CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA

• La cromatografía en columna fue la técnica de separación utilizada por Tswett en 1903 para separar clorofila.

CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA • En este método se empaca un tubo de vidrio, tal como una bureta,

con un adsorbente (fase estacionaria) como la gel de sílice (sílica gel: SiO2 xH2O) finamente molida, alúmina ( Al2O3xH2O), carbonato de calcio CaCO3, celulosa o florisil (Polímero de silicona fluorada). Una cantidad de muestra de la mezcla que se desea separar se adsorbe en la parte superior del absorbente

Separación de los componentes de una mezcla.

ADSORBENTES Y RETENCIÓN

Papel Celulosa Almidón Azúcares Silicato de magnesio Sulfato de calcio Ácido silícico Gel de síliceFlorisil Óxido de magnesio Óxido de aluminio Alúmina básicaAlúmina ácida

Incrementa la capacidad de retención

Polaridad del material adsorbente

Polaridad de los componentes de la mezcla

A mayor polaridad, mayor será la retención y más difícil será mover cada componente de la mezcla a través de la columna.

ADSORBENTES Y RETENCIÓN

Alúmina A. básica es útil para separar aminas y compuestos sensibles a la acidez. A. Ácida es útil para separar ácidos carboxílicos, aminoácidos y compuestos sensibles a las bases. A. Neutra se usa para compuestos no ácidos y no básicos, así como para compuestos sensibles tanto a ácidos como a bases.

Gel de sílice y Florisil Se utilizan ampliamente con una variedad de compuestos orgánicos, incluidos los alcoholes, cetonas, ésteres, compuestos azo, aminas y ácidos carboxílicos.

Celulosa, almidón y azúcares Son utiles para algunos productos naturales muy sensibles a las interacciones ácido-base.

DISOLVENTE

• En ocasiones se encuentra que un solo disolvente separa todos los componentes de la mezcla, en otros casos, es necesario encontrar una mezcla que pueda separarlos.

Elusión de compuestos

Hidrocarburos AlquenosÉteresDerivados halogenos AromaticoasAcetonas Aldehidos Ésteres Alcoholes Aminas Ácidos y bases fuertes

Más rápidos (Eluirán con disolventes poco polares)

Orden de Elución

Más lentos (Necesitan disolventes polares)

• Por lo general, se comienza con un disolvente de bajo poder eluyente para separar los compuestos que son débilmente retenidos por la columna, luego aumenta de forma gradual el poder eluyente para obligar que los componentes adsorbidos con más fuerza, bajen por la columna.

Formación de fisuras

Preparación de la columna

La preparación correcta de la columna de cromatografía es

crítica para su éxito.

Si el adsorbente tiene fisuras, canales o burbujas

de aire, o si tiene una superficie irregular o fuera de la horizontal, será imposible

obtener una separación completa de la mezcla.

Preparación de la columna

Sujetar con unas pinzas de tres dedos la columna de cromatografía en posición

vertical.

Llenar la columna a tres cuartas partes con elutente.

Colocar una pequeña cantidad de algodón en el fondo de la

columna.

Drenar una pequeña cantidad de disolvente y compactar el algodón con la varilla hasta

eliminar cualquier burbija que se haya atrapado.

Colocar un embudo en la parte superior de la columna y agregar arena formando una

capa de 1cm arriba del algodón y se permite drenar el

disolvente.

Adicionar la suspension del adsorbente

Adicionar lentamente y con agitación la suspensión a la

columna, mantener la llave de paso abierta y recibir el

disolvente en un matraz.

Golpear suavemente de forma constante la columna durante

la operación de llenado.

Añadir disolvente del matraz colector a la suspensión en

caso de que espese demasiado antes de ser añadida a la columna

El disolvente recuperado deberá reciclarse varias veces por la columna para asegurar un asentamiento completo y

un empacado firma del absorbente a la columna.

Método de la suspensión o lechada

Preparación de la columna Sujetar con unas pinzas de tres dedos la columna de cromatografía en posición

vertical.

Llenar la columna hasta la mitad con eluyente

Añadir el adsorbente seco poco a poco, mientras se

golpea la columna con suavidad y se permite que

el eluyente fluya lentamente.

El nivel de adsorbente haya alcanzado la altura

deseada.

Pasar el disolvente drenado, varias veces por la columna para asegurar

el asentamiento del adsorbente.

Cuidar que el adsorbente no se seque y que esté al nivel y sin irregularidades

Añadir una pequeña capa de arena sobre la

superficie del adsorbente.

Método de empacado en seco

APLICACIÓN DE LA MUESTRA A LA COLUMNA

Elusión de la muestra

Monitorear el progreso de la cromatografía

Cromatografía en columna seca

Columna empaquetada sin disolvente No se cambia el disolvente

Cromatografía rápida (flash)

Drenar disolvente hasta 0.5 cm de la fase estacionaria.

Disolver la mezcla en la mínima cantidad de disolvente.

Colocar mezcla a separar en la superficie de la columna.

Drenar lentamente el disolvente hasta que la muestra llegue a la superficie del disolvente.

Aplicación de la muestra a la columna rápida (flash)

Adicionar eluyente a la muestra gota a gota con pipeta pasteur, posteriormente con pizeta.

Abrir la llave de la colimna y aplicar presión de aire.

Colectar fracciones pequeñas (5mL a 10 mL) en frascos numerados.

Elusión de la muestra en columna

flash

Ventajas y desventajas de la cromatografía en columna

Ventajas Desventajas•Se pueden purificar cantidades relativamente pequeñas de muestra.

•Toma gran cantidad de tiempo para establecer condiciones adecuadas para desarrollar la cromatografía cuando se trata de sustancias nuevas.

•Es un método de purificación más completo que la destilación o recristalización.

•No se puede utilizar para grandes cantidades de muestra a separar.

•Las columnas cromatográficas consisten en un número de zonas adyacentes en cada una de las cuales hay suficiente espacio para que un analito esté en equilibrio entre dos fases.

• Cada una de estas zonas se conoce con el nombre de plato teórico (de los que hay N en cada columna).

•La longitud de una columna contiene una altura del plato, H, que tiene unidades de longitud, normalmente en micras.

Teoría de la eficiencia de la columna cromatográfica

•El valor numérico de N y H para cada columna en particular es expresado en referencia a cada analito.

•La altura del plato está relacionada con la anchura del pico del analito y la distancia que recorre dentro de la columna, X:

• σ: es un estándar de desviación de la banda gaussiana.

•Para los picos gaussianos simétricos la anchura de la base es igual a 4σ y la anchura del pico al punto de inflexión, ωi es igual a 2σ. Por lo tanto el valor de H puede ser calculado desde el cromatograma midiendo la anchura del pico.

•El numero de platos teóricos en la columna entera viene dado por:

Donde L es la longitud de la columna

•Si consideramos la posición del pico a X=L con el hecho de que la anchura del pico en su base es ω, obtenida de las tangentes dibujadas desde los dos puntos con más pendiente del pico, es igual a 4σ, la ecuación anterior se convierte en:

•Si en ligar de medir L y ω en unidades de longitud se hace en tuempo, la ecuación quedará:

•La medición del ancho del pico , es más confible cuando se realiza a la mitad de la altura del pico, con la cual se puede utilizar:

•También puede hacerse en función de la altura y área del pico:

•Es importante que tanto TR, W ó W1/2 ó área/altura se expresen en las mismas unidades ya que N es adimensional.

•Para que un sistema sea eficiente, se necesitan fases poco viscosas, espesores de pelicula delgados y columnas de poco diámetro, para que se favorezca la transferencia de masa. La velocidad promedio de la fase móvil tambien afecta la altura del pico, por lo que hay una velocidad óptima para obtener el máximo de eficiencia. Generalmente se trabaja a fluidos mayores de éste para no perder demasiado tiempo en análisis