UNIVERSIDAD AUTONOMA DE GUERRERO

UNIDAD DE CIENCIAS DE DESARROLLO REGIONAL

DOCTORADO EN CIENCIAS AMBIENTALES

Seminario de Tesis I

Agentes entomopatógenos para la regulación de

poblaciones de Aedes aegypti transmisor de

chikungunya, dengue y fiebre Zika

Presenta:

MSP Abel Jiménez Alejo

Acapulco, Guerrero agosto de 2015

Tema de tesis

Interacción patógeno-hospedero.

Estado del arte

Palabras clave: entomopathogenic fungi, Aedes aegypti, nematodos, Bacillus

thuringiensis.

De las enfermedades infecciosas olvidadas un grupo importante son las

transmitidas por vector, las cuales están relacionadas fuertemente con la pobreza

y son altamente vulnerables a los cambios ambientales (Dujardin et al; 2010). El

mosquito Aedes aegypti es transmisor del virus de dengue, chikungunya (OMS,

2015) y virus zika (Derraik et al; 2015). El dengue es una enfermedad viral

transmitida por artrópodos, se estima que hay 390 millones de infecciones de

dengue por año, de los cuales 96 millones se manifiestan aparentemente (Bhatt

et al; 2013). La fiebre chikungunya es una enfermedad parecida al dengue que se

acentúa en las articulaciones las complicaciones graves no son frecuentes, sin

embargo en adultos mayores y personas con alguna enfermedad crónica

(diabetes, tuberculosis o VIH) puede contribuir a la muerte; hasta el 26 de junio de

2015 se habían reportado 387,115 casos sospechosos y se confirmaron 11,792

en la región del Continente Americano (OMS; 2015). La fiebre del Zika es una

enfermedad similar al del dengue, es causada por el virus Zika (ZIKV), y consiste

en fiebre leve, salpullido, dolor de cabeza, dolor en las articulaciones, dolor

muscular, malestar general y conjuntivitis no purulenta que ocurre entre tres a

doce días después de la picadura del mosquito; de acuerdo a la Dirección de

Epidemiologia de la Secretaria de Salud (2015) no hay casos de fiebre zika en

México ni importados ni autóctonos sin embargo es inevitable descartar el riesgo

de propagación del virus como sucedió con chikungunya por la presencia del

vector que transmite dichas enfermedades; el virus ya se encuentra en ocho

estados Brasil.

La única forma de disminuir las enfermedades transmitidas por Ae. aegypti es

reducir la densidad vectorial, para ello, actualmente se utilizan estrategias

verticales que incluyen uso de plaguicidas las cuales han fallado debido a que el

mosquito vector ha desarrollado resistencia a insecticidas organoclorados,

organofosforados, carbamatos y piretroides (De la Cruz Gallardo et al; 2014)

respecto a los piretroides se ha demostrado en Malasia (Ishak et al; 2015), en la

isla de Martinica (Marcombe et al; 2012) y en La Guayana Francesa (Dusfour et

al; 2011); en México particularmente en el estado de Guerrero también se ha

demostrado la resistencia a los piretroides (Aponte et al; 2013, Chino et al; 2014 y

Che et al; 2015) lo cual justifica el uso de grupos químicos distintos a los

piretroides con el consecuente impacto al ambiente y a la salud.

Por lo anterior es factible investigar nuevas alternativas amigables con el medio

ambiente, en este sentido Howard (2011), considera que una de las alternativas

es el uso de hongos entomopatógenos porque además de no contaminar son muy

eficaces para infectar o matar mosquitos, aunque las poblaciones sean

resistentes a los insecticidas.

Por otro lado Santos et al; (2009), han demostrado que la humedad es un factor

muy importante para que el hongo Metharizium anisopliae cumpla su función

ovicida, tales condiciones de saturación se dan fácilmente en las lluvias, sin

embargo en criaderos a la sombra y protegidos de la luz UV también son

adecuados para un control eficaz con M. anisopliae.

Diversos estudios (Benserradj y Mihoubi; 2014, Priyadarshini y

Lekeshmanaswamy; 2014 y Hazrat Bilal et al; 2012) han demostrado la

patogenicidad de M. anisopliae sobre larvas de 4º instar de Culex pipiens, Ae.

aegypti y Ae. albopictus bajo condiciones de laboratorio y consideran que es una

buena alternativa para reducir las poblaciones de los mosquitos. Éste hongo

entomopatógeno puede ser considerado como un bioinsecticida seguro que no

afecta al ser humano o los animales domésticos.

Se ha demostrado que el tegumento larvario es más favorable para la colonización

por M. anisopliae, sin embargo con el tegumento de los mosquitos la eficacia de

los conidios se reduce al 50% en medios acuosos, por lo que es más prometedor

trabajar con los adultos (Vieira et al; 2013).

En este sentido Munguía et al. (2011), transmitieron el hongo Beauveria bassiana

a través de la copula de machos a hembras de Ae. aegypti y obtuvieron 90% de

mortalidad en 15 días; en otro estudio realizado por Villanueva et al. (2011)

evaluaron dos cepas de M. anisopliae una de alta virulencia y otra de baja

virulencia sobre adultos de Ae. aegypti y en donde a través de la copula se

diseminaron las cepas y se logró reducir la fecundidad en un 99% con una alta

mortalidad y permitió una baja tasa de fecundación.

Por su parte Paula et al. (2011), encontró que la susceptibilidad de las hembras de

Ae. aegypti se modifica después de su alimentación con sangre, debido a que

están llenas y se ponen a reposar sobre los paños negros impregnados de los

hongos entomopatógenos y se optimizan las tasas de infección.

También Mendoza-Ledesma et al. (2015), consideran que el hongo Gliocladium

virens en combinación con el insecticida clorpirifos-etil puede ser una alternativa

para disminuir las poblaciones de Ae. aegypti en Tapachula, Chiapas.

Así también Paula et al. (2013), midieron la eficiencia de paños impregnados con

M. anisopliae con el imidacloprid y paños sin tratamiento como control,

demostrando la eficiencia del tratamiento en condiciones simuladas de

intradomicilio, sin controlar la humedad o la temperatura, además consideran muy

importante ocupar paños negros.

Del mismo modo Carolino et al; (2014), monitorearon la persistencia de M.

anisopliae en condiciones simuladas de campo para controlar a Ae. aegypti,

consideraron que al añadir el hongo más una mezcla de aceite vegetales y

sintéticos aumenta la persistencia del entomopatógeno y solo es necesario

cambiar el paño negro cada mes.

Existen estudios que proponen controlar los mosquitos vectores con hongos

entomopatógenos pero en combinación con insecticidas (Paula et al; 2011 y

Ledesma et al; 2015) para sinergisar su efecto; sin embargo ese sinergismo se

puede lograr también utilizando extractos vegetables que tienen actividad larvicida

como el estudio de Angel-Ríos et al. (2015), en donde evaluaron por separado

extractos de paraíso, guanábano e higuerilla y dos especies de hongos

entomopatógenos (M. anisopliae y Paecilomyces sp) sobre larvas del gusano

cogollero (Spodoptera frugiperda) a nivel de laboratorio con M. anisopliae y

encontraron 55% de mortalidad

El uso de hongos entomopatógenos es una alternativa amigable con el ambiente

para el control del vector del dengue y reducir el impacto de los insumos químicos

al ambiente, de ahí la importancia de este estudio.

Problema

Dengue, chikungunya y virus zika son enfermedades de importancia en la salud

pública a nivel mundial; el dengue provoca la muerte si no se atiende a tiempo y la

otra es incapacitante y puede contribuir a la muerte en personas de edad

avanzada o que padecen enfermedades crónicas como diabetes, tuberculosis o

VIH. Guerrero es uno de los estados de México que a lo largo de la historia del

dengue siempre ha estado dentro de los primeros lugares en casos de dengue y

recientemente se han reportado de manera masiva casos por fiebre Chikungunya

a finales de 2014 y principios de 2015 principalmente en municipios de la región

Costa Grande, Costa Chica y Acapulco.

Tales municipios cumplen con las características adecuadas para la reproducción

del vector Ae aegypti transmisor de Dengue y Chikungunya el cual se reproduce

en agua limpia.

El control del mosquito vector de dichas enfermedades desde hace más de 40

años se realiza con el uso de insecticidas principalmente por aspersiones, rociado

espacial y la colocación de abate en los depósitos de agua limpia, adicionalmente

se ha utilizado la descacharrización, sin embargo dichas medidas no han tenido

efecto, ya que por un lado la enfermedad de dengue sigue en aumento año con

año y con la introducción de casos de chikungunya la situación se complica.

El mosquito ha creado resistencia a los insecticidas empleados en su control por lo

cual es pertinente investigar alternativas ecológicas en la lucha contra estas

enfermedades. Por lo cual se plantean las siguientes preguntas de investigación.

¿Es posible controlar el mosquito que transmite el dengue y chikungunya a través

del uso de agentes entomopatógenos?

¿Cuál será la fase más viable del mosquito para atacar con los hongos

entomopatogenos?

¿Cuál será la dosis letal media y noventa y cinco de un hongo entomopatógeno

para infectar larvas y mosquitos de Aedes aegypti?

¿Cuál será la dosis letal media y noventa y cinco de un nematodo

entomopatógeno para infectar larvas y mosquitos de Aedes aegypti?

¿Cuál será la dosis letal media y noventa y cinco de btacillus thurringiensis var.

israeliensis para infectar larvas y mosquitos de Aedes aegypti?

¿Cuál será la actitud que tienen las personas que viven en Acapulco sobre el uso

de hongos entomopatogenos en su agua limpia?

¿Cuál será el método más eficaz para aplicar los hongos entomopatógenos en los

recipientes de agua de los hogares?

¿Cada cuánto hay que aplicar o reemplazar los hongos para que el efecto se

mantenga constante?

¿Existirá la posibilidad de incorporar el uso de hongos entomopatogenos como

parte del programa de vectores para controlar el vector de dengue y

chikungunya?

Variable dependiente: reducción de la densidad vectorial de Aedes aegypti.

Variables independientes: patogenicidad del hongo, interacción hongos-

mosquitos, interacción hongos-larvas, aceptación del uso de hongos

entomopatógenos, suministro de agua, uso del agua, tiempo de efectividad de los

hongos.

Hipótesis

En la interacción huésped-patógeno formada por los cosmopolitas Aedes aegypti-

hongos imperfectos, la variación genética inherente y aleatoria ha seleccionado

poblaciones del vector más susceptible a las micosis pero también a hongos más

patógenos, y esta asociación sigue patrones desconocidos.

Objetivo general

Determinar la patogenicidad de hongos entomopatogenos nativos aislados en

Guerrero sobre Aedes aegypti bajo condiciones controladas de laboratorio y su

manejo en campo para el uso como posibles controladores biológicos.

Objetivos específicos

Identificar macroscópicamente cepas de hongos entomopatógenos de

suelos e insectos de la localidad Acapulco y algunas localidades de la

región Costa chica de Guerrero.

Realizar el cultivo d los hongos entomopatógenos aislados.

Implementar criaderos a nivel laboratorio para obtener larvas de cuarto

instar y adultos de Aedes aegypti.

Evaluar la patogenicidad de hongos aislados contra larvas de cuarto instar

de Aedes aegypti, así como su efecto en la sobrevivencia.

Evaluar la patogenicidad de hongos aislados sobre adultos de Aedes

aegypti, así como su efecto en la fecundidad, fertilidad y sobrevivencia.

Determinar la cepa más patógena de los diferentes hongos aislados para

larvas de cuarto instar y adultos de Aedes aegypti en condiciones de

laboratorio.

Evaluar la cepa más patógena bajo condiciones de campo para comprobar

su efectividad en el control de Aedes aegypti en varias localidades de

Acapulco con altos índices de casos de dengue y chikungunya.

Evaluar la implementación de los hongos entomopatogenos a través de la

mediciones de índices entomológicos de estados larvales y pupales y de

adultos de Aedes aegypti.

Material y métodos

Colección y cría de mosquitos

Los experimentos se realizarán en el laboratorio de Control Biológico de la Unidad

Académica de Desarrollo Regional de la Universidad Autónoma de Guerrero se

establecerá una colonia de mosquitos de Ae. aegypti.

Para establecer la colonia de mosquitos se colectarán, huevos de Aedes aegypti

mediante el uso de ovitrampas colocadas en cinco localidades del Municipio de

Acapulco. Se colocará una misma cantidad de ovitrampas en cada localidad las

ovitrampas serán elaboradas con botellas de plástico de 1L y adentro se le pondrá

papel filtro para que las hembras grávidas ahí coloquen sus huevos.

Cada papel filtro se guardara en una bolsa hermética y será transportado al

Laboratorio cada bolsa se etiquetara debidamente con la información siguiente:

número de ovitrampa, localidad y fecha. La eclosión de huevos se inducirá

sumergiendo los huevos en agua tibia (35ºC) y se les adicionará 0.5 g de extracto

de levadura. Las larvas se alimentarán diariamente con 0.5g de comida para

peces distribuida uniformemente en la superficie hasta llevarlos a larvas de cuarto

instar, cuando sean adultos los mosquitos serán alimentados con una solución de

sacarosa al 10% suministrada a través de un algodón.

Colección y aislamiento de hongos entomopatógenos

Los hongos serán colectados de suelos cercanos a cultivos de maíz y de insectos

infectados por hongos en diferentes localidades. Las muestras se colocarán en

cajas de petri con medio papa-dextrosa-agar (PDA), las cajas en oscuridad y a

una temperatura de 22 ± 3°C. Los hongos serán identificados en base a sus

características morfológicas: el color, forma de la colonia, formas y color de

estructuras morfológicas, según las claves y descripciones de Subramanian (1971)

Egorova (1980) y Barnet y Hunter (1998). Después de obtener las conidias para

infectar los adultos y las larvas de Aedes aegypti.

Bioensayos

Se colocaran en cámaras de infecciones adultos para lograr su infección con los

hongos entomopatogenos en condiciones de laboratorio, los adultos serán

alimentados con una solución azucarada de sacarosa al 10% para que se

alimenten durante el tiempo del ensayo se llevara a cabo una bitácora donde la

mortalidad se registrara diariamente. Los adultos muertos diariamente se

colocaran cajas Petri con medio de cultivo PDA. Las cajas se sellarán e incubarán

a una temperatura de 25±2 °C y después de 5 días se observarán al microscopio

estereoscópico para evidenciar cualquier crecimiento fúngico.

Las conidias de los hongos serán probadas contra las larvas de mosquito

mediante la adición suspensión fúngica de vasos de plástico que contendrá 50 ml

de agua destilada con 25 larvas del cuarto estadio. Cada vaso estará inoculado

con 1 ml de suspensiones de hongos (109, 108, 107, 106 y 105 conidia / ml).

Tratamientos de control se llevaran a cabo por adición de 10 ml de agua destilada.

Cada ensayo se llevará a cabo tres veces. Las larvas serán alimentadas con

alimento para peces, la mortalidad de larvas será evaluada sobre una base diaria

de 15 días.

Pruebas de campo

Después de analizar la bibliografía adecuada se elegirá la técnica más adecuada

para comprobar la efectividad de los hongos sobre mosquitos y larvas de Aedes

aegypti en condiciones de campo.

Encuestas entomológicas

Se diseñara un formato para registrar la información de la inspección

entomológica, incluyendo tipo y ubicación del recipiente; presencia y tiempo del

abate en el recipiente; estación del año y la presencia de larvas y/o pupas.

Se realizarán dos mediciones con seguimiento a los hogares, la finalidad fue

documentar los potenciales criaderos del vector Aedes aegypti;

Previo consentimiento informado en cada hogar se realizará la inspección

entomológica de los recipientes con agua. Sistemáticamente la revisión se hará

dentro y fuera de la casa (peridomicilio) en el sentido de las manecillas del reloj.

Un criadero será positivo cuando se encuentre al menos una larva y/o pupa en el

recipiente.

Recolección, clasificación y cuantificación de larvas y pupas

Para recolectar todas las larvas y pupas se utilizarán pipetas o dullas de plástico y

coladores adaptados con un mango de madera, en el caso de los recipientes que

estén bajo la sombra se usarán linternas para facilitar la recolección. Las larvas y

pupas se guardarán en bolsas de plástico debidamente identificadas con la

siguiente información: código del hogar, nombre y número de recipiente, sitio y

fecha de recolección. Se colocarán en termos para transportarlos durante el

trabajo de campo. Posteriormente se almacenarán a -20ºC hasta el momento de

ser identificadas y cuantificadas por entomólogos en el Laboratorio de Control

Biológico de Unidad de Ciencias de Desarrollo Regional.

Para la clasificación y cuantificación se utilizarán claves taxonómicas de Ibañez-

Bernal (1994) y un microscopio estereoscópico marca Olympus CX41.

Posteriormente se conservarán en viales con alcohol al 70%.

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