rodeadas de un halo claro dentro de anillos opacos).

8. Realizar el conteo final multiplicando por el inverso de la dilución. Reporte (UFC/ml o gr)

CONFIRMACIÓN E IDENTIFICACIÓN DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS

1. Prueba de coagulasa

2. Realizar la coloración de gram a varias colonias características (raíz cuadrada del total y no menos de 3 colonias) Observar al microscopio cocos grampositivos en racimos.

3. Sembrar en igual número de tubos que contienen infusión cerebro corazón las colonias características y grampositivas.

4. Incubar a 37 ªC por 24 horas.

5. Transferir 0.3 ml de cada cultivo a tubos limpios y marcados como prueba de coagulasa que contienen 0.3ml de plasma fresco humano (o plasma de conejo)

6. Incubar a 37 ªC por 4 horas, observar cada hora hasta la formación del coágulo. Si después de este tiempo da negativo, incubar hasta 24 horas.

7. Realizar el conteo final sobre la cantidad total de colonias contadas y el número de confirmadas positivas, ejemplo: Total de colonias contadas en la dilución 10-2 = 30 3000 Colonias elegidas para realizar la prueba de la coagulasa = 7 Positivas en la prueba de la coagulasa= 5 Reporte de Staphylococcus aureus coagulasa positiva: 3000 x 5 X= = 2142 = 2 x 103 bacterias / g ó ml.

Determinación de termonuclesa.

1. Incubar las placas de Baird Parker positivas por 2 horas a 60ªC.

2. Adicionar sobre las placas de Baird Parker 15 ml de agar azul de O- Toluidina DNA fundido a 45ªC.

3. Incubar por 3 horas a 37 ªC. 4. Observar presencia de una zona rosada brillante sobre cada colonia de Staphylococcus aureus indica una prueba positiva.

PASOS PLACA PETRIFILM

1. Inocule 1 ml de la dilución de la muestra y espárzalo.




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2. Incube la placa a 35°C durante 24 horas. Cuente las colonias confirmadas.

3. Pase la placa a una segunda temperatura de incubación de 62°C por 1 hora para eliminar las nucleasas que no son termoestables.

5. Incube nuevamente la placa a 35°C por 1 a 3 horas

6. Cuente las colonias confirmadas. Reporte (UFC/ml o gr)

RECUENTO DE MOHOS Y LEVADURAS



01 MAT Medios de cultivo Agua peptona 0.1% Agar Ogy Cuchillos-cucharas Pipetas 1 y 10Ml Asa bacteriológica Bolsas de polipropileno Gradilla Tubos de ensayo Cajas de petri Algodón Placa petrifilm

02 EQU Homogenizador

Balanza

Incubadora

Reactivos

Ítem Descripción

Reactivos Materiales

alcohol al 70%

Procedimiento

Paso DETERMINACIÓN DE MOHOS Y LEVADURAS

1. Preparar las diluciones de igual forma que para el recuento en placa. Seleccionar las cajas entre 20 y 100 colonias y multiplicar por el inverso de la dilución.

2. Marcar tres cajas de petri con fecha, muestra, dilución y No. del grupo.

3. Marcar una caja como control del medio y otra como control del diluyente

4. Pipetear a las cajas de petri 1 ml de cada una de las diluciones y 1 ml del diluyente.

5. Verter 15ml de agar Extracto de malta-oxitetraciclina (OGY) fundido a 45ªC en cada una de las cajas




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6. Mezclar de igual forma que para el recuento en placa.

7. Dejar solidificar.

8. Invertir las cajas e incubar a 22ªC por 5 a 7 días (envolver las cajas con papel Kraft).

9. Sacar las cajas, evaluar el control del medio y del diluyente

10. Seleccionar las cajas entre 20 y 100 colonias y multiplicar por el inverso de la dilución. Reporte (UFC/ml o gr)

PLACA PETRIFILM

Inocule 1 ml de la dilución de la muestra y espárzalo.

Incube la placa a 35°C durante 24 horas. Cuente las colonias confirmadas.

Pase la placa a una segunda temperatura de incubación de 62°C por 1 hora para eliminar las nucleasas que no son termoestables.

Incube nuevamente la placa a 35°C por 1 a 3 horas

Cuente las colonias confirmadas. Reporte (UFC/ml o gr)

Consulta

1. .Fundamento del agar OGY , y agar CGA.

2. Importancia de la determinación de mohos y levaduras y en qué tipo de

alimentos se determinan.

3. Importancia de la determinación de staphylococus aureus y en qué tipo de alimentos se determina.

Bibliografía

http://multimedia.3m.com/mws/mediawebserver?mwsId=SSSSSu7zK1fslxtUmx_9MxmUev7qe17zHvTSevTSeSSSSSS--

http://www.slideshare.net/bado/guas-microbiologa-de-alimentos.



http://www.slideshare.net/bado/guas-microbiologa-de-alimentos




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Laboratorio No 06

Tema: RECUENTO DE Bacillus cereus y Pseudomonas spp EN ALIMENTOS

Objetivos

Dar a conocer las bases para el reconocimiento analítico de Bacillus cereus y de Pseudomona spp en los alimentos.

Reportar de forma correcta los análisis realizados.

Emitir un concepto sobre la calidad de los alimentos analizados.

Realizar recuento de Bacillus cereus y Pseudomona a partir de los alimentos como ovoproductos.

Fundamento

Bacillus cereus Es un microorganismo aerobio, Gram positivo, esporulado, común en el suelo, vegetales, alimentos crudos y procesados. Cuando se encuentra un numero alto, mayor de 10 6 colonias por gramo, en un alimento, puede ocasionar intoxicación alimentaria. Se presentan dos clases de enfermedades por la ingesta de alimentos contaminados con este microorganismo:

Forma clásica. Los alimentos implicados mas comunes son, el arroz, las pastas y la arepa. Esta

enfermedad también conocida como gastroenteritis o forma diarreica. Tiene un periodo de incubación de 24 horas aproximadamente.

Forma Emética o llamada también intoxicación: tiene un periodo de incubación de 5 a 13 horas aprox.

Es un microorganismo indicador de la calidad de las condiciones de almacenamiento de productos refrigerados, ya que su presencia en este tipo de alimentos, indica, que hubo una posible interrupción en la cadena de frío. Los alimentos no deben permanecen a temperatura ambiente una vez cocidos, ya que cerca del 50% de los alimentos e ingredientes alimentarios están contaminados hasta cierto punto (< 10/gr) por este organismos. La ingestión de alimentos que han sido conservados a temperatura ambiente después de su cocción, permite que las esporas, las cuales sobreviven la ebullición, germinen y se multipliquen a niveles altos y verter las toxinas al alimento para que finalmente provoquen la intoxicación.




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Medios de cultivo, Equipos Y Materiales

Item Tipo Descripción

01 Medio Medios de cultivos

Agua peptona 0,1%

Agar Céreus según Mossel

Agar Gelatina

Agar Almidón

Agar Citrato Simmons

Agar Urea

Agar SIM

Caldo nitrato

Caldo MR-VP

Caldo MR-Glucosa (5%)

Caldo MR-Xilosa (5%)

Caldo MR-Arabinosa (5%)

Caldo Cerebro corazón

02 EQUI Homogenizador

Balanza

Incubadora

03 MAT Cuchillos- cucharas

Pipeta 1 y 10ml

Asa bacteriológicas

Bolsas de polipropileno

Gradilla

Tubos de ensayos

Reactivos

Coloración de Gram.

Reactivos de Kovacs

Solución lugol

Griess

Alfa naftol 5%

KOH 40%




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Rojo de metilo

Peróxido hidrogeno 3%

Oxidasa

Procedimiento

1 Preparar las diluciones de igual forma que para el recuento en placa.

2 Marcar tres cajas de petri que contienes agar Cereus según Mossel con fecha, muestras dilución, y numero del grupo .

3 como control Marcar dos cajas que contienes agar Céreus según Mossel, una del medio y la otra como el control diluyente.

4 Adicionar 0.1 ml de cada una de las diluciones y 0.1 ml de diluyentes en las cajas marcadas respectivamente que contienen el medio a Céreus según Mossel.

5 Extender con una varilla la muestra sobre toda la superficie del medio, hasta que la superficie que de seca

6 Incubar por 24-48 horas 35-37ªC.

7 seleccionar las cajas que contengan entre 20 a 200 colonias y características (colonias rosadas con bordes regulares e irregulares. Con un halo denso a su alrededor debido a la lecitinaza). Realizar el conteo final del conteo final multiplicado contarlas colonias por el inverso de la dilución y por 10.

8

Tomar al menos tres UFC características, realizarles la prueba de la catalasa y al coloración de Gram. se observa bastones Gram: si son catalasa positiva y ala coloración de Gram se observa bastones Gram positivos con extremos mas o menos cuadrados, en cadenas Cortas o largas y entre lazadas con bacteriano realizar la identificaciones bioquimicas.

IDENTIFICACIONES BIQUIMICAS DE BACILLUS CEREUS

pasos Subcultivar tres colonias características en caldo cerebro corazón . Realizar las siguientes pruebas bioquímicas.

Hidrólisis de la gelatina: Siembre dos lines paralelas en agar gelatinas e incubar a 37ºC por 24h.

Hidrólisis de almidón: Siembra dos líneas paralelas en agar almidón incubar a 37ºC por 24 horas

Agar urea: inocular el fondo por picadura y el bisel por estría e incubar a 37ºC por 24 h.

Agar citrato Simmons: inocular el fondo por picadura y el bisel en línea e incubar a 37ºC por 24h.

Movilidad: inocular el fondo ( agar SIM) por picadura e incubar a 37ºC por 24h .




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.Reducción de nitrato: caldo Nitrato .

Producción acetoina: caldo MR- VP.

fermentación de carbohidratos: Glucosa, Xilosa, Arabinosa.

Comparar los resultados con las características bioquímicas de Bacillus cereus

Fundamento

PSEUDOMONAS EN ALIMENTOS Son bacilos Gram Negativos, que se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza, agua, suelo, hortalizas, aves y productos marinos. Son aerobios facultativos, móviles por un flagelo polar (monotricos)o inmóviles con raras excepciones, son oxidasa positiva, tienen un metabolismo estrictamente respiratorio (oxidativo) y no fermentativo: ciertas especies pueden atacar la glucosa y otros glúcidos por vía oxidativa, crecen en medios simples a temperaturas de 30ºC,produciendo pigmentos en la mayoría de los casos. A nivel hospitalario se comporta como oportunistas produciendo infecciones y hasta septicemia, son carga normal de muchos alimentos produciendo alteración de los mismos, su presencia en aguas recreacionales puede causar problemas de infecciones como conjuntivitis, otitis etc. Algunas especies de Pseudomonas pueden alterar los alimentos, dentro de las propiedades que las hacen importantes en los alimentos son: 1. Su capacidad para utilizar compuestos de carbono muy distintos. 2. Su capacidad para producir diversas sustancias que influyen desfavorablemente en el sabor. 3. Su capacidad para utilizar alimentos nitrogenados sencillos. 4. Su capacidad para sintetizar sus propios factores de crecimiento o vitaminas. 5. La actividad lipolitica y proteolítica de algunas especies. 6. Su tendencia aerobia que les permite un crecimiento rápido y obtener productos de oxidación y mucosidad en aquellas superficies de los alimentos en las que es mas probable que exista una contaminación masiva. 7. Su capacidad para crecer a temperaturas bajas. 8. La producción de pigmentos por algunas especies. La mayor parte de las cepas producen piocianina, un pigmento de fenacina verde e hidrosoluble que imparte un Color verdoso al medio de cultivo. Es probable que la presencia de piocianina sea la única característica necesaria Para identificar una Pseudomona aeruginosa porque ningún otro no fermentador sintetiza este pigmento.




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La Pseudomona aeruginosa es la especie más importante en la alteración de los alimentos refrigerados debido a su carácter psicotrófico. Materiales y Equipos


01 MAT Pipetas estériles de 1 ml y/o de 0,1 ml

Cajas de petri estériles con el medio sólido

Asas de hockey

Pipeta 1 y 10ml

Asa bacteriológica

Bolsas Polipropileno

Gradillas

Tubos de ensayo

Cajas de Petri

02 EQUI Lámpara luz UV

Incubadora a 30ºC+/-2ºC

Reactivos y medios de cultivo

Ítem Descripción

Agar Mossel

Caldo casoy doble concentración

Caldo casoy concentración simple

Agar cetrimide

Reactivo

Oxidasa

Solución amortiguadora fosfato PH 7.2

Procedimiento

Paso Descripción

1 Preparar la muestra y diluciones de los homogeneizados, tal y como se ha mencionado anteriormente.

2 Transferir 0.1 ml de la dilución de 10- 1 sobre la superficie de cajas de petri estériles, previamente marcadas, que contienen el medio de cultivo Agar Mossel .

3 Esparcir el inoculo con ayuda del asa de hockey sobre el medio de cultivo.

4 Dejar secar sobre una superficie completamente plana.

5 Hacer control de esterilidad del medio de cultivo, incubando una caja que contenga agar Mossel , sin adición de la muestra, incubando a 37ºC +/- 2ºC.

6 Se invierten las cajas y se incuban a 30ºC+/-2ºC Por 48 horas.




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7 Seleccionar las cajas que presenten entre 20-200 colonias, que sean manitol negativas, con un halo denso de lecitinasa positivo

Interpretación de los resultados. (CONFIRMACION BIOQUIMICA)

REDUCCION DE NITRATOS A NITRITOS :

-Tome una colonia y siembre en caldo nitrato, incube a 30ºC por 24 horas. - Compruebe la presencia de nitritos en el medio, añadiendo a cada tubo 1 ml de reactivo de Griess y observe el color que presenta: Positivo: color rojo. Negativo: incoloro. Confirmar al adicionar una mínima cantidad de polvo de Zinc: Color rojo (negativo) No hay cambio de color: (positivo)

FERMENTACION DE GLUCOSA:

-Tome una colonia sospechosa e inocúlela en un tubo con glucosa. Al leer y observar cambio a color amarillo, es índice de la fermentación del azúcar por este microorganismo.

LICUEFACCION DE GELATINA:

- Tome una colonia sospechosa e inocúlela en agar gelatina. Incubar a 22ºC por espacio de 24ª 72 horas. Al leer si observa una consistencia liquida, la prueba se consideraría positiva.

HIDRÓLISIS DEL ALMIDON :

- Tome una colonia y siembre por estría en agar almidón. Incube a 32ºC por 24-48 horas. Inunde la superficie con solución lugol y observe la hidrólisis.

PRUEBA DE VOGUES PROSKAUER: ( VP ):

- Tome con el asa una colonia sospechosa y transfiérala a un tubo con caldo VP e incube a 35ºC ( 24- 48 horas ) .Revele agregando alfa naftol y KOH. Negativo: sin color. Positivo: Anillo rojo en la superficie. Prueba complementaria: Gram: Bacilos +. Expresión de resultados Informar ufc/ gr o ml según lo analizado.

Procedimiento

Paso Descripción

1 Limpiar con alcohol al 70% el recipiente que contiene la muestra de agua a analizar.

2 Mezclar muy bien la muestra.

3 Adicionar la muestra de agua así:

10ml en tubos (5) que contienen 10ml cada uno en caldo casoy a doble concentración.

1ml en tubos (5) que contienen 10ml cada uno en caldo casoy a simple concentración.

1ml en tubos (5) que contienen 10ml cada uno en caldo casoy a simple concentración a partir de una dilución 1:10 de solución buffer




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fosfató aun PH 7.0

4 Mezclar e incubar por 24 horas a 37ºC.

5 Anotar los tubos que presentan crecimiento positivo (turbidez).

6 Confirmar la presencia de Pseudomonas aeruginosa mediante un recipiente de todos los tubos positivos al agar cetrimide.

7 Incubar a37ºC Por 24 horas

8 Confirmar la presencia de Pseudomonas aeruginosa realizando la prueba de la oxidasa: colocar una colonia en la tirilla, adicionar una gota de agua destilada estéril, y leer en los 60segundos siguientes. la aparición de un color morado o azul indica prueba de oxidasa positiva.

9 Anotar todos los tubos positivos que fueron confirmados por crecimiento en el agar cetrimide por formación de un pigmento verde azulado, además el olor característico a frutas y la prueba de la oxidasa positiva

10 Buscar en la tabla correspondiente y expresar el resultado como NMP de Pseudomonas aeruginosa/ 100 ml de agua

Hidrólisis de la gelatina: zonas claras alrededor de las colonias luego de cubrir las colonias con reactivo sublimados con Hg

Hidrólisis de almidón: zonas claras alrededor de las colonias luego de cubrir las colonias con lugol

Agar urea: Tubos con reacción acida(amarillos).,Urea Negativa.

Agar Citrato Simmons: medio de cultivo verde citrato negativo.

Movil: Crecimiento desplazado a través de la línea de siembra.

Reducción de nitratos: Aparición de un color rojo luego de adicionar el reactivo de Griess.

Producción de acetoina: : Aparición de un color rojo luego de adicionar el reactivo de alfa naftol y el hidróxido de potasio.

Fermentación de carbohidratos: (Glucosa, Xilosa, Arabinosa) Por medio de viraje del medio a amarillo.

Consulta 1. Fundamento del agar Mossel 2. Que es la asparagina? Para que se usa. 3. Existe probabiliad de encontrar Pseudomonas en agua envasada?

Bibliografía

1 P. R. Hayes.Food Microbiology and Hygiene.Editorial.Elsevier Applied Science Publishers Ltd.pàg.39-147.

2 ICMSF.Microorganismos de los alimentos .Técnicas de análisis microbiológicas, Volumen 1 y 2 edición, Editorial Acribia Zaragoza, España, 1984.




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Laboratorio No 07

Tema: RECUENTO DE Clostridium SULFITO REDUCTOR Y PRUEBA DE ESTERILIDAD COMERCIAL

Objetivos

Documentar el procedimiento para llevar a cabo el recuento de Clostridium Sulfito reductor en el análisis de microbiología de alimentos.

Conocer y desarrollar el procedimiento para el análisis microbiológico de enlatados.

Determinar la presencia de Clostridium sulfito reductores de muestras de alimentos.

Familiarizarse con los métodos de aislamientos de bacterias anaeróbicas en alimentos.

Conocer los peligros que ocasionan estos microorganismos en la salud del consumidor.

Fundamento

Clostridium Sulfito Reductor

El grupo bacteriano de los sulfito-reductores está integrado por bacterias pertenecientes al género Clostridium que tienen en común reducir el sulfito a sulfuro que en presencia de citrato férrico o cualquier otra sal de metales pesados, dan como resultado la formación de colonias negras.

. Éste género está formado por más de cien especies, los cuales son bacilos grampositivos, anaerobios, esporulados, ubicuos pudiendo ser encontrados en el suelo y aguas residuales así como también en la flora intestinal de hombres y animales. En su mayoría son saprofitos, pero los patógenos pueden causar graves enfermedades en el hombre como gangrena gaseosa, botulismo, tétanos, infecciones de piel y partes blandas, colitis asociada a antibióticos e intoxicaciones alimentarias. La capacidad para provocar enfermedad está vinculada a la posibilidad de sobrevivir en condiciones ambientales adversas mediante la formación de esporas, crecer rápidamente y producir toxinas histolíticas, enterotoxinas y neurotoxinas. Suelen usarse para apreciar la deficiente calidad higiénica en la elaboración del alimento, pudiéndose encontrar en el agua y productos de origen animal, su número es escaso en productos frescos, siendo la capacidad de esporular la que les confiere gran resistencia. De esta forma, los alimentos que pueden estar contaminados son: carnes vacuna, pollo, salsas cocinadas y no refrigeradas.

Este análisis es considerado como el recuento indicador más importante de las




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bacterias anaerobias esporoformadoras. Se empleara para su crecimiento el medio de cultivo especifico, Agar SPS (Agar sulfito polimixina sulfadiazina) el cual es un medio selectivo para Clostridium perfringens y de esta forma determinar su presencia o ausencia en el análisis Microbiológico de alimentos de consumo humano.

Los enlatados Los enlatados o también llamados conservas, incluyen aquellos productos, que generalmente esterilizados, permanecen sin contaminarse a temperatura ambiente, durante largos periodos de tiempo. Tienen una vida útil que puede variar entre seis meses y varios años. Se les consideran productos alimenticios preparados en recipientes metálicos, de vidrio, plástico, hojalata, que tienen cierre hermético y han sido sometidos a un tratamiento que garantiza la destrucción de todas las formas bacterianas vegetativas o esporuladas y de cualquier enzima. Las características principales exigibles en una conserva o enlatado son:

Inocuidad para el consumidor.

Mantenimiento inalterable de sus caracteres organolépticos durante largos periodos de tiempo.

Para lograr la inocuidad sería suficiente con emplear un tratamiento térmico elevado, que daría lugar a que los caracteres organolépticos del producto sufrieran una modificación sensible. Por esta causa se suelen tener en cuenta dos conceptos respecto a la esterilidad de las conservas:

Esterilidad Biológica: significa que existe una ausencia total de microorganismos y sus toxinas, así como la inactivación de enzimas celulares y microbianas.

Esterilidad comercial: significa que NO deben existir formas vegetativas, esporas de bacteria patógenas o toxinas, ni microorganismos capaces de alterar el producto. Las enzimas celulares y microbianas se inactivan.

En las conservas de esterilidad comercial se toleran esporas pertenecientes a la familia Bacillaceae, no patógenas, no toxigenicas, e inertes, es decir, incapaces de germinar. Materiales y Equipos


01 EQU Estufa.

02 EQU Incubadora de 37ºC +/- 2ºC.




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03 MAT Tubos tapa rosca estériles.

04 MAT Glicerina o aceite mineral.

05 MAT Pipetas estériles de 1 ml.

06 MAT Gradillas

07 MAT Mechero Bunsen

Reactivos

Ítem Descripción

01 Diluyente: Agua Peptona

02 Agar SPS (Sulfito-polimixina-sulfadiazina)

Procedimiento para muestra de alimentos

Paso Descripción

1 Tomar la cantidad de muestra adecuada y agregarla en un recipiente estéril con agua peptona. Realizar las diluciones deseadas (10-1, 10-2, 10-3) de los homogeneizados.

2 Transferir 1 ml de la dilución 10-1 al tubo tapa rosca vacio estéril, previamente marcado.

3 Calentar el tubo a 80ºC durante 10 minutos.

4 Pasar una vez calentado el tubo a un recipiente con agua fría (2ºC) por 5 minutos.

5 Agitar

6 Adicionar 10 ml de agar SPS previamente fundido y mantenido a 45ºC.

7 Dejar solidificar el tubo en posición recta.

8 Ya sólido el medio se adiciona glicerina o aceite mineral para crear atmósfera de anaerobiosis

9 Se tapan muy bien los tubos y se incuban a 37ºC+/-2ºC por 24 a 72 horas.

10 Si resulta ser positivo, se observara colonias de característico color negro.

Procedimiento para muestra de agua

Paso Descripción

1 Tomamos 5 tubos de ensayo a los cuales les agregaremos 5 mL de aguas servidas a cada uno.

2 Luego agregaremos el medio Wilson-Blair, previamente calentado (disuelto) en el baño María

3 El agua servida debe haber sido también




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calentada, previamente, en el baño María a 80 ºC por 10 min

4 Al medio le agregamos la solución sulfato-ferrosa

5 Luego incubamos los tubos en anaerobiosis a 37 ºC por 48 h.

6 Se observarán, de ser positivas, colonias negras en la profundidad.

7 Los resultados se dan en “esporas de Clostridium sulfito reductoras/100 mL”.

Cálculo e interpretación de los resultados.

Leer los tubos que presenten entre 5 a 50 colonias de color negro.

Calcular el número de total de colonias multiplicando por el factor de dilución.

Expresión de resultados

Los resultados se expresan como UFC (unidades formadoras de colonias) por gramo o mililitro según corresponda.

La detección de Clostridium sulfito-reductores, así como su recuento, se puede también hacer :

1. Investigando el recuento de formas vegetativas y esporuladas, conjuntamente.

El medio utilizado es selectivo para gérmenes sulfito- reductora de la mayor parte de los Clostridium, se reduce a sulfuro. El sulfuro, al reaccionar con el citrato de hierro, que se manifiesta formando un precipitado negro alrededor de las colonias. Se cuenta el número de colonias negras crecidas y se multiplica por el factor de dilución del tubo, para obtener el recuento total de colonias de formas vegetativas y esporas de Clostridium sulfito- reductores, conjuntamente por gramo o mililitros.

2. Investigando la presencia de formas esporuladas.

Para obtener únicamente las formas esporuladas de Clostridium sulfito-reductores, se aprovecha su termorresistencia calentando a 80ºC el producto, la suspensión madre o las diluciones decimales, y enfriar inmediatamente bajo el grifo, de esta manera, se destruyen las formas vegetativas. Es importante, conocer que el medio agar SPS, se funde y se regenera calentándolo en agua hirviendo durante 10 minutos para expulsar el oxigeno.




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Después se enfría hasta alcanzar 47-50 ºC, bajo un chorro de agua fría.

Esterilidad comercial en CONSERVAS:

Control de estabilidad: Control rutinario para comprobar las modificaciones que han sufrido las conservas tras una preincubación previa. Se realiza en la fábrica antes de autorizar la salida de un lote. Pruebas:

Diferencias envase conserva incubada testigo

Variaciones en pH.

Diferencias de análisis bacterioscopico Control de esterilidad:

Control que se realiza para comprobar un procedimiento de esterilización o si existieron problemas en el control anterior. Pruebas:

Morfología, flora microbiana revivificable

Termorresistencia de la flora

Temperatura optima de crecimiento.

ANALISIS MICROBIOLOGICO DE LAS CONSERVAS:

Para este análisis es necesario dividir en varias etapas, que se describen a continuación: 1. Lavado de envases:

Antes de proceder al análisis microbiológico, es buena práctica lavar cada uno de los envases con agua jabonosa y aclarar después con agua potable. 2. Examen macroscópico preliminar de los envases:

Consiste en comprobar el estado de las conservas para descubrir posibles defectos o alteraciones tales como:

Aspecto general Limpias

Sucias

Grasientas

Abombamiento Normales

Abombadas

Estalladas

Torsiones




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Manchas Oxido

Rezumado

Otras

Hermeticidad Normales

Fisuras

Roturas

3. Incubación: Una vez realizado el examen externo de los envases, se someten a incubación, SOLAMENTE los no alterados para controlar la estabilidad del producto. Dentro de los objetivos de la incubación, se encuentran:

Permitir la germinación de las esporas aletargadas.

Conseguir el crecimiento de microorganismos mesofilos y termófilos, utilizando tiempos de incubación apropiados a temperatura adecuada.

PROCEDIMIENTO DE INCUBACION

Formar tres grupos con el material traído para la práctica: las unidades de muestra deben ser del mismo lote, en lo posible:

Paso Descripción

1 Grupo al que se le aplica temperatura de mesofilos: 37ºC durante 28 días. Practica: 8 días.

2 Grupo al que se le aplica temperatura de termófilos: 55ºC durante 10 días. Practica: 8 días.

3 Grupo que pertenece a temperatura ambiente y cuya utilidad es para que sea control.

El desarrollo microbiano producido durante la fase de incubación, puede dar lugar a la aparición de unos signos no observados en el examen macroscópico preliminar y que revelan falta de estabilidad de la conserva. Las conservas o enlatados mantenidos en incubación, deberán ser observadas diariamente para comprobar si se producen alteraciones , y evitar, en caso de abombamiento, que pueda explotar.

4. Examen externo del envase después de la incubación: Es necesario que las conservas se estabilicen a temperatura ambiente durante 1 a 4 horas. A continuación se examina la conserva para comprobar posibles alteraciones:

Abombamiento ( de origen físico, químico, o biológico )

Oxidación

Deformación.




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5. Apertura del envase y toma de muestra para el análisis: Estas operaciones deben ser extremadamente cuidadosas, con el fin de evitar contaminaciones externas que podrán FALSEAR LOS RESULTADOS.

La persona que realiza las operaciones se lavara las manos correctamente, secándose solo con toallas desechables. Y usar guantes.

Empapar algodón con alcohol sobre la tapa del envase.

Evitar tocar el alimento con las manos, NO HABLAR.

Cuando se trata de envases abombados, su apertura puede suponer un peligro para el manipulador, por lo que se tomaran medidas para protegerse de la salida violenta del contenido.

Los recipientes se abren con el abrelatas previamente esterilizado. La apertura se hace a cierta distancia de la línea de inserción de la tapa, para evitar contaminaciones, ya que el borde es difícil de desinfectar. Se debe flamear la tapa antes de abrirla. Recién abierto el envase, se comprueba visualmente el aspecto del producto, tomando nota de las posibles alteraciones.

Examen del contenido de la lata:

Olor: putrefacto, fecal, a acido sulfhídrico, a queso, a acido butírico.

Aspecto: textura blanda, dura; consistencia: liquida, o viscosa; presencia de elementos extraños.

6. Examen interno del envase: Se extrae el producto para hacer un examen minucioso de la parte interna del envase, con el fin de descubrir alteraciones del color, de las paredes debidas a reacciones químicas, así como lesiones de oxidación y desprendimiento del esmalte protector. 7. Examen microscópico: En las conservas, los microorganismos se pueden encontrar en tres formas: vegetativas, esporuladas o esporas inertes. En general, una buena conserva, no debe contener más de 2 a 3 bacterias muertas por campo microscópico, excepto en alimentos cuya elaboración es consecuencia de una fermentación biológica. Cuando predominan cocos gram positivos, se sospecha de la presencia de la entero toxina estafilocócica

Procedimiento para el análisis Microbiológico

Paso Descripción

1 Primero realizar dilución hasta 10-1, dejar sedimentar de 3 a 5 minutos.




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2 Hacer una extensión fina del alimento sobre un portaobjetos bien limpio.

3 Aplicar coloración de Gram

4 Examinar 10 a 20 campos distintos y contar las agrupaciones microbianas encontradas.

8. Interpretación del control de estabilidad: De acuerdo con los exámenes ejecutados, para que la estabilidad de una conserva sea correcta, debe ocurrir:

Que después de la fase de incubación no existan modificaciones del envase.

Que después de la incubación no se observen modificaciones del contenido.

Que la variación del pH entre la conserva incubada y la no incubada sea igual o inferior a 0.5 unidades.

Que la variación del número de microorganismos observados en la conserva incubada con respecto a la no incubada sea inferior a 100.

Consulta

1. Investigue para que clase o tipo de alimentos se debe realizar análisis de esporas de Clostridium sulfito reductor. 2. En que radica la importancia de realizar el análisis de esporas de Clostridium sulfito reductor? 3. Que son los enlatados? Como se clasifican? 4. Qué tipo de tratamiento reciben los siguientes alimentos previo a su enlatado, para ello elabore o busque diagramas de flujo de los procesos: a. salchichas b. atun Bibliografía

Descripción

http://books.google.com.co/books?id=9EIfkks8uxMC&pg=PA74&lpg=PA74&dq=clostridium+sulfito+reductor+en+alimentos&source=bl&ots=RGeQZ-ijeg&sig=8wyUZJ5085LdUtKa4CpFLul4rhc&hl=es&ei=JgeiTMLjCIH68Ab5mdXnCA&sa=X&oi=book_result&ct=result&resnum=8&ved=0CDAQ6AEwBw#v=onepage&q=clostridium%20sulfito%20reductor%20en%20alimentos&f=false

http://www.bvsops.org.uy/pdf/clostridium.pdf

http://www.scribd.com/doc/6674027/Microbiologia-de-Alimentos-Practica-n-14Aislamiento-e-identificacionde-Clostridium-perfringens

http://www.webs.ulpgc.es/hica/PRAC/RUTPRAC/CONSERVAS/1OPCCONSERV.pdf

http://www.cleanmasterltda.com/descargas/lecturas/botulismo.php

http://www.conservasenlata.com/opinion_j.jsp

ANEXOS

No. Anexo Descripción




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01 Tubos estériles en anaerobiosis

02 Resultados positivos de sulfito- reductores en muestra de agua

03 Germinación de esporas de Clostridium sulfito-reductores. Se

observa un crecimiento confluente que impide el recuento. El agar se ha resquebrajado y elevado con motivo de la formación de gas




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Laboratorio No

08

Tema:

RECUENTO DE SALMONELLA SPP, Y LISTERIA MONOCYTOGENES

Objetivos

Familiarizar al estudiante con la investigación de Salmonella y Listeria monocytogenes en muestras de alimentos.

Conocer la importancia del reconocimiento de Salmonella como indicador de calidad en muestras de alimentos y su impacto sobre la salud

Indagar sobre los alimentos que puedan contaminarse con Listeria monocytogenes

Conocer el procedimiento de recuento para Listeria monocytogenes

Aplicar mecanismos de prevención de transmisión de: Listeria monocytogenes y Salmonella spp.

Fundamento

LA SALMONELLA Es un género de bacteria que pertenece a la familia Enterobacteriaceae, formado por bacilos gramnegativos, anaerobios facultativos, con flagelos perítricos y que no desarrollan cápsula (excepto la especie S. typhi) ni esporas. Son bacterias móviles que producen sulfuro de hidrógeno (H2S). Fermentan glucosa por poseer una enzima especializada, pero no lactosa, y no producen ureasa. Es un agente productor de zoonosis de distribución universal. Se transmite por contacto directo o contaminación cruzada durante la manipulación, en el procesado de alimentos o en el hogar, también por vía sexual. Crece bien en los medios ordinarios de cultivo, sin requerir factores esenciales. En el hombre causa dos manifestaciones clínicas: fiebre tifoidea, y gastroenteritis (toxiinfección alimentaria) Los alimentos más implicados son la carne y productos cárnicos, la leche y los huevos. La refrigeración de los alimentos y una correcta manipulación y cocción son factores limitantes de la contaminación. En los alimentos como consecuencia de la naturaleza de la contaminación, se ven acompañadas de gran cantidad de Enterobacterias muy similares, de aquí la necesidad de su PRE-enriquecimiento. LISTERIA MONOCYTOGENES Bacilo Gram positivo, no ramificado y anaerobio facultativo capaz de proliferar en un amplio rango de temperaturas (1°C a 45°C) y una elevada concentración de sal. Es




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catalasa positivo y no presenta cápsula ni espora. Tiene flagelos perítricos, gracias a los cuales presenta movilidad a 30ºC o menos, pero es inmóvil a 37 ºC, temperatura a la cual sus flagelos se inactivan. es un importante agente causal de septicemias y meningitis principalmente entre los niños, ancianos, y personas inmunosuprimidas. Origina mastitis en las vacas, lo cual lleva implícito la dispersión de gran número de esas bacterias en la leche que sin duda, es el principal alimento transmisor de listeriosis. Los alimentos que con mayor frecuencia están implicados en la transmisión de esta enfermedad son: leche cruda pasteurizada, el queso blando, carnes crudas y el pollo. La capacidad de Listeria monocytogenes de crecer a temperaturas de refrigeración y su tolerancia a la sal y al nitrito sódico, hacen que esta bacteria pueda contaminar los alimentos refrigerados. Logra sobrevivir en la superficie de las carnes y durante la preparación y almacenamiento de la leche en polvo. Es importante tener en cuenta el control de los manipuladores, higiene en la leche, brindar tratamiento adecuados a todo tipo de carnicos, y de igual forma a la leche.

Materiales y Equipos (investigación de SALMONELLA)


01

MAT

02

EQU

- 2ºC.

Reactivos

Ítem Descripción

a estéril ( 225 ml )




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Procedimiento

Paso Descripción

1

PRE-enriquecimiento en medio liquido no selectivo: en esta etapa se logra la revivificación de las cepas de Salmonella lesionadas, se incrementa su vitalidad y se adquieren las condiciones fisiológicas adecuadas para su perfecto desarrollo: - Se pesan asépticamente 25 gramos de la muestra. - Transferirlos a un frasco que contenga 225 ml de agua peptona estéril. Mezclar e incubar a 37ºC por 18 a 20 horas.

2

Enriquecimiento en medio liquido selectivo: en esta etapa se estimula y favorece el crecimiento de Salmonella, y se restringe la proliferación de flora competitiva: - Inocular 1 ml del cultivo anterior sobre 10 ml de caldo selenito, incubado a 37ºC durante 18-24 horas. - La recuperación óptima de Salmonella se obtiene entre los 42 a 43ºC.

3

Aislamiento diferencial sobre medios sólidos selectivos: en esta etapa se restringe aun más, el crecimiento de la flora competitiva, y se estimula el de Salmonella. - A partir de los cultivos obtenidos en el medio liquido selectivo, sembrar por agotamiento sobre: - Agar Salmonella- Shigella ( S.S ). - Agar XLD - Incubar a 37ºC durante 24 a 48 horas.

4

Confirmación Bioquímica: - Se lleva a cabo con la utilización del sistema API 20E. - Aislar una colonia típica de Salmonella - Incubar en cámara húmeda a 37ºC por 24 horas. - Revelar y leer de acuerdo a la codificación. O realizar pruebas individuales de : TSI / LIA / KIA / CITRATO / UREA.

5

Confirmación serológica: - Mediante la confirmación serológica se puede identificar




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Salmonella al nivel de especie. - Enviar muestra al servicio de Salud para esta identificación - En casos positivos se repite el procedimiento para confirmar el reporte.

Materiales y Equipos (Listeria monocytogenes)

ITEM TIPO DESCRIBCION

01

MAT

02

EQU

+/- 2ºC

Reactivos

item descripcion

procedimiento

1

PRE-enriquecimiento en medio liquido no selectivo: en esta etapa se logra la revivificación de las cepas de Listeria monocytogenes, se incrementa su vitalidad y se adquieren las condiciones fisiológicasn adecuadas para su perfecto desarrollo: - Se pesan asépticamente 25 gramos de la muestra. - Transferirlos a un frasco que contenga 225 ml de agua peptona estéril o directamente al Caldo Fraser. Mezclar e incubar a 37ºC por 18 a 20 horas.

2

Siembra en medios sólidos diferenciales: A partir del cultivo anterior, sembrar una asada por aislamiento sobre




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el agar Palcam, incubando a 37ºC por 24 horas.

3 Identificación: realizar las pruebas de coloración de Gram, oxidasa y catalasa

4

A partir de las cepas que sean : Bacilos Gram positivos, catalasa positivas y oxidasa negativas, serán identificadas utilizando una batería de bioquímicas que incluya:

Movilidad Fermentación de carbohidratos. Siembra en TSI. Siembra en caldo VP RM.

Consulta

1. Consulte sobre la composición, empleo e interpretación de los medios que se

usan para la determinación de Salmonella spp, y Listeria monocytogenes.

2. Describa el crecimiento típico de las colonias de Salmonella spp, y Listeria monocytogenes., según cada medio de cultivo descrito para su aislamiento.

3. Elabore un cuadro sinóptico donde describa las características bioquímicas de cada

microorganismo.

4. Como define microorganismo emergente? Cual es su importancia? Mencione 4 ejemplos de bacterias emergentes.

5. Describa la enfermedad que produce Listeria y Salmonella, teniendo en cuenta: a. Periodo de incubación b. Alimentos implicados c. Síntomas d. Prevención de la contaminación e. Tratamiento adecuado.

Bibliografía

Descripción

www.aidelaboratorio.com/drupal-6.../index.php?q

http://www.aidelaboratorio.com/drupal-6.../index.php?q




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http://www.microbiologiadealimentos.com/doc/guias%20de%20laboratorio/PRACT_7-_Salmonella_-_Listeria.[1].pdf

http://es.wikipedia.org/wiki/Salmonella

http://es.wikipedia.org/wiki/Listeria_monocytogenes

http://www.cybertesis.edu.pe/sisbib/2004/centurion_pm/html/sdx/centurion_pm.html

ANEXOS SALMONELLA SPP. Medios selectivos

AGAR SS: Ágar altamente selectivo que se utiliza para el aislamiento de Salmonella y de alguna especies de Shigella. Se diseñó para diferenciar fermentadores de lactosa de los que no la fermentan, proporcionando buena inhibición de coliformes sin restringir el crecimiento de otros BGN patógenos. Salmonella y Shigella (y otros no fermentadores de lactosa) producen colonias transparentes, translúcidas, mientras los pocos fermentadores de

lactosa que se desarrollan dan colonias mucosas, rojizas.

AGAR XLD : agar BD XLD [agar xilosa-lisina-desoxicolato] es un medio moderadamente selectivo y de diferenciación para el aislamiento y la diferenciación de patógenos entéricos gram negativos (Salmonella y Shigella) de muestras clínicas y no clínicas. Es adecuado en especial para el aislamiento de la especie Shigella. REACCION: Salmonella, positiva a H2S




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De rojo a amarillo con centros de color negro. Shigella, Salmonella, negativas a h2s y colonias rojas.

LISTERIA MONOCYTOGENES

Agar Palcam GRAM Vista microscópica de Listeria monocytogenes en una tinción Gram POSITIVA de bacilos cortos.




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Laboratorio No

09

Tema:

ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AMBIENTES, SUPERFICIES Y MANIPULADORES

Objetivos

Documentar el procedimiento para llevar a cabo una correcta toma de

muestra de Ambientes, superficies y manipuladores. Evaluar mediante la toma de muestras, y su posterior análisis algunas de las

condiciones higiénico sanitarias de un lugar determinado de preparación y manipulación de alimentos.

Familiarizar al estudiante en el tratamiento adecuado de toma de muestras, y las exigencias a nivel nacional e internacional sobre control de ambientes, superficies y manipuladores.

Poner en evidencia la presencia de los microorganismos existentes en el ambiente, superficie y manipuladores.

Optimizar la técnica de escobillado con el fin de mejorar la eficacia de recuperación de microorganismos adheridos a las superficies.

Fundamento

AMBIENTE

El aire además de partículas en suspensión, es portador de bacterias en forma vegetativa o esporuladas, esporos de hongos y virus. Por ello puede ser causa tanto de contaminación de alimentos como de infecciones en el hombre. Para la preparación de alimentos en general, se debe conocer y controlar la calidad microbiológica del aire, ya que este podría ser fuente de contaminación para el material con el que se labora. La evaluación de la calidad microbiológica del ambiente nos indica la cantidad de microorganismos que están presentes en un área determinada. Mientras mas limpia es un área, menor será el número de microorganismos presentes en el aire de la misma. Los microorganismos generalmente no están flotando en al aire sino que se encuentran sobre partículas inertes, por ejemplo polvo, gotas de agua, etc., que le sirven como medio de transporte, y pueden encontrarse aislados o agregados. Existen diferentes métodos que permiten evaluar la calidad microbiológica del aire, uno de los más utilizados es el método de sedimentación en placas de agar, que consiste en exponer placas con un medio de cultivo sólido al ambiente durante un periodo determinado, incubar las placas y hacer el recuento de las colonias




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obtenidas. Con este método se detectan los, microorganismos que caen sobre la superficie de la placa, lo cual simula lo que ocurre normalmente cuando se esta trabajando en esa área. Esta práctica se realiza para asegurar la higiene del ambiente en contacto con los alimentos procesados. Así mismo, podemos diseñar un plan para el seguimiento de la evolución de la misma y la implantación de posibles medidas correctoras. SUPERFICIE El control Microbiológico de superficie nos proporciona información sobre la cantidad de microorganismos presentes sobre una superficie, la cual puede ser un equipo, mesón, ropa, manos del personal, etc. Se empleara el método del Hisopo, para ello se define el área donde se va a tomar la muestra, usando una plantilla de 5 x 4 cm 2, es decir un área total de 20 cm2. Los controles microbiológicos se realizan para asegurar la higiene de los elementos y superficies en contacto con los alimentos procesados. Así mismo, podemos diseñar un plan para el seguimiento de la evolución de dicha higiene y la implantación de posibles medidas correctoras. MANUPULADORES Un alimento puede estar contaminado en su origen o bien puede ser el manipulador quien lo contamine durante el procesado. La persona que va a manipular un alimento tiene una abundante carga microbiana en la piel, pero nunca deberán aislarse de ellas bacterias patógenas. Por lo tanto resulta evidente la necesidad de que el manipulador mantenga una perfecta condición de higiene durante el procesado de los alimentos. Los microorganismos pueden pasar a los alimentos de diversas formas:

Directamente: Existen microorganismos productores de enfermedades transmisibles por alimentos que se encuentran en la nasofaringe, piel y folículos pilosos. Por tanto, a través de las gotitas de saliva que se emiten al hablar, toser, etc., y a través del contacto de heridas e infecciones cutáneas con los alimentos, pueden quedar éstos contaminados. En este caso, se deberá utilizar un vendaje impermeable o, lo que es mejor, si es posible abstenerse de manipular alimentos hasta que se haya producido la curación.

A través de las manos: Las uñas transportan microorganismos, son

especialmente peligrosas después del uso de los servicios higiénicos debido a la gran cantidad de gérmenes presentes en las heces. En algunas ocasiones, los manipuladores contaminan los alimentos con gérmenes que




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se encuentran en su organismo. Cuando esto es consecuencia de una enfermedad en su fase aguda, el problema se reduce, pues el trabajador deja el trabajo por baja laboral; el problema es mucho mayor cuando la persona que elimina los gérmenes no presenta ningún síntoma o es un portador, por lo que los análisis microbiológicos no siempre son eficaces para detectar los gérmenes; lo más adecuado es una correcta educación y formación sanitaria que evite estos riesgos.

materiales y equipos ( ambientes )


01

MAT

Cava Cajas de petri que contienen los medios de cultivo. Cinta marcadores de punta fina lapicero reloj.

Reactivos

Ítem Descripción

01

agar plate count agar sabouraud

Procedimiento

paso Descripción

1.

Identifique el ambiente a muestrear, anotando las actividades que allí se llevan a cabo, y si ya se realizo previamente la higienización.

2

Ubíquese en varios sitios del área en donde usted va a ubicar las cajas de petri.

3.

Destape cuidadosamente la caja evitando tocar el interior, y expóngala al medio durante 15 minutos.




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4.

Transcurrido el tiempo, tape la caja inmediatamente, márquela y llévela a la cava.

5

Para el caso de Mohos y Levaduras junte las cajas con ayuda de cinta de enmascarar para facilitar la incubación, y asegure las otras cajas de manera que evite que se abran o se contaminen, se debe evitar la incorrecta manipulación para no obtener resultados falsos.

6.

Llene completamente el acta de toma de muestra, teniendo en cuenta de anotar el nombre de los responsables de la higienización del lugar, así como quien acompaña en la toma de muestra.

7.

Transporte al laboratorio en el menor tiempo posible

8.

Una vez en el laboratorio incube las muestras de acuerdo al grupo de microorganismos que busca y el medio empleado para ello.

Materiales y Equipos ( De Superficie )

Ítem tipo

01

MAT

Hisopos o escobillones estériles

estéril. Plantillas estériles. Cava Cajas de petri estéril

reactivos

Ítem descripcion

Agar saboraud Agar Plate count




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Agar chromocult

Procedimiento

paso Descripción

1.

Identifique la superficie a muestrear: mesa de trabajo, tabla, olla, un plato, cuchillo, etc.

2.

Encienda el mechero en una zona que proporcione comodidad y seguridad

3.

Destape con cuidado la plantilla y ubíquela en el sitio de toma

4.

Saque un hisopo estéril y humedézcalo en el agua peptona

5.

Frote la superficie en dos sentidos dentro del área delimitada ( plantilla ) corresponde a 20 cm2

6.

Este procedimiento debe hacerse en 5 partes diferentes que representen

7.

Introduzca el escobillón en el tubo, quebrando la parte superior de madera que se descarta.

8.

Identifique el tubo y llévelo a la cava.

9.

Llene completamente el acta de toma de muestra, teniendo en cuenta de anotar el nombre del manipulador que realizo la higienización del lugar, o equipo o del utensilio.

10.

Si es posible anote las condiciones higiénicas sanitarias que usted observa en el momento de la toma para facilitar la interpretación de los resultados.

11.

Transporte al laboratorio en el menor tiempo posible a una temperatura no mayor de 4ºC.

SIEMBRA

1.

A partir del tubo con el hisopo, transfiera 1 ml a cajas estériles




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2.

Adicione agar Plate count para analizar aerobios mesofilos, agar chromocult y saboraud para analizar coliformes, mohos y levaduras respectivamente.

3.

Incube a las temperaturas y tiempos adecuados

Materiales y Equipos ( Manipuladores )

Ítem tipo Descripción

01

MAT

1 tubo con agua peptona estéril Escobillones estériles Gradilla o frascos

reactivos

Ítem descripción

agar chromocult agar Baird Parker asa de jockey

Procedimiento

Pasos Descripción

1.

Identifique a la persona a quien va a tomar la muestra, anotando las actividades que llevo a cabo antes de la toma y pregunte si ya se realizo previamente la higienización de sus manos

2.

Destape el tubo con agua peptona estéril y humedezca el escobillón estéril

3.

Solicite a la persona a quien va a tomar la muestra que abra las manos y facilite la toma dando la vuelta a sus manos una vez se tome la muestra de las palmas

4.

Frote cuidadosamente cada dedo, cada uña y en las zonas interdigitales

5.

Una vez realizado esto, introduzca el escobillón en el tubo con agua




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peptona y quiébrelo, tape, marque la muestra y guarde en la cava

6.

Llene completamente el acta de toma de muestra, teniendo en cuenta de anotar el nombre del manipulador y la actividad que realizaba previamente a la toma de muestra

7.

Observe si el manipulador tiene lesiones en sus manos o en sus uñas, regístrelo e indague en caso de tener lesiones graves si esta en tratamiento o no para ello.

8.

Se debe indicar al manipulador que lave sus manos luego de efectuada la toma de muestra, ya que podrían quedar restos del medio de cultivo en los dedos y así favorecer el crecimiento de los microorganismos.

9.

Transporte al laboratorio en el menor tiempo posible, a una temperatura de 4ºC.

10.

Una vez en el laboratorio refrigere las muestras en caso de no realizar la siembra inmediatamente

SIEMBRA

1.

A partir del tubo con el hisopo, transfiera 1 ml a cajas estériles

2.

Adicione agar chromocult para analizar coliformes

3.

Adicione 0.1 ml sobre agar Baird parker, y distribuya el inoculo con ayuda del asa de jockey.

4.

Incube a las temperaturas y tiempos adecuados.

Consulta

1. ¿Que métodos de toma de muestras actuales y rápidos de ambientes,

manipuladores y superficies existen? ¿Que ventajas presentan frente a los métodos tradicionales empleados en la practica?

2. ¿Como se informa correctamente cada uno de los análisis realizados para ambientes, superficies y manipuladores? Justifique cada una de sus




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respuestas.

3. ¿Que es y cual es la función de un medio de cultivo de transporte? Mencione ejemplos.

4. Que consecuencias tendrá para un área de preparación de alimentos, el no realizar control riguroso de los ambientes, superficies y manipuladores, explique cada uno por separado.

5. ¿Investigar acerca de cuales microorganismos podemos encontrar en el ambiente, superficie y manipuladores?

6. ¿Cuales patologías pueden estar asociados con dichos microorganismos de cada uno de ellos?

7. Elabore un folleto creativo, en donde ilustre la importancia de realizar cada

uno de estos análisis, motivando a los sitios de preparación de alimentos a que implementen este tipo de controles.

Bibliografía

Descripción

Díaz, R., Gamazo C., López-Goñi, I. 1999. “Manual Práctico de Microbiología”. Cap. 32: Cultivos de microorganismos del ambiente. 2ª Ed. Editorial Masson S.A. Barcelona, España. 151 pp.

www.aidelaboratorio.com/drupal-6.../index.php?q..

www.microbiologiadealimentos.com/doc/.../PRACT_8_A..%5B1%5D.pdf

essa.uncoma.edu.ar/academica/materias/microbiologia.../Cap1.pdf

http://www.aidelaboratorio.com/drupal-6.../index.php?q




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Laboratorio No 10

Tema: ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE LECHE Y DERIVADOS LÁCTEOS

Objetivos

Conocer los análisis microbiológicos que se realizan a los derivados lácticos fermentados o no fermentados.

Reconocer los microorganismos patógenos importantes que pueden llegar a contaminar esta clase de alimentos.

Analizar y discutir los resultados obtenidos, y establecer comparaciones con la normatividad vigente que aplica para estos productos.

Fundamento

Los derivados lácteos son productos elaborados a partir de la leche. Comprenden dos grandes grupos: a. Lácteos fermentados. b. Lácteos no fermentados. Dentro de los derivados lácteos más comunes se pueden encontrar: • Leches Acidificadas como el yogurt y el kumis . • Leches Reconstituidas . • Productos Grasos como la mantequilla y la crema de leche . • Leches Modificadas como la leche descremada, semidescremada y deslactosada. • Leches Pulverizadas . • Dulces de leche como el arequipe y la leche condensada. • Quesos frescos y maduros La producción de derivados lácteos en el mundo nace de la necesidad que tuvo (Y tiene) el hombre para conservar la leche y según algunos autores, esto se dio inicialmente con pueblos primitivos que transportaban la leche en estómagos de algunos animales, dentro de los cuales podemos encontrar cabras y ovejas, y que después de largos viajes empezaba a coagularse de tal forma que se obtuvieron los primeros quesos

. Luego se encontró que al acidificar la leche de manera controlada, se podía garantizar un mayor tiempo de duración del producto si se comparaba con la leche recién ordeñada, que es demasiado




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susceptible a la acción del medio ambiente. Otros empezaron a adicionar azúcar, lo cual disminuía la actividad acuosa y volvía al producto final más resistente a la descomposición. Leche pasteurizada: La leche pasteurizada se obtiene después del proceso de pasteurización, que consiste en el calentamiento de la leche cruda a altas temperaturas seguido de un rápido enfriamiento9. La leche pasteurizada es envasada en diferentes empaques para el consumo final. Leche en polvo: La fabricación de leche en polvo requiere un proceso de pulverización. Primero se recibe la leche y se estandariza y homogeniza su nivel de grasa. Posteriormente es pasteurizada y mediante desecación por cilindros o por pulverización se obtiene la leche en polvo; finalmente se empaca en recipientes de hojalata, bolsas de aluminio o de papel. Leches ácidas: Para la obtención de leches ácidas (yogur) se agregan aditivos –estabilizantes o vitaminas– a la leche homogeneizada; después el compuesto es sometido a tratamientos térmicos a diferentes temperaturas y luego se inocula e incuba con streptococcus, termofilus y el Lactobacilus bulgaricus. Terminados estos procesos, la mezcla se enfría, obteniéndose el yogur base. A éste se agregan frutas, jarabes, saborizantes y colorantes, para producir yogures especiales. CONTROL MICROBIOLÓGICO DE LA LECHE: La leche como producto natural analizada contiene microorganismos deben ser estudiados por su utilidad y otros por la capacidad de alterar la composición y características organolépticas de la leche y derivados lácteos o por ser agentes causales de enfermedad en los consumidores, es así que en ella pueden encontrarse microorganismos de los diferentes grupos: bacterias, hongos (mohos y levaduras) y virus, los cuales serán descritos brevemente a continuación, de acuerdo a su importancia en la industria láctea. BACTERIAS

Las bacterias. En la leche se pueden encontrar diverso géneros y especies bacterianas. Aquellas de mayor importancia en la industria láctea son las llamadas bacterias lácticas y las bacterias coliformes.

A) BACTERIAS GRAM. POSITIVAS: Bacterias lácticas:




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Son un grupo de bacterias de diferentes géneros, ampliamente distribuidas en la naturaleza. Se encuentran en el suelo y en cualquier lugar donde existan altas concentraciones de carbohidratos, proteínas desdobladas, vitaminas y poco oxigeno. Son Gram positivas y su forma puede ser bacilar, cocoide u ovoide. Soportan pH 4 en leche. Son anaeróbicas facultativas, mesófilas y termófilas y de crecimiento exigente. Pueden serhomo ferm entativas (más del 90% de su metabolismo resulta en ácido láctico) oheteroferm entativas (producen además del ácido láctico, otros ácidos y gases). Aportan

sabor y aroma, ya que como parte de su metabolismo fermentativo se da la producción de acetaldehído, diacetilo, acetoina, acetona, lactonas, ácidos volátiles, alcohol y gas. Aportan beneficios para la salud de los consumidores, el cual se ha descrito como efecto probiótico. Micrococcos: Débilmente fermentadores, forman parte de la flora inocua que contamina la leche cruda. Tienen poca actividad enzimática, por lo tanto son de muy poca importancia como agentes de adulteración en la leche. Sin embargo por ser la flora más abundante en leche cruda y tener cierta capacidad proteolítica pueden llegar a ser causante de alteraciones en leches pasteurizadas mal almacenadas. Estafilococos: Son anaerobios facultativos, fuertemente fermentadores. Son de gran importancia desde el punto de vista sanitario. Causan mastitis y pueden provocar enfermedades o intoxicaciones en los humanos. Staphylococcus aureus produce una exotoxina que causa fuertes trastornos intestinales en los humanos, la cual es termorresistente, por lo cual no es destruida con la pasteurización. El Staphylococcus epidermidis se ve implicado en algunos casos de mastitis, por lo cual puede llegar a

contaminar la leche. Bacterias esporuladas: Los Bacillus son bacterias aeróbicas con actividad enzimática variada producen acidificación, coagulación y proteolisis. Los Clostridium son anaerobios estrictos, producen gas. Algunos producen toxinas patógenas (Clostridium botulinum). Ambos géneros son de poca importancia en leche cruda, su crecimiento es inhibido por las bacterias lácticas. Cobran importancia en productos lácteos como en leche pasteurizada, quesos fundidos, leches concentradas, quesos de pasta cocida. Resisten la pasteurización por su capacidad de producir esporas, las cuales solo se destruyen a temperaturas por encima de 100 ºC. B) BACTERIAS GRAM. NEGATIVAS: Enterobacterias: Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son huéspedes normales del intestino de los mamíferos, por lo tanto su presencia en el agua y la leche se relaciona con contaminación de origen fecal. Las enterobacterias son menos abundantes en la leche que otras bacterias gran negativas, sin embargo, tienen una gran importancia desde dos puntos de vista, higiénico: ya que varias de estas




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especies tienen poder patógeno, de las cuales la más temible es la Salmonella y otras que pueden provocar trastornos gastrointestinales (Yersinia, E. Coli, Shigella); y tecnológico: ya que son bacterias heterofermentativas, grandes productoras de gas (carbónico e hidrogeno) además producen sustancias viscosas y de sabor desagradable, todo lo cual conduce a la alteración de la leche o subproductos. De las enterobacterias las más comunes encontradas en los productos lácteos son las del grupo Coliformes (Escherichia, Enterobacter, Klebsiella y Citrobacter). La determinación de su presencia indica calidad higiénica de la leche cruda y pasteurizada. Pseudomonas: Más del 50% de la flora Gram negativa de la leche cruda está representada por este género. Juegan un papel importante en la conservación de productos lácteos, ya que además de ser psicrófilas, varias especies tienen un gran poder proteolítico y lipolítico. Además se ha descrito que algunas de estas enzimas resisten temperaturas por encima de los 80 ºC, por lo cual pueden causar alteraciones aún en productos elaborados con leches pasteurizadas. Acromobacteriaceae: Este grupo de bacterias no fermentan la lactosa, no son proteolíticas ni patógenas, pero representan las bacterias psicrófilas que crecen en las leches conservadas a baja temperaturas, algunas pueden producir sustancias viscosas y pigmentos. Se han descritos los génerosFlavobacterium, Alcaligenes y Achromobacter. C) MOHOS Y LEVADURAS: No tienen importancia en leche fluida, sino más bien en los productos. Algunas especies son utilizadas como cultivos lácteos para el afinado de los quesos madurados como el Penicillium candidum y Penicillium camemmberti en los quesos de corteza blanca como el Camembert y el Penicillium roqueforti en los quesos de pasta azul. Las levaduras al igual que los mohos son de poca importancia en la leche líquida y son fácilmente destruidos a temperaturas de pasteurización. En la leche se encuentran la especies Cándida cremoris, Saccharomyces lactis, Sacharomices kefir. Torula kefir se encuentra en los granos de kefir utilizados para producir esta bebida láctea, caracterizada por su sabor ácido-alcohólico, producto de la fermentación de la lactosa por estas especies.


ITEM TIPO DESCRIPCIÓN

01 MAT Cajas de petri grande

02 MAT Pipetas de 1 ml

03 MAT Tubos de ensayo 9 ml

04 MAT Pipeteadores

05 MAT Pipeta 10 ml

06 MAT Asa de Hockey

07 EQUI Estufa o mechero




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08 EQUI Incubadora

Reactivos

ÍTEM DESCRIPCIÓN

01 Medios de cultivo deshidratados: Agua peptona, Agar Baird Parker, Agar Sabouraud,

Agar Chromoculth, etc.

Procedimiento

PASO DESCRIPCIÓN

1 Leer cuidadosamente las instrucciones para realizar el análisis microbiológico de productos lácteos.

2 Medir 11ml o gr del producto lácteo y mezclar en 99ml de agua peptona.

3 Realizar diluciones hasta 10-3 con 1ml de 100.

4 Tomar 1ml de cada dilución y sembrar en el medio correspondiente por método de placa profunda o de superficie según corresponda.

5 Incubar a 37°C para Coliformes totales y fecales, Staphylococcus aureus y 25° C por 24h para Mohos y Levaduras.

6 Observar los resultados y realizar el informe final. Consulta

1. Nombre dos métodos de conservación para los productos lácteos. 2. Mencione algunas medidas preventivas para evitar la contaminación de los productos

lácteos. 3. Realice un diagrama de flujo acerca del procedimiento de obtención de 5 derivados lácteos. 4. Elabora una cartilla que contenga en forma de glosario, todos los términos que se tienen en

cuenta para el procesamiento de la leche, y obtener derivados de ella. Guiarse por el decreto 616.

Bibliografía

http://www.scribd.com/doc/6906371/Microbiologia-de-Alimentos-Control-Microbiologico-de-La-Leche http://www.consumer.es/seguridad-alimentaria/sociedad-y-consumo/2003/01/29/4920.php http://www.engormix.com/MA-ganaderia-leche/industria-lechera/articulos/elaboracion-derivados-lacteos-como-t2604/472-p0.htm

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http://www.engormix.com/MA-ganaderia-leche/industria-lechera/articulos/elaboracion-derivados-lacteos-como-t2604/472-p0.htm




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Laboratorio No 11

Tema: ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUAS Y DE BEBIDAS REFRESCANTES ( Parte 1 )

OBJETIVOS

Conocer el procedimiento de análisis de aguas por la técnica de Filtración por membrana.

Reconocer la importancia del estudio microbiológico en el análisis de aguas.

Adquirir destreza en los técnicas y procedimientos de un análisis microbiológico en aguas.

Desarrollar el método de numero más probable y establecer comparaciones con el método de filtración por membrana.

FUNDAMENTO

FILTRACIÓN POR MEMBRANA La filtración es el proceso que consiste en separar un sólido suspendido del liquido en el que esta suspendido al hacerlos pasar a través de un medio poroso por el cual el liquido puede penetrar fácilmente. El líquido a filtrar se denomina suspensión, el líquido que se filtra, el filtrado, y el material sólido que se deposita en el filtro se conoce como residuo. Esta técnica de filtración por membrana es eficaz para analizar la presencia de contaminación microbiana o por partículas en las soluciones acuosas. Se empleara para su crecimiento el medio de cultivo específico Agar Plate Count, Agar Chromoculth y agar Cetrimide, en donde se manifestará su presencia o ausencia en el análisis Microbiológico de agua apta para el consumo humano. NUMERO MAS PROBABLE La determinación de microorganismos coliformes totales por el método del Número más Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos a 35°C ± 1°C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales Biliares. Esta determinación consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase Confirmativa. En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite la recuperación de los microorganismos dañados que se encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante. La determinación del número más probable de microorganismos Coliformes fecales se




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realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 ± 0.1°C por un periodo de 24 a 48 h

MATERIALES Y EQUIPOS

Item Tipo FILTRACION DE MEMBRANA

01 MAT Pipetas estériles de 10 ml. Cajas de petri estériles con agar plate count, Membranas de

0.45m. Pinzas metálicas.

02 EQU Equipo completo de filtración por membrana. Incubadora de 37ºC +/- 2ºC.

DETERMINACION NUMERO MAS PROBABLE (NMP)

01 MAT Tubos. Pipetas. Pipeteador Campana durham

02 EQU Incubadora Lámpara de fluorescencia

REACTIVOS

Ítem MEDIOS DE CULTIVO

01 Agar plate count, agar chromoculth y agar cetrimide., servido y solidificado en cajas de petri estériles.

Medios de cultivo

Caldo lauryl sulfato, agua peptona

PROCEDIMIENTO

Paso 1

FILTRACIÓN POR MEMBRANA

Realizar limpieza y desinfección del área de procedimiento

Mezclar muy bien la muestra para asegurar de esta forma la homogeneización antes de preparar las diluciones correspondientes.

En el archivo de toma de muestras debe aparecer el nombre de la muestra, con una descripción detallada de la misma, teniendo en cuenta procedencia de la muestra, pH, cloro residual, etc.

Registrar la muestra en el cuaderno con el número consecutivo correspondiente.




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Marcar el material a emplear con el código de la muestra: frascos de dilución y cajas de petri con el medio de cultivo.

Agitar vigorosamente la muestra de agua para homogeneizar la flora que pueda contener.

Preparar la dilución 10-1, midiendo 10 ml de la muestra, y transferirlos a un frasco que contenga 90 ml de agua destilada estéril.

Según el agua se realizan más diluciones o solo se llega hasta 10-1, ya que son aguas tratadas

Cálculo e interpretación de los resultados.

Se observa el crecimiento y se hace el conteo total de la caja sembrada.

Las colonias típicas de coliformes totales tienen color rojo. Las colonias de coliformes fecales son de color violeta azulado. Las colonias de Pseudomona son de color verde, se deben confirmar

con la prueba de oxidasa. El cálculo de resultados se expresa mediante la siguiente fórmula:

Ufc / 100 ml = numero de colonias ---------------------------------- X 100 Volumen de muestra filtrada. Si se filtro la muestra a partir de una dilución, tener en cuenta este factor al final del cálculo de los resultados.

Expresión de resultados los resultados se expresan como UFC( unidades formadoras de

colonias ) por cada 100 mililitros de muestra

DETERMINACIÓN DE NUMERO MAS PROBABLE (NMP)

Limpiar y desinfectar el área donde se va a trabajar. Tomar 10 ml de la muestra (agua) se agrega a un recipiente con

agua peptona estéril de 90 ml mezclar. Realizar las diluciones hasta 10-3

En 9 tubos se le agrega 10 ml de caldo lauryl sulfato, los tres primeros tubos tienen concentraciones doble y los 6 tubos restantes concentraciones sencillas los tubos llevan campana de durham.

Después de realizar las diliciones, se toma de cada dilución: 10-1 los tres primero tubos de concentración doble 1 ml a cada tubo , dilución 10-2 tres tubos de concentración sencilla 1 ml a cada tubo, de igual manera la dilución 10-3.




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Se lleva a incubar a 37 ºC/ 24 horas.

RESULTADOS

Si se observa crecimiento bacteriano con producción de gas las 24h o antes, la presencia de bacterias coliformes fecales se considerará confirmada, prosiguiendo con el método del filtro de membrana para conteo.

Si se requiere el análisis completo de coliformes totales, se llevan a la fase de confirmación todos los tubos primarios en los que haya aparecido cualquier cantidad de gas o crecimiento ácido a las 24h de incubación.

N.M.P. se calcula mediante tablas de estadística que establecen la cantidad de bacteria.

En base a los resultados de estos análisis se establece el siguiente criterio para la aceptación del agua potable para consumo.

Consulta

1. Cuál es el decreto y resolución actuales por las cuales se debe regir para el control de calidad de agua potable’? 2. Cuáles son las características físicas y químicas que debe reunir un agua para consumo humano? 3. Que parámetros permiten diferenciar un agua cruda, un agua de pozo, con una muestra de agua potable? 4.Que otro tipo de análisis se deben realizar para un estudio de análisis de aguas?

Bibliografía

http://www.microbiologiadealimentos.com/ http://www.latinpedia.net/ciencia/agua-potable/Analisis-microbiologico http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL




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Laboratorio No 11

Tema: ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE AGUAS Y BEBIDAS REFRESCANTES ( Parte 2)

Objetivos

Conocer y diferenciar las características de las bebidas refrescantes.

Desarrollar habilidades en el manejo de la técnica de las placas Petrifilm, en el análisis microbiológico de aguas y bebidas refrescantes.

Reconocer la flora predominante en la alteración de este tipo de productos.

Fundamento

Son bebidas no alcohólicas preparadas con agua potable o mineral y que lleva la adición de uno o varias de las siguientes sustancias:

zumos de fruta extracto de frutas frutas, semillas, tubérculos disgregados agentes aromáticos esencias naturales edulcorantes anhídrido carbónico

Se consumen en estado líquido para saciar la sed. Es uno de los campos que más está progresando. Se distingue: agua gaseada, gaseosa, bebida de zumos de fruta, bebida de extractos, bebida de frutas, semillas o tubérculos, bebidas aromatizadas.

AGUA DE SODA: Bebida blanda, sin alcohol. En sentido estricto es una bebida bicarbonatada. En un principio se llamó agua de self, a las aguas carbonatadas que pretendían ser imitación de agua mineral. El producto debe responder:

PRINCIPALES COMPONENTES

Edulcorantes

Sacarosa: Se emplea un jarabe de concentración adecuada que se expresa en grados Brik; también se emplean glucosa, fructosa, lactosa, maltosa siempre en forma soluble. Los edulcorantes naturales tienen la ventaja de que dan uniformidad al sabor así como sabor dulce que contraresta la acidez y cuerpo de la bebida. Las bebidas de cola contienen entre un 9 y un 10 % de jarabe, las bebidas de limón entre un 9,5 y un 10,5 % y los de naranja 13-13,5%. El edulcorante artificial resulta más barato ya que




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su poder edulcorante es mayor, además no aporta energía.

Ácidos: Pueden ser cítrico, tartárico, fosfórico, láctico; otros menos empleados málico, acético, adípico, fumárico. En cuanto a las concentraciones: 0,9% de tartárico, 0,6 de málico, 0,3 de láctico, 0,7 de fosfórico. Para obtener una bebida de calidad no es necesario alcanzar estas concentraciones. El ácido cítrico es muy soluble en agua, se mantiene muy bien en solución. El tartárico se encuentra en la naturaleza como sal ácida de potasio, muy soluble en agua, se utiliza mezclado con el ácido cítrico. El láctico se emplea cuando se pretende conseguir sabores suaves y prolongados. Se exige que sea muy puro y casi siempre mezclado con cítrico.El fosfórico es el más fuerte utilizado en industria en forma diluida, su máxima aplicación es en bebidas tipo cola, no es válido para gaseosas, limonadas, naranjadas.

Esencias: Exentos de terpenos, proceden de extractos de frutas; limón y nuez moscada en bebidas tipo cola; esencias de limón verde, dulce, rosa en las limonadas; esencias de naranja dulce, amarga, mandarina, sabor sintético de Jerez en naranjadas.

Colorantes: Tanto naturales como artificiales. La tartracina en limonadas y naranjadas; el amarillo ocaso y el Ponceau en las naranjadas. En ocasiones se precisa un agente espumante: saponina que se sustituye por la esencia del regaliz. También conservantes autorizados



01 MAT Hisopos estériles

02 Pipetas estériles de 1, 5 y 10 ml.

03 Cajas de petri esteriles

04 Pipeteadores

01 EQU Incubadoras a 37°C.

02 Lámpara u.v 360 nm.

Reactivos

Ítem Descripción

01 Peptonas de 90 ml, 9 ml.

01 Placas petrifilm de aerobios mesofilos, Coliformes, mohos y levaduras

Procedimiento

Paso Descripción

1 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA Agitar las botellas tapadas, invirtiéndolas varias veces. Flamear la tapa de la botella antes de abrirla, y flamear el destapador Deje reposar 10 minutos. Destape la botella, flamee la boca de la botella y vacíe el contenido en un




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erlenmeyer esteril. Agitar por rotación en el recipiente por un tiempo de 30 segundos, con el objetivo de desprender todo el CO2 ( En caso de bebidas carbonatadas.)

2 EXAMEN DE BOTELLAS Y ENVASES Colocar 90 ml de agua peptona en cada botella Agitar Sembrar 1 ml de la solución en cada una de las placas de petrifilm. Se realiza análisis de aerobios mesofilos, Coliformes totales y fecales, mohos y levaduras.

3 EXAMEN DE TAPAS Utilice un hisopo estéril, sumergido en 9 ml de diluyente, frote la parte interna de la tapa, y enjuague el hisopo y déjelo en el tubo con el diluyente. Sembrar 1 ml de la solución en cada una de las placas de petrifilm. Se realiza análisis de aerobios mesofilos, Coliformes totales y fecales, mohos y levaduras.

4 EXAMEN DEL PRODUCTO Se realizan diluciones hasta 10-3.

Sembrar 1 ml de la solución en cada una de las placas de petrifilm. Se realiza análisis de aerobios mesofilos, Coliformes totales y fecales, mohos y levaduras.

Consulta

1. Defina cada uno de los productos que se consideran como bebidas

refrescantes. 2. Elabore el diagrama de flujo del proceso de obtención de una gaseosa, e

identifique en el los posibles puntos de contaminación, y las medidas preventivas para evitar cualquier salida de control.

3. Que normatividad existe en Colombia, que apliquen para este tipo de productos?




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Laboratorio No 12

Tema: ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE PLATOS PREPARADOS

Objetivo

Determinar los tipos de análisis microbiológicos que se realizan para el examen de platos preparados.

Identificar la flora típica contaminante de este tipo de productos.

Conocer algunas definiciones y clasificación de estos alimentos.

Realizar el protocolo de aislamiento de Listeria monocytogenes a partir de alimentos.

Reconocer las características fisiológicas y bioquímicas de esta bacteria relevantes para su identificación en el laboratorio.

Enunciar la importancia de L. monocytogenes en el campo de la microbiología

de alimentos.

Fundamento

Los platos preparados son alimentos que se elaboran partiendo de muy diversos productos que poseen, individualmente, una flora especifica. Por otra parte, están sometidos a numerosas manipulaciones para su preparación y conservación (cocción, refrigeración) que influyen notablemente sobre la naturaleza de dicha flora. La cocción puede ser un factor de selección de la flora esporulada que, cuando se produce un enfriamiento lento, origina una proliferación considerable. A la inversa, el paso del almacenamiento en frio, a la exposición a la temperatura ambiente, puede dar lugar a una multiplicación excesiva de los contaminantes microbianos. Se trata de preparaciones culinarias, cocinadas o precocinadas, elaboradas a partir de muy diversos productos: Carnes de abasto, carne de aves, caza, pescados, moluscos, crustáceos, huevos, etc. Acompañados de salsas, productos lácteos, verduras, legumbres, rellenos y otros. Los platos preparados son cada día más numerosos y variados. Para que estos productos alcancen una buena calidad microbiológica, es necesario:

- Que las materias primas no estén contaminadas o lo estén minimamente. - Que durante su elaboración se eviten nuevos aportes microbianos y la

proliferación de la flora presente. - Que se conserven adecuadamente después de su elaboración.

Dada la gran diversidad de materias primas utilizadas en la elaboración de platos preparados, es posible el aporte de flora indeseable muy variada, razón por la que se impone el control de cada una de ellas, así como de otros agente que, como las especias, son frecuentes vectores de contaminación. Es evidente que no se deben mezclar materias primas de calidades microbianas distintas y no correctas.




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Durante la elaboración del producto hay que evitar la proliferación de los microorganismos presentes, procurando que no existan oportunidades que faciliten el crecimiento de los mismos. Es importante, después de la cocción, someter el alimento a un enfriamiento rápido previo a su conservación en frigorífico. Dicho enfriamiento no debe superar las dos horas:

- En refrigeración, a temperatura inferior a 3°C. - En congelación, a temperatura de -18°C o inferior.

En la fase de preparación del plato, además de evitar la proliferación de la flora procedente de la materia prima, es necesario no aportar nuevos gérmenes mediante manipulaciones poco higiénicas o por utilización de material contaminado en un ambiente sucio. En el aspecto sanitario, los platos preparados pueden constituir un riesgo para el consumidor si están mal elaborados o conservados, ya que casi todas las bacterias productoras de toxiinfecciones alimentarias se pueden encontrar en ellos, conociéndose numerosos casos de enfermedades gastrointestinales de origen alimentario causadas por platos preparados, donde se han aislado Salmonella spp, S. aureus enterotoxigénico, Clostridium perfringens,Bacillus cereus y otros.

Los platos preparados, además de ser inofensivos para la salud, deben mostrar un buen aspecto que los haga apetecibles y no rechazables. Para conseguirlo, los que no sean de consumo inmediato se conservaran en refrigeración a temperatura inferior a 3°C o en congelación o ultra congelación, a temperaturas de -10 ó -18°C, respectivamente. La alteración de estos productos se manifiesta por cambios en sus caracteres organolépticos (aspecto, gusto, olor) debido principalmente a la acción de bacterias psicotróficas (Pseudomonas, Achromobacter, etc.) levaduras y mohos. Los platos preparados destinados a ser conservados en caliente antes de su consumo, se mantendrán, inmediatamente después de su preparación, a una temperatura mínima de 65°C en su parte profunda hasta el momento de su consumo, que tendrá lugar en el transcurso del miso día. Estos alimentos, por sus características especiales, exigen un control microbiológico muy estricto y constante de la materia prima, distintas fases de elaboración y como producto terminado. DEFINICIONES:

- Platos preparados: son los productos obtenidos por mezcla y condimentación de alimentos de origen animal y/o vegetal, con o sin adición de otras sustancias autorizadas, contenidos en envases apropiados, herméticamente cerrados o no, según el procedimiento de conservación utilizado, y dispuestos para ser consumidos, ya directamente o previo simple calentamiento o tras un tratamiento.




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- Plato precocinado: es el resultado de una preparación culinaria completa,

envasado y sometido a un procedimiento de conservación de los citados adelante. Este plato necesita, por tanto, tratamiento domestico adicional.

- Plato cocinado: es el resultado de una preparación culinaria completa, envasado y sometido a un proceso de conservación de los citados aquí. Este plato se encuentra dispuesto para el consumo con calentamiento previo o sin él. Pueden expenderse platos cocinados en recipiente tapados y mantenidos, inmediatamente después de la preparación, a temperaturas iguales o superiores a 65°C, medidos en la zona central del producto. Estos platos deben consumirse el mismo día de su preparación y reciben el nombre de “platos cocinados de consumo inmediato”.

- Refrigeración: consiste en someter a los alimentos a la acción de bajas

temperaturas, sin alcanzar las de congelación. La temperatura de refrigeración deberá mantenerse uniformemente y sin cambios bruscos durante el periodo de conservación y ser apropiada para cada tipo de producto.

- Congelación: consiste en someter a los alimentos a un procedimiento industrial de frio que haga bajar la temperatura, en el centro geométrico, como máximo a 10°C bajo cero. No se fijan los tiempos o velocidades para alcanzar la congelación, ya que son específicos de cada plato preparado.

- Ultracongelación: consiste en someter a los alimentos a un proceso realizado en instalaciones convenientes y especificas de modo que, partiendo de unas temperaturas muy bajas, se rebase rápidamente la zona de temperatura de máxima cristalización.



01 MAT Pipetas de 1 ml, 5 ml, y 10 ml.

02 Asas de hockey

03 Papel filtro

01 EQU Balanzas

02 Licuadoras

03 incubadoras




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Reactivos

Ítem Descripción

01 Peptonas de 225 ml, 90 ml, 9 ml.

02 Agar plate count

03 Agar chromocult

04 Caldo selenito

05 Agar S.S

06 Agar XLD

07 Agar Baird Parker

08 Batería de pruebas bioquímicas

09 Placas petrifilm de aerobios mesofilos, Coliformes, y S. aureus.

Procedimiento

Paso Descripción

1 Recuento de aerobios mesofilos: siembre 1 ml en profundidad de las diluciones 10-3 y 10-2 por duplicado. Adicione el agar SPC. Incube a 37°C durante 24 a 48 horas.

2 Recuento de Coliformes totales: siembre 1 ml en profundidad de las diluciones 10-3 y 10-2 por duplicado. Adicione agar Chromocult . Incube a 37°C durante 24 a 48 horas.

3 Recuento de coliformes fecales: siembre 1 ml en profundidad de las diluciones 10-3 y 10-2 por duplicado. Adicione agar Chromocult. Incube a 44°C durante 24 a 48 horas.

4 Investigación de salmonella: pese 25 gramos de la muestra. Adicione 225 ml

de agua de peptona tamponada. Incube a 37°C / 18 a 24 horas. Proceda como se ha explicado anteriormente. Realice las pruebas confirmativas.

5 Recuento de Staphylococcus aureus coagulasa (+): siembre o,1 ml de las diluciones 10-2 y 10-1, sobre superficie de Agar Baird Parker. Extienda el inoculo con asa de Hockey. Incube a 37°C / 24 a 48 horas. Proceda hacer las pruebas confirmativas como se ha explicado. De igual forma sembrar 1 ml en placa de petrifilm.

Consulta

1. Investigue los parámetros que se deben tener en cuenta para correlacionar los

resultados con la legislación Colombiana. 2. En el Microproyecto de Proyección social, que se viene trabajando, aplicar esta

práctica de Laboratorio para un plato preparado escogido. 3. Elaborar un plegable informativo, sobre Prevención de la contaminación de

microorganismos en los alimentos.




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Bibliografía

Descripción

www.invima.org.gov

Revista electrónica de España: Eroski Consumer.

www.who.int/foodsafety

http://www.invima.org.gov/

http://www.who.int/food




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Referencias bibliográficas

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2. Dahms S. Microbiological sampling plans – Statistical aspects. Mitt. Lebensm. Hyg. 2004; 95:32-44.

3. Cordier J. Microbiological criteria – Purpose and limitations. Mitt. Lebensm. Hyg. 2004; 95:28-31.

4. Decreto 3075 de 1997.Colombia.

5. I.C.M.S.F. Microorganismos de los alimentos. 7. Análisis microbiológico en la gestión de la seguridad alimentaria. Zaragoza, España: Editorial Acribia, S. A.; 2004.

6. Hildebrandt G, Bohmer L, Dahms S. Three-class attributes plans in microbiological quality control: A contribution to the discussion. J. Food Protect. 1995; 58(7):784-790.

7. Forsythe S. Alimentos seguros: Microbiología. Zaragoza, España: Editorial Acribia,

S.A. ; 2003.

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9. Jay J. Microbiología moderna de los alimentos. (4ª ed). Zaragoza, España: Editorial

Acribia, S.A.; 2002.

10. Lightfoot N, Maier E (edit.). Análisis microbiológico de alimentos y aguas: Directrices para el aseguramiento de la calidad. Zaragoza, España: Editorial Acribia, S. A.; 2002.

11. Pascual M, Calderón V. Microbiología alimentaria: Metodología analítica para alimentos y bebidas. (2ª ed.). Madrid, España: Díaz de Santos, S.A.; 2000.

12. I.C.M.S.F. Microorganismos de los alimentos. 2. Métodos de muestreo para análisis microbiológicos: Principios y aplicaciones específicas. Zaragoza, España:

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13. I.C.M.S.F. Microorganisms in foods. 2. Sampling for microbiological analysis: Principles and specific applications. Canada: Blackwell Scientific Publications, Univ. of Toronto Press; 1986.

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15. Zea Z, Ríos de Selgrad M. Evaluación de la calidad microbiológica de los productos cárnicos analizados en el Instituto Nacional de Higiene "Rafael Rangel" durante el período 1990-2000. Rev. Inst. Nac. de Hig. "Rafael Rangel". 2004; 35(1):17-24.

16. Banwart G. J. Basic food microbiology. (2ª ed.). New York, U.S.A.: An Avi Book; 1989

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