Comparación del método HPLC y método de infrarrojos para la ...
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Pablo Contreras Ruiz Susana Sanz Cervera Facultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática Proyecto Fin de Carrera Agricultura y Alimentación 2013-2014 Título Director/es Facultad Titulación Departamento PROYECTO FIN DE CARRERA Curso Académico Comparación del método HPLC y método de infrarrojos para la determinación de azúcares en la miel Autor/es
Transcript of Comparación del método HPLC y método de infrarrojos para la ...
Pablo Contreras Ruiz
Susana Sanz Cervera
Facultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática
Proyecto Fin de Carrera
Agricultura y Alimentación
2013-2014
Título
Director/es
Facultad
Titulación
Departamento
PROYECTO FIN DE CARRERA
Curso Académico
Comparación del método HPLC y método de infrarrojospara la determinación de azúcares en la miel
Autor/es
© El autor© Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2014
publicaciones.unirioja.esE-mail: [email protected]
Comparación del método HPLC y método de infrarrojos para la determinaciónde azúcares en la miel, proyecto fin de carrera
de Pablo Contreras Ruiz, dirigido por Susana Sanz Cervera (publicado por la Universidadde La Rioja), se difunde bajo una Licencia
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COMPARACIÓNDELMÉTODOHPLCYMÉTODODEINFRARROJOSPARALADETERMINACIÓNDEAZÚCARESENLAMIEL.
TRABAJO FIN DE CARRERA
PABLO CONTRERAS RUIZ
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INDICE DE CONTENIDO
0.-ANTECEDENTES...................................................................................................................... 5
1.-RESUMEN ............................................................................................................................... 9
2.-INTRODUCCION .................................................................................................................. 13
2.1. Características generales, propiedades, origen y tipos de miel ........................................ 15
2.2. Datos económicos ............................................................................................................ 21
2.2.1 A nivel mundial.......................................................................................................... 21
2.2.2 La miel en España ...................................................................................................... 24
2.3. Composición de la miel.................................................................................................... 27
2.3.1 Composición media de la miel ................................................................................... 27
2.3.2. Viscosidad de la miel ................................................................................................ 28
2.3.3. Cristalización de la miel ............................................................................................ 29
2.3.4 Azúcares en la miel .................................................................................................... 30
2.4. Métodos de determinación de azúcares en la miel ........................................................... 32
2.4.1. Refractometría........................................................................................................... 32
2.4.2 Determinación química de azúcares totales ............................................................... 32
2.4.3. Métodos enzimáticos................................................................................................. 33
2.4.4. Métodos cromatográficos (HPLC) ............................................................................ 34
2.4.5. Espectroscopía infrarroja (IR) ................................................................................... 35
2.4.6. Comparación de HPLC con espectroscopía IR ......................................................... 36
3.-OBJETIVOS ........................................................................................................................... 37
4.-MATERIALES Y METODOS ............................................................................................... 41
4.1. Muestras ........................................................................................................................... 43
4.2. Método analítico mediante HPLC.................................................................................... 44
4.3 Milkoscan / FOSS ............................................................................................................. 47
4.4 Análisis estadístico............................................................................................................ 47
5.-RESULTADOS Y DISCUSION ............................................................................................ 49
5.1. Composición de azúcares obtenida mediante HPLC........................................................ 51
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5.1.1. Calibración del equipo .............................................................................................. 51
5.1.2. Análisis de muestras de miel ..................................................................................... 52
5.2. Composición de azúcares obtenidos mediante Milkoscan/Foss....................................... 60
5.3. Comparación de los resultados obtenidos mediante HPLC y Milkoscan......................... 63
6.-CONCLUSIONES .................................................................................................................. 69
7.-REFERENCIAS...................................................................................................................... 73
8.-ANEJO I ................................................................................................................................. 79
9.-ANEJO II ................................................................................................................................ 89
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ANTECEDENTES
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0.-ANTECEDENTES
He llevado a cabo esta investigación a lo largo del 2013 en el país vecino, en Portugal, en el Centro de Apoyo Tecnológico Agroalimentario, también llamado CATAA, situado en la localidad de Castelo Branco, capital del distrito de Castelo Branco, en la región de Beira Interior Sur o Beira Baixa como se conocía antiguamente.
Estuve el año anterior realizando una estancia Erasmus y surgió la posibilidad de realizar una investigación durante tres meses en la Escuela Superior Agraria de Castelo Branco gracias a la profesora Drra. Ofelia Anjos. Al principio no resulto fácil, debido al idioma, ya que aunque sea similar no es lo mismo y más si se emplean términos técnicos, así que debo dar las gracias por su paciencia tanto a Ofelia como al químico al mando en el centro, Dr. Paulo Antunes.
Este centro está subvencionado por el Gobierno Portugués y tiene cooperación con organismos españoles, dispone de varios laboratorios de ensayos químicos, microbiológicos y físicos; aquí se desarrollan e implementan nuevas tecnologías, así como asistencias técnicas, mejoras continuas de sistemas de gestión de calidad y prestación de servicios de análisis a compañías agro industriales.
Sitio web CATAA : http://www.cataa.pt/
Escola Superior Agrária de Castelo Branco : http://www.ipcb.pt/ESA/
. Imagen 1: Centro CATAA en Castelo Branco
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RESUMEN
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1.-RESUMEN
La investigación que he llevado a cabo trata de analizar la aplicación en miel de dos de los métodos empleados en la determinación de azúcares en alimentos, comparando su eficacia y fiabilidad: el método de cromatografía HPLC y el método de infrarrojos conocido como Milkoscan o FOSS.
Los azúcares son los componentes mayoritarios de la miel y determinan sus principales características. Por tanto debemos establecer la cantidad de cada uno de los tipos de azúcares presentes en la miel utilizando los métodos más adecuados para su determinación. Para ello hemos realizado analíticas mediante el empleo del método de infrarrojos con el equipo “Milkoscan/Foss” para comprobar si los resultados obtenidos eran fiables respecto a los obtenidos mediante cromatografía liquida de alta resolución (HPLC).
1.-RESUMO
Os açucares são o maior componente nas méis , por isso, precisamos de conhecer os métodos de determinação, A investigação que eu fiz foi analisar a aplicação na mel em dois grupos de métodos utilizados na determinação de açúcares em alimentos, comparando sua eficiência e confiabilidade: o método de HPLC e o método conhecido como MilkoScan infravermelho ou FOSS, para assim comprobar si os resultados obtidos são fiáveis como o respeito nos obtidos na cromatografia liquida de alta resolução.
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INTRODUCCION
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2.-INTRODUCCIÓN
2.1. Características generales, propiedades, origen y tipos de miel
La miel es un fluido dulce y viscoso producido por las abejas a partir del néctar de las
flores o de secreciones de partes vivas de plantas o de excreciones de insectos chupadores de
plantas. Las abejas lo recogen, transforman y combinan con la enzima invertasa que contiene la
saliva de las abejas y lo almacenan en los panales donde madura.
La miel tiene cualidades reconocidas y utilizadas por los seres humanos desde tiempos
remotos, como alimento y para endulzar naturalmente. Existen diversas referencias históricas a
esta sustancia. Además de las citas bíblicas, muchos otros pueblos, como los antiguos egipcios o
los griegos, por ejemplo, se referían a la miel como un producto sagrado, llegando a servir como
forma de pagar los impuestos. En excavaciones egipcias con más de 3.000 años fueron
encontradas muestras de miel perfectamente conservadas en vasijas ligeramente tapadas.
También existen registros prehistóricos en pinturas rupestres de la utilización de la miel.
Son conocidas diversas variedades de miel que dependen de la flor utilizada como
fuente de néctar y del tipo de abeja que la produjo, pero como éstas la fabrican en cantidad cerca
de tres veces superior de lo que necesitan para sobrevivir, siempre fue posible, primeramente,
recoger el exceso de ésta para el ser humano y más tarde realizar la domesticación de las abejas
para el fin específico de obtener su miel, técnica conocida como apicultura.
Además, la miel presenta propiedades antibacterianas y farmacológicas que aumentan
su valor y su utilización a otros usos añadidos a su innegable valor nutritivo.
Efectos antibacteriales
En 1919, ya Sackett observó que algunas bacterias mueren rápidamente en miel no
esterilizada por calor, dando mejores resultados las mieles diluidas. En 1937, Dold, Du y Dzio
fueron los primeros en examinar las propiedades antibacteriales de la miel, que se atribuyó a
una sustancia llamada en aquellos entonces, "inhibina". Esta era susceptible al calor y a la luz.
Posteriormente, varios investigadores demostraron que mieles de diversos orígenes
tenían efecto sobre bacterias gram-positivas y gram-negativas. Este efecto no era atribuido
únicamente a la acidez, alto contenido de azúcares, compuestos nitrogenados, sino a una
sustancia bactericida que era susceptible al calor, a la luz solar y a un pH bajo. En 1944, Plachy
señaló que las mieles de altura (>1,000 m) tenían por lo menos el doble de la actividad
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antibacterial que mieles de áreas bajas (<1,000 m). Igualmente, se observó que sobre los 1,000
m la mayoría de las mieles tenían un porcentaje más alto de mielada. La mielada tiene
propiedades antibacteriales más marcadas que la miel floral. Más tarde se encontró que los
efectos de la "inhibina" eran causados por la acumulación de peróxido de hidrógeno, producido
por un sistema natural de glucosa oxidasa.
Lavie en 1960 afirmó que la miel no tiene propiedades fungistáticas como tal y que la
razón de que los mohos no pueden crecer es por la alta concentración de azúcares.
Efectos farmacológicos
La miel ha sido utilizada en la medicina desde tiempos inmemorables. En los últimos
cincuenta años se han realizado numerosos experimentos "in vitro" que demuestran los efectos
de la miel en tejidos y órganos animales. Sin embargo, estos no necesariamente son aplicables a
la fisiología humana, aunque es muy probable. Una de las áreas donde más se habla sobre los
beneficios de la miel es en la aplicación tópica en quemaduras.
La viscosidad de la miel es una barrera excelente contra microorganismos. Su alta
solubilidad en agua la hace fácil de eliminar. Y sus propiedades corrosivas leves previenen o
evitan daño adicional a tejidos. En 1970 Manjo concluye lo siguiente: “lo mejor para una herida
es dejarla sola y al descubierto, a menos que se aloje una infección y se requiera de tratamiento
antibiótico, en tal caso es probable que la miel sea tan efectiva como cualquier otra cosa”.
El alto contenido de Fructosa de la miel ha llevado a que se utilice para elevar el
metabolismo de alcohol en pacientes de alcoholismo. Por otro lado, se recomienda una gota de
miel pura en cada ojo para lavar y eliminar molestias en los mismos. En términos generales, al
utilizar miel en un paciente es menos probable que se haga daño al paciente, en comparación
con las demás substancias químicas preparadas por el ser humano. Por el contrario, en la
mayoría de los casos ha probado ser beneficiosa. El problema se presenta cuando se le
atribuyen propiedades que ésta no tiene o se utiliza en formas que no son acordes con sus
características físico/químicas. Lo que sí que no puede discutirse es que es un suplemento
alimenticio y un tonificador excelente.
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Valor Nutritivo
La miel fue un artículo alimenticio de supervivencia para los hombres primitivos. Dado
su valor endulzante, es atractiva para las personas y animales, aun cuando haya que recibir una
que otra picadura durante el proceso de cosecha. Recordemos que durante muchos siglos la miel
de abejas jugó un papel clave como endulzante ya que no se conocía el azúcar de caña o de
remolacha o el jarabe de maíz alto en Fructosa.
Según la FAO/UN, la miel presenta una cantidad energética de 3,04 cal/g , o 1,380
cal/lb.
Entre los factores nutritivos más atractivos de la miel está el hecho de que es un
alimento de alto valor calorífico fácilmente asimilable. Es un producto que en su forma natural e
inalterada está prácticamente predigerido. Muchas personas, conscientes de que mientras más
sana sea su dieta, mayores son las probabilidades de llevar una vida sin problemas de salud, han
comenzado o incrementado su consumo de miel de abejas como parte de una dieta equilibrada.
La miel que más aporta a la salud del ser humano es la miel cruda/no-filtrada (raw/un-
filtered). Las enzimas, vitaminas, proteínas y demás componentes activos de la miel son
sumamente susceptibles al calor. Muchas mieles comerciales son pasteurizadas y filtradas a
presión o ultra-filtradas lo cual destruye muchos de los componentes beneficiosos. Motivos para
calentar la miel son:
(1) el control de la cristalización,
(2) evitar la posibilidad de fermentación,
(3) disminuir la viscosidad.
El filtrar a presión hace la miel más transparente y por lo tanto más agradable a la vista;
no obstante, se le eliminan las partículas de polen y coloides que aportan proteínas.
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Tipos de mieles
Existen tantos tipos de mieles como fuentes de néctar y mielatos existen. Cada tipo
tiene el sabor que le confiere el conjunto de la flora del territorio en el que el colmenar está
instalado; no existe prácticamente miel que provenga únicamente de un solo tipo de flor.
Sin embargo cuando hay especies dominantes suele hablarse de tipo de mieles
específicas o monoflorales, por ejemplo, miel de alfalfa, de eucaliptos, etc. Las mieles pueden
clasificarse por sus plantas de origen con los siguientes criterios básicos: cuando la proporción
de granos de polen de una sola planta presenta más del 50 % del conjunto de polen presente en
la miel, se da a la miel el nombre de esta planta.
Las características principales de algunas mieles más comunes son las que se detallan a
continuación:
-Miel de girasol (Helianthus annuus): tono amarillo oscuro, sabor agradable.
-Miel de lavanda (Lavandula spp): ámbar oro oscuro, sabor excelente, muy
apreciada; cristalización crema de color blanco para el lavandín, menos fina para la miel de
verdadera lavanda, contiene mucha glucosa.
-Miel de alfalfa (Medicago sativa L.): clara azucarada, cristaliza rápidamente en
cristales blancos.
-Miel de meliloto (Melilotus spp): blanca o amarilla verdosa clara; sabor
excelente que recuerda al de la canela o la vainilla.
-Miel de menta (Mentha spp): ámbar, aroma bien definido; cristalización fina; la
parte acuosa es particularmente rica en vitamina C (1,6 mg/Kg).
-La miel de los bosques de las coníferas que proveen de mielato es muy
apreciada. Es fácilmente reconocible por el color oscuro y verdusco que le confieren las algas
microscópicas que contiene.
-Existen mieles de frutos. Una de las más típicas es la miel de dátiles que las
abejas fabrican a partir de azúcar de dátiles puesto a secar al sol en los oasis de África del Norte
y del medio oriente. Esta miel es pardo oscura (casi negra) y de muy buena calidad.
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Clasificación
Por su origen botánico, las mieles se clasifican en miel de flores y miel de mielada:
-La Miel de Flores es la obtenida principalmente de los néctares de las flores.
Se diferencian en Mieles Monoflorales, que es cuando el producto obtenido proviene
principalmente de flores de una misma especie y posee características sensoriales,
físico/químicas y microscópicas propias, y las Mieles Poliflorales o Milflores.
-Las Mieles de Mielada son las obtenidas primordialmente a partir de
secreciones de las partes vivas de las plantas o de excreciones de insectos succionadores de
plantas que se encuentran sobre ellas.
Según el método de obtención, las mieles se clasifican en
-Miel escurrida, es la miel obtenida por el escurrimiento de los panales
desoperculados, sin larvas.
-Miel prensada, es la miel obtenida por el prensado de los panales sin larvas.
-Miel centrifugada, es la miel obtenida por centrifugación de los panales
desoperculados, sin larvas.
-Miel filtrada, es la que ha sido sometida a un proceso de filtración sin alterar su
valor nutritivo.
Según su presentación, las mieles pueden ser:
-Miel en panales o en sección, es la miel almacenada por las abejas en las celdas
operculadas de panales nuevos, construido por ellas mismas que no contengan larvas y
comercializada en panales enteros o secciones de tales panales.
-Mieles con trozos de panales, es la miel que contiene uno o más trozos de
panales, exentos de larvas.
-Miel cristalizada o granulada, es la miel que ha experimentado un proceso de
natural solidificación como consecuencia de la cristalización de la glucosa.
-Miel cremosa, es la miel que tiene una estructura cristalina fina y que puede
haber sido sometida a un proceso físico que le confiere esa estructura y que la haga fácil de
untar.
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Según su destino:
-La miel para consumo directo, es la que responde o cumple ciertos requisitos
ya explicados (color, sabor, consistencia, etc.)
-La miel para ser utilizada por industria como endulzante y/o saborizante, es la
que responde a las características o requisitos previamente explicados, excepto en el índice de
diastasa y el contenido de hidroximetil furfural que podrán ser menor que 8 en la escala de
Gothe y mayor que 40 mg/Kg respectivamente. Sólo podrá ser empleada para la fabricación de
sustancias alimenticias como caramelos de miel, y otros productos que son saborizados y
aromatizados.
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2.2. Datos económicos
2.2.1 A nivel mundial
La miel es un producto al alza, pudiéndose deber al interés de los consumidores por tomar alimentos más sanos, así como la demanda de productos naturales, provenientes de agriculturas ecológicas.
Se estima que en el mercado europeo produce el 13% del total mundial, siendo los principales productores España, Rumania, Grecia, Francia, Hungria, Alemania y Polonia.
La UE representa el 20-25% del consumo mundial de miel, en al año 2007, el consumo de miel alcanzo las 310 mil toneladas
En general, el mercado de la miel es estable, lo que no significa que no esté evolucionando. Por ejemplo la preferencia por miel monofloral se ha incrementado, ya que también se ha incrementado la preocupación por los efectos de los cultivos intensivos, así como del medioambiente en general. Esto ha motivado a la vez el interés por la miel orgánica y de comercio justo.
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Cuadro 2 y 3: Principales exportadores e importadores de miel entre 2006 y 2010.
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El crecimiento promedio anual entre los años 2006 y 2010 ha sido de un 15%; siendo el volumen de comercio de miel de abeja durante el año 2010 de 441 mil toneladas.
En el año 2008 el mercado mundial de la miel fue de 4000 millones de dólares, siendo Europa Occidental el destino de un tercio de las ventas al por menor, seguido por la región de Asia-Pacífico y luego América del Norte.
En términos de consumo per cápita, Suiza es líder con 1,4 kg, seguido por nueva Zelanda y República Checa con 0,7 kg. Los consumidores estadounidenses presentaron un consumo per cápita de 0,2kg.
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2.2.2 La miel en España
A continuación se muestran los datos de producción de miel a nivel del territorio español mediante el censo apícola elaborado por el registro general de explotaciones ganaderas en 2013 y su evolución. Los datos de años anteriores (desde el año 2008 hasta el año 2012) se muestran en el Anejo I.
Cuadro 4: Distribución del número total de explotaciones apícolas por comunidades autónomas
Cuadro 7: Distribución del número total de explotaciones apícolas, mayo 2013
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Cuadro 8: Evolución del número de explotaciones apícolas por comunidades autónomas
Como podemos observar mediante las tablas, se aprecia un ligero incremento del número de explotaciones apícolas, siendo las mayores productoras las comunidades autónomas de Andalucía, Galicia y Castilla y León con un 15% de la producción cada una, así como también un incremento en la producción de miel y ceras, llegando casi a duplicarse la producción de miel y a triplicarse la producción de ceras.
Cuadro 9: Histórico de la producción de miel y cera en España
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Cuadro 10: Evolución de la producción de miel y cera en España
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2.3. Composición de la miel
La composición de una miel va a depender de dos factores principales; (1) de la composición del néctar o néctares de origen y (2) de factores externos. La primera va a depender principalmente de la especie o conglomerado de especies de plantas que producen el néctar. Factores externos, ajenos a la especie apibotánica o factores secundarios son: tipo y química del suelo, clima, manejo apícola y manejo de la miel una vez cosechada por el apicultor. Es sumamente difícil hablar de una muestra promedio o de una composición promedio de miel ya que las variaciones encontradas a través del globo terráqueo son muy amplias.
2.3.1 Composición media de la miel
La miel presenta una serie de compuestos los cuales vamos a describir a continuación
Azúcares, representando un 80% de los componentes totales.
Agua, la cantidad media suele ser de un 18%. Debido a la alta concentración de azúcares, la miel presenta un alto grado de higroscopicidad, por lo que puede captar el agua cuando la humedad relativa sea igual o superior al 60% .
El resto de los componentes de la miel solo alcanza un 2% del total, siendo:
Proteínas: las más importantes son enzimas, mayoritariamente aportadas por la abeja, y de forma minoritaria por la planta.
Las principales enzimas existentes en la miel son:
Invertasa: convierte la Sacarosa del néctar en Glucosa y Fructosa.
Diastasa: hidroliza el almidón a dextrinas o azúcar. La α-amilasa divide las cadenas de almidón produciendo dextrinas y la β- amilasa que separa la Maltosa de los terminales de las cadenas de almidón.
Glucosa oxidasa: transforma la Glucosa en glucolactona, a su vez produce ácido glucónico y peróxido de hidrogeno.
Catalasa: convierte el peróxido de hidrogeno en agua y oxígeno.
Fosfatasa ácida: es una hidrolasa que se encarga de eliminar grupos fosfato de varios tipos de moléculas, es decir, realiza desfosforilaciones.
Sales minerales, ampliamente representadas en la miel aunque su presencia dependerá, como anteriormente comentamos, del origen geográfico y floral de ésta. Es proporcional al color: cuanto más oscura sea la miel, mayor contenido de sales minerales presentará.
Vitaminas, en mayor concentración se encuentran las vitaminas del grupo B y la vitamina C y, en menor concentración las vitaminas A, D y K. Provienen del néctar y del polen, pero se encuentran en muy pequeñas cantidades.
Ácidos, la miel contiene una serie de ácidos, dentro de los cuales se incluyen los aminoácidos (0,05-0,1%) y ácidos orgánicos (0,17-1,17%). La acidez de la miel se encuentra en una escala de pH, entre 3,2 y 4,5 siendo el promedio de 3,9.
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Entre los ácidos orgánicos presentes en la miel, se incluye: acético, butírico, cítrico, fórmico, glucónico y láctico. El ácido más común presente es el ácido glucónico, asociado fuertemente al contenido de glucosa, ya que la enzima glucosa-oxidasa convierte la glucosa en ácido glucónico. También se forma durante este proceso peróxido de hidrógeno, uno de los responsables de las propiedades antibacterianas de la miel.
La consecuencia más significativa del pH tan bajo es la estabilización contra microorganismos. Además, los ácidos orgánicos interactúan con otros sabores.
2.3.2. Viscosidad de la miel
La miel se comporta como un líquido newtoniano, es decir que la viscosidad es independiente de la velocidad de deformación.
La viscosidad es la propiedad de los fluidos que se caracteriza por su resistencia a fluir, debida al rozamiento entre sus moléculas. En el sistema internacional se mide en Pascales por segundo, pero la unidad más utilizada son los centipoise (cps). La miel presenta una viscosidad aproximada de 10.000 cps medida a temperatura ambiente (normalizada a 21 ºC).
Cuadro 11: Viscosidades aproximadas de productos comunes.
La viscosidad de la miel es sumamente importante cuando hablamos de bombear miel por un tubo o una manga. Mientras más viscosa la miel, más grande tiene que ser el tubo o hay que aumentar la temperatura de la miel para que ésta sea menos viscosa o utilizar una bomba de mayor capacidad y menor velocidad. Sin embargo, desde el punto de mantener la calidad de la miel, es preferible aumentar el tamaño del tubo o aumentar la capacidad de la bomba antes que aumentar la temperatura. Si hay que calentar la miel hay que tener la precaución de evitar calentarla más arriba de los 43.33°C (110°F). De lo contrario se afectará el color, el sabor y algunos componentes importantes como las enzimas.
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2.3.3. Cristalización de la miel
La cristalización de la miel se debe principalmente a la cantidad existente de glucosa en proporción a la cantidad de Fructosa. La granulación se debe a la cristalización de la Glucosa debido a su estado sobresaturado. La Glucosa se separa ya que es menos soluble que la Fructosa, dando origen a hidratos de Glucosa en forma sólida. Puede ayudar a la granulación la presencia de impurezas, como granos de polen, burbujas de aire y polvo o pequeñas moléculas de cera creando núcleos de granulación originando los cristales.
Que aparezcan cristales en la miel no es indicador de una calidad inferior, aunque de cara al consumidor éste prefiera una miel limpia y sin presencia de cristales, prefiriendo éstos una miel de textura fina sin moléculas groseras.
Mediante el estudio de la proporción de glucosa, fructosa y agua podemos predecir la posible cristalización de la miel. Para ello se han propuesto diferentes índices en los que se relaciona la cantidad de Glucosa (g), Fructosa (f) y agua total presente (a) o disponibles (actividad de agua, aw) de una miel:
(Fuente Consejería de Agricultura y Alimentación de La Rioja)
Siendo I2 = (glucosa/agua)/(1-aw)n
Análisis Criterio
observación 0= no hay cristales
2=muy pocos cristales
6=semi cristalino
9=completamente cristalino
glucosa/agua g/a<1,70 no hay granulación g/a>2,20 rápida granulación
fructosa/glucosa f/g>1,22 no hay granulación
f/g<1,15 rápida granulación
(glucosa‐agua)/fructosa (g‐a)/f<0,36 no hay granulación
(g‐a)/f>0,42 rápida granulación
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2.3.4 Azúcares en la miel
Cómo hemos señalado, la miel está compuesta mayormente por azúcares, aproximadamente un 77-80%, y son estos los que imparten a la miel sus características principales como viscosidad, higroscopicidad, granulación, valor energético, propiedades térmicas, poder rotatorio etc… Además, junto con otras sustancias como ácidos, compuestos nitrogenados y minerales, contribuyen en el sabor de la miel.
-Monosacáridos, disacáridos y oligosacáridos
En casi todas las muestras de miel, la Fructosa (levulosa) es el azúcar predominante estando en mayor concentración con un 38 % por término medio, mientras que la glucosa (dextrosa) presenta un porcentaje medio de un 31%. Aunque factible, es muy rara la muestra en la cual la dextrosa es el azúcar principal. El valor medio de la relación Fructosa/Glucosa es 1,2:1, el cual va a variar dependiendo del tipo de miel. Estos dos azúcares juntos contabilizan el 85-95% de los carbohidratos de la miel. Existen unos doce o trece disacáridos adicionales pero éstos contribuyen en un porcentaje muy bajo del total.
La composición en azúcares es útil para valorar el grado de pureza. En un principio se pensó que la fracción de azúcares en la miel estaba compuesta básicamente por Glucosa y Fructosa, con algo de Sacarosa y dextrinas en cantidades menores. Sin embargo, los nuevos métodos de análisis y separación de azúcares han puesto en evidencia la presencia de más de treinta azucares diferentes. White, (1975), Huidobro y Simal (1985).
Moreira y De María (2001) han descrito los siguientes di- y tri-sacáridos, aunque algunos de ellos solo están presentes a nivel de trazas y en unas pocas muestras y otros no han podido ser aun confirmados:
NOMENCLATURA TRIVIAL NOMENCLATURA SISTEMATICA
DISACARIDOS
Celobiosa 2 O-β-D glicopiranosil (1-4) D-glicopiranosa
Gentiobiosa 2 O-β-D glicopiranosil (1-6) D-glicopiranosa
Isomaltosa 2 O-α-D glicopiranosil (1-6) D-glicopiranosa
Isolamtulosa 4 O-α-D glicopiranosil (1-6) D-fructofuranosa
Kojibiosa 1 O-α-D glicopiranosil (1-2) D-glicopiranosa
Laminaribiosa 3 O-β-D glicopiranosil (1-3) D- glicopiranosa
Leucrosa 4 O-α-D glicopiranosil (1-5) D- fructofuranosa
Maltosa 1 O-α-D glicopiranosil (1-4) D- glicopiranosa Maltulosa 2 O-α-D glicopiranosil (1-4) D- fructosa Melobiosa 4 O-α-D galactopiranosil (1-6) D-glicopiranosa Neotrehalosa 3 O-α-D glicopiranosil β-D glicopiranosido Nigerosa 2 O-α-D glicopiranosil (1-3) D-glicopiranosa Palatinosa 2 O-α-D glicopiranosil (1-6) D- fructosa Sacarosa 1 O-α-D glicopiranosil β-D fructofuranosido Turanosa 1 O-α-D glicopiranosil (1-3) D- fructosa
Cuadro 12: Principales disacáridos existentes en la miel
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TRISACARIDOS Centosa 4 O-α-D glicopiranosil(1-4)-O-α-D glicopiranosil(1-2)D-
glicopiranosa 1-cestosa 4 O-α-D glicopiranosil(1-2)-β-D-frucofuranosil (1-2)-β-D
fructofuranosido Erlosa 1 O-α-D glicopiranosil(1-4)-α-D glicopiranosil-β-D fructofuranosido4-α-gentiobiosiglicosa 4 O-β-D glicopiranosil(1-6)-O-α-D glicopiranosil(1-4)D-
glicopiranosa 3-α-isomaltosilglicosa 4 O-α-D glicopiranosil(1-6)-O-α-D glicopiranosil(1-3)D-
glicopiranosa Isomaltotriosa 2 O-α-D glicopiranosil(1-6)-O-α-D glicopiranosil(1-6)D-
glicopiranosa Isopanosa 2 O-α-D glicopiranosil(1-4)-O-α-D glicopiranosil(1-6)D-
glicopiranosa Laminaritriosa 4 O-α-D glicopiranosil(1-3)-O-β-D glicopiranosil(1-3)D-
glicopiranosa Maltotriosa 2 O-α-D glicopiranosil(1-4)-O-α-D glicopiranosil(1-4)D-
glicopiranosa Melizitosa 2 O-α-D glicopiranosil(1-3)-O-β-D fructofuranosil(2-1)α-D-
glicopiranosido Panosa 2 O-α-D glicopiranosil(1-6)-O-α-D glicopiranosil(1-4)D-
glicopiranosa Rafinosa 2 O-α-D galactopiranosil(1-6)-O-α-D glicopiranosil β-D-
fructofuranosido Teanderosa 2 O-α-D glicopiranosil(1-6)-α-D glicopiranosil β-D-fructofuranosido1Mayoritarios 2Minoritarios 3Trazas 4 No confirmados Cuadro 13: Principales trisacáridos existentes en la miel
32
2.4. Métodos de determinación de azúcares en la miel
Actualmente entre los métodos más usados para la determinación de los azúcares en la miel destacan la refractometría, la determinación química de azúcares reductores totales, los métodos enzimáticos y la cromatografía liquida de alta resolución (HPLC).
2.4.1. Refractometría
Es una técnica óptica basada en el índice de refracción, de la cual obtenemos información sobre la materia seca presente en la miel, y nos proporciona una aproximación del azúcar total presente. Se mide en grados Brix (ºBx), estimando el cociente total de azúcar disuelto en el líquido. Es el método más sencillo, rápido y barato para hacer una estimación aproximada de la cantidad de azúcar total presente en la miel, aunque tiene sus limitaciones de exactitud.
Imagen 2: Refractómetro
2.4.2 Determinación química de azúcares totales
Se basa en el método de Lane-Eynon, el cual consiste en reducir el complejo de cobre de un volumen dado del reactivo de Fehling en ebullición, mediante la adición de la muestra diluida de miel, usando azul de metileno como indicador.
En soluciones alcalinas, la glucosa, la fructosa y otros azúcares reductores tienen la propiedad de oxidarse a sus respectivos ácidos carboxílicos, reduciendo el cobre en estado cúprico (Cu+2) a óxido cuproso (Cu+1). El método volumétrico de Lane y Eynon calcula el volumen de una solución de prueba que se requiere para precipitar todo el cobre presente en una cierta cantidad de solución de Fehling de concentración conocida.
La oxidación puede ocurrir tanto en ambiente básico ccomo en ambiente ácido. Una oxidación suave de la aldosa produce el correspondiente acido carboxílico llamado ácido glucónico, una oxidación muy enérgica produce el ácido dicarboxílico llamado ácido glucárico.
El reactivo de Fehling produce la oxidación alcalina de aldosas y de cetosas que van a transformarse en ácido glucónico. Está compuesto de dos soluciones A y B que deben mezclarse al momento de su uso. La solución A contiene CuSO4. La solución B contiene tartrato de sodio en NaOH. El tartrato tiene la función de complejar al Cu2+ produciendo coloración azul. La especie oxidante es el Cu2+ que se reduce a Cu+ precipitando como óxido de cobre Cu2O rojo.
33
La oxidación total de los monosacáridos tiene lugar por la intercepción de la forma de cadena abierta presente en el equilibrio hemiacetal del aldehído-cetona, aunque en cualquier momento sólo hay una cantidad pequeña de la forma de la cadena abierta, esa cantidad se reduce y continúa hasta que toda la muestra ha experimentado la reacción.
2.4.3. Métodos enzimáticos
Los métodos enzimáticos han sido recomendados como técnica rutinaria y de investigación en la miel por su especificidad y fácil y rápido manejo de la muestra. Existen en el mercado kits ya preparados para realizar la determinación enzimática, como por ejemplo el kit de la empresa Boehringer.
Determinación de D-glucosa
La enzima hexokinasa cataliza a pH 7,6 la fosforilación de D-glucosa con adenosin-5-trifosfato con formación simultanea de adenosin-5-difosfato. La Glucosa 6-fosfato formada se oxida a partir de la Nicotinamida Adenin-Dinucleótido-Fosfato en presencia de Glucosa 6-Fosfato-deshidrogenasa a gluconato-6-fosfato formándose Nicotinamida Adenina Dinucleótido Fosfato reducido.
D-glucosa + ATP HK G-6-P + ADP
G-6-P + NADP+ G6P-DH D-gluconato-6-fosfato + NADPH +H+
La cantidad de NADPH formada en la reacción equivale a la cantidad de D-glucosa, y se determina por su absorción a longitudes de onda de 334, 340 ó 365 nm.
Determinación de fructosa
La hexokinasa también cataliza la fosforilación de la D-fructosa con ATP a fructosa-6-fosfato
Mas tarde, esta fructosa-6-fosfato se convierte em glucosa-6-fosfato mediante la fosfoglucosaisomerasa
D-fructosa + AT HK F-6-P +ADP
F-6-P PGI G-6-P
La G-6-P reacciona con NADP formándose gluconato-6-fosfato y NADPH. Aquí también el parámetro a medir es el NADPH, la cantidad formada es equivalente a la cantidad de fructosa.
Determinación de sacarosa (inversión enzimática)
La sacarosa se hidroliza mediante la enzima β-fructosidasa, una invertasa, a D-glucosa y D-fructosa
Sacarosa + H2O β-FRUCTOSIDASA D-glucosa + D-fructosa
De la diferencia de concentraciones de D-glucosa antes y después de la inversión enzimática, se calcula la cantidad de sacarosa.
34
2.4.4. Métodos cromatográficos (HPLC)
Es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla. Consiste en una fase estacionaria no polar (columna) y una fase móvil
Los azucares (pKa 12-13) se comportan como ácidos débiles a pH elevado (12-14) y son parcial o totalmente ionizados. De este modo se pueden separar por un mecanismo de intercambio iónico. Es necesario utilizar una columna de película resinosa no porosa, de alto cambio iónico, con las siguientes propiedades:
-Rápida transferencia de masa y difusión
-Elevada estabilidad a variaciones de pH
-Buena estabilidad mecánica (4000 psi )
Imagen 3: Esquema y principales equipamientos en un cromatógrafo liquido de alta resolución La identificación de los componentes se realiza midiendo los tiempos de retención, y la cuantificación se realiza según el método del estándar externo a través de las áreas de los picos o bien la altura de los mismos.
Este es el método de determinación de azúcares más preciso y fiable, pudiendo utilizarse tanto para la cuantificación de azúcares mayoritarios como para la detección de azúcares minoritarios. De hecho, es el método más utilizado en la literatura científica reciente dedicada al análisis y caracterización de mieles. (León – Ruiz et al., 2011; Sporns, 1992; Ciulu, 2011; Primorac, 2011; Ouchemoukh, 2009; Foldhazi, 1994).
Sólo aproximadamente 20% de los compuestos conocidos permiten ser analizados por cromatografía de gases, ya sea porque no son suficientemente volátiles y no pasan a través de la
35
columna, o porque son térmicamente inestables y se descomponen en las condiciones de separación. HPLC no está limitada por la volatilidad o la estabilidad térmica de la muestra.
La HPLC permite muy buenas separaciones e identificaciones de sustancias o grupos de sustancias en un tiempo corto, tanto cualitativa como cuantitativamente. Como condición, es imprescindible que la muestra sea soluble en un disolvente al ser la fase móvil un líquido. La cromatografía líquida de alta resolución tiene ventajas en el análisis de los azúcares debido a su gran solubilidad en agua y su idoneidad para la separación de especies no volátiles o termolábiles. Es la técnica analítica de separación más ampliamente utilizada debido a sus cualidades de sensibilidad, velocidad, reproducibilidad separación, y la exactitud de los resultados, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su gran adaptabilidad a sustancias que son de gran interés para la industria, la ciencia y la sociedad,
2.4.5. Espectroscopía infrarroja (IR)
Esta espectroscopia se fundamenta en la absorción de la radiación IR por las moléculas en vibración. Una molécula absorberá la energía de un haz de luz infrarroja cuando dicha energía incidente sea igual a la necesaria para que se dé una transición vibracional de la molécula. Es decir, la molécula comienza a vibrar de una determinada manera gracias a la energía que se le suministra mediante luz infrarroja.
Pueden distinguirse dos categorías básicas de vibraciones: de tensión y de flexión. Las vibraciones de tensión son cambios en la distancia interatómica a lo largo del eje del enlace entre dos átomos. Las vibraciones de flexión están originadas por cambios en el ángulo que forman dos enlaces. En principio, cada molécula presenta un espectro IR característico (huella dactilar), debido a que todas las moléculas (excepto las especies diatómicas homonucleares como O2 y Br2) tienen algunas vibraciones que, al activarse, provocan la absorción de una determinada longitud de onda en la zona del espectro electromagnético correspondiente al infrarrojo.
De esta forma, analizando cuales son las longitudes de onda que absorbe una sustancia en la zona del infrarrojo, podemos obtener información acerca de las moléculas que componen dicha sustancia.
La espectroscopia infrarroja tiene su aplicación más inmediata en el análisis cualitativo y se ha empleado en la detección de distintos compuestos en alimentos
36
Imagen 4: Analizador de infrarrojos Milkoscan, Foss Instruments, DK
2.4.6. Comparación de HPLC con espectroscopía IR
A pesar de su exactitud, el método HPLC, presenta una serie de inconvenientes, tales como:
-elevado coste del equipo
-manejo complejo y necesidad de alto grado de formación del analista
-necesidad de realizar numerosas diluciones para la preparación de las muestras, con el consiguiente acúmulo de error.
-duración del ensayo ya que cada carrera en el cromatógrafo son 70 minutos, mientras que empleando el método de infrarrojos obtenemos resultados en 5 minutos.
Por ello, para los análisis rutinarios resultaría conveniente la utilización de un sistema más sencillo y asequible. Los equipos Milkoscan/Foss vienen siendo utilizados en el análisis de rutina de distintos alimentos (leche, vino, zumos…) por su sencillez de manejo y la rapidez en la obtención de datos. Su adecuación al análisis de azúcares en miel puede ser una alternativa a los problemas planteados por la Cromatografía Líquida de Alta Resolución.
37
OBJETIVOS
38
39
3. OBJETIVOS
1.-Establecer la viabilidad de la aplicación de métodos estandarizados de análisis químico de alimentos por Espectrometría Infrarroja (Milkoscan/Foss) en la determinación de la composición de azúcares en la miel.
2.-Comparar los resultados obtenidos en la determinación de la composición de azúcares en miel con Espectrofotometría Infrarroja con la composición hallada con el método cromatográfico HPLC.
3.-Determinar si es factible la utilización del equipo Milkoscan/Foss en el análisis de la composición de azúcares en miel.
40
41
MATERIALES Y METODOS
42
43
4. MATERIALES Y MÉTODOS
4.1. Muestras
Hemos usado 58 muestras en este estudio, 26 obtenidas directamente de los apicultores de la zona y las restantes 32 han sido muestras comerciales obtenidas de los supermercados.
Las muestras de apicultores fueron traídas de regiones del centro de Portugal durante dos años consecutivos. Esas muestras fueron guardadas con temperatura controlada de 15º C
El origen botánico de las 26 muestras obtenidas de los apicultores fue estudiado de acuerdo a Louveaux et al. (1978), procediendo a afirmar que son mieles multiflorales con un importante porcentaje de polen de Romero, aunque no suficiente como para considerarse miel monofloral.
Las otras 32 mieles comerciales portuguesas fueron identificadas con la referencia de la etiqueta como:
-algarroba (3 muestras);
-eucalipto (5);
-girasol;
-naranja (2);
-multifloral (6);
-madroño;
-romero (6);
-romero y brezo;
-tomillo;
-tomillo y romero;
-brezo (5)
44
4.2. Método analítico mediante HPLC
Se utilizó un Cromatógrafo Líquido de Alta Resolución, el cromatógrafo Dionex ICS 3000, con detector electromecánico IPAD (Detector Integrado de Pulso Amperométrico).
La columna analítica utilizada fue una columna de acero inoxidable de diámetro 4,6 mm y longitud 250 mm, conteniendo gel de sílice modificado con grupos aminos, con tamaño de partícula de 5 micras. Concretamente, se utilizó la columna CarboPac PA20 de 3x150 mm con dos precolumnas AminoTrap 3x30 mm y CarboPac PA20 2x30 mm.
Las condiciones cromatográficas utilizadas fueron:
Flujo: 0,5 mL/min
Volumen de eluyente inyectado: 500µL
Temperatura de la columna: 30 ºC
Temperatura del detector: 30 ºC
Tiempo de carrera: 35 minutos
Tiempo de regeneración: 40 minutos
Los eluyentes (solución de NaOH) son dos:
-Fase A, de regeneración 200mM de NaOH
-Fase B, fase móvil 15mM de NaOH
El volumen de muestra inyectado fue de 10 µL
Imagen 5: Cromatógrafo Dionex ICS 3000 empleado en el ensayo
Preparación de las soluciones estándar
Se obtuvieron curvas de calibración inyectando soluciones estándar de azúcares, midiendo la altura de los picos obtenidos (absorbancia). Las curvas se ajustaron por análisis de regresión de mínimos cuadrados.
45
Se utilizaron soluciones estándar de glucosa, fructosa, sacarosa, maltosa, turanosa, trehalosa y melezitosa para identificar y cuantificar individualmente los componentes azucarados de las muestras de miel. El método fue adaptado por Bognanov, (1997).
Imagen 6 y 7: Microjeringa y útiles para la preparación de disoluciones empleados en los
ensayos
P0 P1 P2 P3 P4 P5
Solução Mãe Mix Padrões
Vi (mL)
1 1 2,5 2,5 1 2,5
Padrão m (g) Pureza (%)
Conc (mg/ml) Vi (mL) Vf (mL)
Conc. (ppm)
Vf (mL)
200 100 100 50 10 10
Glucose 0,10057 99,7 1,0027 1 50 20,054 0,10027 0,20054 0,50134 1,00268 2,00537 5,01341
Sacarose 0,10083 100 1,0083 1 50 20,166 0,10083 0,20166 0,50415 1,00830 2,01660 5,04150
Frutose 0,10084 100 1,0084 1 50 20,168 0,10084 0,20168 0,50420 1,00840 2,01680 5,04200
Turanose 0,1002 99,5 0,9970 1 50 19,940 0,09970 0,19940 0,49850 0,99699 1,99398 4,98495
Maltose 0,10037 99,7 1,0007 1 50 20,014 0,10007 0,20014 0,50034 1,00069 2,00138 5,00344
Trehalose 0,10067 100 1,0067 1 50 20,134 0,10067 0,20134 0,50335 1,00670 2,01340 5,03350
Melezitose 0,10031 99,7 1,0001 1 50 20,002 0,10001 0,20002 0,50005 1,00009 2,00018 5,00045
Estándares químicos usados (pureza, proveedor y número de referencia)
Analyte CAS number Supplier Purity (%) Water (%)
Trehalose 6138-23-4 Sigma-Aldrich 100 10
Fructose 57-48-7 Sigma-Aldrich 100 --
Glucose 50-99-7 Sigma-Aldrich 99.7 --
Sucrose 57-50-1 Sigma-Aldrich 100 --
Melezitose 207511-10-2 Sigma-Aldrich 100 4
Turanose 547-25-1 Sigma-Aldrich 99.5 --
Maltose 6363-53-7 Sigma-Aldrich 99 5
El agua utilizada fue agua ultrapura obtenida mediante sistema SG Ultra Clear TWF
46
Preparación de los eluyentes (fases A y B)
Para la fase A: diluimos 21 mL de NaOH al 50% en 2 litros de agua
Para la fase B: diluimos 1,6 mL de NaOH al 50% en 2 litros de agua
Una vez preparadas las disoluciones, debemos filtrar las posibles impurezas que obstruyan los conductos del cromatógrafo por lo tanto se utiliza una bomba de vacio (-14 bares) y además se introducen en un baño de ultrasonidos para eliminar las posibles burbujas.
Imagen 8 : Preparación de eluyente Imagen 9 :Eliminación de burbujas de los eluyentes Los eluyentes se utilizaron inicialmente en una proporción de 80% de B y 20% de A. Se realizaron pruebas y los tiempos de retención no concordaban con los patrones por lo que se modificaron un poco las proporciones, siendo para el B un 83% y para A un 17%.
Para la preparación de las muestras:
El procedimiento fue el siguiente:
-Pesamos 1g de muestra de miel con un error de ±0,0001 g y disolvemos en 500 mililitros de agua ultrapura.
-Un mililitro de esta disolución se lleva a un volumen de 200 ml también con agua ultrapura.
-Esta muestra se filtra mediante una jeringa y un filtro GHP Acrodisk de 0,2 micras.
-Las muestras se incorporan al revolver de muestreo del cromatógrafo y se comienza el análisis, con el programa Chromeleon.
47
4.3 Milkoscan / FOSS
El equipo se encontraba calibrado mediante un programa predefinido para mieles y zumo, por lo que se procedió directamente al análisis de las muestras de miel.
Metodología
Pesamos cinco gramos de muestra de miel previamente homogeneizada, rigurosamente con un error de ±0,001 g, y disolvemos en un matraz de 50 mL.
Las muestras se introducen directamente, a través de una malla metálica a modo de filtro de posibles impurezas, a un vaso para poder introducir los sensores del aparato.
Cada cinco muestras, por duplicado, se realiza una limpieza del sensor con agua ultrapura.
La solución es determinada en el Milkoscan FT120 usando el programa predefinido “calibración de miel y zumo”
4.4 Análisis estadístico
En cuanto al análisis estadístico, se realizaron cálculos sencillos como trabajo con tablas, medias y desviaciones, mediante el programa de cálculo Excell versión 2003.
48
49
RESULTADOS
50
51
5. RESULTADOS
5.1. Composición de azúcares obtenida mediante HPLC
5.1.1. Calibración del equipo
Se obtuvieron curvas de calibración inyectando soluciones estándar de azúcares, midiendo la altura de los picos obtenidos (absorbancia). Las curvas se ajustaron por análisis de regresión de mínimos cuadrados.
0,00
1,25
2,50
4,50
0,00 1,25 2,50 4,50
Turanose External ED_1Area [nC*min]
ug/mL
0,00
2,50
5,00
8,00
0,00 1,25 2,50 4,50
Melzitose External ED_1Area [nC*min]
ug/mL
0,00
2,50
5,00
8,00
0,00 1,25 2,50 4,50
Trehalose External ED_1Area [nC*min]
ug/mL0,0
5,0
10,0
16,0
0,00 1,25 2,50 4,50
Glucose External ED_1Area [nC*min]
ug/mL
0,0
5,0
10,0
16,0
0,00 1,25 2,50 4,50
Frutose External ED_1Area [nC*min]
ug/mL0,00
2,00
4,00
7,00
0,00 1,25 2,50 4,50
Sacarose External ED_1Area [nC*min]
ug/mL
0,00
2,00
4,00
7,00
0,00 1,25 2,50 4,50
Maltose External ED_1Area [nC*min]
ug/mL
52
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,2-5,0
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0 MEL 20130617 #7 P2 ED_1nC
min
1 -
Tre
ha
los
e -
1,9
17
2 -
Glu
co
se
- 3
,90
03
- F
ruto
se
- 4
,35
04
- S
ac
aro
se
- 5
,10
05
- 5
,76
76
- M
ele
zito
se
- 7
,28
4
7 -
Tu
ran
os
e -
9,2
34
8 -
Ma
lto
se
- 1
5,7
84
9 -
28
,35
0
10
- 3
4,1
67
11
- 3
4,6
00
12
- 3
6,3
67
Cuadro 14: Cromatograma tipo obtenido de la solución patrón de azúcar P2 .
Una vez obtenidas las rectas de calibración con los azúcares estándar individuales, se procedió a obtener el cromatograma de una mezcla patrón de azúcares, obteniendo cromatogramas tipo como el que muestra el Cuadro 14.
Tras analizar los cromatogramas obtenidos, se pudo establecer los tiempos de retención da cada uno de los azúcares y las características de los picos que los detectan. Así se obtuvieron los datos que se recogen en la Tabla 1.
No. Time Peak Name Width Height Resol. Resol. Plates Plates Asymmetry
min min nC (USP) (EP) (USP) (EP)
1 1,917 Trehalose 0,221 4,611 8,354 8,531 1209 1276 1,324
2 3,900 Glucose 0,254 9,184 1,684 1,709 3763 3848 n.a.
3 4,350 Frutose 0,280 7,982 2,509 2,542 3862 3962 n.a.
4 5,100 Sacarose 0,318 2,878 2,171 2,209 4120 4188 1,038
5 5,767 n.a. 0,296 0,373 4,300 4,344 6060 6326 1,055
6 7,284 Melezitose 0,409 2,520 4,361 4,444 5070 5046 1,105
7 9,234 Turanose 0,485 1,163 10,779 10,817 5795 6178 1,063
8 15,784 Maltose 0,730 1,357 9,371 7,735 7476 7194 1,048
9 28,350 n.a. 1,952 15,282 n.a. n.a. 3375 2036 n.a.
10 34,167 n.a. n.a. 0,083 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
11 34,600 n.a. 0,638 0,240 3,963 3,845 47108 42797 0,978
12 36,367 n.a. 0,254 9,907 n.a. n.a. 327995 332255 2,270
AVERAGE: 0,531 4,632 5,277 5,131 37.803, 37.737, 1,235
Tabla 1. Relación de tiempos de retención, área de picos de la solución patrón de azúcar P2.
5.1.2. Análisis de muestras de miel
53
El siguiente cuadro (Cuadro 15) muestra el cromatograma que se obtiene al analizar los azúcares de una muestra de miel. El análisis de los picos obtenidos y su comparación con los resultados de los cromatogramas empleados en la estandarización previa, permitió determinar y cuantificar los azúcares presentes en cada muestra. La Tabla 2 recoge los resultados correspondientes al cromatograma de la miel del Cuadro 15.
0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,2-20
0
13
25
38
50
63
75
88
100
120 MEL 20130408 #18 [modified by geral.lab] 1200493 ED_1nC
min
1 - T
rehalo
se - 1
,850
2 - 2
,784
3 - G
lucose - 3
,917
4 - F
ruto
se - 4
,350
5 - S
acaro
se - 5
,100
6 - 6
,117
7 - 6
,367
8 - M
elz
itose - 7
,150
9 - 7
,450
10 - T
ura
nose - 9
,250
11 - 1
2,0
84
12 - 1
3,2
50
13 - 1
4,5
67
14 - M
altose - 1
5,8
17
15 - 2
6,2
17 1
6 - 2
8,0
67
17 - 3
4,5
17
18 - 3
5,0
84
Log p
H.V
alu
e
Cuadro 15: Cromatograma tipo para una muestra de miel.
No. Ret.Time Peak Name Cal.Type Points Offset Slope Curve R-Square Std.Dev. LQ
min (C0) (C1) (C2) %
1 1,85 Trehalose LOff 12 0,012 1,939 0,000 99,998 0,013 0,132
3 3,92 Glucose LOff 12 0,054 3,885 0,000 99,993 0,048 0,484
4 4,35 Frutose LOff 12 0,065 3,784 0,000 99,990 0,058 0,580
5 5,10 Sacarose LOff 12 0,010 1,577 0,000 99,996 0,015 0,149
8 7,15 Melzitose LOff 12 -0,003 1,674 0,000 99,996 0,016 0,157
10 9,25 Turanose LOff 12 -0,015 0,968 0,000 99,996 0,010 0,095
14 15,82 Maltose LOff 12 -0,018 1,725 0,000 99,998 0,011 0,108
Tabla 2: Relación de tiempos de retención, área de picos de una muestra de miel.
Los tiempos de retención de los picos obtenidos en cada cromatograma de las muestras de miel analizadas se recogen en el Anexo II. Con ellos, y utilizando los resultados obtenidos en la estandarización de azúcares (apartado 5.1.1) pudo determinarse la composición en azúcares
54
de las muestras de miel analizadas. Los resultados obtenidos, expresados en porcentaje, se recogen en la Tabla 3.
Las muestras se analizaron por duplicado para obtener un resultado más fiable. Se puede observar la repetibilidad de los resultados para todos los azucares analizados.
55
TREHALOSA GLUCOSA FRUCTOSA SACAROSA MELZITOSA TURANOSA
MALTOSA TOTAL F/G
1200488 n.a. 25,693 37,688 1,029 3,151 2,232 2,029 71,823 1,467 1200488d n.a. 25,580 37,650 1,041 3,248 2,251 1,948 71,717 1,472 1200498 0,012 25,794 33,758 0,831 1,454 2,418 1,734 65,989 1,309
1200498d 0,005 25,819 34,037 0,843 1,529 2,445 1,622 66,295 1,318 1200480 n.a. 26,432 38,206 0,521 1,474 2,126 0,885 69,644 1,445
1200480d n.a. 26,746 38,608 0,510 1,459 2,094 1,017 70,435 1,444 1200495 n.a. 23,482 34,888 0,677 2,488 2,683 1,374 65,592 1,486
1200495d n.a. 23,481 34,840 0,655 2,498 2,709 1,399 65,581 1,484 1200496 n.a. 30,358 35,019 0,650 1,059 2,434 1,340 70,860 1,154
1200496d n.a. 30,125 35,192 0,705 1,074 2,445 1,302 70,843 1,168 1200476 n.a. 26,822 38,397 0,599 1,073 2,097 1,792 70,781 1,432
1200476d n.a. 26,894 38,622 0,621 1,291 2,105 1,844 71,377 1,436 1200494 n.a. 23,242 34,441 0,608 2,462 2,652 1,234 64,639 1,482
1200494d n.a. 23,253 34,525 0,616 2,422 2,676 1,280 64,772 1,485 1200492 n.a. 25,063 36,603 <0,400 1,357 2,010 1,559 66,592 1,460
1200492d n.a. 25,008 36,536 <0,400 1,132 2,021 1,568 66,265 1,461 1200487 n.a. 31,083 45,176 <0,400 0,914 2,432 2,143 81,748 1,453
1200487d n.a. 31,110 45,260 <0,400 0,911 2,431 2,101 81,813 1,455 1200497 n.a. 27,839 37,364 0,520 1,791 2,616 1,435 71,564 1,342
1200497d n.a. 27,872 37,228 0,561 1,758 2,612 1,412 71,442 1,336 1200483 n.a. 26,351 38,074 <0,400 1,742 1,931 1,959 70,057 1,445
1200483d n.a. 26,281 38,065 <0,400 1,757 1,948 1,934 69,986 1,448 1200490 n.a. 24,301 37,174 <0,400 1,521 2,708 1,157 66,861 1,530
1200490d n.a. 24,204 36,996 <0,400 1,504 2,519 1,154 66,377 1,529 1200499 0,025 25,866 33,294 <0,400 2,090 2,421 1,676 65,345 1,287
1200499d 0,024 25,938 33,426 <0,400 2,108 2,448 1,681 65,602 1,289 1200486 n.a. 25,172 37,717 <0,400 1,717 2,164 2,283 69,052 1,498
1200486d n.a. 25,533 38,286 <0,400 1,810 2,164 2,294 70,087 1,499 1200489 n.a. 25,723 36,664 <0,400 3,141 2,196 1,793 69,516 1,425
1200489d n.a. 25,690 36,823 <0,400 3,079 2,218 1,772 69,581 1,433
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TREHALOSA GLUCOSA FRUCTOSA SACAROSA MELZITOSA TURANOSA
MALTOSA TOTAL F/G 1200500 n.a. 26,145 38,672 <0,400 1,821 2,326 1,454 70,418 1,479
1200500d n.a. 26,494 38,802 <0,400 1,827 2,345 1,468 70,936 1,465 1200501 n.a. 18,353 44,149 <0,400 1,596 2,225 2,057 68,380 2,405
1200501d n.a. 18,502 44,601 <0,400 1,568 2,235 2,021 68,927 2,411 1200493 0,072 25,694 38,299 0,491 1,363 2,311 1,899 70,057 1,491
1200493d 0,072 25,680 38,383 0,482 1,358 2,206 1,862 69,972 1,495 1200491 n.a. 24,563 37,963 0,748 1,546 2,782 1,155 68,757 1,546
1200491d n.a. 24,453 38,059 0,807 1,586 2,575 1,087 68,568 1,556 L24 n.a. 23,516 37,218 1,125 2,670 3,759 2,001 70,289 1,583
L24d n.a. 23,767 37,655 1,086 2,692 3,821 1,954 70,974 1,584 1200482 n.a. 26,216 39,195 0,767 1,057 2,585 2,625 72,444 1,495
1200482d 0,007 26,200 39,171 0,736 1,070 2,596 2,498 72,271 1,495 1200485 0,145 27,067 37,308 0,695 1,788 2,693 1,404 70,955 1,378
1200485d 0,142 27,040 37,568 0,671 1,855 2,720 1,381 71,236 1,389 1200479 0,040 27,209 40,108 1,196 1,037 2,170 3,041 74,761 1,474
1200479d 0,022 27,374 40,184 1,408 1,049 2,166 3,043 75,225 1,468 1200477 0,039 28,874 39,326 0,809 1,244 2,345 2,200 74,798 1,362
1200477d 0,037 28,753 39,531 0,797 1,186 2,349 1,990 74,605 1,375 1200481 n.a. 24,267 40,743 0,716 1,749 2,508 0,693 70,675 1,679
1200481d n.a. 24,263 40,665 0,833 1,757 2,505 0,807 70,831 1,676 R6 n.a. 21,660 38,686 1,079 2,787 3,589 1,117 68,918 1,786
R6d n.a. 21,713 38,633 1,120 2,841 3,541 1,263 69,111 1,779 1200478 0,028 27,517 40,597 1,163 0,919 2,352 1,810 74,358 1,475
1200478d 0,032 27,482 40,444 1,235 0,938 2,347 1,974 74,419 1,472 L4 0,033 23,425 35,387 1,037 3,552 3,371 1,240 68,012 1,511
L4d 0,034 23,470 35,358 1,028 3,527 3,350 1,171 67,904 1,507 L14 n.a. 29,611 38,603 1,016 1,513 2,687 0,553 73,982 1,304
L14d n.a. 29,643 38,636 0,833 1,534 2,784 0,539 73,969 1,303 I5 0,013 26,559 41,723 1,089 0,717 2,264 2,708 75,060 1,571
I5d 0,013 26,536 41,677 1,141 0,700 2,251 2,939 75,244 1,571 M2 n.a. 22,544 38,760 1,305 3,138 3,965 1,513 71,225 1,719
57
M2d n.a. 22,795 39,230 1,292 3,069 3,981 1,691 72,057 1,721 L8 n.a. 30,517 41,695 0,831 1,000 2,377 1,729 78,149 1,366
L8d n.a. 30,483 41,752 0,881 1,007 2,343 2,046 78,511 1,370 L10 n.a. 24,892 40,906 0,814 1,268 2,783 2,018 72,682 1,643
L10d n.a. 24,765 41,139 1,006 1,229 2,830 2,259 73,228 1,661 L3 0,055 25,104 37,297 1,102 3,275 3,560 1,177 71,516 1,486
L3d 0,078 25,089 37,364 1,128 3,257 3,573 1,186 71,597 1,489 L18 n.a. 22,270 36,371 1,533 2,290 3,026 1,547 67,037 1,633
L18d n.a. 22,287 36,411 1,443 2,254 3,198 1,225 66,818 1,634 L16 0,007 20,513 35,616 1,644 1,710 3,209 0,702 63,394 1,736
L16d 0,003 20,328 35,399 1,703 1,656 3,195 0,683 62,963 1,741 OA1 n.a. 29,894 38,580 1,362 1,584 2,785 0,714 74,919 1,291
OA1d n.a. 29,928 38,716 1,446 1,540 2,865 0,761 75,256 1,294 I6 n.a. 21,976 37,089 1,375 1,998 2,400 0,728 65,566 1,688
I6d n.a. 21,801 37,309 1,462 1,958 2,856 0,790 66,175 1,711 I12 n.a. 22,514 37,514 0,928 1,874 2,613 0,874 66,317 1,666
I12d n.a. 22,479 37,474 1,055 1,898 2,275 0,896 66,077 1,667 L9 n.a. 19,566 31,492 2,059 1,690 3,474 0,932 59,213 1,610
L9d n.a. 19,645 31,301 2,040 1,720 3,492 0,850 59,048 1,593 OA2 0,065 27,454 39,617 1,345 1,951 1,842 2,390 74,599 1,443
OA2d 0,079 27,441 39,166 1,316 1,982 1,837 2,383 74,126 1,427 L15 n.a. 23,060 38,852 1,237 2,187 3,253 2,239 70,828 1,685
L15d n.a. 23,009 38,853 1,377 2,233 3,233 2,223 70,928 1,689 I13 0,094 25,768 33,213 <0,400 1,539 1,056 0,712 62,382 1,289
I13d 0,084 25,743 33,109 <0,400 1,503 1,190 0,427 62,056 1,286 L17 0,118 23,143 34,360 1,321 2,471 2,898 1,476 65,668 1,485
L17d 0,115 23,315 34,197 1,443 2,433 2,764 1,200 65,353 1,467 L25 0,357 20,886 30,300 1,335 6,566 3,100 0,994 63,181 1,451
L25d 0,353 20,853 30,303 1,398 6,595 3,001 1,493 63,642 1,453 I29 0,323 16,888 25,546 0,679 4,783 2,098 0,711 50,705 1,513
58
TREHALOSA GLUCOSA FRUCTOSA SACAROSA MELZITOSA TURANOSA
MALTOS
A TOTAL F/G I29d 0,321 16,906 25,468 0,673 4,801 2,058 0,650 50,557 1,506 L22 0,683 17,706 30,946 2,025 1,464 3,397 0,577 56,115 1,748
L22d 0,680 17,630 30,985 2,080 1,509 3,297 0,581 56,081 1,758 I9 n.a. 20,825 34,031 1,425 1,954 3,018 0,848 62,101 1,634
I9d 0,009 20,719 33,911 1,373 2,014 3,009 0,908 61,935 1,637 I15 0,116 22,595 32,389 1,504 2,722 3,319 1,259 63,788 1,433
I15d 0,102 22,616 32,340 1,430 2,750 3,401 1,709 64,247 1,430 I11 n.a. 23,614 37,405 1,887 2,016 1,836 1,835 68,594 1,584
I11d n.a. 23,479 37,460 1,963 1,986 1,786 2,232 68,906 1,595 TREHALOSA GLUCOSA FRUCTOSA SACAROSA MELZITOSA TURANOSA MALTOSA TOTAL F/G
media 0,060 25,076 37,541 1,067 1,757 2,514 1,472 69,808 1,485 desviación 0,164 3,212 3,494 0,410 1,020 0,562 0,609 5,393 0,186
Tabla 3.- Contenido en Azúcares de distintas muestras de miel realizado por duplicado y determinado mediante HPLC, expresado en porcentaje %.
59
La precisión de ese método nos permite establecer un ajuste hasta la milésima. Destacar igualmente la práctica ausencia de variabilidad entre los datos obtenidos en el análisis de cada miel y su correspondiente duplicado, indicador de la repetibilidad del método.
Los datos obtenidos muestran que el azúcar mayoritario es la Fructosa, con una cantidad media de 37,541 %, seguido por la Glucosa con una cantidad media de 25,076 %. Ya en mucha menor proporción aparece la Turanosa, con una cantidad media de 2,514 %. La relación media entre los azúcares mayoritarios es de 1,485.
El análisis de azúcares por este método, no permite determinar el contenido en Sacarosa cuando esta se presenta en cantidades inferiores al 0,400 % . Con todo, la media del contenido en este azúcar en las mieles analizadas fue de 1,067%
Los resultados obtenidos son coherentes con los señalados por otros autores en mieles de origen floral de otras regiones geográficas, como los obtenidos por Pajuelo (2004), con unas composiciones medias de Glucosa de 22 a 40%, Fructosa de 27 a 44% y Sacarosa de 2 a 15 %. Por tanto nuestros datos se encuentran dentro del rango de sus composiciones medias.
Igualmente, y dado el diferente origen y procedencia de las mieles, las desviaciones encontradas entre las concentraciones de azucares están dentro de lo esperable.
Comparando con otros autores como White (1962) en su estudio Composition of American Honeys, expone unos valores medios:
Glucosa 31,3%
Fructosa 38,2%
Sacarosa 1,31%
También podemos comparar los resultados con los obtenidos por los obtenidos por el Departamento de Agricultura y Alimentación de La Rioja, en su estudio La Rioja honey composition (Sanz, 1994), en el cual la Fructosa obtiene un 38,08%, Glucosa 30,80% y Sacarosa 1,85%.
También se obtuvieron datos correctos respecto a las mieles italianas (Ciulu, 2011), asi como las mieles croatas (Primorac, 2011) y las obtenidas en Argelia (Ouchemoukh, 2009).
En cuanto al país vecino Portugal, legislativamente (Decreto-Lei nº 214/2003 ), la composición media de Fructosa y Glucosa es de 38% y 31% respectivamente. Según el Codex Alimentarius, al igual que el Boletín Oficial del Estado (BOE, 1975), expresa la cantidad de Fructosa y Glucosa (la suma de ambas), no menos de 60g/100 g, es decir un mínimo de 60 %. Para el contenido de Sacarosa se exige un contenido máximo de 5g/100g, un 5%. Podemos afirmar que las mieles analizadas cumplen ambas exigencias legales.
60
5.2. Composición de azúcares obtenidos mediante Milkoscan/Foss
Este equipo se encontraba estandarizado para la determinación de azúcares en otras muestras alimentarias por lo que se procedió a su utilización directa con las muestras de miel. Es necesario señalar que este método sólo permite el análisis de los tres azúcares más importantes en miel y cuyos requisitos de composición recoge la legislación actual, tal y como hemos señalado. Se trata de los dos azúcares mayoritarios (Fructosa y Glucosa) y de Sacarosa, azúcar indicador del grado de madurez de la miel.
En la Tabla 4 se recogen los resultados obtenidos en la determinación del contenido en Glucosa, Fructosa y Sacarosa de las diferentes muestras de miel analizadas.
Tabla 4.- Contenido en Azúcares de distintas muestras de miel analizado por duplicado, determinado mediante Milkoscan /Foss, expresado en porcentaje (%).
GLUCOSA FRUCTOSA SACAROSA TOTAL fructosa/glucosa
muestra
1200490 37,0 40,8 3,7 81,5 1,1
1200490d 37,0 40,7 3,3 81,0 1,1
1200488 35,5 42,8 3,3 81,6 1,2
1200488d 35,7 43,0 3,3 82,0 1,2
1200492 35,0 43,2 2,2 80,4 1,2
1200492d 35,0 43,4 2,3 80,7 1,2
1200476 35,6 44,5 2,2 82,3 1,3
1200476d 35,5 44,6 2,4 82,5 1,3
1200486 36,2 44,6 2,6 83,4 1,2
1200486d 36,3 44,6 2,5 83,4 1,2
1200480 36,4 43,7 1,0 81,1 1,2
1200480d 36,0 43,4 1,2 80,6 1,2
1200487 35,6 43,2 1,8 80,6 1,2
1200487d 35,5 42,9 2,1 80,5 1,2
1200489 33,7 42,5 3,8 80,0 1,3
1200489d 34,0 42,4 3,4 79,8 1,3
1200494 37,4 42,3 2,3 82,0 1,1
1200494d 37,2 42,1 2,0 81,3 1,1
1200495 37,0 42,5 2,0 81,5 1,2
1200495d 37,0 42,4 1,7 81,1 1,2
1200496 35,5 45,5 2,0 83,0 1,3
1200496d 35,5 45,5 1,9 82,9 1,3
1200498 36,6 41,3 2,9 80,8 1,1
1200498d 36,3 41,0 2,8 80,1 1,1
1200501 26,9 51,1 1,8 79,8 1,9
1200501d 26,6 51,0 1,6 79,2 1,9
1200500 32,6 46,2 1,8 80,6 1,4
1200500d 32,4 46,2 1,6 80,2 1,4
1200497 37,7 43,3 3,7 84,7 1,2
1200497d 37,5 43,5 4,1 85,1 1,2
1200483 36,6 42,8 3,3 82,7 1,2
61
1200483d 36,8 42,8 3,4 83,0 1,2
1200499 38,1 41,2 3,7 83,0 1,1
1200499d 38,1 41,0 3,8 82,9 1,1
1200490 37,0 40,8 3,3 81,1 1,1
1200490d 37,0 40,7 3,7 81,4 1,1
1200488 35,5 42,8 3,3 81,6 1,2
1200488d 35,7 43,0 3,4 82,1 1,2
1200493 34,6 43,0 2,6 80,2 1,2
1200493d 34,6 42,8 2,7 80,1 1,2
1200491 33,1 43,7 1,8 78,6 1,3
1200491d 33,0 44,0 1,9 78,9 1,3
L24 35,9 45,1 3,1 84,1 1,3
L24d 35,9 45,1 3,1 84,1 1,3
1200482 37,0 44,1 3,6 84,7 1,2
1200482d 37,0 44,1 3,5 84,6 1,2
1200485 38,1 42,3 3,1 83,5 1,1
1200485d 38,2 42,4 3,1 83,7 1,1
1200479 37,1 43,7 3,9 84,7 1,2
1200479d 37,0 43,9 3,8 84,7 1,2
1200477 32,9 45,3 2,1 80,3 1,4
1200477d 33,2 45,2 2,2 80,6 1,4
1200481 31,9 46,0 2,1 80,0 1,4
1200481d 31,9 46,1 2,2 80,2 1,5
R6 34,0 46,1 2,1 82,2 1,4
R6d 33,9 46,3 2,5 82,7 1,4
1200478 29,9 48,4 1,7 80,0 1,6
1200478d 29,9 48,1 1,4 79,4 1,6
L3 37,5 43,8 2,9 84,2 1,2
L3d 37,3 43,9 3,0 84,2 1,2
OA1 41,6 45,0 1,0 87,6 1,1
OA1d 41,9 45,0 1,4 88,3 1,1
l15 34,4 46,4 2,9 83,7 1,3
l15d 34,3 46,7 2,8 83,8 1,4
L9 38,4 43,6 2,8 84,8 1,1
L9d 38,4 43,4 3,2 85,0 1,1
I12 32,4 43,3 2,0 77,7 1,3
I12d 32,7 43,4 1,9 78,0 1,3
OA2 34,8 42,2 1,8 78,8 1,2
OA2d 35,0 42,0 1,8 78,8 1,2
L17 36,0 41,8 2,3 80,1 1,2
L17d 36,1 41,9 2,1 80,1 1,2
L16 34,6 44,1 1,7 80,4 1,3
L16d 34,5 44,3 1,9 80,7 1,3
media 35,7 43,5 2,5 81,5 1,2
desviación 2,6 2,1 0,8 2,1 0,1
62
Este método permite la determinación de los azucares Glucosa, Fructosa y Sacarosa, con una precisión de dos decimales, pero hemos ajustado a un decimal ya que los resultados había que multiplicarlos por 10 debido al factor de dilución.
Viendo los resultados obtenidos mediante Milkoscan/Foss observamos, tal y como ocurría para el análisis con HPLC, una repetitividad en cuanto a las cantidades de azúcares obtenidas en los análisis duplicados de cada muestra.
De nuevo, los resultados obtenidos permiten afirmar que el azúcar mayoritario es la Fructosa, con una proporción media de 43,5% seguido de la Glucosa con un 35,7%. La Sacarosa presentó una cantidad media de 2,6 %.
A pesar de que, y tal como se discute en el siguiente apartado, los datos obtenidos mediante el sistema Milkoscan/Foss son mayores respecto a los obtenidos por el método cromatográfico, según los valores medios anteriormente citados del Boletín Oficial del Estado y de los valores determinados por White (1962) y otros autores, las muestras se encuentran dentro de los valores estimados como normales, incluyendo el valor máximo exigido para la sacarosa.
63
5.3. Comparación de los resultados obtenidos mediante HPLC y Milkoscan
La Tabla 5 muestra una comparación de resultados para los parámetros Glucosa, Fructosa y Sacarosa entre método cromatográfico HPLC ajustados a un decimal y método de infrarrojo Milkoscan/Foss.
Tabla 5: Comparación de resultados entre HPLC y Milkoscan.
GLUCOSA FRUCTOSA SACAROSA
MUESTRA HPLC FOSS HPLC FOSS HPLC FOSS
1200490 24,3 37,0 37,7 40,8 1,0 3,7
1200490d 24,2 37,0 37,6 40,7 1,0 3,3
1200488 25,7 35,5 36,6 42,8 1,0 3,3
1200488d 25,6 35,7 36,5 43,0 1,0 3,4
1200492 25,1 35,0 37,2 43,2 <0,4 2,3
1200492d 25,0 35,0 37,0 43,4 <0,4 2,2
1200476 27,0 35,6 38,2 44,6 0,5 2,4
1200476d 27,0 35,5 38,6 44,6 0,5 2,6
1200486 25,2 36,2 38,4 44,6 0,6 2,5
1200486d 25,5 36,3 38,6 44,6 0,6 2,6
1200480 26,4 36,4 37,7 43,7 0,5 1,2
1200480d 26,6 36,0 38,3 43,4 0,5 1,0
1200487 31,1 35,6 34,4 43,2 0,6 2,1
1200487d 31,1 35,5 34,5 42,9 0,6 1,8
1200489 25,7 33,7 45,2 42,5 <0,4 3,4
1200489d 25,7 34,0 45,3 42,4 <0,4 3,8
1200494 23,2 37,4 36,7 42,3 0,6 2,0
1200494d 23,2 37,2 36,8 42,1 0,6 2,3
1200495 23,5 37,0 33,8 42,5 0,8 1,7
1200495d 23,5 37,0 34,0 42,4 0,8 2,0
1200496 30,4 35,5 34,9 45,5 0,7 2,0
1200496d 30,1 35,5 34,8 45,5 0,6 1,9
1200498 25,8 36,6 35,0 41,3 0,6 2,8
1200498d 25,8 36,3 35,2 41,0 0,7 2,9
1200501 18,3 26,9 37,3 51,1 0,5 1,6
1200501d 18,5 26,6 37,2 51,0 0,6 1,8
1200500 26,1 32,6 38,6 46,2 <0,4 1,6
1200500d 26,5 32,4 38,8 46,2 <0,4 1,9
1200497 27,8 37,7 44,1 43,3 0,5 4,1
1200497d 27,9 37,5 44,6 43,5 0,5 3,7
1200483 26,3 36,6 38,0 42,8 <0,4 3,4
1200483d 26,3 36,8 38,0 42,8 <0,4 3,3
1200499 25,9 38,1 33,3 41,2 <0,4 3,8
1200499d 25,9 38,1 33,4 41,0 <0,4 3,7
1200493 25,7 34,6 38,3 43,0 0,5 2,7
1200493d 25,7 34,6 38,4 42,8 0,5 2,6
1200491 24,5 33,1 37,9 43,7 0,7 1,9
1200491d 24,4 33,0 38,0 44,0 0,8 1,8
64
L24 23,5 35,9 37,2 45,1 1,1 3,1
L24d 23,8 35,9 37,6 45,1 1,1 3,1
1200482 26,2 37,0 39,2 44,1 0,7 3,5
1200482d 26,2 37,0 39,2 44,1 0,7 3,6
1200485 27,0 38,1 37,3 42,3 0,7 3,1
1200485d 27,0 38,2 37,5 42,4 0,7 3,1
1200479 27,2 37,1 40,1 43,7 1,2 3,8
1200479d 27,4 37,0 40,2 43,9 1,4 3,9
1200477 28,9 32,9 39,3 45,3 0,8 2,2
1200477d 28,7 33,2 39,5 45,2 0,8 2,1
1200481 24,3 31,9 40,7 46,0 0,7 2,1
1200481d 24,3 31,9 40,6 46,1 0,8 2,2
R6 21,6 34,0 38,7 46,1 1,1 2,5
R6d 21,7 33,9 38,6 46,3 1,1 2,1
1200478 27,5 29,9 40,6 48,4 1,2 1,4
1200478d 27,5 29,9 40,4 48,1 1,2 1,7
L3 25,1 37,5 37,3 43,8 1,1 2,9
L3d 25,1 37,3 37,3 43,9 1,1 3,0
OA1 29,9 41,6 38,6 45,0 1,4 1,0
OA1d 29,9 41,9 38,7 45,0 1,4 1,4
l15 22,6 34,4 32,4 46,4 1,5 2,9
l15d 22,6 34,3 32,3 46,7 1,4 2,8
L9 19,6 38,4 31,4 43,6 2,0 3,2
L9d 19,6 38,4 31,3 43,4 2,0 2,6
I12 22,5 32,4 37,5 43,3 0,9 2,0
I12d 22,5 32,7 37,5 43,4 1,0 1,9
OA2 27,4 34,8 39,6 42,2 1,3 1,8
OA2d 27,4 35,0 39,3 42,0 1,3 1,8
L17 23,1 36,0 34,3 41,8 1,3 2,1
L17d 23,3 36,1 34,2 41,9 1,4 2,3
L16 20,5 34,6 35,6 44,1 1,6 1,9
L16d 20,3 34,5 35,4 44,3 1,7 1,7
media 25,7 35,6 37,6 43,6 0,8 2,3
De nuevo los datos obtenidos para la Sacarosa por el método HPLC por debajo de 0,40 % no fueron estimados y, por tanto, estos se han expresado como < 0,4.
Se puede observar que los datos obtenidos por el método de infrarrojos Milkoscan son notablemente más altos que los obtenidos por el método HPLC. Así, la cantidad de Glucosa fue 1,38 veces mayor en el análisis efectuado con Milkoscan que con el realizado con HPLC, 1,15 veces mayor para Fructosa y 2,77 veces mayor para la Sacarosa.
Esto puede ser debido a la menor precisión en los ensayos de Milkoscan o a que el programa que está siendo utilizado para la determinación de azucares en la miel no es el correcto, o simplemente, este método no es el adecuado para la determinación de los azúcares en la miel.
65
La disparidad entre los datos obtenidos en ambos análisis se muestra en las Gráficas 1-6. Puede observarse la falta de correlación entre los resultados obtenidos entre ambos métodos.
Resulta especialmente importante señalar en el caso de la determinación de la Sacarosa, como el método de análisis por HPLC no detecta cantidades de este azúcar apreciables en muestras en las que el método Milkoscan señala un contenido en azúcar próximo al 4%. Esta gran disparidad puede resultar muy importante ya que se trata de un azúcar cuyo contenido resulta determinante para establecer su aptitud para la comercialización de la miel (recordemos que la legislación exige un contenido en Sacarosa <5%).
Gráfica 1: Dispersión de datos para las muestras de sacarosa.
Gráfica 2: Dispersión de datos para las muestras de glucosa.
66
15
20
25
30
35
40
45
15 20 25 30 35 40 45
Carboydrates mesured with M
ilkoscan
Carboydrates mesured with HPAEC‐PAD (%)
Glucose
Ideal line
Gráfica 3: Dispersión de datos para las muestras de fructosa.
En el Centro de Apoyo Tecnológico Agroalimentario de Portugal en el que se realizó este estudio, se elaboraron gráficas incluyendo más datos de muestras de miel, como se puede observar en las siguientes gráficas 4,5 y 6. Las conclusiones a las que se llegó fueron las mismas: hay una falta de correlación entre los resultados conseguidos entre un método y otro.
20
25
30
35
40
45
50
20 25 30 35 40 45 50
Carboydrates mesured with M
ilkoscan
Carboydrates mesured with HPAEC‐PAD (%)
Frucose
Ideal line
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
0 1 2 3 4 5 6
Carboydrates mesured with M
ilkoscan
Carboydrates mesured with HPAEC‐PAD (%)
Sacarose
Ideal line
Graficas 4,5, 6: Dispersión de datos de
67
Fructosa, Sacarosa y Glucosa
Cabe destacar los valores obtenidos para la sacarosa mediante el método Milkoscan/Foss, con unos datos de entre 5 y 6% , que no presentan ninguna coherencia y según la legislación nos encontraríamos con unas mieles no aptas para el consumo debido al alto porcentaje de este azúcar. Si utilizásemos este método, los datos obtenidos y con ellos las decisiones a tomar serían erróneas, ya que no se corresponden con los datos reales y correctos obtenidos por el HPLC.
68
69
CONCLUSIONES
70
71
6. CONCLUSIONES
A la vista del trabajo realizado se concluye que:
1.-Se ha puesto a punto el método cromatográfico HPLC para la detección y cuantificación de azúcares en miel.
2.-Este método mostró una buena reproducibilidad en los datos obtenidos permitiendo además cuantificar la presencia de azúcares minoritarios con alta precisión.
3.-Los resultados obtenidos en el análisis de la composición de azúcares en mieles por HPLC de 58 muestras de miel floral de distinta procedencia y origen, concuerdan con la composición en azúcares establecida por otros autores.
4.-Se ha analizado la composición en los azúcares glucosa, fructosa y sacarosa de las mismas muestras siguiendo el método estandarizado del equipo Milkoscan/Foss
5.-Los resultados obtenidos mediante este método fueron, igualmente, altamente reproducibles si bien presentaron un nivel de precisión menor que con el método HPLC.
6.-Los resultados obtenidos por el método Milkoscan/Foss muestran valores más elevados para los tres azúcares analizados que los obtenidos por el método HPLC lo que, en el caso de la sacarosa puede tener repercusiones a la hora de establecer su aptitud para la comercialización.
7.-Por todo ello se concluye que el método estándar de determinación de azúcares del equipo Milkoscan/Foss, si bien proporciona resultados de forma más rápida y sencilla que el método HPLC, debe ser ajustado para la determinación precisa de azúcares en miel.
72
73
REFERENCIAS
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7. REFERENCIAS
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Norma chilena . Miel de abejas-determinación del contenido de fructosa, glucosa, sacarosa, turanosa y maltosa-método HPLC con detector IR. NCh574-2006.
Universidad del país vasco- espectrofotometría de infrarrojos, 2006.
Decreto-Lei nº 214/2003 de 18 de Setembro, Diário da República nº 216 – Iª Série-A, Ministério da Agricultura Desenvolvimento Rural e Pescas. Lisboa.
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ANEJO I
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ANEJO II
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ANEJO II
ANION SUMMARY REPORT
No. Name Time Area Asymmetry(EP) Plates(EP) Height Resolution(EP) Amount
min nC*min nC (%)
Trealose Trealose Trealose Trealose Trealose Trealose Trealose
ED_1 ED_1 ED_1 ED_1 ED_1 ED_1 ED_1
1 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
2 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
3 P0 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
4 P0 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
5 P1 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
6 P1 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
7 P2 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
8 P2 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
9 P3 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
10 P3 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
11 P4 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
12 P4 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
13 P5 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
14 P5 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
15 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
16 P2 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
17 1300448 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
18 1300448d n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
19 I8 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
20 I8d n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
21 L2 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
22 L2d n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
23 R1 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
24 R1d n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
25 L28 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
26 L28d n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
27 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
28 P2 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
29 I10 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
30 I10d n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
31 M1 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
32 M1d n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
33 L26 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
34 L26d n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
35 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
36 P2 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
37 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
38 L20 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
39 L20d n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
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40 L23 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
41 L23d n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
42 M4 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
43 M4d n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
44 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
45 P2 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
46 L1 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
47 L1d n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
48 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
49 P2 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
50 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
51 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
Average: #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0!
Rel.Std.Dev: #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0! #¡DIV/0!
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No. Name Time Area Asymmetry(EP) Plates(EP) Height Resolution(EP) Amount
min nC*min nC ug/mL
Glucose Glucose Glucose Glucose Glucose Glucose Glucose
ED_1 ED_1 ED_1 ED_1 ED_1 ED_1 ED_1
1 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
2 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
3 P0 3,78 0,394 n.a. 3737 2,375 1,54 0,0873
4 P0 3,83 0,401 n.a. 3709 2,377 1,59 0,0892
5 P1 3,87 0,736 n.a. 3799 4,357 1,66 0,1840
6 P1 3,90 0,735 n.a. 3891 4,363 1,67 0,1838
7 P2 3,90 1,554 n.a. 3848 9,184 1,71 0,4151
8 P2 3,90 1,561 n.a. 3882 9,248 1,71 0,4171
9 P3 3,90 3,614 n.a. 3762 21,218 1,70 0,9973
10 P3 3,90 3,635 n.a. 3830 21,461 1,65 1,0032
11 P4 3,90 7,158 n.a. 3754 41,875 1,70 1,9988
12 P4 3,90 7,202 n.a. 3771 42,070 1,70 2,0111
13 P5 3,90 14,166 n.a. 3737 82,628 1,62 3,9791
14 P5 3,90 14,143 n.a. 3712 82,402 1,68 3,9724
15 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
16 P2 3,90 1,562 n.a. 3882 9,267 1,66 0,4173
17 1300448 3,90 9,088 n.a. 3822 53,859 1,64 25,4513
18 1300448d 3,90 9,066 n.a. 3856 53,824 1,65 25,3868
19 I8 3,90 9,662 n.a. 3848 57,389 1,65 27,0991
20 I8d 3,90 9,666 n.a. 3830 57,366 1,65 27,1099
21 L2 3,90 8,549 n.a. 3822 50,601 1,71 23,8819
22 L2d 3,90 8,533 n.a. 3821 50,888 1,65 23,8363
23 R1 3,90 8,226 n.a. 3839 48,861 1,71 22,9841
24 R1d 3,90 8,255 n.a. 3796 48,940 1,65 23,0653
25 L28 3,90 9,291 n.a. 3830 55,032 1,64 25,9796
26 L28d 3,90 9,310 n.a. 3822 55,089 1,64 26,0313
27 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
28 P2 3,90 1,559 n.a. 3839 9,184 1,66 0,4167
29 I10 3,90 9,893 n.a. 3830 58,660 1,65 27,7232
30 I10d 3,90 9,898 n.a. 3822 58,624 1,65 27,7367
31 M1 3,92 5,962 n.a. 3803 35,045 1,65 16,5848
32 M1d 3,90 5,957 n.a. 3804 35,263 1,65 16,5689
33 L26 3,90 8,405 n.a. 3830 50,129 1,65 23,5068
34 L26d 3,90 8,437 n.a. 3737 49,498 1,63 23,5994
35 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
36 P2 3,90 1,552 n.a. 3839 9,147 1,66 0,4146
37 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
38 L20 3,90 9,770 n.a. 3771 57,989 1,64 27,3663
39 L20d 3,90 9,734 n.a. 3830 58,201 1,65 27,2642
40 L23 3,88 6,996 n.a. 3747 41,282 1,64 19,5134
41 L23d 3,90 6,988 n.a. 3805 41,446 1,65 19,4907
42 M4 3,90 10,685 n.a. 3804 63,161 1,65 29,9353
43 M4d 3,90 10,617 n.a. 3779 62,947 1,64 29,7436
44 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
94
45 P2 3,90 1,532 n.a. 3821 9,059 1,60 0,4091
46 L1 3,90 11,022 n.a. 3762 65,174 1,64 30,8745
47 L1d 3,90 11,079 n.a. 3813 65,570 1,65 31,0346
48 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
49 P2 3,90 1,547 n.a. 3839 9,165 1,66 0,4131
50 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
51 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
Average: 3,895 6,784 #¡DIV/0! 3.806,707 40,103 1,653 15,102
Rel.Std.Dev: 0,554 % 58,758 % #¡DIV/0! 1,175 % 58,631 % 2,014 % 82,121 %
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No. Name Time Area Asymmetry(EP) Plates(EP) Height Resolution(EP) Amount
min nC*min nC ug/mL
Frutose Frutose Frutose Frutose Frutose Frutose Frutose
ED_1 ED_1 ED_1 ED_1 ED_1 ED_1 ED_1
1 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
2 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
3 P0 4,184 0,388 n.a. 3772 2,052 2,27 0,087
4 P0 4,250 0,397 n.a. 3814 2,080 2,40 0,090
5 P1 4,300 0,695 n.a. 3944 3,655 2,52 0,181
6 P1 4,334 0,682 n.a. 4107 3,678 2,56 0,177
7 P2 4,350 1,538 n.a. 3962 7,982 2,54 0,438
8 P2 4,350 1,556 n.a. 3971 8,041 2,49 0,443
9 P3 4,350 3,456 n.a. 4003 17,941 2,55 1,022
10 P3 4,334 3,467 n.a. 3964 18,004 2,55 1,025
11 P4 4,350 6,896 n.a. 3946 35,250 2,52 2,070
12 P4 4,350 6,979 n.a. 3954 35,448 2,51 2,096
13 P5 4,334 13,482 n.a. 3791 67,925 2,48 4,077
14 P5 4,350 13,587 n.a. 3843 68,159 2,48 4,109
15 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
16 P2 4,334 1,557 n.a. 4064 8,227 2,58 0,443
17 1300448 4,334 12,850 n.a. 3932 67,694 2,49 38,860
18 1300448d 4,334 12,825 n.a. 3940 67,570 2,50 38,784
19 I8 4,334 12,006 n.a. 3948 62,907 n.a. 36,323
20 I8d 4,334 11,981 n.a. 3973 63,029 n.a. 36,246
21 L2 4,350 11,581 n.a. 3995 60,729 n.a. 34,926
22 L2d 4,334 11,629 n.a. 3997 61,224 n.a. 35,071
23 R1 4,350 11,448 n.a. 3970 59,691 n.a. 34,542
24 R1d 4,334 11,523 n.a. 3989 60,426 n.a. 34,770
25 L28 4,334 12,345 n.a. 3924 64,384 n.a. 37,255
26 L28d 4,334 12,359 n.a. 3932 64,573 n.a. 37,299
27 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
28 P2 4,334 1,577 n.a. 4039 8,202 2,54 0,450
29 I10 4,334 10,912 n.a. 3948 56,844 n.a. 32,951
30 I10d 4,334 10,912 n.a. 3965 57,013 n.a. 32,949
31 M1 4,350 10,450 n.a. 4028 54,980 2,52 31,488
32 M1d 4,334 10,443 n.a. 4005 55,044 2,58 31,467
33 L26 4,334 12,364 n.a. 3956 64,621 n.a. 37,360
34 L26d 4,334 12,336 n.a. 3916 64,125 n.a. 37,276
35 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
36 P2 4,334 1,548 n.a. 4047 8,129 2,56 0,441
37 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
38 L20 4,334 11,736 n.a. 3948 62,278 2,60 35,448
39 L20d 4,334 11,711 n.a. 3989 62,424 2,64 35,373
40 L23 4,317 11,345 n.a. 3934 60,399 2,88 34,230
41 L23d 4,334 11,360 n.a. 3973 60,408 2,78 34,276
42 M4 4,334 11,497 n.a. 3981 61,001 3,17 34,701
96
43 M4d 4,334 11,551 n.a. 3956 60,802 2,59 34,867
44 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
45 P2 4,317 1,481 n.a. 4075 7,936 2,67 0,420
46 L1 4,334 11,116 n.a. 3924 58,216 3,10 33,528
47 L1d 4,334 11,041 n.a. 3981 58,545 2,57 33,298
48 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
49 P2 4,334 1,537 n.a. 4098 8,026 2,56 0,438
50 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
51 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
Average: 4,330 8,296 #¡DIV/0! 3.963,366 43,406 2,594 21,007
Rel.Std.Dev: 0,664 % 58,538 % #¡DIV/0! 1,781 % 58,534 % 7,075 % 81,330 %
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No. Name Time Area Asymmetry(EP) Plates(EP) Height Resolution(EP) Amount
min nC*min nC ug/mL
Sacarose Sacarose Sacarose Sacarose Sacarose Sacarose Sacarose
ED_1 ED_1 ED_1 ED_1 ED_1 ED_1 ED_1
1 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
2 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
3 P0 4,834 0,150 1,16 4085 0,739 5,75 0,106
4 P0 4,950 0,151 1,10 4114 0,734 5,79 0,107
5 P1 5,034 0,292 1,08 4245 1,432 6,01 0,196
6 P1 5,067 0,281 1,21 4439 1,418 6,16 0,189
7 P2 5,100 0,607 1,04 4188 2,878 2,21 0,393
8 P2 5,084 0,608 1,16 4214 2,908 2,30 0,394
9 P3 5,100 1,497 1,12 4226 7,171 2,12 0,953
10 P3 5,084 1,507 1,18 4183 7,168 2,19 0,959
11 P4 5,100 3,113 n.a. 4070 14,218 2,06 1,969
12 P4 5,100 3,495 n.a. 4020 14,388 5,97 2,209
13 P5 5,084 6,264 n.a. 3931 27,864 n.a. 3,950
14 P5 5,100 6,354 n.a. 3943 28,083 n.a. 4,006
15 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
16 P2 5,084 0,585 1,14 4267 2,859 2,29 0,379
17 1300448 5,084 0,932 n.a. 3864 4,226 n.a. 5,981
18 1300448d 5,084 0,903 n.a. 3904 4,166 n.a. 5,797
19 I8 5,117 0,067 n.a. n.a. 0,331 n.a. 0,540
20 I8d 5,117 0,073 n.a. n.a. 0,324 n.a. 0,578
21 L2 5,134 0,088 n.a. n.a. 0,436 n.a. 0,673
22 L2d 5,134 0,086 n.a. n.a. 0,417 n.a. 0,660
23 R1 5,134 0,121 n.a. n.a. 0,552 n.a. 0,876
24 R1d 5,117 0,146 n.a. n.a. 0,585 n.a. 1,033
25 L28 5,117 0,063 n.a. n.a. 0,330 n.a. 0,512
26 L28d 5,117 0,064 n.a. n.a. 0,301 n.a. 0,518
27 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
28 P2 5,084 0,625 n.a. 4044 2,844 2,05 0,405
29 I10 5,117 0,116 n.a. n.a. 0,525 n.a. 0,847
30 I10d 5,134 0,130 n.a. n.a. 0,540 n.a. 0,937
31 M1 5,150 0,277 n.a. 3244 1,203 n.a. 1,854
32 M1d 5,134 0,262 n.a. 3497 1,177 n.a. 1,760
33 L26 5,117 0,099 n.a. n.a. 0,466 n.a. 0,738
34 L26d 5,117 0,123 n.a. n.a. 0,495 n.a. 0,889
35 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
36 P2 5,084 0,566 n.a. 4138 2,650 2,18 0,367
37 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
38 L20 5,084 0,160 1,26 4544 0,851 1,78 1,124
39 L20d 5,084 0,159 1,20 4775 0,860 1,66 1,120
40 L23 5,117 0,096 1,24 5264 0,534 n.a. 0,723
41 L23d 5,117 0,093 1,30 4951 0,521 n.a. 0,705
98
42 M4 5,117 0,018 1,83 8583 0,120 n.a. 0,234
43 M4d 5,084 0,024 1,53 4460 0,133 n.a. 0,271
44 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
45 P2 5,084 0,462 1,16 4419 2,337 2,46 0,302
46 L1 5,117 0,022 1,56 7940 0,148 n.a. 0,256
47 L1d 5,084 0,025 1,54 4306 0,136 n.a. 0,278
48 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
49 P2 5,084 0,496 n.a. 4146 2,321 6,01 0,324
50 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
51 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
Average: 5,092 0,761 1,267 4.482,897 3,448 3,471 1,125
Rel.Std.Dev: 1,038 % 193,551 % 16,645 % 24,962 % ######## 54,639 % 124,122 %
No. Name Time Area Asymmetry(EP) Plates(EP) Height Resolution(EP) Amount
99
min nC*min nC ug/mL
Melezitose Melezitose Melezitose Melezitose Melezitose Melezitose Melezitose
ED_1 ED_1 ED_1 ED_1 ED_1 ED_1 ED_1
1 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
2 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
3 P0 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
4 P0 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
5 P1 7,167 0,327 1,09 5066 1,278 4,45 0,195
6 P1 7,250 0,327 1,08 5091 1,265 4,53 0,195
7 P2 7,284 0,664 1,11 5046 2,520 4,44 0,408
8 P2 7,284 0,673 1,13 5005 2,541 4,46 0,414
9 P3 7,284 1,665 1,20 5039 6,246 4,48 1,042
10 P3 7,284 1,659 1,15 5039 6,250 4,44 1,038
11 P4 7,284 3,274 1,20 5025 12,287 4,46 2,060
12 P4 7,284 3,312 1,20 4998 12,309 4,45 2,084
13 P5 7,284 6,522 1,18 4950 24,215 4,43 4,116
14 P5 7,284 6,526 1,20 4957 24,201 4,44 4,118
15 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
16 P2 7,267 0,667 1,18 4975 2,512 4,49 0,410
17 1300448 7,450 0,167 n.a. 4131 0,596 3,87 0,941
18 1300448d 7,450 0,147 n.a. 4379 0,568 3,90 0,814
19 I8 7,450 0,256 n.a. n.a. 0,949 n.a. 1,505
20 I8d 7,434 0,247 n.a. n.a. 0,920 n.a. 1,446
21 L2 7,167 0,330 n.a. n.a. 1,454 n.a. 1,967
22 L2d 7,150 0,343 n.a. n.a. 1,471 n.a. 2,049
23 R1 7,150 0,300 n.a. n.a. 1,310 n.a. 1,779
24 R1d 7,150 0,308 n.a. n.a. 1,320 n.a. 1,830
25 L28 7,434 0,209 n.a. n.a. 0,803 n.a. 1,203
26 L28d 7,434 0,223 n.a. n.a. 0,804 n.a. 1,290
27 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
28 P2 7,284 0,655 1,09 5039 2,483 4,45 0,402
29 I10 7,150 0,331 n.a. 4018 1,370 n.a. 1,977
30 I10d 7,150 0,331 n.a. 3745 1,367 n.a. 1,976
31 M1 7,150 1,084 1,68 5262 3,678 n.a. 6,730
32 M1d 7,134 1,081 1,60 5268 3,679 n.a. 6,715
33 L26 7,434 0,327 n.a. n.a. 1,195 n.a. 1,948
34 L26d 7,417 0,324 n.a. n.a. 1,175 n.a. 1,931
35 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
36 P2 7,267 0,659 1,16 5002 2,489 4,48 0,405
37 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
38 L20 7,434 0,193 n.a. 4113 0,724 3,08 1,101
39 L20d 7,434 0,207 n.a. 3778 0,748 n.a. 1,189
40 L23 7,134 0,627 n.a. 4881 2,449 n.a. 3,842
41 L23d 7,134 0,602 n.a. 4936 2,455 n.a. 3,690
42 M4 7,434 0,278 n.a. n.a. 1,026 n.a. 1,638
43 M4d 7,417 0,269 n.a. n.a. 1,026 n.a. 1,580
100
44 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
45 P2 7,267 0,663 1,13 4961 2,494 4,47 0,407
46 L1 7,434 0,222 n.a. n.a. 0,818 n.a. 1,286
47 L1d 7,417 0,207 n.a. n.a. 0,817 n.a. 1,191
48 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
49 P2 7,267 0,665 1,12 4961 2,500 4,47 0,409
50 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
51 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
Average: 7,297 0,945 1,206 4.786,600 3,546 4,324 1,778
Rel.Std.Dev: 1,593 % 158,479 % 14,012 % 9,544 % ######## 8,382 % 87,178 %
101
No. Name Time Area Asymmetry(EP) Plates(EP) Height Resolution(EP) Amount
min nC*min nC ug/mL
Turanose Turanose Turanose Turanose Turanose Turanose Turanose
ED_1 ED_1 ED_1 ED_1 ED_1 ED_1 ED_1
1 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
2 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
3 P0 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
4 P0 8,900 0,086 1,07 6467 0,300 11,40 0,111
5 P1 9,084 0,172 1,01 6232 0,600 10,89 0,210
6 P1 9,184 0,157 1,11 6704 0,563 11,00 0,192
7 P2 9,234 0,347 1,06 6178 1,163 10,82 0,408
8 P2 9,234 0,334 1,09 6330 1,133 10,66 0,394
9 P3 9,250 0,853 1,04 6215 2,852 10,70 0,984
10 P3 9,234 0,869 1,07 6156 2,850 10,61 1,002
11 P4 9,250 1,730 1,02 6112 5,661 10,63 1,983
12 P4 9,250 1,752 1,03 6105 5,671 10,59 2,008
13 P5 9,250 3,518 1,00 6061 11,327 10,54 4,019
14 P5 9,250 3,491 1,02 6075 11,268 10,57 3,988
15 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
16 P2 9,234 0,333 1,09 6269 1,127 10,68 0,393
17 1300448 9,234 0,105 1,17 6463 0,366 7,53 1,332
18 1300448d 9,267 0,116 1,01 5885 0,387 7,55 1,449
19 I8 9,250 0,157 n.a. 6291 0,516 7,53 1,925
20 I8d 9,250 0,163 n.a. 6083 0,538 7,45 1,990
21 L2 9,267 0,273 n.a. 5810 0,862 5,88 3,235
22 L2d 9,250 0,261 n.a. 5933 0,856 6,94 3,096
23 R1 9,267 0,240 1,05 6550 0,829 7,34 2,862
24 R1d 9,234 0,240 1,11 6353 0,842 7,07 2,865
25 L28 9,267 0,157 n.a. 6112 0,522 7,40 1,914
26 L28d 9,250 0,161 n.a. 5789 0,552 11,48 1,968
27 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
28 P2 9,234 0,333 1,05 6246 1,136 10,79 0,393
29 I10 9,267 0,229 n.a. 5803 0,722 7,08 2,739
30 I10d 9,250 0,192 1,11 6431 0,682 3,02 2,316
31 M1 9,284 0,314 n.a. 5717 0,992 2,89 3,706
32 M1d 9,250 0,310 n.a. 5663 1,000 2,85 3,660
33 L26 9,250 0,280 n.a. 5884 0,887 7,18 3,326
34 L26d 9,234 0,267 n.a. 5953 0,886 6,91 3,173
35 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
36 P2 9,234 0,335 1,03 6215 1,138 10,81 0,394
37 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
38 L20 9,217 0,109 1,28 7219 0,416 7,62 1,371
39 L20d 9,234 0,143 n.a. 6134 0,468 7,45 1,765
40 L23 9,234 0,268 n.a. 5822 0,898 2,95 3,177
41 L23d 9,234 0,228 1,07 6726 0,808 3,14 2,730
42 M4 9,234 0,235 n.a. 5884 0,774 7,27 2,805
102
43 M4d 9,234 0,239 n.a. 5933 0,760 7,40 2,848
44 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
45 P2 9,217 0,327 1,07 6377 1,111 10,69 0,386
46 L1 9,234 0,199 n.a. 5877 0,675 7,24 2,398
47 L1d 9,234 0,200 n.a. 6156 0,652 7,36 2,404
48 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
49 P2 9,217 0,328 1,06 6346 1,113 10,90 0,387
50 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
51 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
Average: 9,229 0,501 1,071 6.163,975 1,648 8,220 1,958
Rel.Std.Dev: 0,667 % 156,710 % 5,731 % 5,047 % ######## 32,198 % 61,523 %
103
No. Name Time Area Asymmetry(EP) Plates(EP) Height Resolution(EP) Amount
min nC*min nC ug/mL
Maltose Maltose Maltose Maltose Maltose Maltose Maltose
ED_1 ED_1 ED_1 ED_1 ED_1 ED_1 ED_1
1 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
2 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
3 P0 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
4 P0 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
5 P1 15,500 0,310 0,99 7381 0,681 8,51 0,200
6 P1 15,684 0,306 1,05 7251 0,666 8,40 0,197
7 P2 15,784 0,639 1,05 7194 1,357 7,74 0,403
8 P2 15,784 0,639 1,06 6760 1,338 7,85 0,403
9 P3 15,800 1,609 1,03 6958 3,373 8,04 1,003
10 P3 15,784 1,620 1,07 6765 3,362 8,09 1,010
11 P4 15,800 3,224 1,07 6865 6,682 8,34 2,003
12 P4 15,800 3,220 1,08 6800 6,655 8,27 2,000
13 P5 15,784 6,494 1,10 6770 13,315 8,34 4,026
14 P5 15,800 6,452 1,07 6769 13,249 8,36 4,001
15 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
16 P2 15,784 0,629 1,05 6846 1,323 8,45 0,397
17 1300448 15,850 0,601 1,04 5711 1,142 8,19 3,797
18 1300448d 15,834 0,581 1,08 5970 1,143 8,24 3,671
19 I8 15,750 0,060 1,52 9312 0,150 8,94 0,449
20 I8d 15,800 0,062 1,02 9914 0,165 8,81 0,464
21 L2 15,834 0,177 0,95 7093 0,393 8,45 1,171
22 L2d 15,800 0,193 1,01 7303 0,413 8,63 1,269
23 R1 15,850 0,185 1,07 6535 0,384 8,42 1,219
24 R1d 15,800 0,205 0,81 6974 0,415 8,52 1,346
25 L28 15,867 0,089 0,99 8917 0,222 8,84 0,626
26 L28d 15,800 0,092 1,01 9235 0,231 8,98 0,643
27 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
28 P2 15,784 0,571 1,04 7081 1,230 8,75 0,361
29 I10 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
30 I10d 15,800 0,064 1,01 9470 0,164 8,85 0,470
31 M1 15,767 0,048 1,19 11275 0,135 9,13 0,375
32 M1d 15,800 0,050 0,87 10964 0,142 9,07 0,383
33 L26 15,850 0,244 1,03 6549 0,506 8,46 1,589
34 L26d 15,784 0,248 1,01 7113 0,524 8,74 1,609
35 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
36 P2 15,767 0,483 1,05 7190 1,041 9,02 0,306
37 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
38 L20 15,784 0,429 0,88 6466 0,816 9,22 2,731
39 L20d 15,734 0,459 0,91 5806 0,821 8,80 2,917
40 L23 15,800 0,083 0,93 9595 0,214 9,16 0,588
41 L23d 15,717 0,095 1,18 8214 0,227 15,35 0,664
42 M4 15,784 0,135 1,18 8072 0,313 9,15 0,912
104
43 M4d 15,800 0,114 1,11 8018 0,274 9,37 0,782
44 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
45 P2 15,717 0,380 1,06 6880 0,801 9,01 0,243
46 L1 15,767 0,052 1,27 10949 0,149 9,89 0,398
47 L1d 15,717 0,056 1,27 9854 0,152 9,41 0,421
48 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
49 P2 15,700 0,285 1,14 7397 0,643 9,36 0,184
50 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
51 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
Average: 15,778 0,820 1,059 7.742,526 1,706 8,872 1,190
Rel.Std.Dev: 0,393 % 187,767 % 11,591 % 19,170 % ######## 13,259 % 96,526 %
105
No. Name Area Area Area Area Area Area Area
nC*min nC*min nC*min nC*min nC*min nC*min nC*min
Trealose Glucose Frutose Sacarose Melezitose Turanose Maltose
ED_1 ED_1 ED_1 ED_1 ED_1 ED_1 ED_1
1 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
2 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
3 P0 n.a. 0,394 0,388 0,150 n.a. n.a. n.a.
4 P0 n.a. 0,401 0,397 0,151 n.a. 0,086 n.a.
5 P1 n.a. 0,736 0,695 0,292 0,327 0,172 0,310
6 P1 n.a. 0,735 0,682 0,281 0,327 0,157 0,306
7 P2 n.a. 1,554 1,538 0,607 0,664 0,347 0,639
8 P2 n.a. 1,561 1,556 0,608 0,673 0,334 0,639
9 P3 n.a. 3,614 3,456 1,497 1,665 0,853 1,609
10 P3 n.a. 3,635 3,467 1,507 1,659 0,869 1,620
11 P4 n.a. 7,158 6,896 3,113 3,274 1,730 3,224
12 P4 n.a. 7,202 6,979 3,495 3,312 1,752 3,220
13 P5 n.a. 14,166 13,482 6,264 6,522 3,518 6,494
14 P5 n.a. 14,143 13,587 6,354 6,526 3,491 6,452
15 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
16 P2 n.a. 1,562 1,557 0,585 0,667 0,333 0,629
17 1300448 n.a. 9,088 12,850 0,932 0,167 0,105 0,601
18 1300448d n.a. 9,066 12,825 0,903 0,147 0,116 0,581
19 I8 n.a. 9,662 12,006 0,067 0,256 0,157 0,060
20 I8d n.a. 9,666 11,981 0,073 0,247 0,163 0,062
21 L2 n.a. 8,549 11,581 0,088 0,330 0,273 0,177
22 L2d n.a. 8,533 11,629 0,086 0,343 0,261 0,193
23 R1 n.a. 8,226 11,448 0,121 0,300 0,240 0,185
24 R1d n.a. 8,255 11,523 0,146 0,308 0,240 0,205
25 L28 n.a. 9,291 12,345 0,063 0,209 0,157 0,089
26 L28d n.a. 9,310 12,359 0,064 0,223 0,161 0,092
27 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
28 P2 n.a. 1,559 1,577 0,625 0,655 0,333 0,571
29 I10 n.a. 9,893 10,912 0,116 0,331 0,229 n.a.
30 I10d n.a. 9,898 10,912 0,130 0,331 0,192 0,064
31 M1 n.a. 5,962 10,450 0,277 1,084 0,314 0,048
32 M1d n.a. 5,957 10,443 0,262 1,081 0,310 0,050
33 L26 n.a. 8,405 12,364 0,099 0,327 0,280 0,244
34 L26d n.a. 8,437 12,336 0,123 0,324 0,267 0,248
35 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
36 P2 n.a. 1,552 1,548 0,566 0,659 0,335 0,483
37 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
38 L20 n.a. 9,770 11,736 0,160 0,193 0,109 0,429
39 L20d n.a. 9,734 11,711 0,159 0,207 0,143 0,459
40 L23 n.a. 6,996 11,345 0,096 0,627 0,268 0,083
41 L23d n.a. 6,988 11,360 0,093 0,602 0,228 0,095
42 M4 n.a. 10,685 11,497 0,018 0,278 0,235 0,135
43 M4d n.a. 10,617 11,551 0,024 0,269 0,239 0,114
44 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
45 P2 n.a. 1,532 1,481 0,462 0,663 0,327 0,380
46 L1 n.a. 11,022 11,116 0,022 0,222 0,199 0,052
47 L1d n.a. 11,079 11,041 0,025 0,207 0,200 0,056
106
48 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
49 P2 n.a. 1,547 1,537 0,496 0,665 0,328 0,285
50 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
51 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
Sum: 278,141 340,143 31,200 36,873 20,050 31,179 0,000
Average: 6,784 8,296 0,761 0,945 0,501 0,820 #¡DIV/0!
Rel.Std.Dev: 58,758 % 58,538 % ########158,479
% 156,710 %187,767
% #¡DIV/0!
No. Name Height Height Height Height Height Height Height
107
nC nC nC nC nC nC nC
Trealose Glucose Frutose Sacarose Melezitose Turanose Maltose
ED_1 ED_1 ED_1 ED_1 ED_1 ED_1 ED_1
1 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
2 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
3 P0 n.a. 2,375 2,052 0,739 n.a. n.a. n.a.
4 P0 n.a. 2,377 2,080 0,734 n.a. 0,300 n.a.
5 P1 n.a. 4,357 3,655 1,432 1,278 0,600 0,681
6 P1 n.a. 4,363 3,678 1,418 1,265 0,563 0,666
7 P2 n.a. 9,184 7,982 2,878 2,520 1,163 1,357
8 P2 n.a. 9,248 8,041 2,908 2,541 1,133 1,338
9 P3 n.a. 21,218 17,941 7,171 6,246 2,852 3,373
10 P3 n.a. 21,461 18,004 7,168 6,250 2,850 3,362
11 P4 n.a. 41,875 35,250 14,218 12,287 5,661 6,682
12 P4 n.a. 42,070 35,448 14,388 12,309 5,671 6,655
13 P5 n.a. 82,628 67,925 27,864 24,215 11,327 13,315
14 P5 n.a. 82,402 68,159 28,083 24,201 11,268 13,249
15 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
16 P2 n.a. 9,267 8,227 2,859 2,512 1,127 1,323
17 1300448 n.a. 53,859 67,694 4,226 0,596 0,366 1,142
18 1300448d n.a. 53,824 67,570 4,166 0,568 0,387 1,143
19 I8 n.a. 57,389 62,907 0,331 0,949 0,516 0,150
20 I8d n.a. 57,366 63,029 0,324 0,920 0,538 0,165
21 L2 n.a. 50,601 60,729 0,436 1,454 0,862 0,393
22 L2d n.a. 50,888 61,224 0,417 1,471 0,856 0,413
23 R1 n.a. 48,861 59,691 0,552 1,310 0,829 0,384
24 R1d n.a. 48,940 60,426 0,585 1,320 0,842 0,415
25 L28 n.a. 55,032 64,384 0,330 0,803 0,522 0,222
26 L28d n.a. 55,089 64,573 0,301 0,804 0,552 0,231
27 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
28 P2 n.a. 9,184 8,202 2,844 2,483 1,136 1,230
29 I10 n.a. 58,660 56,844 0,525 1,370 0,722 n.a.
30 I10d n.a. 58,624 57,013 0,540 1,367 0,682 0,164
31 M1 n.a. 35,045 54,980 1,203 3,678 0,992 0,135
32 M1d n.a. 35,263 55,044 1,177 3,679 1,000 0,142
33 L26 n.a. 50,129 64,621 0,466 1,195 0,887 0,506
34 L26d n.a. 49,498 64,125 0,495 1,175 0,886 0,524
35 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
36 P2 n.a. 9,147 8,129 2,650 2,489 1,138 1,041
37 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
38 L20 n.a. 57,989 62,278 0,851 0,724 0,416 0,816
39 L20d n.a. 58,201 62,424 0,860 0,748 0,468 0,821
40 L23 n.a. 41,282 60,399 0,534 2,449 0,898 0,214
41 L23d n.a. 41,446 60,408 0,521 2,455 0,808 0,227
42 M4 n.a. 63,161 61,001 0,120 1,026 0,774 0,313
43 M4d n.a. 62,947 60,802 0,133 1,026 0,760 0,274
44 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
45 P2 n.a. 9,059 7,936 2,337 2,494 1,111 0,801
46 L1 n.a. 65,174 58,216 0,148 0,818 0,675 0,149
47 L1d n.a. 65,570 58,545 0,136 0,817 0,652 0,152
48 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
49 P2 n.a. 9,165 8,026 2,321 2,500 1,113 0,643
50 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
51 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
Sum: 0,000 1.644,217 1.779,658 141,388 138,310 65,902 64,812
Average: #¡DIV/0! 40,103 43,406 3,448 3,546 1,648 1,706
Rel.Std.Dev: #¡DIV/0! 58,631 % 58,534 %188,381
% 156,524 %153,556
% 185,286
%
No. Name Amount Amount Amount Amount Amount Amount Amount
108
ug/mL ug/mL ug/mL ug/mL ug/mL ug/mL
Trealose Glucose Frutose Sacarose Melezitose Turanose Maltose
ED_1 ED_1 ED_1 ED_1 ED_1 ED_1 ED_1
1 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
2 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
3 P0 n.a. 0,0873 0,0872 0,1064 n.a. n.a. n.a.
4 P0 n.a. 0,0892 0,0900 0,1068 n.a. 0,1111 n.a.
5 P1 n.a. 0,1840 0,1808 0,1956 0,1952 0,2095 0,1995
6 P1 n.a. 0,1838 0,1770 0,1886 0,1947 0,1919 0,1971
7 P2 n.a. 0,4151 0,4378 0,3933 0,4083 0,4082 0,4030
8 P2 n.a. 0,4171 0,4434 0,3942 0,4140 0,3939 0,4033
9 P3 n.a. 0,9973 1,0223 0,9528 1,0417 0,9844 1,0031
10 P3 n.a. 1,0032 1,0255 0,9593 1,0380 1,0025 1,0099
11 P4 n.a. 1,9988 2,0702 1,9685 2,0598 1,9830 2,0028
12 P4 n.a. 2,0111 2,0956 2,2092 2,0840 2,0085 2,0001
13 P5 n.a. 3,9791 4,0770 3,9498 4,1157 4,0187 4,0259
14 P5 n.a. 3,9724 4,1090 4,0063 4,1183 3,9880 4,0005
15 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
16 P2 n.a. 0,4173 0,4435 0,3794 0,4099 0,3930 0,3966
17 1300448 n.a. 25,4513 38,8604 5,9810 0,9408 1,3316 3,7968
18 1300448d n.a. 25,3868 38,7841 5,7973 0,8137 1,4490 3,6709
19 I8 n.a. 27,0991 36,3226 0,5397 1,5054 1,9253 0,4492
20 I8d n.a. 27,1099 36,2464 0,5777 1,4464 1,9895 0,4639
21 L2 n.a. 23,8819 34,9259 0,6726 1,9670 3,2352 1,1712
22 L2d n.a. 23,8363 35,0711 0,6601 2,0486 3,0963 1,2693
23 R1 n.a. 22,9841 34,5418 0,8761 1,7794 2,8621 1,2186
24 R1d n.a. 23,0653 34,7701 1,0328 1,8301 2,8651 1,3463
25 L28 n.a. 25,9796 37,2550 0,5124 1,2030 1,9141 0,6257
26 L28d n.a. 26,0313 37,2989 0,5177 1,2900 1,9679 0,6431
27 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
28 P2 n.a. 0,4167 0,4497 0,4048 0,4024 0,3930 0,3611
29 I10 n.a. 27,7232 32,9506 0,8474 1,9772 2,7394 n.a.
30 I10d n.a. 27,7367 32,9492 0,9374 1,9761 2,3159 0,4702
31 M1 n.a. 16,5848 31,4878 1,8544 6,7304 3,7056 0,3750
32 M1d n.a. 16,5689 31,4668 1,7601 6,7152 3,6595 0,3827
33 L26 n.a. 23,5068 37,3599 0,7384 1,9482 3,3259 1,5886
34 L26d n.a. 23,5994 37,2762 0,8894 1,9306 3,1734 1,6088
35 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
36 P2 n.a. 0,4146 0,4407 0,3674 0,4052 0,3944 0,3063
37 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
38 L20 n.a. 27,3663 35,4479 1,1237 1,1010 1,3714 2,7309
39 L20d n.a. 27,2642 35,3726 1,1201 1,1894 1,7654 2,9169
40 L23 n.a. 19,5134 34,2304 0,7233 3,8422 3,1767 0,5875
41 L23d n.a. 19,4907 34,2760 0,7050 3,6897 2,7301 0,6641
42 M4 n.a. 29,9353 34,7008 0,2336 1,6380 2,8050 0,9124
43 M4d n.a. 29,7436 34,8673 0,2706 1,5802 2,8477 0,7824
44 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
45 P2 n.a. 0,4091 0,4204 0,3022 0,4075 0,3855 0,2426
46 L1 n.a. 30,8745 33,5283 0,2557 1,2862 2,3978 0,3983
47 L1d n.a. 31,0346 33,2978 0,2782 1,1915 2,4037 0,4210
48 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
49 P2 n.a. 0,4131 0,4376 0,3237 0,4088 0,3870 0,1839
50 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
51 branco n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a.
Sum: 0,000 619,177 861,296 46,113 69,324 78,306 45,230
Average: #¡DIV/0! 15,102 21,007 1,125 1,778 1,958 1,190
Rel.Std.Dev: #¡DIV/0! 82,121 % 81,330 %124,122
% 87,178 % 61,523 % 96,526 %
109
Background Signal Trend Plot and pump pressure trend plot 18:51:48 0.000 Pump_1_Pressure.Step = Auto 18:51:48 0.000 Pump_1_Pressure.Average = On 18:51:48 0.000 EDet1.Mode = IntAmp 18:51:48 0.000 EDet1.CellControl = On 18:51:48 0.000 Data_Collection_Rate = 1.00 18:51:48 0.000 pH.UpperLimit = 13.00 18:51:48 0.000 pH.LowerLimit = 10.00 18:51:48 0.000 Electrode = AgCl 18:51:48 0.000 Waveform Time = 0.00, Potential = 0.10, Ramp = On, GainRegion = Off, Integration = Off
17-06-2013 07:20:00 19-06-2013 01:00:00 20-06-2013 18:40:000
1.000
2.000
3.000
4.000
5.500 TREND Pressure
Inject Time
Mean or Target(Viewed:3519.18)
2s(Viewed:2627.12)
2s(Viewed:4411.24)
3s(Viewed:2181.08)
3s(Viewed:4857.28)
1:M
EL 2
01306
17
2 3 4 5 6 7 8 9 10
11
12 13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45 46
47
48
49
50
51
17-06-2013 07:20:00 19-06-2013 01:00:00 20-06-2013 18:40:0016,0
20,0
22,5
25,0
27,5
30,0
32,0 TREND BackgroundnC
Inject Time
Mean or Target(Viewed:25.8725)
2s(Viewed:23.1167)
2s(Viewed:28.6284)
3s(Viewed:21.7387)
3s(Viewed:30.0063)
1:M
EL
20
12 34 5 6
7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
24
25
26
27
28
29
30
31 32 33 34 35 36 37 38 39 40
41 42
43 44
45
46
47
48
49
50
51
110
18:51:48 0.000 Waveform Time = 0.20, Potential = 0.10, Ramp = On, GainRegion = On, Integration = On 18:51:48 0.000 Waveform Time = 0.40, Potential = 0.10, Ramp = On, GainRegion = Off, Integration = Off 18:51:48 0.000 Waveform Time = 0.41, Potential = -2.00, Ramp = On, GainRegion = Off, Integration = Off 18:51:48 0.000 Waveform Time = 0.42, Potential = -2.00, Ramp = On, GainRegion = Off, Integration = Off 18:51:48 0.000 Waveform Time = 0.43, Potential = 0.60, Ramp = On, GainRegion = Off, Integration = Off 18:51:48 0.000 Waveform Time = 0.44, Potential = -0.10, Ramp = On, GainRegion = Off, Integration = Off
18:51:48 0.000 Waveform Time = 0.50, Potential = -0.10, LastStep = On, Ramp = On, GainRegion = Off, Integration = Off
18:51:48 0.000 Column_TC.Mode = On 18:51:48 0.000 Column_TC.TemperatureSet = 30.00 18:51:48 0.000 Compartment_TC.Mode = On 18:51:48 0.000 Compartment_TC.TemperatureSet = 30.00 18:51:48 0.000 Wait Column_TC.TemperatureState 18:51:48 0.000 Wait finished 18:51:48 0.000 Wait Compartment_TC.TemperatureState 18:51:48 0.000 Wait finished 18:51:48 0.000 Wait SampleReady 18:51:49 0.000 Wait finished 18:51:49 0.000 Load 18:51:49 0.000 Waiting for load response on AS50LoadState. 18:52:44 0.000 Got load response 18:52:44 0.000 EDet1.Autozero 18:52:44 0.000 Flow = 0.500 18:52:44 0.000 %B = 83.0 18:52:44 0.000 %C = 0.0 18:52:44 0.000 %D = 0.0 18:52:44 0.000 Wait CycleTimeState 18:52:44 0.000 Wait finished 18:52:44 0.000 Inject 18:52:44 0.000 Injecting from vial position 1. 18:52:44 0.000 Injection Volume is 500.0 µl. 18:52:44 0.000 Wait InjectState 18:52:45 0.000 Wait finished 18:52:45 0.000 Pump_1_Pressure.AcqOn 18:52:45 0.000 ED_1.AcqOn 18:52:45 0.000 The pH at Acquisition start = 12.0. 18:52:45 0.000 ED_1_Total.AcqOn 18:52:45 0.000 The pH at Acquisition start = 12.0. 18:52:45 0.000 Sampler.ReleaseExclusiveAccess 18:52:45 0.000 Exclusive access finished. 18:52:45 0.001 Flow = 0.500 18:52:45 0.001 %B = 83.0 18:52:45 0.001 %C = 0.0 18:52:45 0.001 %D = 0.0 18:53:15 0.500 Log Pressure: 3505.4 [psi] 18:53:15 0.500 Log Background: 28.4 [nC] 19:17:45 25.000 Flow = 0.500 19:17:45 25.000 %B Gradient Start = 83.0, End = 0.0, Duration = 0.100 19:17:45 25.000 %C = 0.0 19:17:45 25.000 %D = 0.0 19:17:51 25.100 Pump_1_Pressure.AcqOff 19:17:51 25.100 Flow = 0.500 19:17:51 25.100 %B = 0.0 19:17:51 25.100 %C = 0.0 19:17:51 25.100 %D = 0.0 19:17:51 25.100 Log pH.Value: 12.05
111
19:17:51 25.100 Compartment_TC.ReleaseExclusiveAccess 19:17:51 25.100 Exclusive access finished. 19:17:51 25.100 Column_TC.ReleaseExclusiveAccess 19:17:51 25.100 Exclusive access finished. 19:27:51 35.100 Flow = 0.500 19:27:51 35.100 %B Gradient Start = 0.0, End = 83.0, Duration = 0.100 19:27:51 35.100 %C = 0.0 19:27:51 35.100 %D = 0.0 19:27:57 35.200 Flow = 0.500 19:27:57 35.200 %B = 83.0 19:27:57 35.200 %C = 0.0 19:27:57 35.200 %D = 0.0 19:47:57 55.200 Flow = 0.500 19:47:57 55.200 %B = 83.0 19:47:57 55.200 %C = 0.0 19:47:57 55.200 %D = 0.0 20:02:57 70.200 ED_1.AcqOff 20:02:57 70.200 ED_1_Total.AcqOff 20:03:04 End of sample "branco".
