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¿Qué es la Cromatografía?La cromatografía agrupa un conjunto importante y diverso de métodos que facilitan la separación, identificación y determinación de componentes estrechamente relacionados en mezclas complejas; muchas de dichas separaciones son imposibles por otros medios.1 En todas las separaciones cromatograficas la muestra se disuelve con una fase móvil—que puede ser un gas, un líquido o un fluido supercrítico— la cual se hace pasar a través de una fase estacionaria inmiscible fija en una columna o en una superficie sólida. Las dos fases se eligen de tal forma que los componentes de la muestra se distribuyen en grados distintos entre la fase móvil y la fase estacionaria. Aquellos componentes que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria se mueven con mucha lentitud con el flujo de la fase móvil. En cambio, los componentes unidos débilmente a la fase estacionaria se mueven con rapidez. Como consecuencia de las distintas velocidades de migración, los componentes de la muestra se separan en bandas o zonas distintas que se pueden analizar en forma cualitativa y cuantitativa.

Clasificación de la cromatografía

Una clasificación más fundamental de los métodos cromatograficos se basa en los tipos de fases móviles y estacionarias, y en la clase de equilibrios involucrados en la transferencia de los solutos entre las fases.

Tabla 1: Clasificación de los métodos cromatógrafos en columna.

Cromatografía HPLC (Cromatografía liquida de alta resolución)

La cromatografía de líquidos es la técnica analítica de separación más ampliamente utilizada. Las razones de su popularidad son su sensibilidad, su fácil adaptación a las determinaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para automatizarla, su capacidad para separar especies no volátiles o termolábiles, pero sobre todo, su amplia aplicabilidad a sustancias que son importantes en la industria, muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general. Algunos ejemplos de estos materiales son aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, hidrocarburos, carbohidratos, fármacos, terpenoides, plaguicidas, antibióticos, esteroides, especies organometalicas y una variedad de sustancias inorgánicas.

Figura 1: Selección del sistema comatografico en función del tipo de muestra

Clasificación de la cromatografía liquida

Los diferentes tipos de cromatografía liquida se pueden clasificar de diferentes maneras, pero la forma más habitual de clasificación es la realizada en base a la naturaleza de la fase estacionaria, ya que es esta la que impone fundamentalmente el mecanismo de separación; de este modo, se pueden enumerar cuatro tipos de técnicas.

Cromatografía de adsorción (liquido-solido)

La fase estacionaria es un adsorbente y la separación se basa en repetidas etapas de adsorción-desorción

Cromatografía de reparto/adsorción (fases ligadas químicamente)

La separación en este caso, se basa en un reparto del soluto entre la fase móvil y la fase estacionaria.

Cromatografía de intercambio iónico.

Este tipo de cromatografía se da cuando la fase estacionaria presenta en su superficie grupos ionizados capaces de retener selectivamente a iones de signo contrario que circulan en la fase móvil.

Cromatografía de exclusión molecular.

La fase estacionaria, en este caso, es un material poroso de tamaño de poro controlado, que permite la entrada de ciertas moléculas de manera selectiva, dejando fuera otras de mayor tamaño.

El mecanismo de retención en los dos primeros casos es similar, variando únicamente el tipo de interacciones que se producen y cuál de ellas es la predominante; por esta razón, en la práctica se realiza otra división de los dos primeros tipos de cromatografía atendiendo a la polaridad de la fase estacionaria:

Cromatografía de fase normal:

La fase estacionaria presenta puntos activos de alta polaridad y las interacciones que se producen con el soluto son específicas del grupo activo. La fase estacionaria puede ser un sólido adsorbente (sílice o alúmina), o bien, un soporte al que se unen químicamente moléculas orgánicas que presentan grupos funcionales de alta polaridad (ciano, amino, etc.)

Cromatografía de fase reversa (inversa):

La fase estacionaria tiene una naturaleza apolar (cadenas hidrocarbonadas, grupos fenilo) y las interacciones que se producen son inespecíficas (efecto solvofobo)

Instrumentación de la cromatografía liquida.

Para realizar una cromatografía liquida tan solo es necesario disponer de las dos fases implicadas en el proceso y de la columna, la moderna cromatografía de líquidos de alta eficacia , debido al pequeño diámetro de las partículas de fase estacionaria que se utilizan, requiere de la utilización de unos dispositivos que contribuyen el cromatógrafo.

Los componentes básicos de un cromatógrafo de líquidos son:

Dispositivo de suministro de eluyentes (bomba y dispositivo de mezclado de eluyentes) Dispositivos de inyección Conducciones y conexiones. Detector y registrador. Columna.

Figura 2: Esquema básico de un cromatógrafo de líquidos

Instrumentos para HPLC (cromatografía e líquidos de alta eficiencia)

Recipientes para la fase móvil y sistemas para el tratamiento del solvente:Un aparato moderno para cromatografía de líquidos está equipado con uno o más recipientes de vidrio, cada uno de los cuales contiene 500 mL o más de un solvente. A menudo están equipados con un sistema para eliminar los gases disueltos y el polvo de los líquidos Los gases disueltos ocasionan flujos inestables y ensanchamiento de bandas; además, las burbujas y el polvo interfieren con el funcionamiento de la mayoría de los detectores. Con frecuencia, los sistemas también contienen un dispositivo para filtrar los solventes y eliminar el polvo y las partículas sólidas que estén en suspensión para evitar que dañen la bomba o los sistemas de inyección u obturen la columna.Una elución que utiliza un solo solvente o una mezcla de solventes de composición constante se denomina elución isocratica. En la elución con gradiente se usan dos sistemas de solventes y algunas veces más, que difieren de manera notable en cuanto a polaridad y varían en composición durante la separación.

Figura 3: Diagrama que muestra una separación de mezclas y el ensanchamiento de las bandas

Sistemas de bombeo

La misión de la bomba es la de suministrar un caudal constante y libre de pulsos de la fase móvil a través de la columna, sin que el flujo sea influido por la presión en cabeza de columna. Entre los requisitos para las bombas en cromatografía de líquidos esta 1) la generación de presiones de

hasta 6000 psi (lb/in.2) o 414 bares, 2) salida libre de pulsos, ya que las pulsaciones pueden contribuir al ruido de fondo del detector y por lo tanto disminuir la sensibilidad 3) tasas de flujo de 0.1 a 10mL/min, 4) reproducibilidad del flujo de caudal debe ser constante , ya que de él depende la reproductibilidad del tiempo de retención (0.5% relativo o mejor) y 5) componentes resistentes a la corrosión a causa de la diversidad de solventes.

Sistemas de inyección de muestras:

Es de importancia capital, pues un mal sistema de inyección puede dar lugar a ensanchamientos de la banda cromatografía que deterioren la eficacia del sistema cromatógrafo.

Un inyector ideal debe tener las siguientes características: Introducir la muestra en la columna como una banda lo más estrecha posible. Ser de fácil manejo. Dar lugar a resultados reproductibles, tanto en la cantidad de muestra inyectada

como en el ensanchamiento que origina en la banda cromatografía. Ser capaz de trabajar a presiones elevadas.

La mayor parte de los cromatógrafos actuales se venden con autoinyectores. Dichas unidades tienen la capacidad de inyectar muestras en el cromatógrafo de líquidos a partir de frascos que están en un carrusel o desde placas microtituladoras. Por lo regular, contienen rizos de muestreo y una bomba de jeringa para inyectar volúmenes desde menos de 1 μL hasta más de 1 mL .Algunos poseen medios controlados por temperatura que facilitan el almacenamiento de la muestra y efectúan reacciones de derivación antes inyectarla. La mayor parte de los equipos se puede programar para facilitar las inyecciones automáticas en el sistema de cromatografía de líquidos.

Figura 4: Rizo de muestreo para cromatografía de líquidos. Con la válvula en la posición que se muestra a la izquierda, la jeringa llena el rizo y la fase móvil pasa de la bomba a la columna. Cuando la válvula se coloca en la posición que se muestra a la derecha, el rizo queda insertado entre la bomba y la columna, de tal modo que la fase móvil arrastra la muestra hacia la columna.

Columnas para cromatografía de líquidos de alta resolución

Las columnas para esta técnica se construyen de ordinario con tubo de acero inoxidable de diámetro interno uniforme. Algunas ocasiones las columnas para cromatografía de líquidos de alta resolución se fabrican con tubos de vidrio de paredes resistentes o con polímeros como el polieteretercetona. La columna es el elemento fundamental de un cromatógrafo de líquidos, puesto que es en ella donde tiene lugar la separación; por lo tanto, resulta fundamental una correcta elección de la columna adecuada para cada separación; por lo tanto, resulta fundamental una correcta elección de la columna adecuada para cada separación, ya que con una columna inadecuada o de mala calidad nunca se obtendrán buenos resultados aunque se disponga del mejor instrumental.

Las columnas más utilizadas en cromatografía de líquidos son las de relleno; estas columnas consisten en un tubo, generalmente de acero, relleno de fase estacionaria adecuada al tipo de separación que se pretende llevar acabo. La mayoría de las columnas para cromatografía de líquidos miden de 5 a 25 cm de largo. Invariablemente se usan columnas rectas. A veces se pueden alargar acoplando dos o más de ellas. El diámetro interior de las columnas analíticas es a menudo de 3 a 5 mm; los tamaños de las partículas de los rellenos más comunes son 3 o 5 μm. Las columnas que más se utilizan miden de 10 a 15 cm de longitud y 4.6 mm de diámetro interior y están rellenas con partículas de 5 μm.

Figura 5: Componentes de la columna

Las características de la columna que influyen sobre su capacidad de separación son:

Diámetro interno Longitud Conexiones Relleno Tamaño de partículas de relleno

Relleno de la columna.

Todas las separaciones cromatograficas tienen lugar sobre la fase estacionaria .Las fases estacionarias en cromatografía de líquidos, están constituidas generalmente por partículas de materiales rígidos o semirrígidos, y en la gran mayoría de los rellenos se suele utilizar sílice con este fin, aunque también es posible encontrar rellenos basados en polímeros sintéticos.

En la mayoría de rellenos de columnas de cromatografía liquida, la sílice utilizada realiza una de las tres funciones siguientes:

Superficie adsorbente: En este caso los propios grupos activos de la superficie de la sílice son los responsables de la separación.

Soporte de la fase estacionaria: Está impregnada a la superficie de la sílice o bien se encuentra ligada químicamente a ella.

Actuación como substrato microporoso: En este caso, la sílice permite la selección de moléculas en función de su tamaño.

Tipos de detectores.

Los detectores para cromatografía de líquidos son de dos tipos básicos. Los detectores basados en una propiedad de la solución son sensibles a una propiedad de la fase móvil, como el índice de refracción, la constante dieléctrica o la densidad, la cual es modulada por la presencia de solutos. En cambio, los detectores basados en una propiedad del soluto responden a alguna de las propiedades de este último, como la absorbancia en el UV, fluorescencia o corriente de difusión, que no son inherentes a la fase móvil.

Detectores de ultravioleta/visible.

Cuando se hace pasar una radiación electromagnética a través de compuestos que presentan determinados grupos funcionales, estos experimentan una excitación electrónica a causa de la absorción de energía, a una longitud de onda que será específica para cada grupo funcional .Esta energía, provoca el paso de un electrón desde el estado fundamental hasta un nivel de energía superior. La absorción de energía, se traduce en una disminución de la intensidad del haz luminoso que se ha hecho pasar a través de la muestra, pudiéndose medir esta disminución de intensidad haciendo incidir el haz sobre una fotocélula.La utilización de la absorción de luz ultravioleta o visible para el control de una corriente liquida y analizar los distintos componentes que lleva en disolución, es una extensión natural de la espectrofotometría. Al contrario de lo que ocurre con el índice de refracción , la absorción UV o visible es un parámetro específico para cada compuesto , ya que este debe presentar una absorción adecuada en alguna región del espectro o , en su caso, debe combinarse con un reactivo adecuado para formar un derivado que presente absorción.

Cuando la muestra no absorbe la radiación por sí misma, el hallar un reactivo adecuado que dé lugar a un derivado coloreado para poder medir la absorción en visible.

Detectores de longitud de onda variable:

Los detectores de longitud de onda variable son particularmente útiles en tres casos:En el caso de que pueda obtenerse una mejor sensibilidad a una longitud de onda distinta de 254nm o de otras longitudes de onda para las que existen filtros.En el caso de que los distintos componentes de la muestra presentan gran absorción a diferentes longitudes de onda y, por tanto, el trabajo a una única longitud de onda reduzca la sensibilidad e incluso pueda resultar imposible la detección de algunos de los componentes de la muestra.En el caso de que se desee una operación con paro del flujo combinado con un registro del espectro completo de picos.Detectores de absorción con capacidad de barrido

Los detectores espectrofotométricos de ultravioleta más potentes son los instrumentos de arreglos de diodos. Varios fabricantes ofrecen este tipo de instrumentos, los cuales permiten recoger los datos de un espectro completo en aproximadamente un segundo. Por consiguiente, los datos espectrales de cada pico cromatografico se pueden recoger y almacenar a medida que aparecen al final de la columna.La base de funcionamiento de los espectrofotómetros con arreglo de diodos es simple; el haz de radiación que ha atravesado una cubeta de flujo continuo, a través de la que circula la fase móvil procedente de la columna cromatografica, es dispersado por medio de una red de difracción fija, siendo recogidas simultáneamente todas las longitudes de onda dispersas mediante una matriz de fotodiodos.

La configuración del equipo permite trabajar en modo isocrático, gradiente binario o de pasos, hasta una presión de 20 Atmósferas. El gradiente puede ser de composición de solventes, presión o flujo. La medición en la zona UV-Visible con el detector de diodos permite la lectura simultánea de 16 señales o canales (lambdas) entre 190-800 nm con la obtención del espectro total o parcial, diagrama de isocontorno (ploteo de contorno), vista tridimensional y pureza de pico para el desarrollo de métodos. Con el detector de fluorescencia se puede trabajar en el rango de 220-900 nm tanto en la excitación como en la emisión, pudiendo variar ambas en el tiempo, o sea, hacer mediciones con programación. Finalmente las mediciones con ambos detectores pueden ser independientes o simultáneas.

Figura6: Detector UV de arreglo de diodos.

ESTUDIO DE VALIDACIÓN DE LA METODOLOGÍA PARA LA DETERMINACIÓN DE VITAMINA A EN ALIMENTOS INFANTILES INSTANTÁNEOS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTO

RENDIMIENTO (HPLC)

Resumen

Con la finalidad de controlar la calidad de alimentos infantiles instantáneos se efectuó la validación de la metodología para la determinación de la vitamina A por cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Para la precisión del sistema se evaluaron tres parámetros: tiempo de retención, área y altura, hallándose una desviación estándar relativa (RSD) máxima de 1,78%. En la linealidad se obtuvo un coeficiente de correlación r=0,99 y una precisión con un RSD de 2,70%. La exactitud del método se evaluó en términos de recuperación mediante la adición de vitamina A al alimento obteniéndose un porcentaje de recuperación de 97,98%; y para la sensibilidad del método se obtuvo un límite de detección (LOD) de 0,06 µg/g y un límite de cuantificación (LOQ) de 0,58 µg/g. Con los resultados obtenidos se demuestra que el método en estudio es preciso, exacto, lineal y altamente sensible para ser utilizado en el control de calidad de alimentos infantiles instantáneos para la determinación de vitamina A.

Introducción

Vitamina A es el nombre genérico utilizado para describir al retinol, sus ésteres y los correspondientes isómeros. Sólo está presente, como tal, en los alimentos de origen animal, aunque en los vegetales se encuentra como provitamina A en forma de carotenos. Los diferentes carotenos se transforman en vitamina A en el cuerpo humano, se almacenan en el hígado en grandes cantidades y también en el tejido graso de la piel (palmas de las manos y pies, principalmente), por lo que pueden subsistir largos períodos sin su aporte.

La principal función de la vitamina A es la protección de la piel y su intervención en el proceso de visión de la retina. También participa en la elaboración de enzimas en el hígado y de hormonas sexuales y suprarrenales. El déficit de vitamina A produce ceguera nocturna, sequedad en los ojos (membrana conjuntiva) y en la piel, y afecciones diversas de las mucosas. En cambio, el exceso de esta vitamina produce trastornos como alteraciones óseas, e incluso inflamaciones y hemorragias en diversos tejidos.

La vitamina A se encuentra principalmente en productos animales tales como leche, crema, mantequilla, queso, huevos, carne, hígado, riñón y aceite de hígado de bacalao. Por lo general, se encuentra como ésteres de ácidos grasos de cadena larga pero también se encuentra como retinol. Se destruye muy fácilmente con la luz, con la temperatura elevada y con los utensilios de cocina de hierro o cobre. Los alimentos infantiles instantáneos, en su gran mayoría, son fortificados normalmente utilizando formulaciones especiales que mejoran su estabilidad y valor nutritivo, siendo la ingesta diaria recomendada (RDA) de 400 -700 µg de vitamina A, para niños de 1 -10 años de edad.

En el Perú, los programas de complementación alimentaría distribuyen alimentos instantáneos a la población con alto riesgo de desnutrición; en ese sentido, el desarrollo de tecnologías adecuadas para la evaluación de micronutrientes como la vitamina A, son necesarias para el control de calidad de los productos designados a los beneficiarios de estos programas.

El análisis de las vitaminas en los alimentos es un gran desafío para los analistas dado que se asocia con problemas significativos. Muchos de estos problemas han sido eliminados gracias a los recientes avances en la tecnología y el desarrollo de nuevos enfoques analíticos. A pesar de ello, no es una tarea fácil analizar vitaminas y se necesita experiencia y los conocimientos adecuados para producir resultados reproducibles, que sean exactos y válidos.

El primer método válido para la determinación de Vitamina A fue un bioensayo4; luego, se establecieron los métodos espectrofotométrico y fotométrico5, sin embargo, ambos métodos están expuestos a interferencias, desde algunas sustancias como carotenos, derivados y productos de descomposición de la vitamina A que podrían absorber luz en la misma región ultravioleta o dar colores similares con los reactivos utilizados en la determinación fotométrica. Es así, que estos métodos no son lo suficientemente específicos para determinar esta vitamina, además que la confiabilidad de sus resultados depende del éxito en los pasos de purificación y los procedimientos de trabajo.

Como vemos, el problema realmente no son los métodos de determinación, sino más bien los procedimientos de extracción, ya que debido a su inestabilidad, algunos autores prefieren extraer separadamente cada vitamina liposoluble6.

En ese sentido, y buscando una óptima metodología de análisis, en el presente estudio se realizó la validación de la metodología por HPLC para la determinación de vitamina A contenida en alimentos infantiles instantáneos.

Material y métodos

EQUIPOS

Se utilizó un equipo de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), marca Shimadzu, modelo LC10A, con inyector automático, bomba con sistema de gasificación, con integrador o sistema de registro, software para el procesado de datos cromatográficos, detector de arreglo de diodos (longitud de onda variable). La columna cromatográfica fue de acero inoxidable LC-18 para fase reversa, de 25 cm x 4,6 mm de diámetro interno, 5 µm de diámetro de partícula, y guarda columna con cartucho C18, Supelco. Las condiciones típicas de operación fueron: sistema isocrático, flujo 1,2 mL/min, volumen de inyección 20 µl, detección UV 242 nm, temperatura de horno, ambiente, y tiempo de corrida 7 min. La fase móvil fue metanol al 100% grado HPLC.

REACTIVOS

Metanol grado HPLC ( Merk), estándar all-trans Retinol: Vitamina A (Sigma), hexano p.a. (Merck), etanol absoluto p.a. (Merk), solución de hidróxido de potasio al 50%, BHT ó Ácido Ascórbico (antioxidantes), y agua tridestilada o grado HPLC. Solución stock estándar de vitamina A: Se disolvieron 100 mg del estándar en 100 mL de etanol absoluto, con aproximadamente 0,002g de BHT, y se guardó la solución en congelación (-20°C), se verificó la pureza del estándar mediante la medición de su espectro de absorción (la vitamina A y los correspondientes ésteres muestran un espectro de absorción característico, donde la posición del pico máximo depende del solvente): en etanol, el retinol a 325 nm, tiene un coeficiente de extinción (E 1 % - 1 cm.) de 1843).

PROCEDIMIENTOS

Se pesaron 20 g de la muestra de alimento infantil (papilla) en un balón de base plana, se colocó un magneto y se adicionó 70 mL de etanol absoluto. Se colocaron los tubos de reflujo y se agitó la mezcla hasta su ebullición con corriente de nitrógeno. Luego, se adicionó 20 mL de solución de KOH al 50% y se saponificó la mezcla por 30 minutos con agitación moderada. Antes de finalizar esta etapa se enjuagó el contenido con 50 mL de agua en 3 porciones. La solución se enfrió a temperatura ambiente y luego se filtró al vacío. Se colocó inmediatamente el contenido en una pera de separación de 250 mL y se adicionó 50 mL de hexano p.a. para proceder a la extracción. Se agitó la mezcla por 20 segundos y al separarse las fases se colocó la capa superior (fase orgánica) en un balón de 250 mL de base redonda que contenía aproximadamente 0,5 g de BHT ó ácido ascórbico. Se efectuó dos veces más la extracción y se juntaron los extractos en el balón de 250 mL. Se evaporó a sequedad el solvente, haciendo uso de un rotavapor con baño de agua a 40°C, se diluyó inmediatamente con metanol grado HPLC el residuo, y se llevó a volumen en un matraz

volumétrico de 10 mL. Finalmente, se pasó la solución final por un filtro de 0,2 µm, llenándolos en viales ámbar de 2 mL para colocados en el inyector del cromatógrafo.

CÁLCULOS

Dónde: Am (Área del pico de vitamina A en la muestra), As (Área del pico de vitamina A en el estándar), Cs (Concentración de vitamina A en el estándar, mg/ml), D (Factor de dilución), Wm (Peso de la muestra, g).

DISEÑO EXPERIMENTAL

Se analizaron muestras de papilla realizándose los ensayos en las muestras previamente homogenizadas con 2 analistas en 2 días diferentes para cuantificar la vitamina A expresada en µg/g. Cada analista realizó 08 ensayos por día, bajo condiciones de repetibilidad y reproducibilidad. La temperatura en el área de cromatografía líquida fue 23°C ± 2°C. La precisión del método analítico se estudió sobre el sistema, evaluando la dispersión de 4 inyecciones por cada uno de los 5 niveles de concentración de la solución estándar de vitamina A; y sobre el método, evaluando la dispersión de la preparación de la muestra. La evaluación correspondió a todo el procedimiento, desde la preparación de la muestra hasta la medición del analito por parte del instrumento.

La exactitud del método se evaluó en términos de recuperación. El analito se adicionó a la matriz, disuelto en el mismo solvente usado para la extracción, y se dejó en contacto con ésta por muchas horas antes de la extracción, para permitir su interacción. Para tal efecto, se trabajó con 3 niveles de concentración diferentes adicionados a la muestra. Las concentraciones de trabajo adicionadas fueron las siguientes: Nivel 1 = 3 ppm; Nivel 2 = 5 ppm; Nivel 3 = 7 ppm. Se tomaron 0,76 mL, 1,27 mL y 1,78 mL de una solución estándar de 100 ppm de vitamina A y se adicionaron a 6 muestras de papilla por nivel. Se dejó en contacto la solución estándar con las muestras durante toda la noche bajo refrigeración y, al día siguiente, se realizó el tratamiento y se hicieron las lecturas de los resultados de las 18 muestras.

La especificidad del método se representó mediante los espectros y el reporte de su correspondiente pureza con las muestras empleadas para la evaluación de la precisión y con la solución estándar. La evaluación de la especificidad del sistema se realizó mediante el software del equipo, trabajándose con la solución estándar y la evaluación. La determinación de los límites de detección y cuantificación se evaluó sobre las muestras empleadas para la prueba de precisión. Estos parámetros también fueron determinados por el software del equipo.

Resultados

En la Figura 1 se muestran los cromatogramas representativos de dos concentraciones (mayor y menor) de vitamina A para la curva de calibración. El tiempo de retención de la vitamina A fue 3,91 ± 0,5 min, siendo el tiempo total de análisis para una muestra de 7 min. La respuesta de detección fue lineal en el rango de concentraciones de 5 - 15 µg/g (Figura 2), obteniéndose un coeficiente de correlación r=0,99. El límite de detección del método en base a la señal / ruido (S/N) fue de 0,06 µg/g y el límite de cuantificación de 0,58 µg/g. El perfil de la precisión que se obtuvo en 16 determinaciones por analista en dos días diferentes, fue: CV de repetibilidad de 3,09% para el analista A, y 2,25% para el analista B vs. en tanto, el método oficial de la AOAC (CV de 3,62%); el CV de reproducibilidad fue 2,70 % vs el obtenido por el método oficial (de 9,72%).

Los resultados de la precisión del sistema, basados en la variación del tiempo de retención, área y altura; se muestran en la Tabla 1. La recuperación obtenida fue de 97,98% vs. la obtenida por el método oficial de la AOAC (de 98,8%).

Figura 1: Cromatograma de la curva de calibración correspondiente a 5ppm y 15ppm de Vit. A.

Figura 2: Curva de calibración de Vit. A.

La especificidad del método se muestra en la Figura 3, donde se observa la ausencia de interferencias debido a la adecuada extracción del analito, y además se muestra la comparación del espectro del estándar puro vs el espectro del analito en la muestra

Figura 3: Cromatograma de muestra con espectro de analito.

Discusión

Varias técnicas han sido propuestas para la medición de la vitamina A en alimentos infantiles 6 fórmulas infantiles. Cada una de ellas tiene sus ventajas y limitaciones, pero, comparado con otros métodos por HPLC, nuestra metodología propuesta tiene la ventaja de que el tratamiento de la muestra se realiza en menos tiempo, en relación al método oficial de la AOAC 992.06 Vitamina A (Retinol) in Miik-Based Infant Formula. Además, la columna que se utiliza en el método propuesto (C18) es más comercial que la columna del método de la AOAC (ciano), ya que esta última trabaja en fase normal siendo, por tanto, más difícil de controlar y por la naturaleza no polar del extracto, se debe usar cromatografía en fase reversa. El tiempo de corrida por muestra es también más corto en nuestra metodología (7 minutos), comparado con el método oficial que es de 10 minutos. Estas características contribuyen al menor costo del análisis.

Es necesario tener presente que tanto la saponificación, la isomerización y la ruptura de la vitamina A son retardados por la adición del antioxidante (ácido ascórbico) y el uso de nitrógeno, el cual interfiere con los agentes de oxidación presentes. Asimismo, el retinol y sus ésteres son rápidamente destruidos por la luz, el oxígeno y los ácidos, por lo que deben almacenarse en frascos ámbar o cubiertos con papel platino o su equivalente.

La muestra y el extracto de la muestra deben protegerse de la luz y la oxidación, evitándose la luz solar directa y la luz brillante. La iluminación artificial es mejor proporcionada por tubos fluorescentes dorados ó equivalentes. En ciertos casos, las diferentes etapas en el procedimiento deberían realizarse en material de vidrio ámbar para prevenir la degradación.

Dado que el calor también contribuye a la isomerización o a una posterior alteración de las vitaminas, debería evitarse el calor innecesario. Por lo tanto, debe tenerse cuidado que, por ejemplo, la evaporación de los solventes se realice lo más suave posible utilizando un evaporador rotatorio, con un buen control de la temperatura, un enfriamiento adecuado de los condensadores y un vacío óptimo. Además, se debe hacer un control espectrofotométrico de la pureza del estándar.

De acuerdo a los resultados obtenidos, podemos concluir que el Método de ensayo CENAN-DQ.ME.16: Método para la Determinación de Vitamina A (retinol) en alimentos infantiles instantáneos por HPLC es preciso, exacto, específico y sensible para los parámetros evaluados en este estudio, ya que se encuentran dentro de los rangos establecidos.