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I. INTRODUCCIÓN Entre las muchas plantas alimenticias que caracterizan a la región andina del Perú, la oca (Oxalis tuberosa mol.) es una de las más interesantes. Esta especie pertenece al grupo de las plantas alimenticias que no han sido estudiadas en forma sistemática ni detallada, a pesar de su importancia, ya que no sólo es un alimento diario en la dieta de los habitantes de los andes, sino que puede ser una alternativa de importancia industrial su estudio en lo referente a la extracción de colorantes. En los últimos años ha surgido un especial interés en la búsqueda de fuentes naturales de colorantes capaces de reemplazar los pigmentos sintéticos usados en la industria alimentaria. Las antocianinas son pigmentos naturales que están siendo estudiados para conocer la composición cuantitativa y cualitativa de las mismas ya que determinan la posibilidad del uso de nuevas plantas cuya base colorante sea la antocianina. Las antocianinas forman parte de los compuestos fenólicos que aparecen como parte de una amplia gama de alimentos funcionales, y en los últimos tiempos se ha
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I. INTRODUCCIÓN
Entre las muchas plantas alimenticias que caracterizan a la región andina
del Perú, la oca (Oxalis tuberosa mol.) es una de las más interesantes.
Esta especie pertenece al grupo de las plantas alimenticias que no han sido
estudiadas en forma sistemática ni detallada, a pesar de su importancia, ya que no
sólo es un alimento diario en la dieta de los habitantes de los andes, sino que
puede ser una alternativa de importancia industrial su estudio en lo referente a la
extracción de colorantes.
En los últimos años ha surgido un especial interés en la búsqueda de
fuentes naturales de colorantes capaces de reemplazar los pigmentos sintéticos
usados en la industria alimentaria. Las antocianinas son pigmentos naturales que
están siendo estudiados para conocer la composición cuantitativa y cualitativa de
las mismas ya que determinan la posibilidad del uso de nuevas plantas cuya base
colorante sea la antocianina.
Las antocianinas forman parte de los compuestos fenólicos que aparecen
como parte de una amplia gama de alimentos funcionales, y en los últimos
tiempos se ha determinado su fuerte relación con la disminución de enfermedades
crónicas como el cáncer, debido a su elevada actividad antioxidante.
El concepto tradicional de que para el mantenimiento de una salud optima
la dieta diaria debe proveer cantidades adecuadas de nutrientes esenciales ha
cambiado últimamente, por la evidencia cada vez mas fuerte de que como una
mezcla compleja de sustancias químicas, los alimentos también contienen
sustancias fisiológicamente activas que cumplen, al igual que los nutrientes
esenciales, una función de beneficio contribuyendo a reducir la incidencia de
ciertas enfermedades y por tanto son necesarios para una vida saludable.
Existe evidencia indicativa que las antocianinas son no sólo no-toxicas y
no mutagénicas, y tienen propiedades terapéuticas positivas (Saija, 1994 citado
por Bridle, et al. 1996) por ejemplo en oftalmología, para el tratamiento de varios
desordenes circulatorios y enfermedades inflamatorias. La reciente apreciación de
las propiedades antioxidantes de la antocianina y flavonoides que reducen el
riesgo de enfermedades coronarias (Waterhouse, 1995 citado por Bridle et al.
1996).
En el presente trabajo de investigación se plantean los siguientes objetivos:
- Caracterización del pigmento antociánico de la cáscara de oca morada
- Evaluación de la estabilidad de la antocianina de la cáscara de oca
morada en función al pH y a la temperatura
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II. REVISIÓN DE LITERATURA
2.1 Origen de la Oca
La Región Andina es uno de los más importantes centros de origen
y domesticación de numerosas especies. Con excepción de la papa, la
diversidad de estos cultivos es poco conocida. El agricultor precolombino
domesticó más de 70 plantas de uso económico en las áreas montañosas de
Sudamérica. De ellas, 17 especies corresponden a raíces y tubérculos. Pero
sólo la papa y el camote han alcanzado importancia mundial. Nueve
especies, que incluyen tres tubérculos (olluco, oca y mashua) más de seis
raíces (arracacha, yacón, achira, mauka, maca y ahipa) forman, con la papa,
los granos, las legumbres y frutas, el sistema de los cultivos andinos, y
constituyen los recursos más valiosos de los Andes.
La Oca, es una oxalidácea originaria de los Andes (Vavilov, 1992;
Zeven y de Wet, 1982; citado por Matos 1992), así lo demuestra la
existencia de una significativa variabilidad interespecífica (León, 1964;
citado por Matos 1992) y de especies afines.
Es posible que los predecesores silvestres de la oca aparecieron en las
sierras altas del Perú; el cultivo progresivo y las migraciones humanas las
habrían extendido hacia el norte y sur. Se cree que estas migraciones
tuvieron lugar en la época pre-inca o tal vez coincidieron con la expansión
del Imperio Inca, sin embargo, no se sabe que distribución geográfica dentro
del Perú precolombino tuvo esta especie ni como se llevo a cabo la
expansión de este cultivo hacia otros países. (Pearsall, 1992)
La domesticación de la oca y la de otros tubérculos andinos pudo suceder
entre la región central del Perú y norte de Bolivia donde se encuentran la
mayor diversidad morfológica, tanto de formas cultivadas como en las
silvestres. El hombre habría extendido su cultivo desde los 8 grados de
latitud norte en los Andes de Mérida de Venezuela, hasta los 25 grados de
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latitud sur en el norte de Chile y Argentina, (Arbizú y Tapia, 1992;
Orbegozo, 1960), donde aún hoy es cultivada por la población rural que
habita en latitudes entre los 3,000 y 4,000 m.s.n.m. (National Academy
Council, 1989)
2.1.1 Clasificación Taxonómica
Clase : Dicotiledónea
Orden : Geraniales
Sub-orden : Geraniaea
Familia : Oxalidácea
Genero : Oxalis
Especie : Oxalis tuberosa molina
La especie Oxalis tuberosa Mol. tiene varios sinónimos: Oxalis
crassicaulis Zucc. , Oxalis crenata Jacq. , Acetosella tuberosa Mol. ,
Xanthoxalis tuberosa (Mol.). (Bracco y Zarucchi, 1993)
La razón de estos sinónimos se debe a que existe cierta confusión en lo que
concierne a los autores que han identificado estas especies. En el Perú las
variedades no son conocidas con nombres especiales, sino que a estos se
les designa de acuerdo a la forma y color o simplemente color, a excepción
de algunas variedades que reciben nombres tales como "Espeja", "Cañera",
"Ruqui", etcétera.
2.2 Características Generales de la Oca
2.2.1 Morfología y Anatomía
El hábito vegetativo de la oca (Oxalis tuberosa) es el de una
dicotiledónea herbácea anual, aunque puede considerársela potencialmente
perenne, debido a la capacidad para reproducirse vegetativamente por
medio de sus rizomas.
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La planta presenta matas cuyo tallo puede ser simple o ramificado de 45 a
65 cm. de alto. El tallo aéreo de la oca es herbáceo y erecto durante las
primeras fases de su desarrollo, haciéndose semipostrado cuando va
alcanzando la madurez. En el tallo se distingue una capa de células muy
pequeñas y estrechamente unidas, de sección cuadrangular, debajo de esta
capa epidérmica se continua una o dos hileras de células parenquimáticas
que contienen clorofila y pigmentos antociánicos disueltos en el jugo
celular (Cárdenas, 1987). En la Figura 1 se puede apreciar la planta en el
campo.
Figura 1. Planta de oca
La forma de los rizomas como también la coloración son muy variados
tanto como las variedades mismas, en la Figura 2 se da un alcance de las
tonalidades presentes en ocas cosechadas en el Perú. Se observan que
todas las coloraciones de los rizomas se encuentran reunidos en tres grupos
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definidos: blanco, amarillo, y rojo, alrededor de estos colores giran las
demás tonalidades existentes con mayor o menos intensidad, pues parece
que estos tres colores son básicos (Orbegozo, 1985).
Según Bukazov citado por Cárdenas (1987), menciona que para la
formación de los tubérculos se requieren de días cortos, razón por la cual
una serie de tentativas de cultivo en otros lugares fuera de su ecosistema
han fracasado, en cuanto al periodo vegetativo, entre los tres tubérculos
menores de los Andes (oca, olluco, mashua) es el más tardío porque dura
por lo menos 8 meses. En la sierra peruana se encuentran desde los 2,500
m hasta cerca de lo 4000 m de altura sobre el nivel del mar altitudes donde
otros cultivos alimenticios difícilmente pueden prosperar. Crece en suelos
pobres y es tolerante a climas adversos y se caracteriza por tener poca
incidencia de plagas y enfermedades
Figura 2. Variedad de color en las Ocas
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2.2.2 Variedades de Oca
Siendo el rizoma la parte vegetativa que sirve de gran ayuda para la
identificación de las variedades, se hará a continuación una breve
descripción de sus características principales en cuanto a su forma y color.
Cárdenas (1987), menciona que no se podría establecer variedades
en el sentido taxonómico, porque los caracteres morfológicos de la planta
no lo permiten pero las diferencias mas marcadas pueden establecerse
basadas en el color y forma de los tubérculos.
Las variedades pueden ser determinadas durante el periodo
formativo de rizomas, puesto que los colores antociánicos, rosado y
violáceo de la piel, son evidentes en un estado temprano de crecimiento, la
presencia o ausencia de tales colores pueden ser determinados cuando los
rizomas son pequeños localizándose con mayor intensidad en los catafilos
y hacia su unión con el tallo aéreo. La pigmentación varia dentro de cada
tubérculo, pero la forma característica de los rizomas ayuda a su
identificación.
Cárdenas, (1987) menciona que las diferencias mas marcadas entre
las numerosa variedades pueden establecerse basadas en el color de los
tubérculos siguiendo este carácter se agrupan las ocas en tres formas: alba,
flava y roseo-violacea.
A la primera forma correspondería todas las ocas de tubérculos
blanco o hialino puro. La segunda forma (flava), correspondería a las ocas
amarillo claro con pigmentos de flavonas posiblemente, y las amarillo
intensa y anaranjadas, pigmentadas con carotenos. La última forma es la
más rica en matices de color, puesto que corresponderían las ocas
pigmentadas de antocianinas y cuyo color de tubérculos varía del rosado
claro hasta el violáceo muy oscuro, casi negro.
En cuanto a las formas de los rizomas, en general éstas son
variadísimas; sin embargo, una cierta forma determinada está casi
relacionada con un color característico. Así las formas alargadas y
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cilíndricas son generalmente blancas o amarillas; las cónicas chicas,
rosadas; las ovales, color salmón, pudiendo ser también blancas; las
cilíndricas medianas o las cónicas alargadas, rosadas o negras. Es por ello
que se puede reducir todas las formas a tres tipos: ovoide, claviforme y
cilíndricos.
Cárdenas (1987), menciona que a partir de estas formas se define
las siguientes variedades: Ver Figura 3
Variedad 1.- Se la conoce con el nombre “Blanca chica”; sus rizomas
varían entre los 6 a 7 cm de largo y 3cm de diámetro. Es de forma
cilíndrico-cónica.
Variedad 2.- Conocida como “Blanca larga” por el color y tamaño de sus
rizomas, tienen una longitud de 12 a 14 cm y 2 cm de diámetro; su forma
es cilíndrica. La pulpa es más harinosa y algo más dulce que la variedad 1.
Figura 3. Variedades de formas de oca
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Variedad 3.- Se le conoce con el nombre de “Rosada” por el color de sus
rizomas. Su forma es marcadamente cónica. Tiene un largo de 7 a 8 cm y
su diámetro mayor es de 3.2 a 3.5 cm. Es una variedad muy solicitada y
consumida por su sabor dulce y su alto rendimiento.
Variedad 4.- Se conoce con el nombre de “Espeja”, es de todas las
variedades la más solicitada por su exquisito sabor dulce característico,
además de la fineza de la pulpa. Es la única que se puede consumir cruda,
su color es salmón claro, su tamaño varia de 5 a 7 cm de largo y 3.5 a 3.8
cm de diámetro. La forma es variada y va desde las redondas hasta las
ovales y cónicas.
Variedad 5.- Es una variedad muy similar a la variedad 2 en cuanto a su
forma y tamaño, pero difiere en el color de sus rizomas que son
anaranjadas y al sabor dulce de su pulpa. Su forma es cónica. Es una de las
más consumidas por su agradable sabor.
Variedad 6.- Llamada “Negra” por el color morado vinoso oscuro de su
epidermis. Es una variedad de pulpa muy harinosa y su color se presenta
hasta el interior de sus rizomas. Su tamaño varia entre 5 a 9 cm y su
diámetro pasa los 3cm. En el mercado tienen poca aceptación
La coloración de los tallos aéreos son también partes del vegetal
que permiten establecer diferenciaciones varietales, aunque no con la
seguridad con que se hace con los rizomas, ya que la coloración del mismo
es poco variable; depende sobre todo de la edad de la planta y en particular
de la intensidad de la luz recibida. Los tallos en algunas variedades son
enteramente verdes, pero en otras puede ser rosados o rojo-violáceo oscuro
como resultado de la presencia de antocianina. Se ha observado que
aquellas plantas que presentan rizomas coloreados (excepto amarillo y
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blanco), sus tallos también muestran color, aunque no precisamente de la
intensidad de aquellos.
El color se encuentra distribuido irregularmente a lo largo del tallo
según las variedades. Así, la pigmentación más intensa en algunas de ellas,
se encuentra localizada en la base del tallo, disminuyendo su intensidad
hacia el ápice, pudiendo encontrarse más intenso el color en otras partes
del mismo. Todas estas formas de coloración encierran grupos
característicos de ocas, encontrándose cierta relación entre el color del
tubérculo y del tallo, pues aquellas variedades que muestran rizomas de
color rojo-violáceo oscuro, sus tallos presentan un color más intenso que
aquellas variedades que tienen rizomas de color rosado claro, esto se puede
observar en la Figura 4. En general, las variedades de oca con rizoma de
color amarillo y blanco, presentan tallos verdes o verde amarillento.
Figura 4. Color en los tallos
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2.2.3 Importancia y Valor Alimenticio
La oca forma parte de la dieta de los campesinos altoandinos y de
la población migrante de estas zonas ubicadas en las capitales de
provincias y departamentos de la sierra peruana. Los tubérculos luego de
ser asoleados, para que sean más dulces, son consumidos de diversas
formas, principalmente sancochados o asados. Algunas formas de oca son
expuestas a bajas temperaturas (“heladas”) y expuestas al sol para obtener
un producto denominado K’haya o chuño; si se lavan después de la
congelación se obtiene un producto denominado Ok’haya, que es
considerado de mayor calidad. (Arbizu et al., 1992)
Los tubérculos, la parte económicamente útil de la planta,
presentan un buen contenido de carbohidratos, además son fuente de calcio
y hierro, siendo considerados como una mediana fuente de proteínas.
Salas (1998), menciona la abundante presencia de flavonoides en la oca,
estos compuestos poseen actividad sobre el metabolismo de las paredes de
los vasos sanguíneos causando resistencia capilar por tanto su principal
área terapéutica se orienta a la diátesis hemorrágica, diabetes, hipertensión
y arteriosclerosis. Además la segunda importante acción de los flavonoides
es la de neutralizar edemas. Los compuestos fenólicos que cumplen
funciones farmacológicas antisépticas, diuréticas y desinfectantes han sido
identificados como los más relevantes dentro del melloco, oca y mashua.
En el Cuadro 1 se muestra la composición química de la oca
reportada por Collazos et al. (1996), este autor menciona que existen
diferencias entre variedades, siendo además influenciadas por el tipo de
suelo y otras condiciones ambientales. Es por ello que en el Cuadro 2 se
puede apreciar la relación existente entre el contenido de promedio de
materia seca, proteína, almidón, azucares y energía en Ocas (Oxalis
tuberosa) de diferentes colores en un estudio hecho por el centro
Internacional de la Papa en 1992 a partir de un agrupamiento de 46
entradas de ocas.
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Cuadro 1. Composición Química Proximal de la Oca
Composición Química Proximal de la Oca(En 100g de Oca)
Calorías
Agua
Proteínas
Grasa
Carbohidratos
Fibra
Ceniza
Calcio
Fósforo
Hierro
Caroteno
Tiamina
Rivoflavina
Niacina
Ácido Ascórbico
61,0 cal.
84,1 gr.
01,0 gr.
0,6 gr.
13,3 gr.
01,0 gr.
01,0 gr.
22,0 mg.
36,0 mg.
01,6 mg.
0,01 mg.
0,05 mg.
0,13 mg.
0,43 mg.
38,4 mg.
Fuente: Collazos(1996)
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2.3 Compuestos Fenólicos
Los compuestos fenólicos o polifenoles constituyen un amplio grupo de
sustancias químicas, considerados metabolitos secundarios en las plantas,
con diferentes estructuras químicas y actividad, englobando más de 8,000
compuestos distintos. La distribución de los compuestos fenólicos en los
tejidos y células vegetales varía considerablemente de acuerdo al tipo de
compuesto químico que se trate, situándose en el interior de las células o en
la pared celular. (Martínez et al., 2000). Los compuestos fenólicos están
relacionados con la calidad sensorial de los alimentos de origen vegetal,
tanto frescos como procesados (Clifford MN., 1988 citado por Martínez et
al., 2000). Su contribución a la pigmentación de los alimentos vegetales esta
claramente reconocida, a través de la antocianidinas, responsables de los
colores rojo, azul, violeta, naranja y púrpura de la mayoría de las plantas y
de sus productos.
2.3.1 Estructura Química y Clasificación
Químicamente, los compuestos fenólicos son sustancias químicas
que poseen un anillo aromático, un anillo benceno, con uno o más grupos
hidróxidos incluyendo derivados funcionales (ésteres, metil ésteres,
glicósidos, etc.). La naturaleza de los polifenoles varias desde moléculas
simples como los ácidos fenólicos hasta complejos altamente polimerizados,
como los taninos. Se presentan en forma conjugada con uno o más residuos
de azúcar unidos a los grupos hidroxilos, aunque en algunos casos se pueden
producir uniones directas entre una molécula de azúcar y un carbono
aromático. Por ello la forma más común de encontrarlos en la naturaleza es
en la forma de glicósidos, siendo solubles en agua y en solventes orgánicos.
Los azucares asociados a los polifenoles pueden ser monosacáridos,
disacáridos o incluso oligosacáridos. Los compuestos a los que se
encuentran unidos con más frecuencia son: glucosa, galactosa, arabinosa,
ramnosa, xilosa, y ácidos galacturónicos. También pueden encontrase
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unidos a ácidos carboxílicos, ácidos orgánicos, aminas, lípidos y a otros
compuestos fenólicos.
Según Harbone (1993), los compuestos fenólicos se pueden agrupar en
diferentes clases dependiendo de su estructura básica: Fenoles, ácidos
fenólicos y ácidos acéticos; Ácidos cinámicos, cumarinas, isocumarinas y
cromonoles; Lignanos y neolignanos; Taninos, Flavonoides. Siendo este
último grupo el más importante dentro de esta clasificación, dividiéndose en
varias subclases con más de 5000 compuestos, siendo los polifenoles mas
distribuidos en las plantas. Son sustancias polifenólicas de bajo peso
molecular que comparten el esqueleto común de difenilpiranos: dos anillos
benceno unidos a través de una anillo pirona o piran heterocíclico. Esta
estructura básica presenta o permite una multitud de sustituciones y
variaciones en el anillo pirona dando lugar a flavonoles, flavonas,
flavanololes, isoflavonoides, catequinas, chalconas, antocianidinas,
leucoantocianidinas y taninos
2.4 Las antocianinas
Las antocianinas son pigmentos solubles en agua, muy extendidos en la
naturaleza y responsables de las variadas tonalidades que van del rojo,
naranja, magenta, violeta, púrpura y azul.
Se les consideran flavonoides porque tienen el esqueleto carbonado C6C3C6
característico. La estructura química básica del grupo flavonoide y su
relación con la antocianina se muestran en la (Figura 5) Dentro de cada
grupo existen muchos compuestos diferentes, dependiendo su color, de los
sustituyentes en los anillos A y B.
Figura 5: Estructura básica de los Flavonoides
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La estructura básica de las antocianinas es el 2-fenilbenzopirilio de la sal
flavilio. Existen como glucósidos de polihidroxi y/o metoxilo presentes, los
tipos, los números y los sitios de unión de los azucares a la molécula. Los
azucares más comunes son glucosa, galactosa, xilosa, arabinosa, di y
trisacáridos homogéneos o heterogéneos formados por combinación de estos
azúcares. Los ácidos que participan mas comúnmente en la acilación de los
azúcares son el cafeíco, p-coumárico, sinápico, p-hidroxibenzoico, ferúlico,
malónico, málico, succínico y acético.
Cuando se hidroliza la mitad azúcar de una antocianina, la aglicona (el
producto no azucarado de la hidrólisis) se conoce con el nombre de
antocianidina. El color de antocianinas y antocianidinas resulta de la
excitación de la molécula por la luz visible. La facilidad con la que la
molécula es excitada depende de la movilidad relativa de los electrones de
la estructura. Los dobles enlaces, que son abundantes en antocianinas y
antocianidinas, son excitados más fácilmente y su presencia es esencial para
el color. Las antocianinas presentes en la naturaleza contienen diversas
antocianidinas, pero en los alimentos ordinariamente sólo existen seis, a
saber: pelargonidina, cianidina, delfinidina, peonidina, petunidina y
malvidina. Las demás son comparativamente raras y se hallan presentes en
algunas flores y hojas.
2.4.1 Reacciones Químicas
El color de las antocianinas esta determinado por su estructura molecular y
el medio físico químico en la que se encuentren. La misma antocianina
puede tener diferente coloración, dependiendo del pH de la solucion y otros
factores; Tswett citado por Markakis, (1974), llamo a las antocianinas
vegetales camaleones. Los factores más importantes que afectan el color de
las antocianinas son los siguientes:
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2.4.1.1 Grado de Hidroxilación y metilación
A medida que el número de hidroxilos fenólicos se incrementan, el
color cambia de rosado hacia el azul. Los grupos metoxilos reemplazan a los
grupos hidroxilos y viceversa. La hidroxilación en la posición -3 parece ser
particularmente significativa cuando esta cambia la máxima absorción del
amarillo naranja a la región roja.
Las velocidades de degradación varían ampliamente entre las antocianinas
debido a sus diversas estructuras. Generalmente, el aumento de la
hidroxilación disminuye la estabilidad, en tanto que el aumento de la
metilación la incrementa. El color de los alimentos que contienen
antocianinas ricas en las agliconas pelargonidina, cianidina o delfinidina es
menos estable que el de los alimentos que contienen antocianinas ricas en
agliconas petunidina y malvidina. La mayor estabilidad de este último grupo
se debe a que los grupos hidroxilo inactivos están bloqueados. Se deduce
que un aumento, por tanto, en la glicosilación, como en los monoglucósidos
o diglucósidos, aumenta la estabilidad. También se ha observado, aunque
no se entiende totalmente por qué, que el tipo de la mitad azúcar influye
sobre la estabilidad.
2.4.1.2 Efecto del pH
Las Antocianinas se comportan como pH indicadores, siendo rojizas
a bajos pHs, azuladas a elevados pHs y siendo casi incoloras a
concentraciones intermedias de H+ o cuando se combinan con flavonoides
amarillos, estas pueden aparecer verdosas. Las estructuras en la Figura 6
han sido asignadas para las antocianinas en varias regiones de pH. La forma
catiónica en la Figura 6 es probablemente la dominante a bajos pH, sin
embargo la forma inestable oxonio, envolviendo los oxígenos fenolicos
pueden también estar presentes. El anión presente a elevados pH puede
tomar alguna de sus estructuras tautoméricas. (Markakis, 1974)
Markakis (1974), manifestó, sin embargo, que las antocianinas muestran
una mínima coloración en su punto isoeléctrico; la pseudobase con la cual se
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interrumpe el sistema de doble enlace es más compatible con la carencia de
color y puede ser la forma dominante a ese pH. Sondheimer citado por
Markakis (1974), presento evidencia para un equilibrio entre iones
hidroxonio y una antocianina (pelargonidina-3-glucósido) en la forma
catiónica roja, R+, y la pseudobase incolora, ROH, en un rango de pH 1.2
a 4.
R+ + H2O ⇆ ROH + H3O+
En las soluciones acuosas inclusive los alimentos, las antocianinas pueden
existir en 4 formas estructurales, dependiendo del pH (Figura 7): la base
quinoidal azul (A), el catión flavilio rojo (AH+), la base pseudobase carbinol
incolora (B), y la chalcona incolora (C). Para cada pigmento solamente dos
de las cuatro especies son importantes por encima del intervalo de pH 0-6.
En una disolución de malvidina-3-glucósido a pH bajo predomina la
estructura flavilio, en tanto que a pH 4-6 predomina el carbinol incoloro.
Una situación similar existe con el a’, 7-hidroxiflavilio, excepto que la
mezcla en el equilibrio consta principalmente de flavilio y la estructura
chalcona. Así a medida que el pH se acerca a 6 la disolución se torna
incolora.
Los productos de degradación, varias veces llamados “phlobaphenes”
pueden ser marrones, rojos o azulados y no ser sensibles a los cambios de
pH.
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2.4.1.3 Temperatura
Así como la mayoría de reacciones químicas, la estabilidad de las
antocianinas y la velocidad de su degradación, en sistemas modelos y
naturales, esta marcadamente influenciada por la temperatura. La
estabilidad térmica de las antocianinas varía con su conformación
estructural, pH, la presencia o ausencia de oxígeno y su interacción con
otros componentes del sistema. En general, las características estructurales
que llevan al incremento de la estabilidad del pH también llevan a la
estabilidad térmica, por ejemplo la hidroxilación de la aglicona disminuye la
estabilidad, mientras que la metoxilación, glicosilación y acilación tienen
un efecto opuesto. En presencia de oxigeno, la máxima estabilidad térmica
de la antocianidina 3,5-glucósido ha sido observada en un pH que va de 1.8
a 2.0, mientras que la antocianidina 3,5-diglucósido ha sido observada en un
pH de 4.0 a 5.0. La degradación de la antocianina es virtualmente pH-
independiente a pH 2.0 a 4.5 en ausencia de oxigeno. (Hendry, 1992)
Adams citado por Francis et al. (1978), menciona que a pH 2 a 4, el
principal camino para la degradación térmica de antocianinas es la hidrólisis
de la molécula azucarada, seguido por la transformación de la antocianina
resultante a una chalcona amarillo pálido o α- diketona.
Hazdrina mencionado por Fenema (1999), menciona que el mecanismo
preciso para la degradación de la antocianina no se ha esclarecido
totalmente. Se han sugerido tres rutas. El cumarin 3,5-diglucósido es el
producto común de la degradación de las antocianidinas (cianidina,
peonidina, delfinidina, petunidina y malvidina) 3,5-diglucósido (Figura 7).
En la ruta (a), el catión flavilio primero se transforma en la base quinoidal,
después de diversos intermediarios y finalmente en el derivado cumarínico y
un compuesto correspondiente al anillo B.
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En la ruta (b), el catión flavilio primero se transforma en la base
carbinol incolora, después en chalcona y finalmente en productos de
degradación pardos. La ruta (c) es similar, excepto en que los productos de
degradación de la chalcona se intercalan primero. Estos tres mecanismos
propuestos sugieren que la degradación térmica de las antocianinas depende
del tipo de antocianina participante y de la temperatura de degradación.
(Fenemma, 1999)
La estabilidad también es dependiente del tipo de aglicona así
tenemos que la malvidin 3,5-diglucósidos fue más estable seguido por la
3,5-diglucósido de peonidina, petunidina, cianidina y delfinidina en el caso
de los vinos. (Francis, F, 1978)
Con pocas excepciones, la degradación de antocianinas, bajo
condiciones aeróbicas y anaeróbicas, sigue una reacción cinética de primer
orden.
Existe un equilibrio entre las cuatro estructuras antocianina
conocida.
(A) (AH+) (B) (C)
Quinoide ⇄ Flavilio ⇄ Base Carbinol ⇄ Chalcona
(Azul) (Rojo) (Incolora) (Incolora)
2.4.1.4 Oxigeno
La naturaleza insaturada de las estructuras de las antocianidinas las
convierte en susceptibles al oxigeno molecular. El oxigeno y la temperatura
han sido referidos como los agentes que aceleran la destrucción de las
antocianinas. El oxigeno puede causar la degradación por mecanismos
directos de oxidación y/o indirectos con lo cual oxida los constituyentes del
medio reaccionando con las antocianinas para producir productos incoloros
y pardos, como resultado de la oxidación directa de la base carbinol.
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2.4.1.5 Luz
Las antocianinas son generalmente inestables cuando se les expone a la
luz UV y a la luz visible así como a otras formas de energía radiante, como
la radiación ionizante. La copigmentacion (la condensación de antocianinas
consigo mismas u otros compuestos orgánicos) puede acelerar o retardar la
degradación, dependiendo de la circunstancias. Los sulfonatos de las
flavonas polihidroxiladas, las isoflavonas y las auronas ejercen un efecto
protector contra la fotodegradación. El efecto protector es atribuible a la
formación de interacciones de los anillos intermoleculares entre el sulfonato
cargado negativamente y el ion flavilio cargado positivamente.
2.4.1.6 Reacciones enzimáticas
Varias enzimas que se encuentran en el interior de las plantas
específicamente en los tejidos han sido implicadas en la decoloración
oxidativa de las antocianinas. Se han identificado dos grupos: glicosidasas y
polifenoloxidasas. En conjunto, se las conoce como antocianasas. Las
glicosidasas, como su nombre lo indica, hidrolizan los enlaces glicosílicos,
dando el azúcar o azucares libres y la aglicona. La perdida de intensidad de
color se debe al descenso de la solubilidad de las antocianidinas y su
transformación en productos incoloros. Las polifenoloxidasas actúan en
presencia de o-difenoles y oxigeno, oxidando las antocianinas. El enzima
oxida primero el o-difenol a o-benzoquinona, ya que esta enzima contiene
cobre y cataliza la reacción entre un grupo fenol y el oxigeno para dar agua
y quinona (Martínez-Valverde et al, 2000), que a su vez reacciona con las
antocianinas por un mecanismo no enzimático para formar antocianinas
oxidadas y productos de degradación.
Hendry (1992), menciona que las polifenoloxidas se les ubica en el
reino vegetal catalizando la transformación oxidativa del catecol y otros o-
dihidroxifenoles a o-quinonas las cuales a su vez pueden reaccionar con
otros compuestos como aminoácidos y proteínas (y/o otros compuestos
fenólicos incluyendo antocianidinas) para producir polímeros pardos de alto
23
peso molecular; u compuestos oxidados de bajo potencial de oxido-
reducción. Las antocianinas son pobres sustratos para las polifenoloxidasas.
La base quinoidal parece ser más susceptible a la degradación oxidativa por
polifenoloxidasas que el catión flavilio. El rango de decoloración mediado
por las polifenoloxidasas parece depender de la sustitución del patron en el
anillo B y grado de glicosilación.
Sin embargo, la actividad de la antocianasa, tanto si es endógena u
exógena puede ser problemática si la retensión máxima del pigmento es
deseada.
Aunque el escaldado de las frutas no es una practica corriente, las
enzimas que destruyen las antocianinas se pueden inactivar mediante un
escaldado breve (45-60 seg. a 90-100 °C). Este procedimiento se ha
sugerido para las guindas antes de congelarlas. (Fenema, 1999).
La peroxidasa es otra enzima que decolora antocianinas, el
pigmento presumiblemente actúa como donador de hidrógeno al complejo
peroxidasa-hidrogeno peroxido. (Markakis, 1974)
2.5 Métodos Espectrales para la caracterización de antocianinas
Por la relación cercana que existe entre las antocianinas y los
factores genéticos que controlan el color de las flores en las plantas mayores
(Lawrence, 1950 citado por Harborne, 1957), considerables esfuerzos se han
hecho para descubrir un método simple para la caracterización de este grupo
de pigmentos glicosídicos. Existen métodos bien conocidos por ejemplo las
pruebas de color y distribución, sin embargo, su valor provee una
información limitada acerca de la naturaleza glicosídica de las antocianinas.
La cromatografía de papel ha sido ampliamente usada como una alternativa
a los test y esta provee de un excelente método para la obtención de
pigmentos puros en pequeña escala.
Fuleki (1978), menciona que los pigmentos antociánicos han sido
identificados por varios métodos con variados grados de precisión. Estos
métodos pueden ser clasificados como siguen:
24
Método Clásico
Este método, perfeccionado por Robinson et al. (1931, 1932) citado
por Fuleki (1978), consiste en una serie de pruebas de color y distribución
en el extracto del pigmento parcialmente purificado. Debido a que las
antocianinas individuales no están separadas, sólo se pueden identificar las
más abundantes. La precisión de este método es algo limitada.
Método Cromatográfico Simple
El avance de las técnicas cromatográficas permitió la preparación
de antocianinas individuales puras y la molesta prueba de distribución se
reemplazo por determinaciones del valor Rf. La identificación se basa en los
valores Rf, absorción máxima y reacciones de color obtenidas con la
antocianina y/o antocianidina. En este grupo se incluyen métodos con
variados grados de precisión todos ellos caracterizados por el hecho de que
las técnicas cromatográficas son usadas pero la evidencia que proveen es
insuficiente para una completa identificación. El método sólo es confiable
para la identificación de la clase a la cual pertenece el particular pigmento de
antocianina.
Método cromatográfico y Espectrofotométrico
Este método se basa principalmente en el trabajo original de Bate-
Smith y Harborne, descrito en el libro de Harborne (1976b) citado por
Francis (1978). La identificación se basa en el Rf y en los valores
espectrales obtenidos con las antocianinas individuales altamente purificadas
y sus productos de la degradación producidos por hidrólisis ácida o
enzimática. El método incluye una prueba de saponificación y la
identificación del componente ácido cuando se sospecha una acilación. Este
método es satisfactorio para la identificación confiable de la antocianina
Cromatografía Líquida de Alta Performance (HPLC)
Los pigmentos semipurificados son aislados usando un equipo de
HPLC, que posee una columna C18 (Octadecyl-siloxane) que es un
material hidrofóbico inerte usado para la cromatografía analítica. Es un
25
método sugerido para mediciones analíticas para el aislamiento de especies
hidrofobias de soluciones acuosas
2.5.1 Espectro de las antocianidinas que ocurren naturalmente
El espectro visible de todas las antocianidinas conocidas que
ocurren en la naturaleza como glicósidos son colectadas en la Cuadro 3
Cuadro 3. Espectro y características de las antocianidinas que ocurren
naturalmente en la región visible
Máximo Espectro
λmax.(mμ)
Pigmento Metanol-HCl Etanol- HCl ∆λ.(mμ)AlCl3
Hirsutidina 536 545 0
Malvidina 542 554 0
Petunidina 543 558 24
Delfinidina 546 557 23
Rosinidina 524 534 0
Peonidina 532 542 0
Cianidina 535 545 18
Pelargonidina 520 530 0
Luteolinidina 493 503 52
Apigenidina 476 483 0
Fuente: Harborne, (1958).
26
En la Figura 8, se observan los seis pigmentos de mayor frecuencia,
estas son pelargonidina, cianidina, peonidina, delfinidina, petunidina, y
malvidina. Dos de ellas, hirsutidina (7-metylmalvidina) y rosidina
(probablemente 7-metilpeonidina) han sido encontradas solo en pocas
plantas. Las otras dos a las cuales les faltan un grupo 3-hidroxil, llamadas
apigenidina y luteolinidina ocurren raramente. El valor de las medidas
espectrales para distinguirlas es claro y el método falla solo con la
delfinidina y petunidina. Afortunadamente, estas dos antocianidinas tienen
diferentes propiedades cromatográficas. La Apigenidina y luteolinidina son
excepcionales y solo dan un espectro máximo estable en álcali metanólico,
con cambios batocrómicos de 56 y 70 mμ respectivamente.
Figura 8: Estructura de las principales antocianidinas
O+
A
B
C
2
345
6
7
89
10
1'
2'
3'
4'
5'6'
Fuente:
Remesy et al. (1996).
27
Cuadro 4. Antocianidinas y ubicación de la sustitución de los radicales
en la estructura de la antocianidina
Sustitución
Antocianidina 3 5 7 3’ 5’
Pelargonidina OH OH OH H H
Cianidina OH OH OH OH H
Peonidina OH OH OH OMe H
Delfinidina OH OH OH OH OH
Petunidina OH OH OH OMe OH
Malvidina OH OH OH OMe OMe
Fuente: Remesy et al. (1996)
Como consecuencia del uso de dos solventes diferentes, metanol y
etanol, es aparente que existe una pequeña pero diferencias detectables entre
el visible máximo de la cianidina y peonidina y entre la delfinidina,
petunidina y malvidina. Considerando metilación de los grupos hidroxilo 3’-
y 5’- causan un pequeño cambio hipsocrómico, un cambio más substancial
de 8-10 mμ es producido cuando el grupo 7-hidroxilo es metilado con
(rosinidina, hirsutidina)
Deberá tenerse en cuenta que el número de sustituyentes en la
molécula da como resultado un color mas profundo. La profundidad es el
resultado de un cambio batocrómico (mayor longitud de onda), lo que
28
significa que la banda de absorción de la luz en el espectro visible se
desplaza del violeta hacia el rojo. El cambio opuesto se conoce como
desplazamiento hipsocrómico. Los efectos batocrómicos son causados por
grupos auxócromos, grupos que por sí mismos no tienen propiedades
cromóforas, pero que producen una profundización en el tono cuando se
unen a la molécula. Los grupos auxócromos son donadores de electrones y
en el caso de las antocianidinas son los grupos hidroxilo y metoxilo. Como
quiera que la capacidad donadora de electrones sea mayor en los grupos
metoxilo que en los grupos hidroxilo, producen un desplazamiento
batocrómico superior al de los grupos hidroxilo (Shrikhande, 1976).
2.6 Caracterización de antocianinas
El espectro de más de 30 antocianinas ha sido medido en el rango
de 240-600 mμ del espectro. Todas las simples antocianinas muestran una
similar absorción en la región ultravioleta y solo en el espectro visible las
diferencias en absorción son aparentes. La posición del máximo visible y el
porcentaje de la absorción a 440 mμ comparada con la máxima longitud
(entre 500 y 550 mμ) están reportadas en el Anexo1. (Harborne, 1957)
Hay dos formas en las cuales esas medidas pueden ser utilizadas
para caracterizar antocianinas. Primero las características espectrales de una
antocianina en particular son obviamente relativas a la antocianidina de la
cual se deriva. Los tres grupos importantes, se basaron en la pelargonidina,
cianidina, y delfinidina, las cuales son bien diferenciadas espectralmente,
por una reflexión de sus diferentes colores en solucion y en los
cromatogramas. Además, los glucósidos de cianidina, delfinidina, y
petunidina pueden ser distinguidos de otras antocianinas por el uso del
cloruro de aluminio.
Segundo, las medidas espectrales para la determinación de la
posición del enlace del azúcar en la molécula de antocianinas. El efecto
general de la glicosilación sobre el espectro visible de la molécula de
antocianina es el cambio a longitudes de onda cortas. La cantidad de su
29
cambio hipsocrómico depende en cual y si los grupos hidroxilo son
glicosilados. El amplio cambio es causado por la introducción de un
residuo de azúcar en la posición –3. Así, la pelargonidina tiene una λmáx. en
520 mμ, y su 3-glucósido en 505 mμ (∆ λ=15 mμ); la cianidina tiene una
λmáx. 535 mμ , su 3-glicósido en 523 mμ (∆ λ=12 mμ); y la delfinidina tiene
λmáx. 544 mμ, su 3- glicósido en 534 mμ (∆ λ=19 mμ). Solo las diferencias
muy pequeñas en la absorción máxima del espectro pueden ser detectados
entre antocianinas conteniendo azúcar en ambas posiciones, 3- y 5- y en el
3- glicósidos. Sin embargo, ahora ha sido observado que el espectro de
absorción en la región entre 400 – 570 mμ de todas las antocianidinas con
residuos de azúcar y benzoil en el grupo 5-hidroxil muestra características
diferentes de esas antocianidinas en las cuales el grupo 5-hidroxil esta libre.
El espectro muestra un distinto hombro en el pico de la curva de absorción
máxima en la región 410-450 mμ . La mejor forma de registro de las
diferencias es comparar la región de la densidad óptica en una longitud
arbitrariamente escogida (por ejemplo 440 mμ ) con la absorción en la
longitud de máxima absorbancia.
Las antocianinas caen en dos clases dependiendo de que haya o no
grupos 5-hidroxil libres. En efecto el porcentaje de intensidad en 440 mμ
de antocianidinas sustituidas en la posición –5 es aproximadamente la
mitad que las correspondientes antocianidinas en la cual el grupo e- hidroxil
libre. Esto provee una nueva y valiosa manera para distinguir entre dos
clases importantes de antocianinas, la 3- y 3:5-glicósidos.
2.6.1 Antocianinas aciladas
El espectro de absorción de varias antocianinas aciladas están
dados en el Apéndice 2. Los pigmentos examinados son típicos de la
mayoría de antocianinas aciladas que han sido examinadas hasta la fecha.
Como ellas contienen un hidroxi-ácido aromático como su componente
acil.
30
La confirmación de la presencia o ausencia de un ácido hidróxido
aromático como un componente acil puede ser hecho por medios espectrales
importantes. El espectro para la antocianina acilada con ácido p- coumárico
(curva B) muestra dos picos en la región ultravioleta en 289 y 310 mμ
debido a la superposición en la absorción del ácido cinámico (λmáx. 310 mμ)
sobre la absorción del pigmento. El espectro de una antocianina simple
(curva A) exhibe un pico simple en 270 mμ y solo una muy débil absorción
en 310 mμ . Además la proporción de la intensidad en 310 mμ en que el
color es máximo es una medida de la proporción molar del ácido cinámico
en la antocianina en el complejo pigmento. (Harborne, 1957)
2.7 Métodos cualitativos para análisis de antocianinas
El énfasis en la identificación de antocianinas en las plantas y en
órganos de plantas ha sido desarrollado por su rol como marcadores
químicos en la taxonomía o sistemas bioquímicos. El contenido de
antocianinas es también usado para determinar la madurez y señal de
madurez de las frutas. Para el especialista en alimentos las antocianinas son
responsables de la calidad delos alimentos así como adulteración.
Para la sistemática identificación de antocianinas involucran tres
etapas principales o importantes: la extracción, purificación y la
identificación.
2.7.1 Extracción
La extracción es usualmente realizada por maceración de unos
cuantos gramos de muestra vegetal en metanol o etanol conteniendo 1% de
HCl. El metanol tiene una ventaja con respecto al etanol, se refiere a que el
metanol no forma mezclas azeotrópicas con agua y tiene bajo punto de
ebullición. De este modo, los compuestos son fácilmente concentrados. El
ácido clorhídrico mantiene pH bajos y forma sales con las antocianinas. La
31
mayoría de los datos de la movilidad cromatográfica de las antocianinas son
reportadas en la forma de sal clorhidra. El uso de otro ácido durante la
extracción puede producir resultados erróneos a partir de una sal formada
que puede diferir considerablemente en la movilidad cromatográfica de su
correspondiente sal clorhidra. Si la antocianina acilada esta presente, 0.05%
de HCl en metanol puede ser usada para minimizar la descomposición de los
pigmentos acilados. El uso de soluciones altamente ácidas es perjudicial.
(Du y Francis 1975)
2.7.2 Purificación
Un paso importante en la examinación detallada de las
antocianinas es el aislamiento en su forma pura. Esto es necesario para
separarlas de otros compuestos los cuales son extraídos de la planta al
mismo tiempo por ejemplo otras antocianinas, flavonoides y sustancias
solubles en agua como los azucares, ácidos y otros minerales. La
separación de antocianinas pueden ser realizadas con solventes
convencionales – solventes de partición o cromatografía.
2.7.3 Cromatografía de papel
El uso de la cromatografía de papel en el estudio de las
antocianinas ha sido utilizada para distinguir diferentes clases de glucósidos
de acuerdo a su distribución entre los alcoholes hidroxilados. En 1948 Bate
Smith exploró satisfactoriamente el uso de la cromatografía de papel y la
purificación de los pigmentos antociánicos de las plantas. Desde entonces
esta técnica ha sido ampliamente utilizada para la separación, purificación e
identificación de antocianinas y otros flavonoides de las plantas. Harborne
(1958) ha identificado más de 100 diferentes antocianinas adoptando la
técnica simple de la cromatografía de papel y ha desarrollado una largo
colección de valores de movilidad cromatográfica (Rf) útiles.
32
El cambio de solventes usados para la separación, purificación e
identificación de antocianinas es limitado como es descrito por Harbone. La
prudente combinación de la cromatografía de papel con solventes efectivos
(mayor fuerza de resolución) puede ser usado ventajosamente para separar
las antocianinas. De este modo, Fuleki (19) pudo separar la cianidina 3-
glucósido y la peonidina-3 glucosídico de sus galactósidos en el arándano,
usando un solvente llamado BBFW (butanol: benceno : ácido fórmico:
agua), luego Fuleki desarrolló otro solvente llamado BFW (butanol: ácido
fórmico : agua) para la separación de antocianinas de las fresas, ruibarbo y
cebollas usando cromatografía de papel, posteriormente este mismo
solvente ha sido utilizado en las cerezas y en otros vegetales. El solvente
BFW es definitivamente superior al solvente BAW con relación a su fuerza
de resolución, sin embargo, el BFW requiere de mayores tiempos de
resolución (48 a 72 horas).
Cabe mencionar que dentro de esta técnica existe la cromatografía
bidimensional que puede obtener los mismos resultados que usando la
cromatografía simple sin embargo, se necesita de más cromatogramas para
obtener una apreciable cantidad de pigmento separado. Así también se han
desarrollado otras técnicas como son el uso de la cromatografía de columna,
cromatografía de capa fina pero sin duda la cromatografía de papel ha sido
la mas aplicada y la que mejores resultados se han obtenido en lo que se
refiere a la separación y purificación de los pigmentos antociánicos.
2.7.3.1 Mobilidad cromatográfica
La movilidad cromatográfica (valor Rf) de las antocianinas es la
más importante característica para identificar pigmentos no conocidos. La
movilidad de los pigmentos en papel filtro Whatman n°1 indica muy
claramente el número de azucares y otros sustituyentes que contiene. En
pigmentos bien unidos los valores Rf pueden ser comparados con la
literatura. El uso de pigmentos auténticos para la comparación de valores
33
Rf con antocianinas no conocidas bajo mismas condiciones en un diferentes
sistemas de solventes vienen ha ser experimentos necesarios para una
separación preliminar. La relación general entre los valores Rf y la
estructura de las antocianinas ha sido descrita por Harborne. El gran número
de grupos hidroxilados presentes en las moléculas de antocianinas, dan un
valor Rf menor en solvente alcohólico (BAW) y acuoso (1% HCl, HAC-
HCl) De este modo el correspondiente glucósido de pelargonidina (I),
cianidina (II) y delfinidina (IV) pueden ser siempre colocados en orden
decreciente a su valor Rf. La metilación efecto reversible de la
hidroxilación, presenta mayor cantidad de grupos metoxilos dando valores
Rf mayores en los mismos tipos de solventes. El incremento de los valores
Rf, causado por la metilación es mas bien menor que la disminución causado
por la hidroxilación. Así el mismo glucósido de cianidina (II) y malvidina
(IV) tienen similar Rf. Existe una relación directa entre el valor Rf y el
número de unidades de azúcar, las cuales son completamente independientes
de la naturaleza de la antocianidina. En solventes acuosos, el efecto de la
glicosilación es un incremento en los valores Rf por ejemplo la cianidina 3-
glucósido la cual tiene un Rf más pequeño que la cianidina 3-diglucósido
que a la vez tiene un Rf más pequeño que el de la cianidina 3-triglucósido.
Lo inverso es cierto para solventes alcohólicos. La acilación causa un
incremento del valor Rf en solventes basados en n-butanol pero una
disminución en solventes acuosos. El efecto de la acilación en los valores Rf
es reversible del que es mostrado por la glicosilación.
2.7.4 Métodos Espectrales
Una antocianina pura en metanol tiene dos absorciones máximas
importantes, una en el espectro visible en el rango de 465 a 550 nm, y una
pequeña en la región ultravioleta cerca de los 275nm. La absorción máxima
en el espectro visible da una clara indicación de su patrón hidroxilado de una
34
antocianidina derivada de una antocianina. Por ejemplo, la pelargonidina
tiene un máximo en 520 nm, la cianidina de 535nm y la delfinidina a 546
nm. La introducción de una molécula de azúcar en la posición 3 de la
antocianidina tiene un cambio hipsocrómico en el espectro. La naturaleza de
la sustitución del azúcar no tiene efecto sobre el espectro.
Las dos clases más comunes de antocianinas, la 3- y la 3,5-
diglucósido, tienen similar espectro de absorción máximo pero muestra
diferencias de intensidad en el rango de los 400 a 460 nm. De este modo, 5-
y 3,5- glucósidos tiene solo un 50% de absorción a 440 nm cuando se
compara con su correspondiente 3-glucósido.
Los pigmentos que contienen azucares en las posiciones 5,7 y 3,7
tienen diferentes absorciones máximas y pueden ser fácilmente distinguidos.
El espectro de una antocianina acilada muestra dos picos en la región
ultravioleta debido a la superposición de la absorción del grupo acilado. La
presencia de un nuevo pico entre los 310 a 350 nm indica la acilación
aromática.
Las antocianinas y antocianidinas las cuales tiene un grupo O-
dihidroxilado experimentan un cambio batocrómico de 15 a 23 nm en
presencia de AlCl3 en un pH de 2 a 4. Así la cianidina y la delfinidina
presentan ese cambio mientras que la peonidina no.
Los métodos espectrales no son considerados suficientes para la
absoluta caracterización de la naturaleza de las antocianinas y la posición de
la glicosilación. Otros análisis químicos son necesarios para establecer la
estructura de la antocianina.
2.8 Capacidad antioxidante
2.8.1 Radicales libres y antioxidantes
Durante varios años la hipótesis de los radicales libres del
envejecimiento ha sido utilizada para explicar los cambios relacionados con
la edad como resultado de un incremento de la incapacidad para competir
35
con el estrés oxidativo (OS) que ocurre durante el transcurso de la vida y
que esta asociado con el incremento de la sensibilidad a los efectos de
estresores oxidativos. El estrés oxidativo se define como un desbalance entre
oxidantes y antioxidantes en favor del primero, dando como resultado un
daño oxidativo en moléculas como ADN, lípidos y proteína (Prior et al.
1998), según este autor las características de un radical libre son:
- Electrón no apareado alrededor del núcleo del átomo.
- Alta inestabilidad
- Es producido por: Procesos metabólicos, humo del cigarro,
smog, pesticidas, drogas, etc.
Un antioxidante es cualquier sustancia que está presente en bajas
concentraciones comparada con un sustrato oxidable y detiene o previene
significativamente la oxidación de dichos sustratos. El sistema normal de
defensa en sistemas biológicos consiste en sistemas enzimáticos y no
enzimáticos. Aunque ambos son importantes en los sistemas biológicos,
considerando el rol de los alimentos antioxidantes, consideraríamos al
sistema biológico antioxidante no enzimático el cual incluye sustancias
como: α-tocoferol (vitamina E), ácido ascórbico (vitamina C), glutatione,
flavonoides, β-caroteno (precursor de la vitamina A), ácido úrico y
proteínas del plasma como la albúmina, ceruloplasmina, transferían, etc.
(Prior, 1998)
El concepto básico de la actividad antioxidante de varios
compuestos naturales y sintéticos comprende una transición redox mediante
la cual la molécula antioxidante dona un electrón (o átomo de hidrogeno,
equivalente a la donación de un electrón y un H+ al radical libre Rº).
Durante el transcurso de esta transferencia de electrones, el carácter
radical (inestabilidad) es transferido al antioxidante, formándose un
36
antioxidante radical derivado (Cárdenas, 2001). E la siguiente ecuación se
muestra la acción de un flavonoide sobre un radical libre:
Flavonoide (OH) + Radical → Radical flavonoide (Oº) + RH
Cualquiera sea el mecanismo inherente a los efectos antioxidantes
de los flavonoides, estos compuestos, al igual que todos los antioxidantes,
deben reunir dos requisitos básicos para ser considerados como tales: en
primer lugar, aun en bajas concentraciones deben proteger los compuestos
contra la oxidación o el daño por radicales libres y, en segundo lugar, el
radical flavonoide (aroxil radical) así formado debe ser lo suficientemente
estable para que la función antioxidante sea efectiva. La falta de
estabilidad que pueda tener el radical aroxilo esta en la base del efecto
prooxidante de algunos flavonoides. A su vez, el radical aroxilo puede ser
recuperado por otros antioxidantes, como el ascorbato (Cárdenas, 2001).
Radical flavonoide(Oº) + acido ascórbico →Flavonoide(OH) + radical ascorbato
2.8.2 Compuestos fenólicos y capacidad antioxidante
Los antioxidantes pueden clasificarse en naturales o sintéticos,
estando estos últimos en desuso debido a los estudios que les atribuyen
efectos carcinógenos. Este hecho ha despertado un creciente interés en el
estudio de los antioxidantes naturales entre los que se encuentran distintos
compuestos fenolitos (Martínez-Valverde et al., 2000).
El comportamiento antioxidante de los compuestos fenólicos
parece estar relacionado con su capacidad para quelar metales, inhibir la
lipoxigenasa y captar radicales libres, aunque en ocasiones puede también
promover reacciones de oxidación ”in vitro” (Martínez-Valverde et al.,
2000).
Para que un compuesto fenólico sea clasificado como antioxidante
debe cumplir con dos condiciones básicas, la primera es que cuando se
37
encuentre en una concentración baja con relación al sustrato que va a ser
oxidado pueda retrasar o prevenir la autooxidación o la oxidación medida
por un radical libre y la segunda es que el radical formado tras el secuestro
sea estable y no pueda actuar en oxidaciones posteriores. Entre los
compuestos fenolíticos con una reconocida actividad antioxidante destacan
los flavonoides, los ácidos fenólicos (principalmente hidroxicinámico,
hidroxibenzóico, caféico y clorogénico) taninos (aliginatos), calconas y
cumarinas, los cuales constituyen la fracción polifenólica de una gran
diversidad de alimentos (Martínez-Valverde et al., 2000).
La capacidad antioxidante varía en función del grupo de
compuestos estudiados y en su solubilidad en fase acuosa o lipídica.
Asimismo, la gran diversidad de métodos empleados proporciona resultados
numéricos distintos difíciles de comparar. Para solventar este problema en la
mayoría de los estudios científicos en los que se valora la actividad
antioxidante bien de compuestos puros, bien de extractos vegetales, se
utiliza el Trolox (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxílico)
como patrón, sustancia que se caracteriza por ser una análogo hidrosoluble
de la vitamina E (Martínez-Valverde et al.,2000).
38
III. MATERIALES Y METODOS
3. Lugar de Ejecución
La presente investigación se realizó en los laboratorios de Biotecnología de
la Facultad de Industrias Alimentarias de la Universidad Nacional Agraria.
3.2 Materiales
3.2.1 Materia Prima
La materia prima utilizada fue cáscara de oca morada (Oxalis
tuberosa Mol. de ocas provenientes de Jauja – Huancayo y proporcionadas
por el Programa de Raíces y Tubérculos de la UNALM .
3.2.3 Material de vidrio
- Beakers de 100 ml, 250 ml y 1000 ml- Erlenmeyers de 100 ml, 500 ml y 500 ml- Balones de 250 ml- Fiolas de 25 ml, 50 ml y 100 ml- Pipetas de 1ml, 2ml, 5 ml, 10 ml- Campana Cromatográfica de vidrio- Placas petri- Tubos de ensayo- Tubos de 50 ml “Falcón”- Termómetro- Embudos de vidrio- Baguetas- Tubos para centrífuga - Micropipetas (0-50 ul y 100 – 1000 ul) con tips- Otros materiales para los diferentes ensayos.
3.2.4 Reactivos
- Etanol 96% (Montana)- Ácido clorhídrico 37% p.a. (J.T. Baker)- Cloruro de Potasio (Merck)
39
- Acetato de Sodio (Merck)- Metanol absoluto p.a (Mallinckrodt)- DPPH (Sigma Aldrich)- Guayacol- Ácido cítrico (Merck)- Fosfato disódico (Merck)- Fosfato de potasio monobásico (Merck)- Fenol (Merck)- Hidróxido de sodio (Merck)- 1-Butanol (Merck)- Ácido acético (Merck)- Agua destilada- Y otros activos necesarios para los análisis proximales.
3.3 Equipos y otros materiales
- Agitador magnético (Barnstead/Thermolyne, USA)- Baño maria con agitación (GFL, Alemania)- Espectrofotómetro (Génesis 5 / Milton Roy, USA)- Refractómetro ABBE- Balanza analítica (A&D Co. Ltd., Japón)- Potenciómetro (Orion, USA)- Estufa (LABOR, Hungria)- Mufla (LABOR, Hungria)- Cocinilla eléctrica (FAEDI, Perú)- Refrigerador- congelador (General Electric, USA)- Autoclave (MST, USA)- Licuadora (Osterizer, USA)- Rotavapor (Buchi, Alemania)- Agitador de tubos (LABOR, Hungría)- Campana Cromatográfica
3.4 Métodos de análisis
Para la realización de los diferentes análisis químicos y físicos se
utilizó cáscara de oca morada con 5 días de cosecha y que no
fueron expuestos al sol (no asoleadas.
3.4.1 Análisis Físico-químicos
40
a) Determinación de humedad y materia seca: Se utilizó el método
gravimétrico porcentual que consiste en secar la muestra en una
estufa a 105 °C por 5-6 horas, hasta obtener un peso constante. El
contenido de humedad es el resultado de la diferencia del peso
inicial y el final expresado en porcentaje (AOAC, 1990)
b) Determinación de ceniza: Es la materia restante después de
incinerar toda la materia orgánica tales como proteínas grasas
carbohidratos en una mufla a 550°C. El contenido de ceniza es el
resultado de la división entre el peso de la muestra calcinada entre
la muestra sin calcinar expresado en porcentaje (AOAC, 1990)
c) Determinación de proteína: Se utilizó el método semi-micro
Kjedalh. Se considero el factor 6.25 como factor de conversión del
nitrógeno a proteína (AOAC, 1990)
d) Determinación de grasa: Se utilizo el método de Soxhlet, que se
basa en la extracción de grasa por medio de solventes hexano-éter,
en los cuales las grasas son solubles luego se conoce el peso por
evaporación del solvente (AOAC, 1990)
e) Determinación de fibra cruda: Se basa en la transformación de
los carbohidratos solubles a compuestos más simples, mediante
doble hidrólisis, una ácida y la otra alcalina, quedando la muestra
insoluble, el filtrado se seca y se pesa. El valor es expresado en
porcentaje (AOAC, 1990)
f) Determinación de carbohidratos: Se obtuvo de la diferencia, esto
es el 100% menos el resultado obtenido de los análisis anteriores
(humedad, ceniza, proteína, extracto etéreo y fibra cruda) (AOAC,
1990)
g) Determinación de pH: Se utilizo el método potenciométrico
(AOAC, 1990)
h) Determinación de almidón: Se basó en la hidrólisis del almidón a
azucares reductores. Se uso el factor 0.94 para la conversión de
azucares reductores a almidón (Lees, 1982)
41
i) Determinación de azucares reductores: Se hizo uso del método
espectrofotométrico según lo recomendado por Miller (1959) El
fundamento de la metodología es la reacción del ácido 3,5-
dinitrosalicílico (DNS) con el grupo reductor del azúcar, en un
medio alcalino. La reacción resulta en la formación de un
compuesto coloreado (marrón). Según la ley de Lambert y Beer, la
intensidad de este color es proporcional a la cantidad de azucares
presentes.
3.4.2 Determinación de la actividad polifenoloxidasa (PPO)
Se basa en medir espectrofotométricamente, a intervalos de un
minuto, el aumento de la absorbancia de una mezcla de la solución
enzimática con ácido clorogénico como sustrato. Al graficar la absorbancia
contra el tiempo los resultados se expresan en aumento de absorbancia por
minuto y por g de proteína. (Schimidt- Hebbel et al., 1969 ). El
procedimiento seguido se describe a continuación:
- Se licuan 35 gr de cáscara de oca, la cual previamente se encuentra
congelada a 0°C, con 70 ml de una solución de 0.3M KCl (4°C)
- La mezcla se centrifuga a 10000 RPM a 0°C y se filtra al vacío y se
enraza a 100 ml
- Se prepara la solución sustrato, la cual consiste de 25 ml de buffer a
pH 5.2, compuesto de ácido cítrico y fosfato disódico, con 10 ml
de una solución de ácido clorogénico 0.0033M, toda la mezcla se
dejó reposar por 10 minutos.
- Se toma 15 ml de la solución sustrato y se le adiciona 5 ml de la
solución enzimática y se agita suavemente por 5 segundos (llevar a
30°C)
- Se lleva al espectrofotómetro y se lee la variación de la absorbancia
a 390 nm cada minuto
- El blanco es la solución con la enzima inactivada.
42
- Se grafica la absorbancia (eje Y) versus el tiempo (eje X) y se
calcula la pendiente de la parte lineal de la curva. Los resultados se
expresan en min-1
-
3.4.3 Determinación de la actividad peroxidasa (PRO)
Se realizo siguiendo el método de Hemeda (1990). El
procedimiento seguido se describe a continuación:
- Se licua 25 gr de cáscara de oca en 100 ml de agua destilada
durante 2-3 minutos
- Se filtra y se centrífuga a 2000 RPM por 20-30 minutos- Se prepara la solución de sustrato que consiste en 10 ml de
guayacol al 1%, 10 ml de H2O2 al 0.3% y 1000 ml de buffer fosfato
de sodio 0,1 M y pH 6.5
- Se toman 20 ml de la solución sustrato y se adiciona 1,6 ml del
sobrenadante crudo
- Luego se procede a medir la variación de la absorbancia a 470 nm y 25 °C
- Se grafica la absorbancia (eje Y) versus el tiempo (eje X) y se
calcula la pendiente de la parte lineal de la curva. Los resultados se
expresan en min-1.
3.4.4 Cuantificación de compuestos fenólicos
Se realizo siguiendo el método de Swain y Hillis (1959). El
procedimiento se describe a continuación:
- Se pesa 15 g de cáscara de oca fresca y se licua durante 2 minutos
con 60 ml de etanol al 96%. El homogenizado se transfiere a un
erlenmeyer.
- Se lava el vaso de la licuadora con 15 ml de etanol y se transfiere a
un erlenmeyer
- Se deja el homogenizado durante 24 horas a 8°C
- Se centrífuga el homogenizado a 5000 RPM durante 30 minutos
43
- Con una micropipeta extraer una alícuota de 0,5 ml del
sobrenadante del extracto y agregar 7 ml de agua destilada
- Adicionar 0,5 ml de reactivo Folin-Ciocalteau 0,25N y agitar por
tres minutos
- Agregar 1 ml de la solución de carbonato de sodio saturada y llevar
a 10 ml con agua destilada y agitar
- Luego de una hora de reacción, leer a 725 nm usando como blanco
una alícuota de 0.5 ml de agua destilada en lugar de la muestra
- Elaborar una curva patrón utilizando ácido clorogénico como
compuesto fenólico de referencia. Los resultados se expresan en
mg equivalente de ácido clorogénico / ml de extracto.
3.4.5. Cuantificación de la capacidad antioxidante (AOA)
Se realizó siguiendo el método de Brand-Williams et al. (1995). Se
describe a continuación:
- Se pesa 15 g de cáscara de oca fresca y se licua durante 2 minutos
con 75 ml de metanol. El homogenizado se transfiere a un
erlenmeyer.
- Se lava el vaso de la licuadora con 15 ml de metanol y se transfiere
al erlenmeyer.
- Se deja el homogenizado durante 20 horas alrededor de 8°C.
- Se centrífuga el homogenizado a 5000 RPM durante 30 minutos.
Se toma del sobrenadante una alícuota para e análisis y se transfiere
a un tubo Ependorff. El extracto puede ser analizado
inmediatamente o almacenado a –20°C para un análisis posterior.
- Preparar una solución de DPPH° con una absorbancia alrededor de
1.1.
- Tomar una alícuota de 0.15 ml del extracto metanólico y 0.15 ml
de metanol.
- Adicionar cada uno en tubos que contengan 2.85 ml de solución de
DPPH° y agitar.
44
- Después de 15 minutos leer a 515 nm, usando como blanco
metanol puro. Anotar el calor obtenido por efecto del extracto (M)
y por defecto del metanol (B).
- Calcular la variación de la absorbancia (∆ABS = B-A)
- Elaborar una curva patrón utilizando como referencia los reactivos
antioxidantes TROLOX o ácido ascórbico. Los resultados se
expresan en mg Equivalentes Trolox/ ml de extracto.
3.5 Cromatografía sobre papel del extracto de cáscara de oca morada
(Oxalis tuberosa mol.)
La metodología utilizada es la propuesta por Harborne (1958) la
cual se describe a continuación:
a) Extracción de los antocianos contenidos en la cáscara de oca
Los pigmentos antociánicos se extraen de la cáscara fresca de oca
morada (Oxalis tuberosa Mol.) con una solución de Metanol - HCl
0.1% (97:3) a temperatura ambiente El extracto se centrifuga a
5000 RPM y se filtra a través de Celite y luego es concentrado a un
pequeño volumen en rota vapor a 40 º C.
b) Separación de los antocianos contenidos en el extracto
Se realiza mediante cromatografía sobre papel Whatman Núm. 1
utilizando como disolvente de desarrollo la mezcla butanol / ácido
acético / agua (4:1:5) (v/v/v) fase superior, por cromatografía
ascendente y Forestal (Ácido acético- agua- HCl conc.)
Las bandas obtenidas se cortan de los cromatogramas secos y son
eluídos separadamente con Agua-metanol-ácido acético (25:70:5,
por volumen). Las bandas individuales son separadas de purezas
polifenólicas por la aplicación de las mismas en papel Whatman
Núm. 3 y desarrollados con (n-Butanol - ácido acético - agua
(4:1:5), por volumen, fase superior) y se repite el procedimiento
45
con Agua - ácido acético (85:15, v/v) como solvente.. La
purificación de los pigmentos se efectúa con la mezcla ácido
acético / agua / HCl conc (15:82:3) (v/v/v)
c) Características Cromatográficas y espectrales
Los pigmentos extraídos y purificados se extraen de la etapa
anterior con el disolvente metanol / HCl 0.01% y se concentran a
vacío a 45°C. A continuación se determinan los valores Rf de los
concentrados sobre papel Whatman Num. 1
Por otra parte, se obtienen los espectros de absorción de las bandas
obtenidas en el intervalo 200 – 600 nm usando como blanco el
disolvente metanol / HCl 0.01%
3.6 Análisis de antocianinas
a) Extracción y cuantificación de antocianinas en medios
alcohólicos
La extracción y cuantificación de antocianinas en medios
alcohólicos se realizo siguiendo la metodología reportada por Fuleki y
Francis (1968). El procedimiento se describe a continuación:
- Se pesa 25 gr de cáscara de oca morada fresca (P) y se licua con 50
ml de una solución de extracción que consiste en HCl 1.5 N :
Etanol 96% (15:85)
- Se transpasa el licuado a un erlenmeyer, se lava el vaso de la
licuadora con 50 ml de la solución de extracción, se transvasa al
mismo erlenmeyer y se deja reposar por 18-24 horas en oscuridad a
8°C
- Luego se filtra la muestra con papel Whatman 1, se enjuaga el
erlenmeyer y el filtro con la solución de extracción y se enrasa a
200 ml (V1)
- Se extrae una alícuota (f1) y se enraza con la solución de
extracción a un volumen conocido (f2)
46
- Se hace un blanco en el espectrofotómetro con la solución de
extracción como blanco
- Se guarda en la oscuridad durante 30 minutos y luego se lee la
absorbancia a 535 nm y a 700 nm. Se determina la diferencia de las
dos absorbancias.
A = A535nm – A700 nm
- Las absorbancias obtenidas no deben ser mayores a 0.7
El contenido de antocianinas totales se expresa de la siguiente
manera:
ACNs (mg / 100 g bh) = A * PM * V1 * f2F1 * P * ε
Donde ε es la absortividad molar para la cianidina 3- glucósido en
medio alcohólico- ácido (ε = 20941 L x mol-1 x cm-1) y PM es el
peso molecular de la cianidina 3- glucósido(PM = 449.2 gr x mol-1)
b) Cuantificación de antocianinas totales en medio acuoso
La cuantificación de antocianinas en medios acuosos se realizo
siguiendo la metodología reportada por Wrolstad (1976). El procedimiento
se describe a continuación:
- Se selecciona un extracto acuoso de la cáscara de oca morada
obtenido mediante cualquier procedimiento de extracción
- Se toma una alícuota conocida (V1) del extracto acuoso y se
diluye con buffer acetato de sodio ( pH 4.5 ) y buffer cloruro de
potasio (pH 1.0), hasta alcanzar un volumen conocido (V2)
- Se guarda en oscuridad durante 15 minutos y se realiza las lecturas
correspondientes en el espectrofotómetro a la longitud de onda de
máxima absorbancia en el visible ( λ vis. máx.) y a 700 nm para los
dos búferes
- Previamente poner en cero el espectrofotómetro con agua destilada
como blanco
47
- Si las absorbancias en la longitud de onda son mayores a 0.8,
rediluir la muestra y ensayar de nuevo
- La absorbancia de la muestra diluida es:
A = ( A λ vis-max - A 700nm)pH 1.0 (1)
ó
A = ( A λ vis-max - A 700nm)pH 1.0 - ( A λ vis-max - A 700nm)pH 4.5 (2)
El contenido de antocianinas totales se expresa de la siguiente
manera:
ACNs (mq Eq. Cy-3-glu / L) = A x PM x FD x 1000 ε
3.7 Metodología experimental
3.7.1 Obtención y acondicionamiento de la cáscara de oca morada
El flujo de operaciones para la obtención de la cáscara de la oca
morada se puede apreciar en la Figura 9, en donde se aprecia las
operaciones básicas las cuales se describen a continuación:
1. Selección.- Operación manual con la finalidad de eliminar aquellos
tubérculos que se encontraban dañados o con indicios de pudrición.
2. Clasificación.- Operación manual con la finalidad de clasificarlos por
tamaño lo cual facilitó la operación de pelado.
3. Lavado y desinfectado.- Se usó agua potable clorada con la finalidad
de eliminar tierra e impurezas que se encontraban en los tubérculos.
4. Pelado.- Operación que se llevó acabo manualmente con ayuda de
cuchillos especiales de acero inoxidable.
5. Escaldado.- Con el objetivo de inactivar enzimas degradativas
polifenoloxidasas (PPO) y peroxidasas (PRO), las cáscaras fueron
sometidas a un tratamiento previo con vapor húmedo a 100 º C. Se
evaluaron tiempos de tratamiento. Para cada tiempo se evaluó la
48
actividad enzimática residual y se determino el tiempo óptimo de
escaldado.
Act. Enzimática Residual
= Act. Enzimática cáscara de oca sometida al vapor (min -1 )
Act. Enzimática cáscara de oca fresca (min-1)
Para la prueba cromatográfica se utilizo cáscara de oca fresca.
6. Congelado.- Para una mejor conservación de las cáscaras, fueron
congeladas por debajo de los -18 ° C, durante el tiempo en que se
desarrollaron las pruebas.
Figura 9. Flujo de operaciones para la obtención de la cáscara de oca
morada
Oca Morada
49
SELECCIÓN
CLASIFICACIÓN
LAVADO Y DESINFECTADO
PELADO
CONGELADO T = -18 °C 2
ALMACENAJET = -18°C 2
Cáscara
Ocas dañadas y podridas
Agua
Agua + impurezas
Pulpa
3.7.2. Evaluación de rendimientos
50
Las ocas luego de la selección y clasificación fueron pesadas con la
finalidad de evaluar el rendimiento que se obtendrá con respecto al peso de
la cáscara y el tubérculo entero.
3.7.3. Caracterización físico-química de la cáscara.-
Las cáscaras de oca morada fueron caracterizadas primeramente
mediante un análisis químico proximal (descritos en el Ítem 3.4.1).
Adicionalmente se midió la capacidad antioxidante y compuestos fenólicos
de la cáscara y tubérculo de la oca morada.
3.7.4 Separación de pigmentos
La metodología utilizada es la propuesta por Harborne (1958)
descrita en el Ítem 3.5.
Los solventes de desarrollo fueron BAW (n-butanol - ácido acético
- agua) y Forestal (Ácido acético - HCl conc. - agua) con los siguientes
condiciones:
Solvente Composición Tiempo de desarrollo
BAW 4:1:5 (v/v) 18 Horas
Forestal 30:3:10 6 Horas
Las pruebas se realizaron hasta obtener bandas bien definidas que
permitieran obtener espectros de absorción definidos y claros. Se utilizo una
muestra de col morada la cual fue tratada en las mismas condiciones que la
cáscara de oca morada y que se usó como medio de comparación para
describir el comportamiento de las mismas sobre el papel.
Se calculo el valor de mobilidad cromatográfica (Rf) que se define
como:
Rf = Distancia recorrida por la sustancia (cm.) X 100
Distancia recorrida por el disolvente (cm.)
51
3.7.5 Extracción de antocianinas
En esta etapa de la investigación se procedió a la extracción de
antocianina de la cascar de oca que ha sido acondicionada según lo referido
en el Ítem 3.7.1 usando como medio de extracción, por un lado un medio
acuoso (Método reportado por Fernández, 1995) y por otro un medio
alcohólico (Método reportado por Fuleki y Francis, 1968). Los parámetros
de cada extracción se pueden observar a continuación:
Parámetros Extracción acuosa Extracción alcohólica
MP: Solvente 1:5 1:5
Temperatura 5 º C 5º C
Tiempo 24 horas 24 horas
pH 2.0 1.0
Luego de obtenidos los extractos se procedió a la cuantificación de
antocianinas (ítem 3.6), fenólicos totales (ítem 3.4.4) y capacidad
antioxidante (ítem 3.4.5)
3.7.6. Evaluación de la estabilidad del colorante
El efecto del pH en la estabilidad del colorante fue evaluado a
través del tiempo (cada 30 minutos por espacio de 2 horas) a 5 diferentes
niveles de temperatura (40, 50, 60, 70, 80 º C) con muestras contenidas en
tubos cubiertos por papel aluminio y sellados con parafilm.
El efecto de la temperatura en la estabilidad del colorante fue
realizado sobre muestras dentro de tubos cubiertos por papel aluminio y
sellados con parafilm e inmersos en un baño de agua a 3 diferentes pHs (2,
3, 3.5) por 0, 30, 60, 90 y 120 minutos.
3.7.6.1 Preparación del colorante:
52
La cáscara de oca morada fue blanqueada por 1 minuto, luego el
colorante fue extraído con Etanol-HCl 1% (85:15), se dejo reposar por 24
horas a 4 º C. Posteriormente el contenido fue filtrado a baja presión
utilizando Celite y centrifugado por 15 minutos a 5000 RPM. Cada muestra
fue preparada a tres pHs diferentes (2, 3, 3.5) con el buffer Mc. Illvaine.
Cada muestra fue inicialmente preparada a pH 0.9 con una lectura de
absorbancia que no sobrepase de 0.8 y a 535 nm como longitud de máxima
absorbancia.
3.7.6.2 Medida de la densidad de color, color polimérico e índice de
degradación
La densidad de color y el contenido de color polimérico fue
determinado usando el método de blanqueado del bisulfito (Wrolstad,
1976). Las soluciones fueron blanqueadas con metabisulfito de potasio
(usando agua como control) y las lecturas de absorbancia fueron tomadas a
420 nm y 535 nm como longitud de máxima absorbancia (λ máx.).
La medida de la densidad de color como indicador de pigmentos
polimerizados, incluyendo taninos y compuestos marrones; es la suma de la
λ máx. + 420 nm de la muestra blanqueada, asumiendo que solo la
antocianina monomérica es blanqueada.
El color polimérico fue expresado como porcentaje del total de la
densidad de color.
Índice de degradación fue obtenido de la relación Absorbancia a
420 nm y Absorbancia a λ máx.
Todas las muestras fueron hechas por triplicado.
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 Composición de la oca morada
53
Con respecto a los componentes estructurales de la oca a lo que se refiere,
cáscara, pulpa y yemas (puntas y raíces), se consideraron los pesos de cada
componente y los resultados se expresaron en porcentaje por cada kilo de
tubérculo entero.
Cáscara 12.3%
Pulpa 85.7%
Yemas 2.0%
Con el fin de conseguir una mayor eficiencia en el proceso de
extracción de la materia colorante se procedió a descartar las puntas de las
raíces o yemas (que representan el 2,0 % del peso total), que presentan
una escasa coloración y poseen una estructura fibrosa que pudiese dificultar
el posterior proceso de molienda. Asimismo se eliminaron aquellas raíces
(yemas) que presentaron pudrición o ciertos signos de desorden fisiológico.
4.2 Análisis químico proximal
Los resultados del análisis químico proximal efectuado sobre la cáscara de
oca morada se presentan en el Cuadro 5 donde se observa, el análisis de los
componentes químico proximales tanto en el tubérculo entero como en la
cáscara. Se puede apreciar que el contenido de agua constituye el mayor
porcentaje con respecto a los demás componentes con un 84.2% para la
cáscara y 85.17 para el tubérculo entero. El contenido de materia seca se
encuentra cercano al valor reportado por un estudio hecho por Brito (1999),
que manifiesta que para la oca variedad morada el porcentaje de materia
seca promedio para el tubérculo entero es de 21.78% y la muestra analizada
para la presente investigación se encuentra en 15.8% para el tubérculo
entero y de 14.83% para la cáscara.
Cuadro 5. Análisis químico proximal de las cáscaras de oca morada
54
Datos para tubérculo entero y peso fresco.
Fuente: * Collazos et al. (1996).
En lo que respecta a los demás componentes, el contenido de
proteína, grasa, fibra y ceniza son menores en la cáscara que en el tubérculo
entero con respecto a este último los valores obtenidos se encuentran
cercanos a los reportados por Collazos et al. (1996). El contenido de
proteína es bajo tanto en la cáscara como en el tubérculo entero, Gross et al.
(1989), menciona que el contenido proteico en ocas es poco y de baja
calidad.
Cabe resaltar además, que la composición química de la oca varía
por causa de varios factores, tales como: orden genético, diferencias entre
variedades, ubicación del cultivo, variedad, agua, luz, suelo, asoleado, etc.
La variabilidad de colores que presenta la oca que van del amarillo
al púrpura no permiten que se pueda obtener una tendencia relacionada al
color y el contenido de cada uno de los parámetros estudiados lo que si
existe es una relación mas equitativa entre el contenido de almidón y
azucares.
55
CARACTERÍSTICAS (expresadas en g / 100 g cáscara)
CantidadTubérculo
entero Cáscara Referencia*
Agua 85.17 84.2 83.0
Proteína 2.85 0.86 3.0
Fibra 3.32 1.08 4.0
Grasa 0.41 0.49 0.5
Ceniza 3.5 1.11 1.9
CHO’S 82.6 82.12 83.0
La forma hortícola morada presenta los valores medio más altos de
almidón con respecto a sus otras variedades (amarillo, roja, naranja) según
lo reportado en los estudios hechos por Brito et al. (1999), lo contrario
sucede con el contenido de azucares reductores, esto se puede observar en el
Cuadro 6, donde se reportan los resultados de las pruebas realizadas a la
cáscara de oca comparados con la referencia de Brito et al. (1999). Con
respecto a ello se puede decir que la cáscara posee un alto contenido de
azucares reductores, aproximadamente la mitad del contenido total de
azucares reductores; el contenido de almidón es bajo, es por ello que los
posteriores procedimientos de extracción del pigmento no presentaron
dificultad, pues se sabe que la presencia de un alto contenido de almidón
encapsula al pigmento disminuyendo la extracción de antocianinas.
Cuadro 6. Contenido de almidón y azucares reductores (Datos
expresados en base seca muestra entera y en porcentaje)
*
Brito
et al.
(1999).
Gross et al., (1995), manifiesta que el azúcar más importante
encontrado en la oca es la sucrosa seguido por la glucosa y la fructosa. Sólo
56
MuestraAlmidón
%
Azucares Reductores
%
Cáscara 1.45 1.47
Tubérculo entero 36.4 3.16
Oca morada * 42.24 ± 3.30 3.54 ± 0.72
Oca Amarilla ª 22.31±3.49 6.58±2.52
Oca Roja ª 21.34±4.10 5.58±0.72
Oca Naranja ª 18.22 5.95
pequeñas trazas de rafinosa y estaquiosa son encontradas en todas sus
formas hortícolas, valores que aumentan de acuerdo al tiempo de asoleado
que se le dé en la post- cosecha de los tubérculos, práctica común dentro de
los pobladores de la región andina.
4.3 Caracterización cromatográfica y espectrofométrica de la
cáscara de oca morada
4.3.1 Resultados de la separación cromatográfica del pigmento
antociánico de la cáscara de oca.
Se llevo a cabo la caracterización del pigmento antociánico de la
cáscara de oca morada (Oxalis tuberosa mol.), mediante la medida de los
valores de mobilidad cromatográfica (Rf) determinados en la cromatografía
sobre papel que se complementan con la medida de parámetros
espectrofotométricos.
En el Cuadro 7 se observan los resultados de la separación
cromatográfica sobre el papel Whatman Nº 3 de la mezcla de antocianos
extraídos de la cáscara de oca morada. Se obtuvieron dos bandas que se
denominarán A y B.
Adicionalmente se utilizo una muestra de col morada la cual fue
tratada en las mismas condiciones que la cáscara de oca morada, banda
obtenida que se denominará C.
57
Cuadro 7. Valores Rf de las antocianinas en cromatografía sobre
papel Whatman N°3
MUESTRARf x 100
BAW Forestal
Oca Morada
A
B
50
34
45.6
42.0
Col Morada
C 32 68.0
*BAW (n-butanol – ácido acético – agua). Forestal (Ácido acético – HCl conc. – agua).
Shirikhande (1976), manifiesta que el principal paso en el examen
detallado de las antocianinas es que el aislamiento debe ser en forma pura,
se debe separar de otros componentes que son extraídos de las plantas al
mismo tiempo como por ejemplo flavonoides y otras sustancias solubles en
agua como azucares, proteínas, ácidos y otros minerales. Para la presente
investigación, la separación se llevo a cabo utilizando como solventes de
desarrollo BAW (n-butanol - ácido acético - agua) y Forestal (ácido acético
– agua - HCl conc.) según la metodología experimental (3.7.4).
La elección de los solventes de desarrollo se llevo a cabo de acuerdo a la
eficiencia de los mismos en la separación de antocianinas, en el caso del
solvente BAW, el n-butanol es el resultado de la saturación del agua de un
disolvente orgánico; a menudo se usa muy poca cantidad de agua, pues así
los compuestos muy polares (aminoácidos, azucares o compuestos
fenolicos) se mueven mas lentamente. Para superar esto se adicionan a
menudo otros componentes a la muestra, estos pueden ser ácidos, bases o
agentes acomplejantes. Estos tienen dos funciones, permiten incorporar
más agua al disolvente, con lo que aumenta la solubilidad de algunas
58
sustancias, mientras disminuyen otras. (Abbot, 1970). El solvente Forestal
es específico para la separación de antocianinas.
El uso de un extracto de col morada tiene la finalidad de
proporcionar un punto de comparación. Smith (1979), menciona que en
algunos casos sólo se puede conseguir la suficiente separación dejando que
el disolvente llegue hasta el extremo del papel. En este caso no es posible
calcular el valor Rf, sin embargo, se puede utilizar una sustancia de
referencia con la cual puede compararse el movimiento de la sustancia en
el papel. En nuestro caso el solvente no llego al extremo del papel. Sin
embargo, se utilizó una muestra de extracto de col morada con la finalidad
de poder comparar.
Carreño et al. (1969), menciona que en una rutina cromatográfica
la relación entre los valores Rf y la estructura de la antocianina ha sido
estudiado por Bate Smith et al. (1950), Abe et al. (1956) y Harborne
(1958), ellos encontraron que: a) El mayor número de grupos hidroxilo
presentes en la molécula de la antocianina (se entiende por tal una
oxigenación adicional de la molécula que causa un aumento en la
absorbancia que se llama cambio batocrómico), inverso menor es su valor
Rf en solventes acuosos y alcohólicos; b) la metilación tiene un efecto
inverso a la hidroxilación, c) la glicosilación incrementa el valor Rf en
solventes acuosos pero disminuye en solventes alcohólicos, d) la acilación
causa un incremento en los valores Rf en solventes alcohólicos pero
menores Rf en solventes acuosos.
Observando los resultados del Cuadro 7 se puede apreciar que la
banda B de la oca morada y la banda C de la col morada tienen cierto
grado de acilación y glicosilación al observarse un menor valor Rf en el
solvente acuoso y mayor valor Rf en el solvente alcohólico para el caso de
la acilación y lo contrario para la glicosilación.
Los resultados están de acuerdo con lo obtenido por Tanchev et al.
(1969) citado por Sapers et al (1981), donde menciona que la antocianina
de la col morada consiste principalmente de cianidina 3-soforosido-5
59
glucósido y cianidina 3-soforósido- 5 glucósido acilada con ácidos
sináptico, ferulico, p-coumarico, y malónico; se puede apreciar su carácter
altamente acilado y glicosilado.
Sun et al. (1967), menciona que si los monoglucósidos están
presentes en el cromatograma estos se moverán más rápido que los
diglucósidos por consiguiente tendrán valores mas altos de Rf, esto se da
en solventes butanólicos, lo contrario sucede en solventes acuosos
(Sakellariades, 1974).
Este efecto se puede observar en los pigmentos separados de la
cáscara de oca específicamente con la banda A que tiene un valor Rf de 50
en comparación de la banda C de la col morada con un valor de Rf de 32,
este último de carácter diglucósido conocido. Con respecto a la banda B se
encontró cierta cercanía en el comportamiento con los valores Rf
obtenidos para la banda C de la col morada, lo que indica que la banda B
de la oca tiene relativo carácter diglucósido.
Los valores de mobilidad cromatográfica del pigmento de la
cáscara de oca y de la col son un medio que nos permite determinar
características importantes de los pigmentos que conforman la materia
colorante del mismo, ya mencionado anteriormente. Sin embargo, su valor
numérico como tal no son idénticos a otros estudios; esto se debe a las
condiciones generales del medio ambiente en donde se realiza la
cromatografía entere otros factores.
Al respecto Bate-Smith (1979), mencionó que las condiciones
necesarias para obtener valores Rf reproducibles, se deberían seguir las
siguientes condiciones: a) La temperatura debe ser controlada dentro 0.5
°C; b) en caso de usarse solventes de revelado la temperatura de revelado
debe ser constante; c) el papel debe equilibrarse con la atmósfera de la
cámara durante 24 horas que preceden a su irrigación con el disolvente; d)
debe utilizarse una misma partida de papel para todas las determinaciones;
e) en cada cromatograma debe revelarse una sustancia control. Factores
60
adicionales a estos están la dirección de las fibras en el papel, la
concentración de la sustancia y presencia de otras sustancias.
Las condiciones como temperaturas, tiempo, partida de papel son
mantenidas constantes tanto en las pruebas realizadas sobre el extracto de
oca morada y col morada. Cabe resaltar que el fin de esta etapa de la
investigación tienen como objetivo caracterizar las dos bandas obtenidas a
partir del extracto de cascara de oca morada las cuales han sido purificadas
y aisladas, mediante la cromatografía sobre papel que a parte de ser un
medio para separar componentes , se comporta también como una técnica
de purificación que elimina al componente de sustancias extrañas de
acuerdo al sistema de solventes utilizados para la técnica y mas no la
identificación de dichas bandas lo que implicaría el desarrollo de técnicas
como hidrólisis para aislar cada componente desdoblando la estructura
primaria de la misma usando componentes puros difíciles de encontrar en
el medio como sustancias control. Factores adicionales a estos están la
dirección de las fibras en el papel, la concentración de la sustancia y
presencia de otras sustancias.
Los valores obtenidos poseen fuerte evidencia que indican la
presencia de una antocianina específica, existe concordancia con el
desenvolvimiento obtenido y los reportados en la literatura sobre
antocianinas.
4.3.2 Resultados del Análisis espectrofotométrico
Las características espectrales obtenidas de las bandas A, B de la
cáscara de oca y la banda C de la col morada se presentan en la Figura 10.
Se puede observar que el espectro de absorción para las tres bandas son
características de una antocianina, puesto que muestran dos picos bien
definidos uno en la región ultravioleta (UV), y otro en el visible.
Las medidas espectrales en el intervalo 240 – 600 nm son usadas
para caracterizar antocianinas para indicar a) la naturaleza de la aglicona,
61
b) la posición de la glicosilación y, c) la posible acilación del pigmento por
un ácido hidroxi aromático ( Puech et al. , 1975).
Figura 10. Espectro de absorción de las bandas A, B, C
10 a. Banda A de la oca morada
10 b. Banda B de la cáscara de oca
62
63
10 c. banda C de la col morada
Las características espectrales de una antocianina en particular son
relativas a la antocianidina de la cual derivan, sin embargo, para generar
antocianidinas a partir las antocianinas se debe hidrolizar el extracto usando
solventes basados en ácido clorhídrico para proceder a una identificación,
comparándolas con antocianidinas estándar difíciles de conseguir en el
medio. A pesar de lo antes mencionado la antocianina como glicósido a
partir de sus análisis cromatográficos y espectroscópicos puede dar una idea
de su modelo de oxigenación, la acilación del pigmento; es por ello que
Lock (1992), menciona que el espectro de absorción se puede dividir en dos:
la banda I que va de 300 a 550 nm región donde se puede visualizar las
alteraciones de los anillos B y C de la estructura química de la antocianina y
la banda II que va de 240 a 285 nm que reflejan los cambios sufridos en el
anillo A de la estructura de la antocianina.
En el anillo A las posiciones 5,7 son hidroxilados, y en el anillo B
el patrón de hidroxilación 3’, 4’, 5’ es del ácido cinámico.
64
A continuación, se analizará el espectro de absorción de la banda A
obtenida a partir de cáscara de oca morada. Se puede observar en la Figura
10 a. la presencia de dos picos bien definidos a 280 nm y 538 nm. Rangana
(1979), menciona que las antocianinas se encuentran dentro de 2 clases
dependiendo de si tienen o no tienen un grupo hidroxilo libre. Las
antocianidinas las cuales el grupo 5-hidroxilo es sustituido con residuos de
azúcar o benzol muestran características diferentes de las que tienen el grupo
libre; el espectro del último grupo solo muestra un hombro distinto de
absorción importante en la región que va de los 410 a 450 nm. La banda A,
no muestra un hombro en la curva de absorción en el intervalo 410-450 lo
que nos indica que estamos frente a una antocianidina cuyo grupo 5-
hidroxilo es sustituido, ya sea por un residuo de azúcar o benzol.
Gross (1987), menciona que la naturaleza de la sustitución del
azúcar no tiene efecto en las características de la curva de absorción, pero la
posición en la cual el azúcar es sustituido produce algunas modificaciones.
La sustitución de un azúcar en C3 produce un hombro en la curva de
absorción en 440 nm además, Harborne (1958), reporto que un hombro en
440 nm en la curva de absorción es utilizada para distinguir antocianinas
sustituidas en la posición 3 y 3,5. La banda A de la cáscara de oca lleva a
inferir que no existiría sustitución en el C3 (posición de la sustitución en al
molécula del carbono).
Con respecto la banda B, en la Figura 10 b. se pueden apreciar tres
picos bien definidos a 280nm, 310nm y 538 nm, la presencia de un pico a
310 nm revelaría que la banda B muestra características de la presencia de
un pigmento acilado puesto que Sun et al. (1967), manifiesta que la
presencia de picos en el rango de 308 a 329 nm indica acilación del
pigmento, además Gross (1987), menciona que la acilación del azúcar de la
antocianina por ácidos del grupo cinámico produce un pico adicional en la
región UV en 310 – 335 nm y otro en 280 nm.
Las bandas A, B obtenidas de la cáscara de oca y la banda C
(Figura 10 c) de la col morada son características de una antocianina
65
presentando tres picos bien definidos, manifestando para el caso de la banda
C su naturaleza acilada y su carácter diglucósido.
4.3.3 Resultados de la reacción al Cloruro de Aluminio (AlCl3)
En la Figura 11 se puede observar los espectros de absorción
obtenidos al añadir Cloruro de aluminio (AlCl3). Se puede observar que
solo la banda B (Figura 11b) y la banda C (Figura 11 c) presentaron un
ligero desplazamiento y aumento de la absorción.
Carreño (1969), menciona que el reactivo AlCl3 distingue entre
antocianinas que tienen 2 grupos hidroxilo en la posición orto en el anillo
B como son la cianidina, petunidina y delfinidina las cuales dan una
reacción positiva al haber cambio de color y desplazamiento batocrómico
de la curva de absorción, lo contrario sucede con la pelargonidina,
peonidina y malvidina que dan una reacción negativa.
Figura 11. Espectro de absorción de las bandas B, C
11 b. Banda B de la cáscara de oca
66
11 c. Banda C de la col morada
La oxigenación adicional (hidroxilación) causa el cambio
batocrómico que se manifiesta en el desplazamiento de la curva de
67
máxima absorbancia. El mecanismo consiste en que el AlCl3 forma
complejos con grupos o-hidroxilo y con grupos hidroxilo cetona vecinos,
en el primer caso el complejo formado es lábil ante la presencia de ácidos
de tal que este desaparece con el agregado de HCl, no así en el segundo
caso en que el complejo formado es estable (Lock, 1992).
La banda A, a pesar de tener un grupo 5-hidroxilo sustituido de
acuerdo a las características obtenidas de su espectro de absorción, al no
reaccionar con el cloruro de aluminio indicaría que no tiene grupos
hidroxilo en la posición orto característico de una cianidina, petunidina o
delfinidina.
De acuerdo a los resultados se puedes decir que la banda A
proveniente de la cáscara de oca puede ser pelargonidina, malvidina o
peonidina, mientras que la banda B puede ser cianidina, petunidina o
delfinidina.
Giusti et al. (1998), menciona que la acilación con ácidos
aromáticos también causa cambio batocrómico a longitudes de máxima
absorbancia, el cual causa diferencias en la percepción del color. Esto se
puede demostrar para la banda C obtenida a partir del extracto de col
morada por su característica acilada ya estudiada y conocida. La banda B
tiene características de ser acilada que sustenta el resultado del análisis de
la curva de absorción al notarse un pico a 310 nm. Sin embargo, se
requiere hacer análisis profundo con la finalidad de identificar el
pigmento.
En el Cuadro 8 se pueden apreciar los resultados obtenidos en esta
etapa de la investigación.
Cuadro 8. Resultados de las características espectrofotométricas
MuestraLong. De max
abs.UV
Long. De max Abs.
visible
Reaccion
AlCl3
Banda A 280 538 negativo
68
Banda B
Banda C
280, 310
289
538
535
negativo
positivo
La distribución de las antocianinas en las partes comestibles de las
plantas se resume como sigue: Las antocianinas basadas en la cianidina
ocurren más frecuentemente. El porcentaje de ocurrencia de las
antocianinas es aproximadamente de 50% con la cianidina, de 12%, para
cada una, con pelargonidina, peonidina y delfinidina y de 7% cada una,
como la pelargonidina y malvidina. Como glucósidos, los 3-glicósidos
tienen una ocurrencia 2,5 veces mayor que los 3,5 diglucósidos, siendo el
más común el cianidin 3- glucósido (Lock,1992).
4.4 Enzimas en la cáscara de oca morada
4.4.1 Inactivación de enzimas polifenoloxidasa (PPO) en la cáscara
de oca morada
En la presente investigación, las cáscaras de oca presentaron
cambio en el color a través del tiempo cuando fueron licuadas con agua
como parte del acondicionamiento a pH alrededor de 4.9 lo cual es primer
indicio de la presencia de un tipo de oxidación.
Se sabe que el daño mecánico o fisiológico de diversas frutas,
verduras y tubérculos ocasiona durante la recolección y almacenamiento
un color pardo, producido por la polifenoloxidasa, que actúa sobre los
compuestos fenólicos presentes en los tejidos vegetales como; el ácido
clorogénico, catecol, antocianos, flavonoides y otros.
Rodríguez-Saona et al. (1998), observaron la formación de
pigmentos marrones durante la preparación y almacenamiento a 1º C de
69
algunos extractos de papa morada. Para prevenir la degradación del
pigmento sometió rodajas del tubérculo a un escaldado con vapor a 100 ºC
por 10 minutos para su almacenamiento
Por todo lo antes mencionado se procedió a estudiar la inactivación
de las enzimas polifenoloxidasa con el fin de encontrar el tiempo óptimo
de escaldado para la inactivación enzimática y asegurar la estabilidad de
las antocianinas de cáscara de oca morada durante el almacenamiento para
las pruebas posteriores.
En el apéndice 4 se reportan los resultados obtenidos con respecto
a la actividad de la enzima PPO y gráficamente en la Figura 12.
Figura 12. Inactivación de la polifenoloxidasa (PPO) en la cáscara de
oca morada
Una mayor pendiente en la curva corresponde una mayor actividad
enzimática, en este caso la mayor actividad corresponde a la muestra que
no ha sido inactivada al vapor húmedo (0.062 min-1), seguido de la que
70
Acitividad de la Enzima Polifenoloxidasa
0,000
0,200
0,400
0,600
0,800
1,000
0,25 0,5 0,75 1 1,25 1,5 2 2,5 3 3,5
Tiempo de actividad min.
D.O
. a 3
90 n
m Cero Minutos
1 minuto
2 minutos
3 minutos
fue expuesta a sólo 1 min (0.027 min-1), a 2 min y 3 min con (0.016 min-1)
y (0.002 min-1) respectivamente. Cereda et al. (1984) citado por Ojeda
(2003) analizaron la actividad de la polifenoloxidasa de 26 cultivares de
camote tanto en pulpa y cáscara de diferente coloración encontrando una
gran diferencia en los valores de actividad de PPO la cual no tuvo relación
con la coloración de la pulpa ni de la cáscara.
Wesche, et al. (2002), menciona, que las antocianinas están
presentes en forma de glicósidos (acilados o no), y en los tejidos que la
contienen pueden ser alteradas, pues estas son altamente susceptibles a la
degradación por efecto de la luz, pH, sulfito, ácido ascórbico, enzimas
como las glicosidasas y polifenoloxidasas; así como por el pardeamiento
no enzimático. Durante el pardeamiento enzimático, las polifenoloxidasas
causan la oxidación de los compuestos o-fenólicos a o-quinonas. Estas
reaccionan rápidamente con otros fenólicos y proteínas en una serie de
reacciones de polimerización conduciendo a la formación de pigmentos
marrones solubles o insolubles llamados melanoidinos o taninos.
Walter y Purcell (1980), citado por Woolfe (1992) indican que un
pardeamiento mínimo esta relacionado con un bajo contenido de sustratos
fenólicos y no con una baja actividad polifenoloxidasa, ya que el
pardeamiento está significativamente relacionado con el contenido de
fenólicos; la PPO se presenta en altas concentraciones con relación al
sustrato. Jankov (1962) citado por Reed (1975) indica que el tiempo
requerido para una completa inactivación de la enzima depende de la
cantidad de ésta encontrada en el fruto.
La prueba demostró que la enzima presente en la cáscara de la oca
morada es altamente termolábil, al observarse inactivación total al primer
minuto lo que demuestra que la PPO no tendría una gran actividad y
estabilidad con una actividad residual de 2.62 %.
4.4.2.Inactivación de la enzima peroxidasa (PRO)
71
Kader et al (2002), menciona que el mecanismo de degradación de
antocianinas por peroxidasas no es aún conocido, varios estudios han sido
dirigidos en que la actividad no contribuye significativamente a la
degradación de antocianinas. Sin embargo, Reed (1975) menciona que la
peroxidasa es ampliamente usada como un índice de blanqueado y de otros
tratamientos térmicos porque es muy resiste a la temperatura. Esto ha sido
aceptado generalmente ya que si la peroxidasa es destruida entonces es
improbable que otros sistemas enzimáticos se mantengan activos.
En la Figura 13 se puede observar la actividad de la peroxidasa en
extractos a partir de cascara sin inactivar e inactivada.
Figura 13. Actividad de la peroxidasa en la cáscara de oca morada
Al igual que en la PPO la PRO es una enzima termolábil, a partir
del primer minuto se inactivó, disminuyendo su pendiente a medida que la
cáscara es expuesta al calor por más tiempo, observando que a los dos
minutos tiene una actividad de 0.003 min-1. Los resultados obtenidos en
las pruebas se pueden observar en el Apéndice 5.
72
Los resultados de la inactivación de la enzima PPO y PRO
expresados en actividad residual se pueden observar en el apéndice 4 y 5,
gráficamente en la Figura 14.
Así tambien, se puede apreciar en el Apéndice 16 la medición del
coeficiente de variabilidad relativa de la PRO, la misma que no posee
unidades de medida y cuantifica porcentualmente la variabilidad de la
densidad óptica observada a los diferentes tiempos para cada tratamiento
efectuado sobre la muestra.
De este modo se selecciono el tiempo de inactivación en 2
minutos, debido a que las actividades residuales experimentan una mayor
disminución entre el primer minuto y segundo minuto, y una menor
disminución entre el minuto 2 y el 3.
Figura 14. Actividad residual en la cáscara de oca para la
polifenoloxidasa y peroxidasa
Sin embargo, se observó que el tratamiento con vapor ocasionaba
alteración en la estructura de la cáscara al producirse una aparente
gelatinización del almidón, obteniendo un producto cocido al ser expuesto
73
mucho tiempo, el cual dificultó la extracción y disminución en la
cuantificación de antocianinas.
Siddiq (1992), menciona que el uso de elevadas es una técnica a
menudo inaceptable para el contenido de antocianinas en jugos de uva,
duraznos y otros porque la elevada temperatura necesaria para la
inactivación de la PPO también causa degradación de antocianinas,
además, la actividad de la PPO en un intervalo de pH (2,8 a 10), pH 6,0 es
donde tiene máxima actividad y a pH 4,5 es inactiva. Con respecto a la
peroxidasa Nicolas et al. Citado por Kader (2002), menciona que la baja
concentración celular de H2O2 es un factor que limita la actividad de la
PRO, además, el principal problema con los estudios de la PRO, es
detectar la fuente de H2O2 requerida para la reacción enzimática.
Es por ello que se expusieron las cascaras solo a 1 minuto puesto que
las pruebas posteriores tanto para la cuantificación y evaluación de la
estabilidad involucraron la exposición de las cascaras en medios ácidos,
creando condiciones poco favorables (pH debajo de 3,5) para la actividad
enzimática por la aparente perdida de la estructura de los sitios activos
como resultado de la desnaturalización de la enzima. (Braverman, 1980).
4.5 Extracción de Antocianinas
Una vez conseguido el tiempo optimo de inactivación se procedió
a extraer y cuantificar las antocianinas de la cascara de oca provenientes de
los extractos obtenidos usando por un lado un medio acuoso (agua
acidulada) y por otro un medio alcohólico (Etanol – HCl (85:15)) de
acuerdo a los parámetros especificados en el ítem 3.7.5
Los resultados obtenidos se observan en el apéndice y
gráficamente en la Figura 15.
Figura 15. Extracción alcohólica y acuosa de antocianinas de la
cáscara de oca morada
74
Se puede observar mayor eficiencia del alcohol como solvente de
extracción obteniendo 1.5916 mg Eq. Cy 3-glu/gr lo cual representa un 45
% mas de lo obtenido usando como solvente agua acidulada que extrajo
0.7192 mg Eq. Cy 3-glu/gr.
El contenido de antocianina fue medido a través del método del pH
diferencial (ítem 3.6). El alto contenido de antocianina a pH1 se debe a la
presencia del catión flavilio altamente coloreado, comparado con la
pseudobase quinoidal y chalconas, las cuales son pálidas e incoloras.
Hrazdina (1981), menciona que las antocianinas exhiben una intensa
coloración rojo solo en un limitado rango de pH, frecuentemente ácido
entre 1 y 3, y fácilmente sufre transformaciones estructurales reversibles
con perdidas de color rojo y la formación de características indeseables de
color,
Cascon et al. (1984), mencionado por Ojeda (2003), observaron
una gran diferencia en la difusión de los pigmentos entre una extracción
alcohólica y acuosa de las antocianinas en camote de pulpa morada,
indicando que en las extracciones acuosas ocurría una difusión
extremadamente lenta debido a la absorción del solvente por el almidón
del camote que fue previamente escaldado y consecuentemente
gelatinizado. La extracción alcohólica la realizaron en el camote fresco
75
(los autores indicaron que no fue necesario un blanqueado ya que por el
efecto del alcohol y el pH ocurre una inactivación enzimática.
Con referencia a lo mencionado, en esta investigación se observó
precipitación de partículas que fue eliminada por centrifugación,
posiblemente esta turbidez se debió la presencia de hidrocoloides como
almidón, pectinas y otros polisacáridos que son más solubles en agua que
en alcohol, por ello este último solvente, la precipitación observada fue
menor. Cabe mencionar que el escaldado previo sobre las cáscaras, el
almidón, pudo ser ligeramente gelatinizado y al solubilizarse se convierte
en un factor de enturbiamiento. Rhom (1978), menciona que al calentar
(por ejemplo en la recuperación de aromas, calentamiento breves,
desaparece la estructura del grano, el almidón queda en solución coloidal y
precipita en el clarificado o zumo, en forma de fina turbidez. En manzanas
inmaduras las cuales contienen almidón, durante la fijación de aromas, los
gránulos de almidón quizá gelatinizan y se disuelven en el jugo. Una vez
que el almidón enturbiante se ha desarrollado en el concentrado, es muy
difícil removerlo o degradarlo. (Kilara, 1982).
Giusti et al. (2000), indica que una extracción en medio acuoso es
muy ineficiente porque el agua o medios mecánicos en general no son tan
eficientes en penetrar en los compartimientos donde el pigmento se
encuentra depositado dentro del tejido, además favorece o permite la
acción de enzimas degradativas que puedan estar presentes. La extracción
con alcohol acidificado es mucho más eficiente en remover todo el
pigmento de los tejidos, el alcohol puede disolver muchos lípidos de las
membranas celulares y permitir la salida del pigmento, además inhibe la
acción de muchas enzimas degradativas.
Deibner et al. (1965) citado por Fuleki y Francis (1968), indican
que el etanol es un solvente no tóxico, más económico y su poder de
extracción es casi tan bueno como el metanol. El agua ayuda a la
recuperación de las antocianinas más hidrofilicas.
76
El contenido de antocianinas expresados en base húmeda por cada
100 gramos de cascara de oca tiene un valor de 159,16 mg ACNs para
este estudio, Arbizu (s.a.) reportó que el contenido de antocianinas en un
estudio hecho en oca estaba comprendido entre 14 a 130 mg/100 gramos.
Ojeda (2003) reportó que el contenido de antocianinas en cáscara de
camote morado era de 137 mg de ACNs /100 gramos de cáscara; en
rábanos de cáscara roja y pulpa blanca se encontraron valores de 12,2 a 52
mg de ACNs/100gramos de raíz (Giusti et al. 1998); en papas de pulpa
roja concentraciones de 28,4 mg de ACNs / 100 gramos pulpa y 21,7 mg /
100 gramos de cáscara. (Rodríguez-Saona et al, 1998).
Sabemos que el contenido de antocianinas varia de acuerdo al tipo
de cultivar, variedad, suelo, factores ambientales entre otros, es por ello la
diferencia obtenida en la cantidad de antocianina en relación a lo obtenido
por Arbizu (s.a.), e incluso es mayor al contenido de otros productos, por
todo lo mencionado la cáscara de oca se perfila como una fuente rica en
antocianinas. Cevallos et al. (2003), menciona que sistemas colorantes
pueden estar presentes en la naturaleza sin embargo, estos necesitan ser
identificados y caracterizados por su composición fitoquímica y atributos
de estabilidad. La región andina ofrece una gran diversidad de raíces con
un elevado potencial como fuente de colorantes incluyendo el camote
morado, el maíz morado entre otros cultivos nativos los cuales tienen una
amplia historia y valor folklórico.
4.6 Cuantificación de Compuestos Fenólicos y actividad
antioxidante
4.6.1 Contenido de compuestos fenólicos
Los resultados se pueden apreciar en el apéndice. El valor en base
seca es 2553.07 mg. Eq. Ácido clorogénico/100 g de muestra mientras que
en base húmeda es 378,62 mg Eq. Acido clorogénico/100 g de muestra.
77
En el Cuadro 9, se puede apreciar el contenido de compuestos fenólicos
totales de varios productos vegetales.
78
Cuadro 9. Contenido de compuestos fenólicos en productos vegetales
expresados en (mg Ac. Clor. /100 g). Base húmeda
Vegetal
F. totales
(mg Ac.
Clor. /100 g)
Vegetal
F. totales
(mg Ac. Clor.
/100 g)
Camote ITA1 1237 Kumara gold 154.4
Camote PCH1 1084 Papa 38.3
Camote PDV1 1215 Papa - cascara roja 41.8
Brocoli2 83.1 Cebolla 66.8
Zanahoria 40.2Lechuga - hoja
roja182.0
Coliflor 35.0 Lechuga corazón 24.4
Kumara cascara 78.5 Tomate 28.8
Lister y Podivinsky (1998)1 Ojeda. (2003)
Por lo observado el contenido de compuestos fenólicos en la
cáscara de oca se encuentra dentro del promedio superior de las diferentes
variedades vegetales reportadas. Rodríguez Saona et al. (1998) evaluaron
el contenido de ácidos fenólicos en la cáscara y pulpa de papa morada. Las
cáscara de los tubérculos mostraron una alta proporción de ácidos
fenólicos libres, especialmente el ácido clorogénico y p-coumarico. Estos
compuestos son usualmente acumulados en las pieles y son de importancia
en los mecanismos de defensa para la infección de lagunas plantas (Frind
79
et al., 1985; Ramamurthy et al. 1992 citados por Rodríguez - Saona et al.
1998).
4.6.2 Actividad Antioxidante
Los resultados de la actividad antioxidante determinado en la cáscara de
oca morada se reportan el apéndice y gráficamente en la Figura 16. La
AOA obtenida fue de 3211.90 ug Eq. Trolox /g bh. Con fines
comparativos se determino AOA en el tubérculo completo y la fresa, que
según los autores (Wang et., 1996; Vinson et al.2001) posee una alta
actividad antioxidante. Se puede observar que la cáscara de oca tiene una
actividad cercana a la fresa.
Figura 16. Capacidad Antioxidante
La fresa tiene una actividad antioxidante (3312.10 ug Eq Trolox / g
bh) mayor respecto al valor obtenido en la cáscara y en el tubérculo entero
de la oca morada con 3211.90 y 2120.23 ug Eq Trolox / g bh
respectivamente.
80
En el Cuadro 10. se compara valores de AOA de algunos productos
de elevada actividad antioxidante y los obtenidos en este trabajo. En el
Cuadro 11 se muestra datos obtenidos por Cisneros ( 2001) de algunos
productos y se puede observar que las cascaras de oca tienen un valor
promedio.
Cuadro 10: Comparación de la Actividad Antioxidante (AOA) en la
oca morada
ProductoAOA
(ug Equiv. Trolox / g bh)
Oca (completa) 2120.23
Oca (cascara) 3211.90
Blueberry 1784
Plum 3244
Camote morado 3167
Maíz morado 4770
Fuente: Elaboración Propia.
Cuadro 11: Actividad Antioxidante (AOA) de los principales productos
con alta capacidad antioxidante
ProductoAOA
(ug Equiv. Trolox / g bh)
Blueberry 1784
Plum 3244
Camote morado 3167
Maíz morado 4770
Fuente: Cisneros (2001).
81
Wang et al. (1996), indican que 1 Lb. de fresas frescas (454g) tiene
una actividad ORAC (6973 umol de equivalente Trolox) alrededor de 1,7 g
de trolox, 3.0 g de -tocoferol (la actividad ORAC de 1 umol de vitamina
C = 0.52 umol de equivalente Trolox (Cao et al. , 1993 citado por Wang et
al., 1996))
La suplementación de antioxidantes naturales a través de una dieta
balanceada que contengan solo frutas seria mucha mas efectiva y también
económica que la suplementación de antioxidantes individuales como la
vitamina C o la vitamina E, en la protección del cuerpo del daño oxidativo
bajo diferentes condiciones (Wang et al., 1996). Por todo ello, las cáscaras
de oca tienen un gran potencial en beneficio de la salud.
4.7 Evaluación de la estabilidad de los extractos colorantes
Para esta etapa de la investigación se utilizo un extracto de maíz
morado con la finalidad de poder tener un punto de comparación. Se sabe
que la composición del pigmento del maíz morado es cianidin 3-glucósido,
no acilada (Pascual-Teresa et al., 1996 citado por Cevallos et al. 2004).
Para la obtención de ambos extractos colorantes se utilizó una
extracción alcohólica por la eficiencia del mismo en extraer la mayor
cantidad de pigmento. Las cáscaras de oca fueron blanqueadas para
eliminar la degradación enzimático de las antocianinas de acuerdo a los
parámetros obtenidos en etapas anteriores de la presente investigación así
también el maíz morado, el cual se expuso al agua caliente por 10 minutos
(Cevallos-Casals et al., 2004).
Para determinar la estabilidad a diferentes pHs los colorantes
fueron preparados a una misma concentración a pH 0.9 (xx mg ACN-
3glucósido) y de ahí fueron ajustados a otros pH.
4.7.1 Estabilidad frente al pH y a la temperatura
82
El efecto combinado del pH y la temperatura en el contenido de
antocianinas de extractos a partir de la cáscara de oca morada y del maíz
morado se presentan en el Apéndice y efecto de los mismos con respecto a
la oca morada se grafican en la Figura 17.
Figura 17. Efecto de la temperatura sobre distintos pHs 2.5, 3, 3.5
17 a. Efecto de la temperatura sobre el pH 2.5
17b. Efecto de la temperatura sobre el pH 3.0
83
17c. Efecto de la temperatura sobre el pH 3.5
Se puede apreciar que para el pH 2.5 (Fig. 17 a), pH 3.0 (Fig. 17 b)
y pH 3.5 (Fig. 17 c), la concentración de antocianinas disminuye a medida
que se da un aumento en la temperatura y pH, observándose también que
en los primeros treinta minutos la disminución es más rápida perdiéndose
aproximadamente 4.37 % de la concentración inicial, pasado este tiempo
la disminución es mucho más lenta notándose un constante orden de
84
estabilidad por el espacio de hora y media restante perdiendo un total de
15.72 % para el pH 2.5 a una temperatura de 40°C. A tiempo de
exposición mayores en este caso 2 horas a 80°C la pérdida es de 57% de la
concentración inicial de antocianinas a pH 2.5 para el caso del extracto a
partir de cáscara de oca morada; en el caso del maíz morado la
disminución de la concentración de antocianinas es mayor alcanzando una
pérdida de más del 70% a ese mismo pH, 2 horas y a 80°C.
Este efecto se puede explicar a través de las transformaciones de
las moléculas de antocianina que ocurre a medida que el pH aumenta.
Heredia et al. (1990) menciona que a pHs cercanos a 2 las antocianinas
existen en su forma catiónica a medida que el pH aumenta, una rápida
desprotonación ocurre proporcionando formas quinoidales que son
incoloras. La hidratación del catión flavilio de la forma hemicetal en
equilibrio con una chalcona (incoloras o amarillas) y el incremento de la
temperatura desplaza el equilibrio a la forma chalcona (incolora).
El color producido por las antocianinas es dependiente de muchos
factores que incluyen estructura, concentración, pH, temperatura, luz
copigmentación, iones metálicos, enzimas, oxigeno, ácido ascórbico,
azúcar y productos de degradación (Francis 1989; Mazza et al., 1993;
Henry, 1996, citados por Rodríguez-Saona (1999). Es conocido el efecto
perjudicial de las altas temperaturas sobre las antocianinas; sin embargo
por lo observado en este trabajo los extractos de cáscara de oca
presentaron una mayor retensión en el contenido de antocianinas en
comparación al extracto a partir de maíz morado. Uno de los factores que
explicaría dicha estabilidad se debería primeramente a la acilación o
copigmentación intramolecular de las antocianinas incluso Jackman y
Smith (1992) menciona que la metoxilación, glicosilación y acilación
confiere un efecto protector frente al deterioro térmico.
Por ejemplo, Rodriguez-Saona et al. (1999), menciona que la
acilación incrementa la estabilidad inclusive la diacilación incrementa aun
más la estabilidad del pigmento respecto a la monoacilación. En etapas
85
anteriores de la presente investigación se determino cierto carácter acilado
de la antocianina de la cáscara de oca morada a través de la caracterización
cromatográfica y espectrofotométrica, los resultados de la estabilidad
obtenida complementan dicha apreciación. Las antocianinas aciladas se
estabilizan por un mecanismo de apilamiento tipo sándwich causado por
las interacciones hidrofóbicas entre el residuo planar del grupo acilo y el
núcleo pirilio cargado positivamente (Goto, 1987 citado por Rodriguez-
Saona et al., 1999). esto previene la adición de nucleófilos, especialmente
el agua, a las posiciones C-2 y C-4 del carbono de la antocianina,
disminuyendo la formación de pseudobase incolora (Brouillard, 1981;
Goto y Koto, 1991 citado por Rodriguez-Saona et al. 1999).
Adicionalmente, Bridle et al. (1999) menciona que con el
incremento del pH el color de las antocianinas palidecen, sin embargo, si
el producto contiene componentes capaces de actuar como copigmentos, el
color puede ser retenido y manteniéndose estable frente a luz.
Con relación a los colores observados, la oca morada exhibe un
color rojo cereza brillante a pH 2,5 disminuyendo a medida que se
incrementa el pH tornándose ligeramente rosa sin llegar a ser incolora. Se
notó adicionalmente, que las lecturas de absorbancia disminuían a medida
que aumenta el pH, esta disminución en absorbancia fue más marcada en
el maíz morado, rico en antocianinas no aciladas, las cuales muestran
estructuras incoloras a pH 3.5. Bolivar et al. (2004), menciona que la
antocianina del maíz morado muestra estructuras incoloras a pH de 4 a 6,
además, Mazza et al., 1993, menciona que a dicho pH, el catión rojo
flavilio se hidrata para producir la base carbinol que es incolora.
Se puede apreciar además que a pH 3.0 hay un ligero incremento
en la retensión del color a temperaturas mayores de 60°C, este aparente
incremento se puede deber al fenómeno de copigmentación intermolecular
entre los compuestos fenólicos presentes y las antocianinas. La
copigmentación intermolecular entre las antocianinas y otros compuestos
flavonoides (p.e rutina, catequiza, ácidos fenólicos) que imparten
86
estabilidad a las antocianinas por la reducción de la producción de la base
carbinol y estabilizando la base quinoidal (Asen et al., 1977; Williams y
Hrazdina, 1979; Brouillard, 1982; Maza y Brouillard, 1982; Mazza y
Brouillard, 1990 citados por Rodriguez-Saona et al., 1999), además de
producir un cambio batocrómico. En e transcurso de este trabajo de
investigación cuando se aisló el pigmento se notó un cambio batocrómico
a la reacción con el reactivo AlCl3 indicando a su vez cierto carácter
acilado del pigmento de la cáscar de oca así como un alto contenido de
ácidos fenólicos que llevarían a confirmar la apreciación con respecto a un
aparente fenómeno de copigmentación en los extracto de oca morada.
Una forma de entender la degradación de los colorantes a diferentes
pHs a través del tiempo es a partir de los valores de retención de color a
longitud de máxima absorbancia; el color polimérico y el índice de
degradación (ID) el cual incluye los tres componentes de la degradación:
un incremento en absorbancia debido al pardeamiento; una disminución en
absorbancia debido a la formación de la base carbinol incolora y el efecto
del cambio batocrómico debido del cambio de la estructura al desarrollo
de una forma menos estable.
El ID es útil para entender el desarrollo de la degradación de la
antocianina en un sistema. Sin embargo, ello no puede ser usado para
comparar sistemas con diferente composición de pigmentos (Francis et al.
1982)
Los resultados de la retención de color, color polimérico e índice de
degradación (ID) se pueden apreciar en el Apéndice y gráficamente en la
Figura 18.
Figura 18. Porcentaje de retensión del pigmento a partir de cáscara de
oca.
Figura 18a. Porcentaje de retensión a pH 2.5
87
Figura 18 b. Porcentaje de retensión a pH 3.0
Figura 18 c. Porcentaje de retensión a pH 3.5
88
Se puede observar que el índice de retención es mayor a pH 2.5
conservándose un 95,63% en comparación al pH 3,5 que retiene 94.48%
de pigmento a 40°C, a la temperatura de 80°C a pH 3.5 retiene el 52.83%
mientras que a pH 2.5 es 51.39 %, esto se puede explicar en que el índice
de degradación es menor a medida que el pH es más ácido lo contrario
sucede con el pH 3.5 donde hay un bajo contenido de catión flavilio que
es de color rojo. Cuando son expuestos a la temperatura la degradación es
mayor.
En el Cuadro 12 se puede apreciar los valores de densidad de color
y porcentaje de color polimérico luego de las dos horas de tratamiento a
diferentes temperaturas para los extractos de oca morada.
Cuadro 12. Densidad de color y Porcentaje de Color Polimérico después
de dos horas.
T °C
pH 2.5 pH 3.0 pH 3.5
Densidadde color
% ColorPolimérico
Densidadde color
% ColorPolimérico
Densidadde color
% ColorPolimérico
40 4,85 44,12 13,83 36,16 13,66 39,70
89
50 5,17 44,29 13,17 40,79 12,44 45,54
60 5,57 46,60 12,81 46,93 11,26 54,32
70 6,35 62,39 12,69 53,47 10,79 63,65
80 9,89 101,37 12,35 84,77 8,42 90,19
Se puede observar el alto grado de color polimerizado a medida
que la temperatura aumenta siendo mayor a pH 2.5 y 3.5 que a pH 3 estas
diferencias pueden estar dadas en los diferentes caminos en la degradación
cinética del pigmento asi como a las condiciones de procesamiento y ala
exposición al calor y tiempo. La estabilidad térmica de las antocinaninas
varía con su estructura, pH, presencia de oxígeno e interacciones con otros
componentes del sistema. Por ejemplo la metoxilación, glicosilación y
acilación confiere un efecto protector frente al deterioro térmico (Jackman
y Smith 1992).
El extracto de oca pH 2.5 a una temperatura de 40°C tiene un bajo
contenido de color polimérico esto se debe a que primero esa temperatura
no afecta agresivamente a la antocianina como sería 80°C luego a que la
mayoría de vegetales o frutas que poseen antocianinas en su constitución,
la mayoría de ellas se encuentran en su estado monomérico, luego de que
comienza el manejo o la transformación del producto empieza la
polimerización que puede ser mayor o menor de acuerdo a las condiciones
de procesamiento. El contenido de color polimérico es mayor para el
extracto de maíz morado apH 2.5 que empieza en 37% y termina en 97.81
(los valores obtenidos se pueden apreciar en el apéndice .
90
Además se puede apreciar que la densidad de color disminuye a
medida que aumenta el Ph y temperatura siendo mayor para el extracto a
pH 3.0.
91
V. CONCLUSIONES
- La cáscara de oca morada esta compuesta de una mezcla de pigmentos, tales
como taninos, presentando características propias de una antocianina.
- El espectro de absorción y la reacción positiva al cloruro de aluminio
indicarían que la antocianina de la cáscara de oca morada tiene características
de ser un pigmento acilado.
- El tiempo óptimo de escaldado a 100 ºC necesario para inactivar más del 95%
de las enzimas degradativas de la cáscara de oca morada fue de 1 minuto. La
PPO y PRO son altamente sensibles al calor inactivándose totalmente al
primer minuto del tratamiento térmico.
- La extracción alcohólica de pigmentos fue mas efectiva en la extracción de
antocianinas seguido de la extracción acuosa.
- La mayor concentración de antocianinas se encontró a partir del extracto
alcohólico con 1.59 mg Eq Cy-3 glu / m bh seguida del extracto acuoso con
0.72 mg Eq Cy-3 glu / m bh.
- La concentración de fenólicos totales resulto ser de 12.62 mg Eq. Ac.
Clorog. / g m bh.
- La actividad antioxidante de la cáscara de oca morada fue de 3211.90 μ Eq-
Trolox / g m bh para el tubérculo entero y 2120.23 Eq-Trolox / g m bh la
cáscara. Comparados con la fresa (3312.10 μ Eq-Trolox / g m bh), los valores
obtenidos por la cáscara son cercanos.
92
- La concentración de antocianinas disminuye a medida que se incrementa el
pH. A pH de 2,5 la concentración fue de 60.53 mg de antocianina monomérica
Cy 3-glucósido; a pH 3.0 de 59.17 mg de antocianina monomérica Cy 3-
glucósido y a pH 3.5 de 53.20 mg de antocianina monomérica Cy 3-glucósido.
- Con respecto al tratamiento térmico el porcentaje de retensión de antocianinas
es menor a medida que se incrementa la temperatura, siendo menor a 80ºC que
a 40 ºC donde se retiene la mayor concentración.
93
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