CROMATOGRAFÍA

SEGÚN IUPAC:

La Cromatografía es un método usado permanentemente para la separación de los

componentes de una muestra en la cual los componentes se distribuyen en dos fases

una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra se mueve.

La fase estacionaria puede ser un sólido, un líquido retenido sobre un sólido o un gel.

La fase estacionaria puede estar extendida como una capa o distribuida como una

película, etc. La fase móvil puede ser líquida, gaseosa o un fluido supercrítico.

La cromatografía es una técnica de separación ( fraccionamiento o purificación) cuyo

propósito es separar y cuantificar analitos en mezclas (por lo general en matrices

complejas).

El botánico russo Mikhail Semenovich Tswett. A inicios del s XX

separó los pigmentos de hojas en una columna de vidrio,

empleando carbonato de calcio (fase estacionaria) y éter de

petróleo (fase móvil).

Tswett le llamó a esta técnica Cromatografía, del griego “escritura

del color”

¿CÓMO ES QUE OCURRE LA SEPARACIÓN EN

CROMATOGRAFÍA?

Por migración de los analitos en mezcla, a diferentes velocidades.

La velocidad de migración está gobernada por diferentes interacciones entre un

soluto (conducido por una fase móvil en movimiento) y un sólido o líquido (fase

estacionaria).

La separación ocurre como resultado de la diferencia de interacción entre los

analitos y la fase estacionaria, el componente más afín a la fase estacionaria se

retiene más y tarda en eluir.

La fase estacionaria por lo general es un sólido poroso, con un tamaño de

partícula muy pequeño, de superficie inerte. Este sólido está recubierto por una

pequeña capa o película de un líquido.

La fase móvil es un solvente de alto grado de pureza o una mezcla de ellos.

FUERZAS INTERMOLECULARES INVOLUCRADAS EN LOS

PROCESOS CROMATOGRÁFICOS

Fuerza intermolecular Grupos típicos en la molécula Fuerza relativa de los

enlaces

Interacciones de Cadenas de hidrocarburos Débil

van der Waals

Dipolares y atracciones Enlaces dobles C = C , halógenos Débil

Inducidas por dipolos nitrógeno

Enlaces hidrógeno Grupos –OH y –NH2 Fuerza moderada

Atracciones iónicas Grupos ionizables o con carga Fuerte

PROCESOS FÍSICO QUÍMICOS QUE OCURREN EN LA

CROMATOGRAFÍA

ADSORCIÓN

Es un fenómeno físico de superficie , las moléculas de una sustancia (adsorbato) se adhieren

en la superficie de un sólido finamente dividido (adsorbente).

El desplazamiento de la sustancia depende del equilibrio adsorción – desorción de la

sustancia contenida en un disolvente móvil sobre un sólido estacionario y ocurre en la

superficie de contacto durante la adsorción.

La proporción de la distribución entre las dos fases luego del

equilibrio se llama coeficiente de adsorción, el cual disminuye

cuando aumenta la temperatura, menos sustancia es adsorbida

cuando la temperatura se incrementa.

El tiempo de retención (tR ) disminuirá y los valores de Rf aumentarán. La

desorción es la separación de las moléculas adsorbidas por el adsorbente.

ADSORCIÓN

Ocurre un reparto múltiple de la muestra entre dos líquidos o fluidos no miscibles por la diferencia de

solubilidad de los componentes en esas fases. (Ley de distribución de Nernst)

La fase estacionaria es siempre un líquido inmovilizado de algún modo y la fase móvil puede ser un

líquido o un gas, que la atraviesa con un gran área de interfase.

C1 C2 : Conc. en fase 2 Ce Ce: Conc. en fase estacionaria

= k = k k : coeficiente de reparto

C2 C1 : Conc. en fase 1 Cm Cm: Concentración en fase móvil

DISTRIBUCIÓN O REPARTO

ELUCIÓN DE LOS COMPONENTES DE UNA

MEZCLA

INTERCAMBIO IÓNICO

La FE es una matriz porosa, llamada resina, es un polímero con grupos portadores de

carga eléctrica positiva o negativa a la cual están enlazados los ligandos y a través de la

cual pasa la fase móvil, la FE retiene el soluto iónico pero de signo opuesto, se

intercambia por un proceso irreversible con iones de la FM.

Se denomina intercambio aniónico si el analito tiene carga negativa y catiónica si tiene

carga positiva.

R+X- + A- R+A- + X-

Resina intercambiadora

aniónica

R-X+ + C+ R-C+ + X+

Resina intercambiadora

catiónica

FILTRACIÓN EN GEL

Es llamada también Cromatografía de permeación en gel y se basa en la diferencia de tamaño

molecular, se usa para compuestos de PM > 2000.

La FE consiste de un fluido contenido dentro de una matriz polimérica tridimensional y porosa

(gel) , cuyos poros no son mayores que un determinado tamaño.

Los poros resultan de la formación de enlaces cruzados formados por una reacción

química entre la cadena del polímero y un reactivo puente, el tamaño de los poros puede

disminuirse , incrementando el número de enlaces cruzados.

La FM es el fluído que está fuera de la matriz del gel. Las moléculas más grandes de las

sustancias son incapaces de ingresar a los poros y son eluidas primero y las más

pequeñas son retenidas dentro de los poros del gel, requiriendo más tiempo y solvente

para ser eluidas .

El límite de exclusión es el tamaño máximo de una molécula ( peso molecular), que puede ser

retenida en los poros del gel .

FILTRACIÓN EN GEL

Características de las resinas de

Exclusión Molecular clásicas

BioGel

Sephadex

P-60P-100P-200P-300G-50G-100G-150G-200

3-605-10030-20060-3002-30

4-1505-3005-600

Nombre Código

Rango de Fraccionamiento(kDa) Flujo máximo

(cm/hr)

55435532

AFINIDAD

AFINIDAD O BIOAFINIDAD

MODALIDADES DE CROMATOGRAFÍA

CROMATOGRAFÍA DE FASE NORMAL

La fase estacionaria es de naturaleza fuertemente polar o hidrofílica: sílice, alúmina y la fase móvil es apolar ( hexano,

cloroformo, etc )

Las muestras polares quedan retenidas más tiempo que las menos polares; es un método apropiado para solutos de

alta y mediana polaridad o para separar isómeros de posición.

En el mecanismo de separación pueden ocurrir : Interacción dipolo – dipolo, interacciones de puente hidrógeno,

transferencia de carga.

CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA

La FE es de naturaleza apolar (hidrocarburos C8, C18), mientras la FM es un líquido polar, agua, MeOH, AcN, THF, el

agua actúa como carrier. La FM es un solvente polar y un modificador orgánico y se puede agregar aditivos, sales o

buffers. La selectividad del sistema depende del modificador en función y su capacidad de aceptar y donar protones.

La fase ligada está formada por un material de base: sílicagel, alúmina, agarosa

copolímero de estireno, que se une químicamente a un compuesto con un grupo funcional

determinado.

La unión más frecuente es un enlace covalente tipo siloxano (Si - O - R). Hay también

uniones tipo amino (SiNR2), tipo carbono (Si – CR3)

Químicamente la sílicagel es un óxido de silicio hidratado (SiO2.H2O), sus átomos internos

están ligados por oxígeno y los superficiales por –OH, es fuertemente higroscópica, el

agua es responsable de su inactividad, es insoluble en solventes no polares y muy soluble

en solventes alcalinos.

Su mecanismo de retención ocurre por la interacción entre el soluto y la fase ligada, que

puede ser:

Partición: del soluto con FM y FE líquidas

Adsorción: interacción con la FE sólida

Mixto: partición y adsorción.

FASE LIGADA

TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

Cromatografía Planar

Se presenta cuando la fase estacionaria está colocada en una superficie plana tridimensional,

aunque una de sus dimensiones es muy reducida, se considera que es bidimensional.

Puede ser:

Cromatografía de Capa fina (Thin Layer Chromatography, TLC)

Cromatografía de Alta Performance en Capa Fina ( High Performance Thin Layer Chromatography,

HPTLC)

Cromatografía en Papel, CP

El flujo de la fase móvil puede ser por capilaridad ( C. horizontal y ascendente) o por capilaridad y

Gravedad (C. descendente).

Cromatografía en Papel y Capa Fina (TLC)

Sembrado:

Puntiforme Banda

Forma de sembrado: Manual (capilares jeringas)

x

Cualitativa

x x x x x

Identificación Pureza Ausencia

Cuantitativa

x x x x

Preparativa

TLC o CCD

TLC (Rf)

Adición de reactivos cromogénicos

TLC

HPTLC

CROMATOGRAFÍA EN PAPEL

EMPAQUETADO

COLUMNA

RESERVORIOf. móvil

ELUCIÓN Y RECOGIDA DE FRACCIONES

MUESTRA

APLICACIÓN

MUESTRA

COLUMNA

llave

LECHO CROMATOGRÁFICOf. estacionaria

FLUJOgravedad

EMPAQUETADO

COLUMNA

SEPARACIÓN

DIFUSIÓN

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

ANÁLISIS DEL

CONTENIDO DE LAS

FRACCIONES

PERFIL DE ELUCIÓN

1 2 4 5 6 7 8 93

resp

uest

a d

el dete

ctor

fracción

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

Moléc. distribuida en f.móvil

Espectrofotométrico

Abs 280nm – ProteínasOtras Abs - Colorantes

FRACCIONES

1 2 4 5 6 7 8 93

ETAPAS DE LA CROMATOGRAFÍA

EN COLUMNA

TERMINOLOGÍA Y PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS

Eluyente : Así se denomina a la fase móvil portadora de la muestra

Eluato: es el término con el que se define la salida del eluyente

ELUYENTE

columna

ELUATO

(entra) (sale)

(proceso de ELUCIÓN

Flujo: mide la velocidad de la fase móvil, se expresa como gasto

en volumen ( ml disolvente/minuto de recorrido de la columna)

o gasto lineal (cm de recorrido/minuto)

CROMATOGRAMA: Gráfica que expresa la respuesta del detector

en función del tiempo de elución

Limitaciones de la cromatografía en

Columna abierta

Imposibilidad física de aumentar el flujo

Resinas compresibles

Corridas de muchas horas

Grandes volúmenes

Descubrimientos que

facilitaron la HPLC

Síntesis de resinas incompresibles

Nuevas técnicas en el empaque de

las columnas

Microparticulación de las resinas

Adelantos en la tecnología

espectrofotometrica

INSTRUMENTACIÓN

DIFERENCIAS MÁS SIGNIFICATIVAS ENTRE

CL A PRESIÓN Y CL POR GRAVEDAD

Técnica Tamaño

partículas (µm)

MP Pº (Bar) Tiempo

(min)

Cromatografía

en Columna

63 - 200 g 0 64

CC Flash 40 – 63 40 mg – 2,5 g 0,75 09

CLBP 50 - 120 10 mg – 1 g 1 - 10 15 - 20

CLMP 25 - 40 100 mg - g 12 12

HPLC prep 12 – 15 500 mg – g 150 -

HPLC

semiprep

10 1 – 50 mg 400 -

HPLC anal 5 µg a 1 mg 20 10

HPLC ultra alta

presión

1,5 - 3 µg 1000 -