Extracción del ADNOriginal de Essy Levy, M.S. y Julie Mathern

Alianza para el Aprendizaje de Ciencias y Matemáticas (AlACiMa)

Relevancia del Aislamiento del ADN

La extracción de ADN es el primer paso en la tecnología del ADN.

• Determinación del perfil de ADN

• Clonación

• Diagnóstico de enfermedades

• Determinación de secuencias de ADN

• Transferencia génica: Organismos Modificados Genéticamente (OMG), agricultura, farmacéutica

• Pruebas ambientales, bioterrorismo

¿Cuáles son las estructuras de una célula?

Tipos de Células

Tipos de Células

Tipos de Células

Resumen del Protocolo: Extracción de ADN Genómico

• Utilización de agua como enjuague para la recogida de las células bucales

• Añadir el búfer de lisis para romper las membranas nucleares y celulares y liberar el contenido nuclear

• Utilización de la proteasa para digerir las proteínas celulares

• Precipitación del ADN con alcohol frío y alta concentración de sal.

Extracción de ADN : Paso-a-Paso

Puesto común (Puesto del Maestro)

Baño a 500C

Botella de isopropanol 91% o etanol 95%, en hielo

Puesto de trabajo de los alumnos Número

(4 Estudiantes/Puesto de trabajo )

Tubos de15 ml con 3 ml de agua 4

Microtubo rosa marcado “prot”, con 1.25 ml de proteasa rehidratada con sal 1

Tubo de 15 ml tubo marcado “lisis” con 10 ml de búfer de 1

Pipetas de plástico 6

Gradilla de hule espuma para los tubos 1

Marcador de tinta indeleble 1

Taza de papel dispensable o un beaker para sostener los 1

tubos de 15 ml y la subsiguiente colección de basura

Materiales para hacer el collar de ADN o un micortubo de1.5ml 1

Guía rápida 1

Extracción y Precipitación de ADN

Listado de Materiales

4 Estudiantes/Puesto de trabajo para un total de 36 Estudiantes

Es de vital importancia realizar una abundante recogida de células.

Para mejores resultados, asegúrese que los alumnos empleen la suficiente cantidad de tiempo recogiendo las células de la mucosa bucal.

Pueda que la colección de muestra en el tubo de 15 mL sea difícil. Puede utilizar un vaso pequeño para dispensar y coleccionar la muestra.

Protocolo de Práctica de Laboratorio

1. Obtenga del instructor un tubo de 15 mL que contenga 3 ml de agua. Marque el tubo con sus iniciales.

2. Cuidadosamente mordisquee el interior de los cachetes por 30 segundos. ¡No sirve de nada sacar sangre!

3. Tome el agua del tubo de15 mL, y con el agua enjuague por 30 segundos.

4. Cuidadosamente escupa el liquido de regreso al tubo de 15 mL.

Pasos 1 − 4

Protocolo de Práctica de Laboratorio

5. Obtenga el tubo de búfer de lisis del puesto de trabajo y añade 2 mL de búfer de lisis a su tubo que contiene el extracto celular.

6. Cierre el tubo e inviértalo suavemente para mezclar los componentes. (¡No lo mezcle muy duro!). Observe su tubo — ¿Ve algunos cambios? Anótelos.

Pasos 5 − 6

Protocolo de Práctica de Laboratorio

7. Obtenga el tubo de proteasa (marcado “prot”) de su puesto de trabajo. Añade 5 gotas de proteasa a su tubo.

8. Cierre el tubo y voltéelo suavemente varias veces.

9. Coloque su tubo en la gradilla o en un beaker en el baño de agua y déjelo incubar por 10 minutos a 50°C.

Pasos 7 − 9

Extracción y precipitación de ADN

¿Por qué se lleva a cabo cada paso?

1. Colección de células

El mordisqueo del interior de la boca, en combinación con el enjuague de agua funciona para separar las células del epitelio alineando la boca.

Es crítico recoger la cantidad suficiente de células.

2. Búfer de Lisis¿Qué es el Búfer de Lisis?• 50 mM Tris-HCI, pH 8.0• 1% SDSBúfer deTris para mantener el pH de la solución en el cual ADN se mantiene estable

1% SDS para romper y abrir las membranas celulares y nucleares permitiendo que el ADN quede libre en la solución.

El detergente SDS desnaturaliza y desdobla las proteínas dejándolas accesibles para las proteasas.

O

S

O

O

O

-

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH2

CH3

SDSNa+

3. ¿Por qué utilizamos la proteasa?

• La proteasa se utiliza para destruir las proteínas nucleares que crean un enlace con el ADN y para destruir enzimas citoplasmáticas que degradan y destruyen el ADN.

• El tratamiento con proteasa incrementa la cantidad de ADN intacto que es extraído.

4. Adición de la solución salina • La solución de proteasa ya contiene sal.

• Los iones de Na+ del NaCI forman enlaces con los grupos de fosfato de las moléculas de ADN, neutralizando las cargas eléctricas del ADN.

• La adición de NaCI permite que las moléculas de ADN se junten en lugar de repelerse una a la otra. De esta manera se facilita la precipitación del ADN de la solución al añadir el alcohol.

Na+

Na+

Na+

Na+

OCH2

O

P O

O

O Base

CH2

O

P

O

O

O

Base

OH

Azúcar

Azúcar

O

La Estructura del ADN

Sólo se muestra una cadena de

ADN.

5. Precipitación del ADN con alcohol frío

• El ADN no se disuelve en alcohol.

• El añadir alcohol hace que el ADN se agregue y se precipite de la solución.

• Las moléculas del ADN precipitadas parecen un material fibroso, como los hilos blancos de una telaraña.

• Las burbujas microscópicas de oxígeno, que se generan al mezclar, se “agregan” al precipitarse el ADN.

• Las burbujas visibles más grandes, levantan el ADN fuera de la solución y lo llevan de la fase acuosa a la fase orgánica (fase del alcohol).

Protocolo de Práctica de Laboratorio

10. Lentamente añade 10 ml de alcohol frió manteniendo el tubo a un ángulo de 45°. Este paso va a requerir de varias adiciones utilizando la pipeta de transferencia desechable.

11. Deje el tubo en posición vertical en la gradilla, a temperatura ambiente y en reposo, durante 5 minutos ¿Que ve?

12. Cierre el tubo y voltéelo de lado y de regreso en posición vertical, con mucho cuidado, unas 10 veces, hasta que las fases de agua y alcohol queden mezcladas y el ADN salga de solución.

Pasos 10 − 12

Preparación de los tapones para los collares

1. Remueva el tapón de plástico del frasco de vidrio.

2. Recorte las “orejas” de dos lados del tapón de plástico.

3. Regréselo al frasco para crear los collares más tarde.

¿Porque?

Para que el tapón no cree una bolsa de aire que prevenga que el frasco quede correctamente cerrado

Preservando la muestra de ADN: Preparación del collar de ADN

1. Utilizando una pipeta desechable, transfiera las fibras de ADN que ha extraído al pequeño frasco de vidrio.

– Transfiera la mayor cantidad de ADN con la menor cantidad de alcohol posible.

– El frasco se debe rellenar dejando por lo menos 2 mm de espacio suficiente para el tapón de plástico.

Preservando la muestra de ADN: Preparación del collar de ADN

2. Introduzca el tapón de plástico recortado en el cuello del frasco y presione con firmeza para cerrarlo

3. Deslice el cordón encerado a través del tapón de plata

4. Aplique una pequeña gota de pegamento en el interior del tapón de plata.

Preservando la muestra de ADN: Preparación del collar de ADN

5. Coloque el tapón de plata sobre la boca del frasquito y presione con firmeza durante 30 segundos. Deje que el pegamento se seque durante 10-15 minutos y después compruebe que el frasquito está completamente sellado.

6. Cuando el pegamento se haya secado, ate el cordón encerado.

Genes en un Frasco

¡Felicidades!¡Has creado un collar con tu propio

ADN!

¿Cuánto tiempo dura el collar de ADN?

El ADN puede durar años en el frasquito

de vidrio. Con el tiempo puede añadir

más alcohol si la cantidad original se

ha evaporado

Genes en un Frasco Componentes del kit

DNA ExtractionModule (166-2000EDU):(contains enough material for 36 students)

Lysis buffer, 150 ml

Powdered protease + salt, 1.5 g

15 ml tubes, 50

Clear, flip-top microtubes, 60

Multicolor, flip-top microtubes, 60

Disposable plastic transfer pipets, 60

Foam microtube holders, 10

Curriculum, including a teacher’s guide, a graphic quick guide, and separate student instructions for basic and advanced-level instruction

DNA Necklace Module (166-2200EDU): (contains enough material for 18 DNA necklaces; order 2 modules for a classroom of 36 students)

Glass vials, 18

Silver caps, 18

Plastic plugs, 18

Waxed string, 18

Super glue gel, 1 tube

Instruction manual

Required Accessories Not Included in Kit:91% isopropanol (available from drugstores) or 95% ethanol, 360 ml

Container of ice, 1

Permanent marker, 1–8

Recommended (Optional) Accessories:Water bath with thermometer 166-0504EDU

(166-2300EDU)Materiales para 36 Estudiantes

Above Kit Contains:(1) DNA Extraction Module (166-2000EDU)

(2) DNA Necklace Modules (166-2200EDU)