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Índice

I. Introducción 3

II. Objetivos 4

III. Marco Teórico 4-5

1. Extracción del ADN vegetal 41.1El ADN vegetal 4-51.2¿Por qué funciona así la extracción de ADN vegetal? 5

IV. Materiales 5

VI. Resultados 6

1. Procedimiento: Flujo grama y representación gráfica para la extracción del ADN 6

2. Constitución de ADN 73. Utilidad aplicada a la extracción de ADN 7-84. ADN recombinante 85. Proceso de reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) 8-106. Protocolo casero para la extracción de ADN 10

VII. Conclusiones 11

VIII. Bibliografía 12

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Introducción

La genética es una disciplina biológica que ha adquirido gran importancia y relevancia durante las últimas décadas del siglo XX. Es así como, en nuestros días los conocimientos que nacen de su desarrollo influyen en el crecimiento de otras disciplinas biológicas, de la medicina y del avance tecnológico general, influyendo incluso en la calidad de vida.

El ácido desoxirribonucleico (ADN) es un ácido nucleico que contiene instrucciones genéticas usadas en el desarrollo y funcionamiento de todos los organismos vivos conocidos y algunos virus; además es responsable de su transmisión hereditaria. El papel principal de la molécula de ADN es el almacenamiento a largo plazo de información. Muchas veces, el ADN es comparado con un plano o una receta, o un código, ya que contiene las instrucciones necesarias para construir otros componentes de las células, como las proteínas y las moléculas de ARN. Los segmentos de ADN que llevan esta información genética son llamados genes, pero las otras secuencias de ADN tienen propósitos estructurales o forman parte en la regulación del uso de esta información genética.

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Objetivos

1. Realizar la extracción de ADN de tejidos vegetales y reflexionar sobre la simpleza de su composición con técnicas sencillas.

2. Observar la estructura fibrilar del ADN.

3. Establecer la relación entre el proceso de extracción y propiedades químico-físicas del ADN.

Extracción del ADN Vegetal

La extracción de ADN requiere una serie de etapas básicas: En primer lugar tiene que romperse la pared celular y la membrana plasmática para poder acceder al núcleo de la célula. A continuación debe romperse también la membrana nuclear para dejar libre el ADN.

El estudio del ADN ha llevado a un enfoque molecular y bioquímico de gran impacto en el crecimiento de los conocimientos genéticos. El análisis del ADN y la información sobre la estructura genética de un organismo nos permite visualizar la complejidad de los procesos involucrados en la expresión genética.

El acido desoxirribonucleico es una macromolécula que se encuentra en el núcleo de la célula y que es responsable de almacenar la información genética. Es una doble cadena anti-paralela organizada en una doble hélice. Está formada por unidades llamadas nucleótidos que se unen entre sí por enlaces químicos estables.

El redescubrimiento de los experimentos de Mendel realizado independientemente por De Vries, Correns y Von Tshermak en 1900, marco el inicio de la genética como disciplina organizada. Durante el crecimiento y desarrollo de esta ciencia, varios descubrimientos claves han servido de puntos de inflexión, acelerando todos ellos la velocidad a la que crecen los conocimientos en genética y, a la vez abriendo nuevos campos de investigación.

El ADN Vegetal

El ADN vegetal se encuentra en el núcleo celular, específicamente dentro de cromosomas, pero también se encuentra en los cloroplastos, ya que este organelo presenta una molécula de ADN circular y arrollada de tipo procarionte y eso le da cierta autonomía parcial con respecto al núcleo, es decir puede realizar sus propias síntesis de proteínas. El ADN de la célula vegetal se encuentra dentro del núcleo, pero además tienen dos orgánulos con su propio material genético: las mitocondrias y los cloroplastos; ambos tienen una molécula circular de ADN. El ADN que se encuentra en los genes es un componente de todas las células; una vez rotas las células, todo el

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material celular queda libre y, en presencia de detergente, se separan los componentes en base a su solubilidad. El ADN se precipita con alcohol y se separa del resto de los componentes.

¿Porqué funciona así la extracción del ADN vegetal?

Función de la sal y del aguaEl agua con una pizca de sal es una mezcla isotónica. Es para que lo que se va

a sacar de la semilla "sufra" lo menos posible.Función del detergente liquido

El detergente rompe las membranas celulares grasosas que rodean el ADN como una burbuja de jabón (parecido), dejándolo libre en el caldo junto con las proteínas y los carbohidratos.Función de las enzimas

El ablandador de carne, zumo de piña o papaya, etc., todos estos son enzimas que cortan las proteínas. Se trata de romper lo que hay dentro de la célula dejando intacto el ADN.Función del alcohol

Al añadir el alcohol se consigue separar el ADN, que tiene más afinidad con el alcohol que con el agua.

Materiales

Cebolla / Kiwi Dos tubos de Ensayo Etanol 95%(frio) Sal No-Iodada(Cloruro de Sodio) Jugo de papaya o piña fresco o

ablandador de carne

Beaker de 100 ml Mortero Detergente liquido Fenol

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Resultados

1. Procedimiento: Flujo grama y representación gráfica para la extracción del ADN

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1.Preparación de una solución

Tapón: Se prepara una

solución de sal y detergente y

10g de sal de 90 ml de agua destilada.

2. Coloque un pedazo de

cebolla/kiwi de unos 2 cm en un mortero y agregue 10 ml de la solución tapón. Macere la cebolla/kiwi

3. Decante el líquido de la mezcla en un

tubo de ensayo limpio y

agregue 1 ml de jugo

enzimático (jugo de piña).

4.Cuidadosamente agregue 10

ml de Etanol frío resbalando por las paredes

del tubo de ensayo. Deje reposar unos tres minutos hasta que se

forme una zona turbia.

5. Utilizando un palillo de madera,

extraer una maraña de

fibras mucosas blancas de ADN y colócalas en

un tubo de ensayo limpio

con una solución salina

al 4%.

6. Agregue 5 gotas de Fenol a la solución

que contiene el ADN.

* Solución de Sal y detergente; esta concentración debido a su alta concentración de iones positivos provoca que los iones negativos de la membrana fosfolipídica se rompa liberando el citosol.

* Maceramiento de el kiwi; esta acción mecánica contribuye al rompimiento de la membrana nuclear y celular.

* Jugo enzimático (jugo de piña): contiene enzimas que desnaturalizan las proteínas que contaminan el ADN.

* Mezcla de ADN y Fenol, el fenol es un indicador que en presencia de ADN se torna rosado oscuro, también se puede usar azul de metileno.

2. Constitución del ADNEl ADN está constituido por unidades llamadas nucleótidos, unidas entre

sí formando largas cadenas. A su vez, cada nucleótido está formado por tres partes:

Un fosfato. El azúcar desoxirribosa. Una base nitrogenada.

Estas últimas se dividen en dos grupos: Las bases puricas (adenina y guanina) y Las pirimidinicas (timina y citosina).

Llamadas así porque se derivan de dos compuestos, la purina y la pirimidina.

3. ¿Qué utilidad se le puede aplicar a la extracción del ADN?Existe un sin número de utilidades que puede dársele a la extracción del

ADN; puesto que a partir de aquí es que se forman las estructuras moleculares

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que regulan y mantienen en buen o mal estado el funcionamiento de nuestro cuerpo, dependiendo de la eficacia que tenga la producción de proteínas.Entre algunas de las utilidades tenemos:

Encontrar relaciones de parentesco. Detectar enfermedades que sean o no hereditarias. Identificar las causas a ciertas afecciones. Buscar solución a estas afecciones.

4. ADN RecombinanteEl ADN recombinante, o ADN recombinado, es una molécula

de ADN artificial formada de manera deliberada in vitro por la unión de secuencias de ADN provenientes de dos organismos de especies diferentes que normalmente no se encuentran juntos. Al introducirse este ADN recombinante en un organismo, se produce una modificación genética que permite la adición de un nuevo ADN al organismo, conllevando a la modificación de rasgos existentes o la expresión de nuevos rasgos. La producción de una proteína no presente en un organismo determinado y producidas a partir de ADN recombinante, se llaman proteínas recombinantes.

El proceso consiste en tomar una molécula de ADN de un organismo, sea virus, planta o una bacteria y en el laboratorio manipularla y ponerla de nuevo dentro de otro organismo. Esto se puede hacer para estudiar la expresión de un gen, para producir proteínas en el tratamiento de una enfermedad genética, vacunas o con fines económicos y científicos.

5. Definir y describir el proceso de PCRLa reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus

siglas en inglés (Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis  cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo; en teoría basta partir de una única copia de ese fragmento original, o molde.

Esta técnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificación resulta mucho más fácil identificar con una muy alta probabilidad, virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadáveres) o hacer investigación científica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificación han hecho que se convierta en una técnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.

Ciclo de amplificación

Inicio

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Este paso consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96 °C (ó 98 °C si se está usando una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto sólo es necesario para ADN polimerasas que requieran activación por calor.

Desnaturalización

En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos cadenas de las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 °C) de la muestra la forma más habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalización depende, por ejemplo, de la proporción de G+C que tenga la cadena, como también del largo de la misma. Otros métodos, raramente empleados en la técnica de la PCR, serían la adición de sales o agentes químicos capaces de realizar la desnaturalización.

Alineamiento o unión del cebador

A continuación se producirá la hibridación del cebador, es decir, el cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 °C durante 20-40 segundos (según el caso), permitiendo así el alineamiento. Los puentes de hidrógeno estables entre las cadenas de ADN (unión ADN-ADN) sólo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada.

Extensión o elongación de la cadena

Actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTP complementarios en dirección 5'→ 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso depende del ADN polimerasa que usemos. Para la polimerasa Taq, la temperatura de máxima actividad está en 75-80 °C (comúnmente 72 °C). El tiempo de extensión depende tanto del ADN polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar. Hay una regla comúnmente usada: en su temperatura óptima, la polimerasa de ADN polimerizará mil bases en un minuto.

Elongación final

Etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 °C durante 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado.

Conservación

Este es un paso que se lleva a cabo a 4-15 °C durante un tiempo indefinido para conservar la reacción a corto plazo.

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La PCR normalmente se realiza con un volumen de reacción de 15-100 μL, en pequeños tubos de 0.2-0.5 mL que se colocan en el termociclador. Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se emplean técnicas de electroforesis, que separan los fragmentos de ADN generados de acuerdo a su carga, esto es, longitud, y, en menor medida y dependiendo de la matriz empleada, a su tamaño: típicamente se emplean la electroforesis en gel de agarosa, para fragmentos grandes; en acrilamida, para los más pequeños; y, de forma más rápida y aplicable a la PCR asociada a marcaje fluorescente, la electroforesis capilar. El/los tamaño/s de los productos de la PCR vienen determinados por un marcador de peso molecular de ADN, el cual contiene fragmentos de ADN de tamaño conocido, y que se corre en el gel junto con los productos de PCR.

6. Protocolo Casero para extraer ADNIngredientes necesarios

-    Alcohol-    Detergente líquido-    Enzimas (ablanda carne) (Si no tienes, usa jugo de piña o solución limpia lentillas)-    Sal-    Agua-    Fuente de ADN (vegetales, carne, etc.)-    Vasos-    Licuadora-    Colador-    Tubo de ensayo de vidrioInstrucciones

1)  Sacar la licuadora.2)  Vierte una taza de agua fría (200 ml), junto con ½ taza del ADN elegido y sal3)  Licúa todo eso a máxima velocidad durante 15 segundos4)  Filtra la mezcla resultante con un colador de casa5)  Ahora debes echarle el detergente a ese líquido que has obtenido de la licuadora. El detergente debe ser un 1/6 de la cantidad del líquido.6)  Déjalo reposar 10 minutos7)  Pásalo a un tubo de ensayo de vidrio hasta 1/3 de su capacidad8)  Añadir una pizca de enzima al tubo de ensayo9)  Agitar suavemente para no romper el ADN (qué frágil el muchacho)10)  Agregar alcohol hasta llenar la mitad del tubo de ensayo11)  El ADN se elevará hasta la interfase y con un palito por fin podrás extraerlo

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Conclusiones

1. El ADN vegetal se encuentra en el núcleo celular, pero también se encuentra en los cloroplastos, ya que estos organelos presentan una molécula de ADN circular.

2. La estructura fibrilar del ADN se puede observar fácilmente una vez rotas las células, quedando así todo el material celular libre.

3. Las propiedades físico-químicas del ADN permiten que al añadir el alcohol (fenol) se consigue separar el ADN, que tiene más afinidad con el alcohol que con el agua.

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Bibliografía

1. Protocolos de Laboratorio de Biología molecular. Corbin. L. Ghislain. M. Dapeng .Z. 2da ed. 1998. CIP. Perú. Lima. Pg. 1-8

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