Isabel Baroja TFM

UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE VALENCIA

ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIERÍA AGRONÓMICA Y DEL MEDIO NATURAL

MÁSTER DE BIOTECNOLOGÍA BIOMÉDICA

Nanodispositivos dirigidos a la detección de patógenos

TRABAJO FINAL DE MÁSTER

Presentado por:

María Isabel Baroja Oviedo

Dirigido por: Dr. José Ramón Murguía Ibáñez

Valencia, Junio 2014

AUTORIZACIÓN

Datos del Trabajo Fin de Máster

Autora: Isabel Baroja Oviedo

DNI: Y2644776C

Título: Nanodispositivos dirigidos a la detección de patógenos

Yo, José ramón Murguía Ibáñez, en calidad de Director del trabajo de fin de máster

cuyos datos figuran en el apartado anterior, autorizo la presentación del mismo y

certifico que éste se adecúa plenamente a los requisitos formales, metodológicos y de

contenido exigidos a un trabajo de fin de máster, de acuerdo con la normativa

aplicable en la ETSIAMN.

__________________________

Firma

Valencia, 3 de junio de 2014

FORMULARIO DEPÓSITO TESIS FIN DE MÁSTER (TFM)

AUTOR 1er APELLIDO 2º APELLIDO NOMBRE DNI/NIE

Baroja Oviedo Isabel P172007721

DIRECTOR TFM (UPV)

1er APELLIDO 2º APELLIDO NOMBRE

Murguía Ibáñez José Ramón

DIRECTOR TFM (NO UPV)

1er APELLIDO 2º APELLIDO NOMBRE

UNIVERSIDAD MÁSTER

UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE VALENCIA

Máster Biotecnología Biomédica

TÍTULO DE LA TESIS Nanodispositivos dirigidos a la detección de patógenos

RESUMEN

El desarrollo de nanodispositivos como plataformas de transporte y liberación de moléculas químicas se ha convertido en una de las más innovadoras aplicaciones descritas durante los últimos años. Una característica fundamental de estos nanodispositivos consiste en que son capaces de liberar compuestos de interés únicamente bajo estímulos específicos lo cual, ha resultado especialmente útil para la investigación farmacológica. Dentro de este área, los nanodispositivos pueden ser utilizados a manera de biosensores o como transportadores de moléculas hacia dianas específicas. Entre los mencionados sistemas, las nasnopartículas mesoporosas de sílice (MSN) como vehículos multifuncionales constituyen un espacio de creciente interés, principalmente, porque estas matrices nanoscópicas tienen propiedades diferenciales como su elevada biocompatibilidad, inercia química, estabilidad térmica y porosidad homogénea. Debido a estas características las MSN se han convertido en herramientas apropiadas para la liberación espacio-temporal controlada de moléculas de interés químico. Dentro de los materiales mesoporosos de sílice, la MCM-41 (“Mobile Crystalline Material-41”), resulta apropiada para la fabricación de dispositivos nanoscópicos, ya que al hacer reaccionar los hidroxilos expuestos en el exterior de estas nanopartículas, resulta relativamente sencillo funcionalizar la matriz inorgánica dando lugar al acoplamiento de las denominadas puertas moleculares. Estas puertas, confieren selectividad a los soportes sólidos, ya que son capaces de abrirse y liberar el contenido de sus poros únicamente ante estímulos controlables como cambios de pH, temperatura, potencial redox, presencia/ausencia de proteínas, iones o ácidos nucleicos. Entre todas las puertas nanoscópicas moleculares, los ácidos nucleicos han sido reconocidos como compuestos interesantes debido a su conformación tridimensional, a su especificidad a la hora del acoplamiento en doble hebra y a su robusta estructura físico-química. En este sentido, el trabajo que nos ocupa, consiste en el diseño, elaboración y estudio de la funcionalidad de un sólido mesoporoso nanoparticulado de tipo MCM-41, cargado con un colorante (rodamina B), funcionalizado con isocianatos y tapizado con una puerta molecular de ADN. Este dispositivo tiene como objetivo de detectar patógenos bacterianos de tipo Mycoplasma. Para lograr la selectividad del sistema, la puerta molecular del nanodispositivo estará formada por dos hebras de ADN de diferentes longitudes (15 y 39 nucleótidos respectivamente) correspondientes a un fragmento altamente conservado de la región ribosomal 16S perteneciente a las bacterias del género Mycoplasma. La hebra pequeña (O1), presentará una modificación sintética (NH2) en su extremo 5´ la cual será acoplada covalentemente a la superficie del sólido al reaccionar con los grupos isocianato. La segunda hebra de ADN (O2), cumple una doble función. Primeramente, se encargará de bloquear la salida de la carga al cubrir los poros de la nanopartícula pero además, estará encargada de mediar las interacciones supramoleculares necesarias para la posterior

liberación selectiva del colorante. La apertura de la puerta molecular dependerá de la presencia de ADN genómico de Mycoplasma en el analito, en cuyo caso la liberación del contenido de los poros, será la consecuencia de hibridación de las bases complementarias de la hebra del ADN genómico presente en el analito con el oligonucleótido (O2) inmovilizado en el nanodispositivo. Para evaluar la fiabilidad del sistema se caracterizó la matriz mesoporosa y se realizaron pruebas de efectividad. A partir de los resultados obtenidos se puede decir, que el límite de detección del nanodispositivo es de aproximadamente 70 copias de ADN de Mycoplasma uL-1. Además, el sistema diseñado es capaz de detectar de manera selectiva la presencia de ADN del género Mycoplasma incluso en presencia de ADN interferente (Candida albicans y Legionella pneumophila). Finalmente, este diseño fue testado con muestras clínicas previamente analizadas mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y los análisis mostraron, que el soporte sólido diseñado identifica de manera selectiva la presencia de micoplasmas en suspensión. En conjunto, estos resultados indican que la nanoformulación desarrollada es un biosensor rápido y eficiente, capaz de detectar ADN bacteriano (Mycoplasma) de manera específica y emitir una señal cuantificable mediante espectroscopia de fluorescencia, lo que lo convierte en una potencial herramienta diagnóstica. Currently, nanodevice development as platforms for the transport and release of chemical molecules has become one of the most innovative applications. A key issue in this field is the design of new “smart” systems based on nanoscale structures and a variety of biomolecules, which perform unprecedented functions. Nanoscale devices can be used to develop biosensors or to deliver molecules to specific targets. In drug delivery, the development of stimuli-responsive systems has attracted tremendous attention. In particular, the use of mesoporous silica nanoparticles (MSN) has a lot of advantages due to its properties such as high biocompatibility, chemical inertness, thermal stability, and homogeneous porosity. Because of these characteristics, MSN have become appropriate tools for spatio-temporal release of chemical molecules. Additionally, mesoporous silica nanoparticles, such as type MCM-41 (Mobile Crystalline Material-41), function as a support that serves as a reservoir in which certain compounds can be stored. Besides, some molecules or molecularly appended objects can be attached on the surface of these containers, thus acting as molecular gates. Among molecular gates, the nucleic acids have been recognized as interesting materials because of their three-dimensional conformation, specificity, double stranded coupling and robust physical-chemical structure. In this work, as a proof of principle, we designed a sensitive nanodevice for direct and rapid detection of Mycoplasma. Therefore, MSN have been selected as the inorganic support. The nanoparticles were loaded with a suitable dye (rhodamine B), and then the external surface was functionalized with isocyanates. Two complementary sequences of DNA with different lengths act as molecular gates in this system. These sequences are highly conserved in the Mycoplasma genome. The smaller DNA strand (O1) has a modification at 5 ' extreme (NH2). Through this modification, the DNA can be coupled covalently to the solid sufrase due to the reaction with the isocyanates. The second strand of DNA (O2) has two functions. First, it will be responsible for blocking the pores of the nanoparticle, but it also for mediating supramolecular interactions. These interactions will be necessary for the subsequent dye release. Consequently, dye release will depend on the presence of genomic DNA of Mycoplasma in the analyte; in which case, genomic DNA will hybridize with oligonucleotide (O2) immobilized on the nanodevice allowing for the dye release. In order to evaluate the effectiveness of this system, the MCM-41 was chemically characterized and probed through different assays. From the results, the limit of detection was calculated from approximately 70 copies of Mycoplasma uL-1. Afterwards, we found that the nanodevice was able to recognize samples selectively contaminated with Mycoplasma, even if there are other microorganisms like Candida albicans or Legionella pneumophila in the analyte. Finally, this system was tested with clinical samples previously analyzed using polymerase chain reaction (PCR). This experience confirms that our device can accurately identify the presence of Mycoplasma, in particular, Mycoplasma pneumonia, with fluorescence spectroscopy. All these results suggest that this technology is fast and efficient tool for diagnostic sensing of bacterial DNA.

PALABRAS CLAVE

DESCRIPTORES EN ESPAÑOL

Nanopartículas mesoporosas de sílice; puerta molecular ; Mycoplasma ; ADN (mínimo tres)

DESCRIPTORES EN INGLÉS

Mesoporous silica nanoparticles; molecular gate ; Mycoplasma ; DNA (mínimo tres)

CLASIFICACIÓN DE LA UNESCO

URL MINISTERIO DE EDUCACIÓN Y CIENCIA: http://www.mec.es/ciencia/jsp/plantilla.jsp?area=plan_idi&id=6&contenido=/files/portada.jsp

CAMPO DISCIPLINA SUBDISCIPLINA

23 2307 2390.01

22 2210 2210.28-1

(máximo tres áreas de conocimiento)

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIERÍA AGRONÓMICA Y DEL MEDIO NATURAL DON/ÑA: María Isabel Baroja Oviedo DNI/NIE: P172007721 DIRECCIÓN: Calle Luis de Milán, Número 9, puerta 10. Código postal 46021. TELÉFONO/S: 601162326 MAIL: [email protected] TÍTULO TFM: Nanodispositivos dirigidos a la detección de patógenos DIRECTOR UPV : José Ramón Murguía Ibáñez DIRECTOR NO UPV: E-MAIL: EXPONE:

Que habiendo cursado un total de 72 créditos de las asignaturas pertenecientes al Máster de Biotecnología Biomédica, y estando interesada en presentar el Trabajo de Fin de Máster SOLICITA:

La asignación de lugar, fecha, hora y del Tribunal que deberá valorar, mediante una exposición pública, los conocimientos adquiridos en los estudios de dicho Máster para la convocatoria:

□ Diciembre □ Marzo □ Mayo x Junio

Valencia a, 3 de junio de 2014

Fdo.:…………………………..

SECRETARÍA DEL DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA E.T.S.I.A.M.N. (Planta Baja del Edificio 3J)

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGÍA. E.T.S.I.A.M.N Camino de Vera, s/nº. 46022 VALENCIA●Tel. +34 963877420●Fax +34 96 3877429

A mi familia en Ecuador por su ejemplo de entrega y generosidad.

A mi familia en Vilafranca del Penedès, por su apoyo y cariño.

A Pau, por ser mi inagotable fuente comprensión, ternura y aliento cada día.

A Sindy, Gabriela y Lorena, por su amistad inquebrantable.

A todos quienes de una u otra manera han hecho este sueño realidad.

“Los científicos dicen que estamos hechos de átomos, pero a mí un pajarito me contó

que estamos hechos de historias”

Eduardo Galeano

Índice de puntos

ÍNDICE DE PUNTOS

I. Introducción……………………………………………………………………………………………..... 1

1. Características biológicas del género Mycoplasma…………………………………….. 3

2. Infecciones producidas por Mycoplasma……………………………………………………. 6

2.1 Neumonías adquiridas en la comunidad y Mycoplasma pneumoniae…. 6

2.2 Artritis reumatoide Mycoplasma fermentans……………………………………… 7

3. Diagnóstico de infecciones por micoplasmas……………………………………………… 8

4. La nanobiotecnología frente a la detección de patógenos bacterianos……….. 9

5. Materiales mesoporosos nanoparticulados………………………………………………. 10

5.1 Propiedades de las nanopartículas mesoporosas de sílice………………… 12

6. Puertas nanoscópicas moleculares……………………………………………………………. 13

6.1 Uso de ADN como puerta molecular………………………………………………... 15

II. Objetivos……………………………………………………………………………………………………. 18

III. Materiales y Métodos………………………………………………………………………………… 22

1. Síntesis de los materiales MCM-‐41, S1 y S1-‐O1-‐O2…………………………………... 24

1.1 Reactivos ………………………………………………………………………………………… 24

1.2 Síntesis del material MCM-‐41………………………………………………………….. 24

1.3 Carga del material MCM-‐41 con rodamina B (S1), hibridación de los

oligonucleótidos O1 y O2 y anclaje covalente del ADN a la superficie de

las nanopartículas (S1-‐O1-‐O2)…………………………………………………………. 25

2. Caracterización de los materiales MCM-‐41, S1 y S1-‐O1-‐O2……………………… 27

2.1 Equipos y condiciones de trabajo…………………………………………………….. 29

3. Ensayos de optimización del sólido…………………………………………………………… 30

3.1 Cinética de liberación…………………………………………………………………. 30

3.2 Ensayo de límites de detección…………………………………………………… 31

3.3 Ensayo con ADN interferente……………………………………………………… 32

3.4 Ensayo con muestras clínicas……………………………………………………… 33

Índice de puntos

IV. Resultados y discusión………………………………………………………………………………. 35

1. Síntesis y caracterización de los materiales mesoporosos………………………... 37

1.1 Diseño del sistema…………………………………………………………………………… 37

1.2 Caracterización de los materiales…………………………………………………….. 38

1.2.1 Estudios de difracción de rayos X…………………………………………. 38

1.2.2 Estudios de microscopía electrónica de transmisión (TEM)….. 40

1.2.3 Estudios de adsorción – desorción de N2……………………………… 41

1.2.4 Análisis elemental y termogravimétrico………………………………. 43

2. Cinética de liberación del sólido final S1-‐O1-‐O2………………………………………. 45

3. Ensayo de límites de detección……………………………………………………………….. 46

4. Ensayo con ADN interferente………………………………………………………………….. 48

5. Ensayo con muestras clínicas…………………………………………………………………... 49

V. Conclusiones……………………………………………………………………………………………… 53

VI. Bibliografía………………………………………………………………………………………………… 58

Índice de figuras y tablas


Figura 1. Fotografía tomada mediante microscopía de transmisión electrónica de

Mycoplasma pneumoniae infectando anillos traqueales…………………………………………. 5

Figura 2. Familia de materiales mesoporosos M41S………………………………………………. 11

Figura 3. Representación esquemática de los grupos silanol presentes en la superficie

del material mesoporoso y la posterior reacción de sustitución nucleofílica alifática

que tiene lugar en el proceso de funcionalización de las nanopartículas………………… 12

Figura 4. Representación esquemática de la actividad de una puerta molecular de tipo

reversible……………………………………………………………………………………………………………….. 13

Figura 5. Esquema de síntesis del material MCM-‐41……………………………………………… 24

Figura 6. Estructura del colorante rodamina B utilizada para cargar el material

mesoporoso MCM-‐41……………………………………………………………………………………………. 26

Figura 7. Esquema representativo del material MCM-‐41 bloqueado con los

oligonucleótidos. La estructura del organosilano elegido para interaccionar con los

oligonucleótidos, del colorante (rodamina B) y las secuencias de oligonucleótidos

utilizadas……………………………………………………………………………………………………………….. 27

Figura 8. Esquema representativo del proceso de apertura de la puerta molecular de

ADN en el sólido S1-‐O1-‐O2 utilizando como estímulo selectivo ADN genómico de

Mycoplasma fermentans……………………………………………………………………………………….. 31

Figura 9. Representación esquemática del mecanismo de acción del

nanodispositivo………………………………………………………………………………………………………. 38


Figura 10. Difractogramas de rayos X. Se muestran los patrones de difracción de la

matriz MCM-‐41 sin calcinar (a), tras el proceso de calcinación (b) y del solido híbrido

S1 (calcinado, cargado con rodamina B y funcionalizado con isocianatos) (c)…………. 39

Figura 11. Imágenes de TEM a) matriz inorgánica del sólido MCM-‐41 después del

proceso de calcinación y b) matriz inorgánica del sólido MCM-‐41 final (S1)…………… 40

Figura 12. A. Isotermas de adsorción de N2. a) Material mesoporoso MCM-‐41

calcinado y b) Sólido S1. B. Isotermas de desorción de N2. a) Material mesoporoso

MCM-‐41 calcinado y b) Sólido S1.………………………………………………………………………….. 41

Figura 13. Termograma del sólido S1……………………………………………………………………… 44

Figura 14. Porcentaje de colorante liberado medido a 576 nm (λexc 555 nm) en

ausencia (a) y presencia (b) de ADN de Mycoplasma fermentans…………………………… 45

Figura 15. a) Porcentaje de colorante liberado en función del número de copias de

ADN genómico de Mycoplasma fermentans medido a los 30 minutos de incubación a

25ºC a 576 nm (λexc 555 nm) y b) Análisis gráfico para obtener el límite de detección

del sistema…………………………………………………………………………………………………………….. 47

Figura 16. Intensidad de fluorescencia de la disolución en porcentaje de colorante

liberado medido a 576 nm (λex 555 nm) en presencia (de derecha a izquierda) de Tris-‐

HCl (blanco), ADN genómico de Mycoplasma fermentans, mezcla de Candida albicans

+ Legionella pneumophila y mezcla de Mycoplasma fermentans + Candida albicans +

Legionella pneumophila…………………………………………………………………………………………. 48

Figura 17. Porcentaje de colorante liberado medido a 576 nm (λex 555 nm) en

presencia (de izquierda a derecha) de ADN genómico de Mycoplasma fermentans,

muestras clínicas 1 y 2 (pacientes positivos según PCR para Mycoplasma), muestras

clínicas 3 y 4 (pacientes negativos según PCR para Mycoplasma) y Tris-‐HCl

(blanco)………………………………………………………………………………………………………………….. 50


Tabla 1. Especies de micoplasmas aisladas en muestras clínicas de origen humano,

tipos de mucosas que colonizan y posible patogenicidad…………………………………………. 3

Tabla 2. Valores específicos del área de superficie aplicando el modelo BET, el

volumen de poro, así como el tamaño del mismo aplicando el modelo BJH. Valores

determinados a partir de las isotermas de adsorción – desorción de N2………………… 43

Tabla 3. Contenido de rodamina B e isocianatos en milimoles por gramo de MCM-‐41

funcionalizada…………………………………………………………………………………………………………. 44

Tabla 4. Presencia/ausencia de bacterias del género Mycoplasma pneumoniae en

muestras de esputo de pacientes con neumonía evaluadas mediante

PCR………………………………………………………………………………………………………………………… 49

Abreviaturas

ABREVIATURAS

AE Análisis elemental

CTABr Bromuro n-‐cetilmetilamonio

MCM-‐41 Mobile Crystalline Material-‐41

MSN Nanopartículas mesoporosas de sílice

PCR Reacción en cadena de la polimerasa

RhB Rodamina B

S1 Sólido funcionalizado con isocianatos y cargado con rodamina B

S1-‐O1-‐O2 Sólido funcionalizado con ADN como puerta molecular

SLF Sistema de liberación de fármacos

TEOS Tetraetilortosilicato

TEM Microscopía electrónica de transmisión

TEA Trietilamina

TG Análisis termogravimétrico

I. INTRODUCCIÓN

Introducción

3

1. Características biológicas del género Mycoplasma

Las bacterias del género Mycoplasma (familia Mycoplasmataceae, orden

Mycoplasmatales) pertenecen a la clase Mollicutes que significa “piel blanda”;

término que hace referencia a su carencia de pared celular. Filogenéticamente, se

relacionan con un grupo de bacterias grampositivas (Bacillus, Lactobacillus,

Clostridium y Streptococcus) de las que divergieron mediante un proceso de evolución

reductiva que provocó la perdida de su pared celular y a una reducción graduada de

su genoma convirtiéndose en las bacterias más pequeñas con capacidad de división

autónoma y vida libre (Matas et al., 2005). Sin embargo, no se conoce el tipo de

presión selectiva que condujo al mencionado proceso de evolución regresiva. Estos

microorganismos de alta complejidad y sofisticación se encuentran ampliamente

distribuidos en la naturaleza. De hecho, se han identificado aproximadamente 200

especies de ellos; de las que apenas 12 han sido aisladas en humanos (Lluch, 2010).

En la tabla 1 se observan los tipos de micoplasmas obtenidos a partir de muestras

clínicas humanas, el lugar de aislamiento y su posible asociación con una patología.

Tabla 1. Especies de micoplasmas aisladas en muestras clínicas de origen humano, tipos de mucosas

que colonizan y posible patogenia (Modificado de Acosta et al., 2010)

Especie Mucosa colonizada Especie

patológica Orofaringe Tracto genitourinario M. pneumoniae + -‐ + M. salivarium + -‐ -‐ M. orale + -‐ -‐ M. buccale + -‐ -‐ M. faucium + -‐ -‐ M. lipophilum + -‐ -‐ M. hominis + + + M. genitalium * + + M. fermentans + + + M. primatum -‐ + -‐ M. spermatophilum -‐ + -‐ M. penetrans -‐ + Desconocida

* aunque se ha encontrado en orofaringe, se desconoce su papel en el tracto respiratorio

Introducción

4

Estos microorganismos tienen tres características biológicas fundamentales que les

hacen ser únicos entre el resto de bacterias y que además, definen su relación con el

hospedador. La primera característica es de carácter morfológico, y se resume por

una parte en la carencia de pared celular y por otra, en su tamaño reducido tanto en

lo que tiene que ver con su dimensión celular (0,2 -‐ 0,8 μm) como con el tamaño de

su genoma (Acosta et al., 2011). La segunda característica es de tipo funcional, y

consiste en la escasa dotación de vías metabólicas; lo cual se puso de manifiesto,

mediante el estudio de los genomas de M. pneumoniae y M. genitalum. A partir de

estas investigaciones se constató la ausencia de los genes implicados en la síntesis de

aminoácidos y la presencia de pocos genes vinculados a la biosíntesis de vitaminas,

precursores de ácidos nucleicos, ácidos grasos y colesterol; lo que hace que estas

bacterias sean altamente dependientes del aporte exógeno (Himmelreich et al., 2002;

Narita, 2009). Como consecuencia de lo anterior, se produce la tercera característica,

que consiste en la íntima relación de dependencia del microorganismo hacia su

hospedador (Lluch, 2010).

Estructuralmente, los micoplasmas son organismos bastante sencillos. Están

conformados por una membrana plasmática trilaminar, un citoplasma con algunos

ribosomas y una molécula de ADN de doble cadena, circular, densamente

empaquetada (Acosta, 2010). Adicionalmente, algunas especies de Mycoplasma,

poseen una estructura terminal denominada orgánulo de adherencia, la cual les

otorga la capacidad de fijarse con gran habilidad en los epitelios de sus hospedadores

(figura 1). La membrana celular tiene una conformación proteo-‐lipídica dependiente

de la aportación exógena de ácidos grasos y colesterol, ya que las escasas vías

metabólicas bacterianas, están principalmente dedicadas a la generación de energía y

en menor grado a la formación de sustratos para las rutas sintéticas. Por otra parte y

como se había mencionado anteriormente, estas bacterias carecen de pared celular

lo que podría explicar su alta sensibilidad frente a choques osmóticos y a la presencia

de detergentes. En contraste, esta característica también les confiere resistencia

frente a los antibióticos β-‐lactámicos (Waites et al., 2004).

Introducción

5

Figura 1. Fotografía tomada mediante de microscopía de transmisión electrónica de Mycoplasma

pneumoniae infectando anillos traqueales. (Imagen de Waites et al., 2004)

Estas bacterias a pesar de su aparente simplicidad, son capaces de formar complejas

relaciones con otros organismos. Es así que, la mayoría de micoplasmas establecen

con el hospedador una relación de comensalismo, pero algunas especies pueden

llegar a ser patógenas (Acosta, 2011). Las especies que se comportan como

patógenas, producen infecciones que son generalmente crónicas y rara vez

fulminantes. En investigaciones publicadas por Waites y Talkington en el año 2004, se

observó que durante el proceso de adherencia algunos micoplasmas lesionan a la

célula hospedadora e interfieren en su metabolismo. Se ha visto además que ciertas

especies incluso están en capacidad de penetrar en una amplia variedad de células

humanas tanto in vitro como in vivo, logrando sobrevivir en el medio intracelular de

manera prolongada. Como es evidente, la localización intracelular protege a estos

microorganismos frente a los potenciales efectos del sistema inmunitario del

hospedador y a la presencia de antibióticos, lo cual dificulta su erradicación y justifica

el aparecimiento de infecciones latentes o crónicas (Waites et al., 2004).

Ahora bien, en términos de salud pública las bacterias del género Mycoplasma son

importantes debido a su actividad como agentes infecciosos y también a su rol como

contaminantes de laboratorio. En relación a esto último, se debe mencionar que los

Introducción

6

cultivos celulares utilizados en la investigación biotecnológica, biomédica y en el

diagnóstico hospitalario son objeto de contaminación con micoplasmas lo cual altera

el crecimiento celular, los patrones enzimáticos, la composición de la membrana e

induce anormalidades cromosómicas. En consecuencia, la mencionada problemática

afecta considerablemente los resultados obtenidos; lo que conlleva pérdidas

económicas y de tiempo. Por esta razón, muchos laboratorios se han visto obligados a

seguir estrictos protocolos de calidad para evitar el aparecimiento de dichos

contaminaciones (Rivera et al., 2006).

Por otra parte, en relación a la participación de los micoplasmas con el aparecimiento

de patologías, se ha visto que estas bacterias están implicadas principalmente en el

desarrollo de neumonías, enfermedades urogenitales no gonocócicas, artritis

reumatoide y enfermedades inflamatorias pélvicas. No obstante con menor

frecuencia, se han descrito meningoencefalitis, neuritis óptica, parálisis de nervios

craneales, ataxia, erupción eritematosa papular o vesicular, mialgias, artralgias,

artritis séptica, pericarditis, miocarditis, glomerulonefritis, vómito, diarrea, otitis y

conjuntivitis asociadas a Mycoplasma (Michelow et al., 2004).

2. Infecciones producidas por Mycoplasma

Por efectos didácticos, en los siguientes apartados profundizaremos únicamente en la

actividad de Mycoplasma pneumoniae y Mycoplasma fermentans dentro del

desarrollo de algunas patologías.

2.1 Neumonías adquiridas en la comunidad y Mycoplasma pneumoniae

Mycoplasma pneumoniae es un patógeno intracelular facultativo cuya distribución es

universal. Esta bacteria es causante de entre un 15 y un 30% de las neumonías

adquiridas en la comunidad, lo cual supone una frecuencia de 2 casos por cada 1000

personas al año y dichas infecciones normalmente son producto de ciclos epidémicos

(Matas et al., 2005). Pero, M. pneumoniae también produce infecciones de vías

respiratorias altas, siendo el segundo agente causal de estas enfermedades después

Introducción

7

del virus influenza A (Ausina, 2004; Matas et al., 1998).

Las infecciones del aparato respiratorio producidas por esta bacteria, de acuerdo a

sus características clínico radiológicas, se denominan neumonías atípicas primarias.

Los síntomas se presentan de manera gradual en el transcurso de algunos días y

consisten en fiebre, tos no productiva, cefalea, mialgias y también pueden estar

acompañados de inflamación del tracto respiratorio. Haciendo uso de una radiografía

de tórax se consigue observar infiltrados ritículonodulillares parahiliares o

peribronquiales que pueden ser uni o bilaterales y además ocasionalmente, aparecen

pequeños derrames pleurales (Ausina, 2004).

Aunque estas bacterias no suelen ser demasiado agresivas, esporádicamente se han

visto casos en los que la infección producida por Mycoplasma pneumonie resulta

fulminante. Esto ocurre especialmente en niños con alteraciones inmunológicas como

anemia falciforme, anaesplenia funcional, hipogammaglobulinemia o síndrome de

Down (Michelow et al., 2004).

2.2 Artritis reumatoide y Mycoplasma fermentans

Aproximadamente desde el año 1970, se ha sospechado una correlación entre el

desarrollo de la artritis reumatoide y la presencia de Mycoplasma fermentans. Sin

embargo, esta asociación ha resultado difícil de probar (Johnson et al., 2000). Pero

con el advenimiento de técnicas moleculares, particularmente con el uso de la

reacción en cadena de la polimerasa (PCR), se ha explicado de mejor manera el papel

de M. fermentans en el desarrollo de dicha patología (Gilroy et al., 2001). Es así que

para el año 2000, Horowitz y colaboradores logran detectar la presencia de

Mycoplasma fermentans en fluido sinovial de pacientes con artritis reumatoide,

artritis inflamatoria no reumatoide y artritis no diferenciadas, haciendo uso de la

citada tecnología (Horowitz et al., 2000).

Estos hallazgos han permitido suponer que microorganismos como Mycoplasma

fermentans, son capaces de iniciar procesos de artritis ya sea por medio de una

Introducción

8

infección crónica, con una cantidad mínima pero persistente de la bacteria, o a través

del mecanismo denominado “hit and run” (Rivera et al., 2002; Rivera, 2003). Este

mecanismo supone que el agente infeccioso se establece en la articulación por un

periodo de tiempo corto y posteriormente es eliminado. No obstante, para este

momento ya ha desencadenado una cascada de eventos que conducen al proceso

inflamatorio (Johnson et al., 2000). Esto se comprobó en 2002, mediante ensayos in

vitro con conejos a los que se inocularon tanto Mycoplasma fermentas como

Mycoplasma arthriditis. En dichas investigaciones realizadas por Rivera et al., se

observó que los mencionados agentes infecciosos únicamente pudieron aislarse a

partir de las articulaciones de los animales de experimentación durante las primeras

semanas post-‐infección, pero el proceso inflamatorio característico de la artritis

prevalece incluso después de la erradicación de las bacterias (Rivera et al., 2002;

Rivera, 2003).

3. Diagnóstico de infecciones por micoplasmas

El diagnóstico clínico de las infecciones causadas por micoplasmas se ha visto limitado

por el crecimiento dificultoso que presentan estos microorganismos y porque hasta

hace poco, se contaba con escasos procedimientos rápidos y sensibles para su

detección. En consecuencia, esto ha llevado a subestimar la participación de estas

bacterias en el contexto de las enfermedades infecciosas. En los próximos párrafos

resumiremos los métodos diagnósticos más comunes aplicados actualmente.

El diagnóstico microbiológico es la práctica más habitual; sin embargo, conseguir un

buen aislado de Mycoplasma a partir de cultivos de muestras respiratorias,

urogenitales o sinoviales es altamente complejo. Principalmente, porque en este tipo

de muestras suelen estar presentes otras especies patógenas lo que lleva a resultados

parcialmente erróneos. Estas dificultades han llevado a la aplicación de técnicas

alternativas como PCR y PCR en tiempo real por su alto nivel de especificidad

(Templeton et al., 2003).

Aun cuando las técnicas moleculares presentan grandes ventajas, los análisis

Introducción

9

serológicos siguen estando más difundidos, especialmente para el diagnóstico de

Mycoplasma pneumoniae; tanto por la facilidad que ofrecen estas técnicas durante la

recogida de la muestra, como por la disponibilidad de múltiples pruebas. Sin

embargo, los mencionados análisis resultan deficientes si se precisa investigar

muestras con los denominados “micoplasmas genitales” (M. hominis, Ureaplasma spp

y M. genitalum) (Sánchez et al., 2003; Talkington, 2004).

Se debe agregar que según los reportes publicados, el diagnóstico de bacterias del

género Mycoplasma haciendo uso de las técnicas vigentes, continúa siendo

dificultoso (Wenisch et al., 2003). Por tanto, es un reto a nivel científico-‐técnico el

perfeccionamiento de las herramientas actuales o en su defecto, la creación de

nuevas estrategias diagnósticas capaces de aportar mayor información acerca del

desarrollo de las enfermedades y de la presencia/ausencia del patógeno examinado.

En este sentido, el desarrollo de plataformas nanotecnológicas resulta un área de

especial interés principalmente por su alta especificidad y versatilidad.

4. La nanobiotecnología frente a la detección de patógenos bacterianos

Durante la última década, el desarrollo de nanodispositivos como plataformas de

transporte y liberación de moléculas químicas se ha convertido en una de las más

innovadoras aplicaciones (Vallet-‐Regi, et al., 2007). Así por ejemplo, en biología los

nanodispositivos sirven para controlar un sinnúmero de procesos presentes en

organismos y microorganismos haciendo uso de nanomateriales y nanopartículas

capaces de operar a nivel molecular. Concretamente, una de las aplicaciones de

mayor interés dentro de la nanobiotecnología se centra en el diseño de sistemas de

liberación controlada de fármacos (SLFs) (Slowing, 2008; Sáez, 2002; Fakruddin,

2012). El objetivo principal de la liberación controlada es en conseguir que la cantidad

correcta de agente activo esté disponible en el momento adecuado y en el lugar

preciso (Sáez, 2002). Para ello, será necesario que el sistema responda a un estímulo

específico, de modo que la liberación sea selectiva. A partir de este concepto en bio-‐

medicina por ejemplo, diversos tipos de nanopartículas han sido desarrolladas bien

sea como sistemas de carga y liberación de fármacos, o como plataformas para el

Introducción

10

diagnóstico de enfermedades. En este último caso, la sustancia a liberarse deberán

tener características colorimétricas, puesto que así facilitarán el diagnóstico

diferencial (Bawarski, 2008).

Entre los nanodispositivos más estudiados se encuentran los liposomas funcionales,

los polímeros terapéuticos (micelas poliméricas, dendrímeros, conjugados polímero-‐

proteína o plímero-‐fármaco), los nanocristales, los nanogeles y las nanopartículas

sólidas (Bawarski, 2008).

Aunque tradicionalmente los liposomas y las micelas poliméricas han sido los

sistemas más investigados, ellos presentan inconvenientes como su baja eficiencia de

encapsulación, deficiente reproducibilidad y acelerada liberación de la carga

(Medvedeva, 2007). En respuesta a dichas limitaciones, ha sido necesario centrar las

investigaciones en otros sistemas como los materiales mesoporosos

nanoparticulados. Este tipo de matrices resultan atractivas debido a algunas de sus

características específicas como la alta capacidad de carga, su relativamente fácil

funcionalización, la basta superficie interna que presentan y la estructura ordenada

de sus poros, lo cual les confiere estabilidad térmica y una fuerte resistencia química

(Li et al., 2012).

5. Materiales mesoporosos nanoparticulados

El uso de materiales mesoporosos nanoparticulados como sistemas de liberación

controlada ha resultado interesante en diversas áreas, especialmente dentro de la

nanomedicina. Esto se debe de manera particular a la capacidad que presentan estas

matrices para funcionar como vehículos multifuncionales a la hora de diseñar nuevos

fármacos. En este contexto, los materiales de base silícea son cada vez más utilizados

para la fabricación de nanodispositivos, pues se ha visto que son plataformas de

liberación adecuadas; tanto para su uso diagnóstico, como terapéutico (Bawarski,

2008; Bandow et al., 2009).

Los materiales mesoporosos de sílice (MSN) se encuentran en la familia de materiales

Introducción

11

sintéticos denominada M41S, creada por la compañía Mobil Oil en el año 1992

(Bernardos, 2010). Este tipo de materiales con características de soportes sólidos,

resultaron ventajosos por la configuración ordenada de sus poros y por su capacidad

para absorber (encapsular) cantidades relativamente grandes de moléculas bioactivas

(Slowing et al., 2008; Argyo et al., 2013).

Figura 2. Familia de materiales mesoporosos M41S (Mas-‐Font, 2010)

Un ejemplo significativo de este tipo de materiales es la MCM-‐41 (Mobile Crystalline

Material-‐41), la cual puede encontrarse tanto de forma nanoparticulada como

microparticulada. En el caso que nos ocupa, haremos referencia únicamente a los

soportes sólidos nanoparticulados. Su característica diferencial de los otros sólidos

M41S, es que presentan una fase hexagonal, mientras que los demás miembros de la

familia están constituidos por fases cúbicas (MCM-‐48) o laminares (MCM-‐50). Estos

tres materiales son fácilmente identificables mediante difracción de rayos X

(Bernardos, 2010), como se puede observar en la figura 2.

Los sólidos se obtienen a partir de la polimerización de un precursor inorgánico (como

el tetraetilortosilicato, TEOS, en disolución acuosa) alrededor de las micelas del

surfactante (bromuro de cetiltrimetilamonio, CTABr). En el caso de la matriz MCM-‐41,

las moléculas del surfactante se encuentran asociadas formando un

Introducción

12

empaquetamiento hexagonal a manera de cilindros que tras la eliminación del

surfactante, bien sea mediante calcinación o por extracción, darán lugar las

estructuras mesoporosas deseadas, con poros del orden de 2-‐3 nm (Beck et al., 1992;

Coll, 2010; Kresge et al., 2012).

Una vez formada la matriz mesoporosa, se observa que en la superficie del sólido

permanecen defectos estructurales en forma de grupos silanol (Si-‐OH) los cuales

resultan de gran utilizad a la hora de funcionalizar las nanopartículas (figura 3).

Durante dicha funcionalización, los grupos silanoles son derivatizados mediante

reacciones de substitución nucleofílica con compuestos de tipo trialcoxisilano cuya

cadena alifática contiene el grupo funcional deseado para el recubrimiento de la

superficie (Mas-‐Font, 2010; Climent-‐Terol, 2012).

Figura 3. Representación esquemática de los grupos silanol presentes en la superficie del material

mesoporoso y la posterior reacción de sustitución nucleofílica alifática que tiene lugar en el proceso

de funcionalización de las nanopartículas (Climent-‐Terol, 2012)

El proceso de funcionalización que acabamos de describir puede realizarse durante la

síntesis del material mesopoproso, a lo cual se denomina co-‐condensación, o una vez

ella ha concluido (post-‐síntesis), dependiendo del grado de funcionalización que se

prenda obtener (Bernardos, 2010).

5.1 Propiedades de las nanopartículas mesoporosas de sílice

Primeramente, tienen un tamaño variable (50-‐300 nm), una porosidad homogénea y

un tamaño de poro regulable (2-‐10 nm) (Argyo et al., 2013). Adicionalmente, cabe

destacar la elevada estabilidad de su estructura tridimensional, así como la gran

Introducción

13

superficie específica (500-‐1000 m2/g) que muestran (Mamaeva et al., 2013).

Asimismo, tienen una apreciable inercia química y una alta capacidad de carga. Pero

sin duda, una de sus cualidades más importantes es la biocompatibilidad (Yang,

2012).

De acuerdo a lo detallado anteriormente, las nanopartículas de sílice mesoporosas

son capaces de albergar de manera eficiente especies de interés químico o biológico.

Sin embargo, para que estos soportes híbridos sean capaces de transportar y liberar

de manera controlada la materia contenida en sus poros, ha sido necesario hacer uso

de las denominadas “puertas nanoscópicas moleculares” las cuales describiremos a

continuación.

6. Puertas nanoscópicas moleculares

Hasta hace poco tiempo, la liberación del contenido de los mesoporos resultaba difícil

de manipular. Lo que quiere decir que la sustancia de interés se difundía de manera

espontánea, sin existir un control sobre la cantidad de materia liberada, ni sobre el

momento en que este evento se producía (Slowing et al., 2008).

Figura 4. Representación esquemática de la actividad de una puerta molecular de tipo reversible

(Climent-‐Terol, 2010)

Para dar solución a dicho inconveniente, se ha introducido el uso de las llamadas

puertas nanoscópicas moleculares. Estas estructuras son generalmente moléculas

orgánicas ancladas en la superficie del sólido mesoporoso. De esta manera, el

dispositivo nanoscópico tiene la capacidad de ocluir en sus poros la carga deseada de

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Introducción

14

manera reversible (figura 4). Esto implica que la puerta molecular permanecerá

cerrada únicamente hasta que el nanodispositivo sea sometido a un estímulo externo

capaz de inducir la apertura de la puerta y de esta manera, facilitar la liberación del

contenido de los poros (Mas Font, 2010).

El desarrollo de las puertas moleculares está estrechamente relacionado con la

aplicación de conceptos tanto de química molecular, como supramolecular (Coll,

2013). A diferencia de la química molecular (entendida como la química del enlace

covalente) la química supramolecular, se enfoca en el estudio de sistemas de

agregados moleculares o iones unidos mediante interacciones no covalentes

(electrostáticas, puentes de hidrógeno, fuerzas de van der Waals, puentes

intermoleculares entre otras). Esta disciplina científica, nace con la intención de imitar

la capacidad que tienen las macromoléculas biológicas para formar supramoléculas

mediante procesos de reconocimiento selectivo (Bernardos, 2010). Un ejemplo claro

de ello, es la capacidad que presentan tanto las proteínas como el ADN para

reconocer de manera selectiva a moléculas afines y unirse con ellas para formar

complejos más grandes involucrados en una serie de procesos bioquímicos (Climent-‐

Terol, 2012).

Aplicando estos conceptos al desarrollo de nanodispositivos de interés biomédico, se

consiguió la fabricación de soportes sólidos de tipo MCM-‐41, constituidos por una

fracción inorgánica de base silícea y una superficie externa funcionalizada con

moléculas orgánicas que presentan un comportamiento cooperativo funcional

(puerta molecular) capaces de encapsular diversas especies químicas en sus poros, las

cuales serán liberadas únicamente bajo estímulos externos específicos (Mas Font,

2010).

Los estímulos moleculares que se utilizan para lograr la apertura de la puerta pueden

ser cambios de pH (Chen et al., 2011; Casasús et al., 2004), temperatura (Yu et al.,

2014; Fu et al., 2003) o potencial redox (Slowing et al., 2007) así como, la presencia o

ausencia de proteínas (Oroval et al., 2013), enzimas de restricción (Zhang, 2013),

iones (Climent et al., 2010; Tan et al.,2012) o ácidos nucleicos (Climent et al., 2013).

Introducción

15

Dentro de los sistemas de liberación controlada, el empleo de ácidos nucleicos a

manera de puertas moleculares ha resultado de particular interés ya que, estas

moléculas presentan ventajas funcionales debido a su conformación tridimensional,

su especificidad a la hora del acoplamiento en doble hebra y su robusta estructura

físico-‐química. Cabe destacar, que la atención se ha centrado fundamentalmente en

las estructuras de ADN monocatenarias, bicatenarias y aptaméricas, así como en el

uso ARN y micro ARNs. Por efectos explicativos, el presente trabajo solo detallará el

uso de ADN como puerta molecular.

6.1 Uso de ADN como puerta molecular

A nivel científico el uso ADN se ha extendido en diversos campos de la

nanotecnología. En los últimos años, las investigaciones se han enfocado de manera

reiterada en la inmovilización de ADN en soportes sólidos. Dicha inmovilización puede

lograrse gracias a métodos de adsorción, a la formación de enlaces covalentes (Yu et

al., 2014) o al aprovechamiento de las cargas electrostáticas presentes en las

moléculas de ADN (Climent et al., 2013).

Existen estudios relativamente recientes que han permitido evidenciar que es posible

utilizar oligonucleótidos con la intención de identificar la presencia de

microorganismos bacterianos en una suspensión. En relación a ello, el grupo de

Martínez-‐Mañez en el año 2010, demuestra que al funcionalizar la superficie de un

sólido de tipo MCM-‐41 con grupos amino, el entorno de las nanopartículas adquiere

una carga parcialmente positiva, con lo cual es capaz de establecer interacciones

electrostáticas y de enlace hidrógeno con los oligonucleótidos.

Mediante este mecanismo, el grupo de investigadores logró comprobar que al

interactuar el soporte sólido con un oligonucleótido seleccionado, el colorante

(fluoresceína) queda encapsulado. Para revertir este proceso, es necesaria la

presencia de la cadena complementaria al ADN monocatenario inmovilizado. De

modo que al formar la doble hélice, exista un desplazamiento de la puerta molecular

y esto permita la liberación de la carga (colorante). El sistema descrito es sin duda

Introducción

16

atractivo. No obstante resulta bastante complejo, debido principalmente a lo

dificultoso que puede llegar a ser encontrar el equilibrio adecuado entre cargas

positivas y negativas en la superficie del sólido.

* * *

Como se ha visto a lo largo de este capítulo, aunque el desarrollo de nuevos sólidos

híbridos con función de puerta molecular es un tema de gran actualidad y rápido

avance, todavía se encuentra en una etapa primaria de desarrollo. Sin embargo, a lo

largo de los últimos años estas sofisticadas arquitecturas han demostrado ser

excelentes candidatas para el diseño de nanodispositivos encargados de la liberación

controlada de diversas especies a distintos niveles. Es así que, una aplicación

interesante para estos dispositivos es su incorporación en el campo del diagnóstico

específico de patógenos de interés clínico; en cuyo caso, el reconocimiento molecular

estaría acoplado a procesos de liberación controlada.

En el desarrollo de estas plataformas, la presencia del microorganismo que se

pretenda identificar, provocará el desplazamiento de la puerta molecular, lo que de

manera inmediata, dará lugar la liberación del indicador, el cual producirá una

respuesta óptica cuantificable.

Considerando lo anterior y debido a la problemática existente con respecto a la

detección de bacterias del género Mycoplasma haciendo uso de las técnicas

convencionales, se pensó en desarrollar un sistema sensor encargado de revelar la

presencia de estas bacterias de manera específica. Para llevar a cabo este propósito,

se pretende elaborar un nuevo soporte mesoporoso de tipo MCM-‐41 recubierto con

una puerta molecular oligonucleotídica, anclada mediante enlaces covalentes y capaz

de liberar la carga confinada en su interior únicamente en presencia del ADN

específico del género Mycoplasma; en cuyo caso, generará una señal detectable

mediante espectroscopia de fluorescencia la cual, permitirá diagnosticar la presencia

de este patógeno en la muestra analizada.

II. Objetivos

Objetivos

20

1. Diseñar, sintetizar y caracterizar un soporte nanoparticulado mesoporoso de

tipo MCM-‐41 que sirva para la detección específica de bacterias del género

Mycoplasma.

2. Estudiar la efectividad diagnóstica del sistema empleando ADN genómico de

Mycoplasma fermentans.

3. Identificar el límite de detección del nanodispositivo diseñado.

4. Comprobar la especificidad del sistema al evaluar la apertura de la puerta en

presencia de ADN interferente procedente de Candida albicans y Legionella

pneumophila.

5. Haciendo uso del nanodispositivo diseñado, analizar muestras clínicas de

esputo previamente diagnosticadas mediante PCR y comparar los resultados

obtenidos.

III. Materiales y Métodos

Materiales y métodos

24

1. Síntesis de los materiales MCM-‐41, S1-‐Rodamina, S1-‐Pneumo

1.1 Reactivos

Los reactivos tetraetilortosilicato (TEOS) 98%, hidróxido de sodio (≥98%), rodamina B,

bromuro n-‐cetiltrimetilamonio (CTABr) (≥99%), cloruro de magnesio hexahidratado

(MgCl2.6 H2O), α,α,α-‐Tris-‐(hidroximetil)-‐metilamina (Tris) (≥99%) y los

oligonucleótidos O1 (5'-‐[AmC6F]GACTACCAGGGTATC-‐3'), O2 (5´-‐

AAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTC-‐3´) y O3 (5-‐

GACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTT-‐3´) fueron adquiridos en la casa

comercial Sigma-‐Aldrich Química S.A.

1.2 Síntesis del material MCM-‐41

El soporte mesoporoso MCM-‐41 fue sintetizado siguiendo la el proceso denominado

“ruta de atranos” (figura 6). De acuerdo a lo estipulado en esta técnica, se utilizó

tetraetilortosilicato (TEOS) como precursor inorgánico y bromuro de

cetiltrimetilamonio (CTABr) como surfactante o template (Coll, 2013; Comes, 2005;

Kresge et al., 1992; Vallet-‐Regí et al., 2007).

Figura 5. Esquema de síntesis del material MCM-‐41 (Coll, 2010)

En el presente trabajo, el sólido fue sintetizado disolviendo 1.00 g (2.74 mmol) de

CTABr (bromuro den-‐hexadecil-‐trimetilamonio) en 480 mL de agua desionizada.


25

Posteriormente, se agregaron 3.5 mL de una disolución acuosa de NaOH 2.00 M. Todo

ello se agitó en una placa calefactora ajustando la temperatura a 80ºC.

Una vez alcanzada esta temperatura, se añadieron 5 mL (2.57 x 10-‐2 mol) de TEOS

(tetraetilortosilicato) por goteo. La mezcla se mantuvo en agitación durante 2 horas,

con lo cual se obtuvo la formación de un precipitado blanco. Inmediatamente, el

producto sólido obtenido por esta reacción, se centrifugó a 9500 rpm, durante 20

minutos; luego de lo cual, se lavó con agua desionizada hasta alcanzar un pH neutro.

Cuando se ha conseguido el pH adecuado, se secó el material en estufa a 60ºC por un

lapso de 24 horas, con el propósito de eliminar la humedad residual. Finalmente, el

sólido fue calcinado durante 5 horas en atmósfera oxidante a 550ºC (para eliminar el

CTABr). Sin el surfactante, los poros del sólido quedaron vacíos dando lugar al

material mesoporoso final (MCM-‐41).

1.3 Carga del material MCM-‐41 con Rodamina B (S1), hibridación de los

oligonucleótidos O1 y O2 y anclaje covalente del ADN a la superficie de las

nanopartículas (S1-‐O1-‐O2)

Una vez calcinado el sólido mesoporoso, se tomaron 209 mg del mismo y se

mezclaron con 74,6 mg de rodamina B (lo que corresponde a una relación 0,8 mmol

de colorante/g de MCM-‐41). También se agregaron 7 mL de acetonitrilo (25 mL de

acetonitrilo/gramo de sólido) y se dejó esta mezcla en agitación y temperatura

ambiente durante 24 horas. Para luego agregar 247,6 μL de 3-‐(trietoxisilil)propil

isocianato (TSPI) en una proporción de 5 mmol de colorante/g de MCM-‐41 (la función

de este grupo será modificar químicamente la superficie del sólido de modo que

facilite el posterior anclaje de la puerta molecular). Dicha suspensión se agitó durante

5 horas y media a temperatura ambiente. Una vez concluido este proceso, el sólido se

separó por centrifugación y se lavó con una disolución concentrada de rodamina B en

acetonitrilo. Finalmente, se secó en vacío durante 24 horas. Con fines explicativos, al

producto de este proceso se le ha denominado S1.


26

Figura 6. Estructura del colorante rodamina B utilizado para cargar el material mesoporoso MCM-‐41

El anclaje covalente de la puerta molecular de ADN a la superficie del sólido se llevó a

cabo mediante la reacción de formación de ureas descrita por el grupo de Tan et al.,

en el año 2012. El anclaje supuso que los grupos isocianato presentes en la superficie

del sólido, reaccionen con el extremo modificado del oligonucleótido O1 5'-‐

[AmC6F]GACTACCAGGGTATC-‐3' dando lugar a la formación de una urea y con ello, a

la incorporación del ADN a la matriz mesoporosa. Esto se llevó a cabo a través de una

serie de pasos consecutivos. Primeramente, 25 μL de una solución 100 μM del

oligonucleótido modificado O1 (5'-‐[AmC6F]GACTACCAGGGTATC-‐3'), y 25 μL de una

solución 100 μM de oligonucleótido O2 (5´-‐

AAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTC-‐3´) se colocaron en un tubo

eppendorf de 1.5 μL y se calentaron hasta alcanzar una temperatura de 95ºC, 5

minutos después, fueron enfriados progresivamente. Una vez alcanzados los 25ºC, los

oligonucleótidos fueron agregados a una solución previamente preparada que

contiene 1 mg de sólido, 50 μL de agua grado milli-‐Q , 700 μL de acetonitrilo anhidro y

2 μL de trietilamina (TEA). Esta suspensión se dejó reaccionar durante 18 horas a

temperatura ambiente y con agitación constante (1000 rpm). De modo que, el

oligonucleótido modificado sea capaz de anclarse de manera covalente a la superficie

del sólido MCM-‐41. Al cabo de las 18 horas, el sólido se lavó mediante centrifugación

a 12000 rpm por 2 minutos con tampón de hibridación (20 mM Tris, 35,5 mM MgCl2)


27

y se recuperó el precipitado (al cual llamaremos S1-‐O1-‐O2). El sólido recuperado fue

secado al vacío durante 4 horas y finalmente fue congelado para su posterior uso

(figura 8).

Figura 7. Esquema representativo del material MCM-‐41 bloqueado con los oligonucleótidos. La

estructuras del organosilano elegido para interaccionar con los oligonucleótidos, la estructura del

colorante (rodamina B) y las secuencias de oligonucleótidos utilizadas.

2. Caracterización de los materiales MCM-‐41, S1 y S1-‐O1-‐O2

Para caracterizar los materiales (MCM-‐41) preparados, se emplearon diversas

técnicas como la difracción de rayos X (DRX), análisis termogravimétrico (TG), análisis

elemental (AE), microscopía electrónica de transmisión (TEM) y adsorción-‐desorción

de N2. Adicionalmente, también se realizaron espectroscopias de fluorescencia

durante los ensayos de liberación.

La difracción de rayos X se utiliza con el propósito de confirmar la estructura de los

materiales sintetizados. Esto se logra al analizar las distancias interatómicas. Para tal

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Rodamina B


28

efecto, aproximadamente 200 mg de los sólidos preparados fueron molturados y

colocados en la bandeja de medición del equipo. El programa con el que se realizó la

medición utiliza ventanas a bajo ángulo (ventana de divergencia de 0,2 mm, ventana

de dispersión de 3mm y ventana del detector de 1mm). El análisis tuvo un tiempo de

duración de 11 minutos sin giro de la muestra.

Por otra parte, con ayuda de ensayos de microscopía de transmisión electrónica

(TEM) se logró observar la estructura microscópica de los materiales sintetizados. Las

imágenes obtenidas presentan diversas intensidades de gris, las cuales se

corresponden con el grado de dispersión de los electrones que han incidido sobre la

muestra. De esta manera se logra obtener una mayor resolución, lo que favorece la

observación de los materiales con respecto al microscopio convencional. Para el

ensayo se preparó una disolución de dicloroetano con una pequeña cantidad de cada

sólido. Una gota de esta suspensión se depositó sobre una rejilla de cobre recubierta

de 300 mallas de carbono y se procedió a la observación de resultados.

Adicionalmente, se realizaron un ensayos de porosimetría. En estos ensayos se

analizaron isotermas de adsorción – desorción de N2; ya que a partir de estas curvas,

se puede determinar el volumen, tamaño y distribución de los poros del material.

Para obtener esta información, las muestras fueron desgaseadas a 120ºC en vacío

overnight. Para calcular los valores concernientes al área de superficie específica, se

tomaron en cuenta los datos de adsorción en el rango de presiones menores

utilizando el modelo BET (Brunauer, 1938). Mientras que, el tamaño de poro fue

determinado siguiendo el método BJH (Barrett, 1951).

Los sólidos también fueron sometidos a análisis termogravimétricos (TG) con la

intención de conocer la cantidad de materia orgánica presente. Esta técnica mide la

variación de masa de un compuesto en función de la temperatura. Es importante

aclarar que las variaciones de temperatura no siempre implican un cambio en la masa

de la muestra; no obstante, existen cambios térmicos que sí se acompañan de

variaciones en la masa tales como la descomposición, sublimación, reducción,

desorción absorción y vaporización y estos cambios de peso pueden medirse


29

utilizando técnicas de termogravimetría (Bernardos, 2010). En nuestro caso, las

muestras se sometieron a una rampa de calentamiento de 10ºC por minuto,

partiendo desde los 25ºC hasta 1000ºC, manteniendo a continuación una isoterma a

1000ºC durante una hora. Todo esto se llevó a cabo en atmósfera de aire y crisoles de

alúmina.

Para completar las técnicas de caracterización de los materiales, se realizó un análisis

elemental (AE), el cual permite determinar el contenido de los compuestos

mayoritarios. Lo que quiere decir que, este análisis comprende el contenido de

nitrógeno, carbono e hidrógeno presentes en la muestra. La técnica está basada en la

completa e instantánea oxidación del analito, mediante combustión con oxígeno puro

a una temperatura aproximada de 1000ºC. A esta temperatura, los productos de

combustión (CO2, H2O y N2) son transportados mediante un gas portador (He) a través

de un tubo de reducción y después son selectivamente separados en columnas

específicas para finalizar siendo desorbidos térmicamente. En la última instancia de la

técnica, los gases pasan de forma separada por un detector de conductividad térmica

que proporciona una señal proporcional a la concentración de cada uno de los

componentes individuales de la muestra.

Finalmente, considerando que las nanopartículas se encuentran cargadas con

rodamina B (colorante), para realizar las mediciones referentes a los ensayos de

liberación, límites de detección, análisis de interferentes y pruebas con muestras

clínicas, se aplicaron análisis de fluorescencia. Esta técnica resulta particularmente

útil ya que permite identificar la cantidad de carga liberada (rodamina B) por la

nanopartícula en un lapso de tiempo determinado.

2.1 Equipos y condiciones de trabajo

Todos los procesos de caracterización mencionados en el apartado anterior se

realizaron en el Instituto de Reconocimiento Molecular y Desarrollo Tecnológico

(IDM) de la Universidad Politécnica de Valencia.


30

Los materiales que fueron sintetizados y caracterizados son los siguientes: MCM-‐41

sin calcinar, MCM-‐41 calcinada, MCM-‐41 calcinada, cargada con rodamina B y

funcionalizada con isocianatos (S1) y el material mesoporoso final S1-‐O1-‐O2.

La difracción de rayos X se consiguió utilizando un difractómetro Philips D8 Advance,

con radiación CuKα. Mientras que el análisis termogravimétrico se realizó en el equipo

TGA/SDTA 851e Mettler Toledo balance, empleando atmósfera oxidante (aire, 80

mL/min).

Por otra parte, el análisis elemental se realizó en un CE Instrument EA-‐1110 CHN

Elemental Analyzer. En lo que refiere a las imágenes de TEM, estas se obtuvieron a

través de un microscopio 100kV Jeol JEM-‐1010. Adicionalmente, se utilizó el equipo

Micromeritics ASAP2010 automated sorption analyser para obtener las isotermas de

adsorción–desorción de N2. Finalmente, se utilizó el equipo Felix 32 Analysis Version

1.2 (Build 56) PTI (Photon Technology International) para llevar a cabo las pruebas de

fluorescencia.

3. Ensayos de optimización del sólido

3.1 Cinética de liberación

Los ensayos de liberación se realizaron utilizando el material nanoparticulado cargado

con rodamina B (S1-‐O1-‐O2) suspendido en tampón de hibridación (20 mM Tris, 37,5

mM MgCl2) así como ADN genómico de Mycoplasma fermentans (analito).

El oligonucleótido O2 (hibridado en la superficie del sólido), fue seleccionado debido a

que se utiliza para la detección de micoplasma mediante técnicas de PCR. Esta

secuencia es capaz de amplificar una región de 280 pares de bases del ADN genómico

correspondiente a todas las especies del género Mycoplasma.

El protocolo utilizado consistió en calentar 100 μL de una solución que contenía 4000

copias de ADN genómico de M. fermentans durante 5 minutos a 95ºC para


31

posteriormente enfriarla a 0ºC durante 3 minutos, para deshibridar la doble hélice de

ADN. Una vez concluido el shock térmico, el ADN fue agregado a una solución que

contenía 100 μg de sólido suspendidos en 900 μL de tampón de hibridación (Tris-‐HCl)

(figura 9). Es necesario mencionar que el ensayo control se realizó bajo las mismas

condiciones sin embargo, en lugar de ADN se colocaron 100 μL de agua grado milli-‐Q.

Figura 8. Esquema representativo del proceso de apertura de la puerta molecular de ADN en el sólido

S1-‐O1-‐O2 utilizando como estímulo selectivo ADN genómico de Mycoplasma fermentans

Con la finalidad de cuantificar el colorante liberado, se retiraron alícuotas de 150 μL a

diversos tiempos (0, 15, 20, 30, 40, y 60 minutos). Estas muestras fueron

centrifugadas (2 minutos a 5000 rpm) y a partir del sobrenadante se midió la

fluorescencia de la rodamina B liberada. La medición se realizó a 576 nm (λex 555 nm).

Para evaluar la reproducibilidad de los resultados, el experimento se repitió en tres

ocasiones.

ADN genómico de Mycoplasma

ADN de Mycoplasma deshibridado

ADN modificado (O1) para anclaje en el sólido 5'-[AmC6F]GACTACCAGGGTATC-3'

ADN modificado O1 hibridado con oligonucleótido O2 (5´-AAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTC-3´)

Rodamina B


32

3.2 Ensayo de límites de detección

Para determinar el límite de detección de nuestro sistema, se siguió un protocolo que

consistía de dos partes. En la primera, se prepararon 10 suspensiones con diferentes

cantidades de ADN de Mycoplasma fermentans (concentraciones comprendidas

desde 1 copia de ADN por microlitro hasta 2x104 copias de ADN por microlitro) y

extrajeron 120 μL de cada una de estas soluciones. Al ser necesario que el ADN esté

deshibridado para conseguir el adecuado funcionamiento del sistema, se calentaron

las muestras de ADN a 95ºC durante 5 minutos y luego fueron enfriadas durante 3

minutos en hielo. En el segundo paso del protocolo, se colocaron 200 μg del sólido en

400 μL de Tris. De esta dilución se sacaron varias alícuotas de 30 μL que fueron

añadidas una a cada una de las diversas soluciones de ADN. La suspensión final se

mantuvo durante 30 minutos en agitación constante (1000 rpm) a temperatura

ambiente y luego fue centrifugada durante 2 minutos a 5000 rpm. El sobrenadante de

este proceso fue analizado utilizando espectroscopia fluorescencia. Dichos análisis se

llevaron a cabo a 576 nm (λexc 555 nm), para determinar la cantidad de rodamina B

liberada por cada sólido.

3.3 Ensayo con ADN interferente

Con la finalidad de definir la selectividad de nuestro sistema, se realizó una prueba

con ADN interferente de los microorganismos Legionella pneumophila y Candida

albicans. Al igual que en el apartado anterior, se dividió el protocolo en dos partes.

En la primera, se extrajeron 120 μL de disoluciones de Mycoplasma fermentans,

Legionella pneumophila y Candida albicans que contenían 1000 copias de ADN por

microlitro. Para realizar el ensayo fue necesario deshibridar la doble hélice de ADN y

para conseguirlo, se calentaron las muestras a 95ºC durante 5 minutos.

Posteriormente, las soluciones de ADN fueron enfriadas durante 3 minutos en hielo.

Al igual que en el apartado anterior, el segundo paso del protocolo, consistió diluir

200 μg del sólido S1-‐O1-‐O2 en 400 μL de Tris. De esta dilución se sacaron alícuotas de

60 μL las cuales fueron añadidas a las soluciones de ADN. La disolución final se

mantuvo durante 30 minutos en agitación constante (1000 rpm) a temperatura


33

ambiente y luego fue centrifugada durante 2 minutos a 5000 rpm. El sobrenadante de

este proceso fue analizado mediante técnicas de fluorescencia. Dichos análisis se

efectuaron a 576 nm (λexc 555 nm), para determinar la cantidad de rodamina B

liberada por cada sólido. Para evaluar la reproducibilidad de los resultados, el

experimento se repitió en tres ocasiones.

3.4 Ensayo con muestras clínicas

Para identificar la capacidad diagnóstica del sistema se realizó una prueba con ADN

de muestras clínicas de pacientes con neumonía, para lo que también se dividió el

protocolo en dos partes. En la primera, se extrajeron 1,2 μL de una solución de ADN

proveniente de una muestra clínica y se agregó el volumen correspondiente de

tampón hasta completar 120 μL. Para realizar el ensayo fue necesario deshibridar la

doble hélice de ADN y para conseguirlo, se calentaron las muestras a 95ºC durante 5

minutos. Posteriormente, las soluciones de ADN fueron enfriadas durante 3 minutos

en hielo. El segundo paso del protocolo, consistió diluir 200 μg del sólido S1-‐O1-‐O2 en

400 μL de Tris. De esta dilución se sacaron alícuotas de 60 μL las cuales fueron

añadidas a las soluciones de ADN (muestras clínicas) previamente preparadas. La

disolución final se mantuvo durante 30 minutos en agitación constante (1000 rpm) a

temperatura ambiente y luego fue centrifugada durante 2 minutos a 5000 rpm. El

sobrenadante de este proceso fue analizado mediante técnicas de fluorescencia.

Dichos análisis se efectuaron a 576 nm (λexc 555 nm), para determinar la cantidad de

rodamina B liberada por cada sólido.

IV. Resultados y discusión

Resultados y discusión

37

1. Síntesis y caracterización de los materiales mesoporosos

1.1 Diseño del sistema

El diseño que propone este trabajo comprende la realización de un sólido

mesoporoso de tipo MCM-‐41 cargado con el colorante rodamina B, funcionalizado en

su superficie con isocianatos y tapizado con dos hebras de ADN una de las cuales se

anclará covalentemente a las MSN.

Por efectos prácticos, el sólido de tipo MCM-‐41 funcionalizado con isocianatos y

cargado con rodamina B será denominado S1 y este mismo sólido después del anclaje

de la puerta molecular se denominará S1-‐O1-‐O2.

Para empezar, los oligonucleótidos O1 (5'-‐[AmC6F]GACTACCAGGGTATC-‐3') y O2 (5´-‐

AAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTC-‐3´) deben entrar en contacto

formando una doble hélice estable (O1-‐O2). Una vez conseguido este propósito, el

ADN (O1-‐O2) se ha de juntarse con el S1. De modo que, los isocianatos presentes en

el sólido reaccionen con el extremo modificado en 5´de O1 permitiendo el anclaje

covalente de la doble hélice O1-‐O2 en la superficie de las nanopartículas mediante la

formación de ureas. A través de esta reacción, se espera que el ADN (O1-‐O2) cubra

los poros del sólido evitando la salida del colorante (Figura 10).

En este diseño, el oligonucleótido O2 cumple una doble función. Primeramente, se

encarga de bloquear la salida de la carga al cubrir los poros de la nanopartícula pero

además, está encargado de mediar las interacciones supramoleculares necesarias

para la posterior liberación selectiva del colorante.

La tercera y última etapa de funcionamiento del sistema, consiste en el

reconocimiento del estímulo. Para ello, el nanodispositivo S1-‐O1-‐O2 se pone en

contacto con una suspensión ADN genómico desnaturalizado (analito). Si el ADN

corresponde al género Mycoplasma, el oligonucleótido O2 de la puerta molecular,

estará en capacidad de identificarlo. Como se puede ver en la figura 10, el evento de


38

reconocimiento comprende la deshibridación del complejo O1-‐O2 ya que O2, tenderá

formar una unión estable con su hebra complementaria presente en el analito. De

acuerdo a lo esperado, esto provocará el desplazamiento de la puerta molecular, la

apertura de los poros y la liberación del colorante encapsulado (figura 10).

Figura 9. Representación esquemática del mecanismo de acción del nanodispositivo

1.2 Caracterización de los materiales

Con la finalidad de constatar la correcta síntesis del nanodispositivo, se procedió a

verificar la estructura química del mismo y su adecuado funcionamiento.

1.2.1 Estudios de difracción de rayos X

Estos estudios fueron realizados para comprobar la síntesis adecuada de los

materiales. Los difractogramas que pueden observarse en la figura 11, han sido

obtenidos para los sólidos a) MCM-‐41 sin calcinar, b) MCM-‐41 calcinada y c) el sólido

funcionalizado con isocianatos y cargado con rodamina. Como se observa en el

difractograma, la MCM-‐41 sin calcinar (curva a) muestra las 4 reflexiones típicas de

los sólidos de tipo MCM-‐41 correspondientes a los planos de difracción (100), (110),

(200) y (210). Estos picos aparecen aproximadamente a los 2; 3,5; 4,2 y 5,7 grados

respectivamente. Entre todos los picos, el (100) cuenta con una mayor intensidad y es

la huella característica de este tipo de materiales. Por tanto, su aparecimiento


39

confirma la síntesis adecuada de la matriz MCM-‐41 (Coll, 2010). Por otra parte, la

curva b) muestra el difractograma de la MCM-‐41 calcinada. En esta imagen podemos

ver el desplazamiento del pico (100) correspondiente a una contracción de la celda

aproximadamente de 5 Å, lo cual ocurre de manera normal durante el proceso de

calcinación debido a la condensación de grupos silanol. Por último, en la curva c) de la

figura 11, se observa el difractograma del nanodispositivo funcionalizado con

isocianatos. Como se puede ver, la intensidad del pico (100) no ha sido modificada

durante la síntesis del material. Lo que implica que las nanopartículas no han sufrido

modificaciones sustanciales en su configuración en los procesos de funcionalización y

cargado. Esto nos permite inferir que la síntesis material híbrido es estructuralmente

exitosa.

Figura 10. Difractogramas de rayos X. Se muestran los patrones de difracción de la matriz MCM-‐41

sin calcinar (a), tras el proceso de calcinación (b) y del solido híbrido S1 (calcinado, cargado con

rodamina B y funcionalizado con isocianatos) (c)

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40

1.2.2 Estudios de microscopía electrónica de transmisión (TEM)

Mediante estos análisis se pudo observar la morfología del material. Como se muestra

en la figura 12 a), las nanopartículas son esféricas, con diámetros comprendidos

entre 80 y 100 nm. Además se pueden ver los canales típicos de la matriz MCM-‐41.

Estos canales se observan como redes blancas y negras alternadas formando poros

hexagonales. Adicionalmente, se puede constatar en la figura 12 b) que en las

nanopartículas después del proceso de funcionalización, no existe ningún cambio

estructural. Ellas continúan siendo esféricas, con bordes y mesoporos bien definidos.

Figura 11. Imágenes de TEM. a) matriz inorgánica del sólido MCM-‐41 después del proceso de

calcinación y b) matriz inorgánica del sólido MCM-‐41 final (sólido S1)

100 nm

a)

100 nm

b)


41

1.2.3 Estudios de adsorción – desorción de N2

Estos análisis permitieron determinar una distribución uniforme del tamaño de los

poros. Se constató que el tamaño medio de los poros es de 2.40 nms. Para deducir

este valor se utilizó el modelo BJH (Barrett, 1951). En la figura 13, se pueden observar

las isotermas de adsorción (A) desorción (B) de N2 de la MCM-‐41 calcinada (a) y del

sólido final cargado y funcionalizado (b).

Figura 12. A. Isotermas de adsorción de N2. a) Material mesoporoso MCM-‐41 calcinado y b) Sólido

S1. B. Isotermas de desorción de N2. a) Material mesoporoso MCM-‐41 calcinado y b) Sólido S1.

0

200

400

600

800

1.000

1.200

1.400

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2

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1 2345(/6785(

8,&+.9'(,&#):;)(/8<8"5(

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0

200

400

600

800

1000

1200

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A

B

$"#


42

Las gráficas de adsorción desorción de N2 presentan el volumen de gas adsorbido en

cm3 por gramo de adsorbato frente a la presión relativa (P/Po, donde Po es la presión

de saturación). En los materiales de tipo MCM-‐41, es habitual encontrar isotermas de

tipo IV. Es importante notar que en estas isotermas, el proceso de adsorción se

relaciona con la condensación del nitrógeno en el interior de los poros por capilaridad

como consecuencia de la adsorción en multicapa.

En la figura 13, la isoterma de adsorción (A) – desorción (B) de la fase calcinada de la

MCM-‐41 (a) muestra el comportamiento característico de los materiales

mesoporosos que consiste en un salto pronunciado a valores de presión intermedia

(0,1<P/Po<0,4) debido a la condensación del nitrógeno dentro de los poros. Para este

caso en particular, los valores se observaron entre 0,2 y 0,4 de P/Po. Por otra parte, la

ausencia de histéresis en este intervalo y la forma de la curva sugieren la existencia de

mesoporos uniformes y cilíndricos. Además, también se observa un proceso de

adsorción de nitrógeno a presiones elevadas (P/Po >0.8) debido a la porosidad textual

presente entre las nanopartículas del material.

Todos los mencionados eventos se repiten, aunque en menor proporción en el sólido

S1 (b) y esto se debe a que el volumen de nitrógeno capaz ingresar en este material,

dependerá de lo vacíos que estén sus poros. Por consiguiente, de acuerdo a la figura

12 A, el volumen de N2 adsorbido por la MCM-‐41 calcinada y vacía (a) es mayor al

volumen de N2 adsorbido sólido cargado con colorante (b), tal como se esperaba.

Dicho evento se corrobora en la gráfica de desorción (figura 12 B). No obstante

también es importante agregar que, aún cuando el sólido S1 muestra una menor

adsorción de N2, la nanopartícula aún permite un ligero flujo del gas (N2). Esto tiene

lugar, porque los poros no se han cerrado completamente puesto que la puerta

molecular aún no ha sido colocada.

Los valores específicos de la superficie, volúmenes de poro y tamaño de los mismos

para ambos sólidos están recogidos en la tabla 2. Aplicando el modelo BET y

utilizando el fragmento inicial de la curva, se puede calcular el área superficial del

sólido, puesto que en esta región los poros se comportan igual que en la superficie


43

externa (Brunauer, et al., 1938). Por otra parte, mediante el modelo descrito por

Barret, Joyner y Helenda (BJH), se calculó el volumen de poro y su distribución,

partiendo de la región de la isoterma en donde inicia la desviación (Muniesa,2013).

De acuerdo a lo esperado, los valores de área de superficie y volumen de poro de la

MCM-‐41 calcinada fueron mayores a los observados en el sólido S1 (tabla 2). Como se

había mencionado anteriormente, esto se justifica porque los poros del material S1,

están llenos de colorante y por tanto, su capacidad para adsorber N2 disminuye.

Tabla 2. Valores específicos del área de superficie aplicando el modelo BET así como el volumen de

poro y el tamaño del mismo aplicando el modelo BJH. Valores determinados a partir de las isotermas

de adsorción – desorción de N2

Área de superficie

(m2g-‐1)

Volumen del mesoporo

(cm3 g-‐1)

Diámetro del

mesoporo (nm)

MCM-‐41 1228,2 0,93 2,40

S1 524,9 0,34 2,40

Una vez obtenidos estos resultados, podemos decir que el material presenta la

estructura mesoporosa adecuada y que el proceso de carga se llevó a cabo de manera

correcta.

1.2.4 Análisis elemental y termogravimétrico

Mediante estos dos estudios se puedo conocer el contenido de rodamina B y de

isocianatos presentes en el sólido funcionalizado. Las determinantes se llevaron a

cabo a partir de los contenidos de carbono, hidrógeno y nitrógeno obtenidos a través

del análisis elemental. Como se puede ver en la tabla 3, la carga de rodamina B es de

0,358 mmol/g de sílice. En cuanto al contenido de isocianatos, se observó una

concentración de 0,469 mmoles/g de sílice.


44

Tabla 3. Contenido de Rodamina B e isocianatos en mmoles por gramo de MCM-‐41 funcionalizada

(sólido S1)

Adicionalmente, se realizó un análisis termogravimétrico. Esta técnica se basa en un

tratamiento térmico e la muestra. Al calentar la muestra sufre una pérdida progresiva

de masa y esta pérdida está directamente relacionada con su naturaleza química.

Figura 13. Termograma del sólido S1

En este ensayo, el primer salto observado en la figura 14, corresponde a la pérdida de

los disolventes, el segundo tiene que ver con la pérdida de materia orgánica y

finalmente el tercero, se debe a la condensación de los silanoles en la superficie del

material. Es así que, del análisis termogravimétrico del sólido híbrido S1, podemos

deducir el contenido de materia orgánica presente en la muestra corresponde a 0,21

gramos de m. orgánica por gramo de sólido. Este valor resulta muy próximo al

obtenido mediante el análisis elemental en donde se calculan 0,26 gramos de m.

orgánica por gramo de sólido. Por tanto, existe una correlación entre los dos análisis y

el contenido de materia orgánica en el sólido S1 está comprendido en el rango de

0,21 a 0,26 gramos de m. orgánica por g de sólido.

Rodamina B

(mmol g-‐1SiO2)

Isocianatos

(mmol g-‐1SiO2)

S1 0,358 0,469


45

Una vez concluidos los procesos de caracterización del nanodispositivo, es preciso

señalar que el material sintetizado cuenta con las características deseadas. Los

procesos de carga y funcionalización se han realizado preservando tanto el tamaño,

como la estructura típica de las matrices MCM-‐41 por lo que se puede señalar que, la

síntesis se ha llevado a cabo de la manera correcta.

2. Cinética de liberación del sólido final S1-‐O1-‐O2

Este ensayo se realizó con el objetivo de estudiar el perfil de liberación del

nanodispositivo sintetizado, así como para corroborar su especificidad. Para estudiar

la liberación diferencial de la carga, se contrastó el comportamiento del sólido en

presencia/ausencia de Mycoplasma fermentans. Los datos fueron evaluados en

función al incremento de fluorescencia con respecto al tiempo.

Figura 14. Porcentaje de colorante liberado medido a 576 nm (λex 555 nm) en ausencia (a) y

presencia (b) de ADN de Mycoplasma fermentans.

De acuerdo a los resultados mostrados por la figura 14, el sólido en ausencia de

Mycoplasma fermentans presenta una liberación insignificante de rodamina B a lo

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b)

a)


46

largo del tiempo (curva a). La baja señal que es capaz de emitir el blanco puede

deberse a una mínima liberación inespecífica. En contraposición, el nanodispositivo

diseñado y caracterizado S1-‐O1-‐O2, en presencia del ADN genómico de Mycoplasma

fermentans, presenta una liberación de rodamina B superior al 90% del contenido del

sólido (curva b) a los 30 minutos de iniciado el ensayo. Este efecto debe

corresponderse con el desplazamiento de la puerta molecular. Dicho desplazamiento

es consecuencia del apareamiento de las bases complementarias de la hebra

presente en el sólido (O2) con el analito disuelto en el tampón (ADN genómico de

Mycoplasma fermentans). Lo cual da lugar a que los poros de las nanopartículas sean

desobstruidos y como resultado de ello, se produzca la salida del colorante cuya

fluorescencia fue cuantificada a 576 nm (λex 555 nm).

3. Ensayo de límites de detección

El grado de liberación del sólido también se estudió en relación a la cantidad de

Mycoplasma presente en el analito. Para conseguir esto, se prepararon distintas

muestras con cantidades variables (número de copias) de ADN de la bacteria

Mycoplasma fermentans. Estas suspensiones fueron incubadas durante 30 minutos

con el sólido S1-‐O1-‐O2. Posteriormente, se registró la cantidad de rodamina B

liberada mediante técnicas de fluorescencia (medición a los 576 nm, λex 555 nm).

Como se puede ver en la figura 15 (a), el sistema es sensible al incremento del

número de copias de ADN disueltas, pero la detección no es constante a lo largo del

experimento. Tal como se observa, en la porción inicial de la curva (figura 15 a) existe

una sección prácticamente plana, lo cual supone que el nanodispositivo no detecta la

presencia de ADN. No obstante, a partir de un determinado número de copias, la

emisión de fluorescencia empieza a incrementar. El momento puntual en el cual el

sistema reacciona ante el estímulo por primera vez, puede determinarse

gráficamente. Para ello se obtienen las ecuaciones que corresponden a las rectas de

regresión logarítmica de las dos fracciones que componen la curva de calibrado

(figura 15 b). Posteriormente, se igualan dichas ecuaciones obteniendo que el punto

en el que ambas rectas convergen es el límite de detección del sistema (LOD). Para el


47

caso que nos ocupa, este valor corresponde aproximadamente a 70 copias de M.

fermentans μL-‐1.

Figura 15. Porcentaje de colorante liberado en función del número de copias de ADN genómico de

Mycoplasma fermentans medido a los 30 minutos de incubación a 25ºC a 576 nm (λexc 555 nm)

4. Ensayo con ADN interferente

Con la intención de identificar la selectividad del nanodispositivo, se realizaron

pruebas con otros patógenos que podrían interferir en la señal de apertura de la

puerta. Para esto se utilizaron condiciones de liberación iguales a las del apartado

anterior. Los agentes estudiados además de M. fermentans fueron Legionella

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

8 80 800 8000

Inte

nsid

ad d

e flu

ores

cenc

ia (U

.A.)

y = 0,3567ln(x) - 1,3455 R! = 0,97781

y = 0,0744ln(x) - 0,1479 R! = 0,91104

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

8 80 800 8000

Inte

nsid

ad d

e flu

ores

cenc

ia (U

.A.)

a)

b)


48

pneumophila y Candida albicans. Ambos microorganismos han sido seleccionados por

ser agentes infecciosos comunes en muestras clínicas donde se encuentra presente

Mycoplasma.

Figura 16. Porcentaje de colorante liberado medido a 576 nm (λex 555 nm) en presencia (de izquierda

a derecha) de Tris-‐HCl (blanco), ADN genómico de Mycoplasma fermentans, mezcla de Mycoplasma

fermentans + Candida albicans + Legionella pneumophila, ADN genómico de Legionella

pneumophila, ADN genómico de Candida albicans y mezcla de Candida albicans + Legionella

pneumophila

Con fines experimentales, se estudiaron tanto muestras puras de ADN de

Mycoplasma fermentans, Legionella pneumophila y Candida albicans por separado,

como combinaciones de dichos microorganismos. Para el efecto se realizaron dos

mezclas, una de ellas contiene cantidades equivalentes de ADN de Legionella

pneumophila y Cándida albicans y la otra, cantidades equivalentes de ADN de los tres

microorganismos (Mycoplasma fermentans, Legionella pneumophila y Candida

albicans).

Como se puede constatar en la figura 16, el sistema diseñado es capaz de identificar

de manera diferencial la presencia de ADN de bacterias de tipo Mycoplasma en

solución y emitir una señal cuantificable. De acuerdo a estos resultados, cuando

Mycoplasma hace parte de una mezcla de microorganismos, la cantidad de carga

liberada disminuye ligeramente con respecto a la señal emitida por el sistema cuando

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(*234546*


49

el analito contiene únicamente ADN de M. fermentans; no obstante, el

nanodispositivo continúa detectando el patógeno. En contraste, cuando la solución a

examinarse contiene Legionella pneumophila, Candida albicans o ambas, el sistema

muestra una liberación basal exigua, prácticamente igual a la emitida por el blanco

(Tris-‐HCl). Esta liberación residual se considera mínima y puede ser atribuida a una

difusión inespecífica de la rodamina B.

5. Ensayo con muestras clínicas

Para evaluar el potencial diagnóstico del sistema diseñado, se decidió enfrentar las

nanopartículas (S1-‐O1-‐O2) a muestras clínicas de pacientes previamente

diagnosticados con neumonía (mediante PCR). Para lograr este objetivo, se contó con

la colaboración del Hospital Universitario Germans Tials i Pujol (Barcelona). Haciendo

uso de la reacción en cadena de la polimerasa, se comprobó que dos de las cuatro

muestras eran positivas para Mycoplasma, mientras que las otras dos eran negativas

(tabla 4).

Tabla 4. Presencia/ausencia de bacterias del género Mycoplasma pneumoniae en muestras de

esputo de pacientes con neumonía evaluadas mediante PCR

Como se puede observar en la figura 17, se evaluaron en el ensayo las cuatro

muestras clínicas mencionadas, más un control positivo (Mycoplasma fermentans) y

blanco (Tris-‐HCl). Tal como se esperaba, una vez finalizado el proceso de análisis con

el nanodispositivo diseñado (S1-‐O1-‐O2), se comprobó que la fluorescencia emitida

Muestra clínica

Resultados del análisis de la

muestra

Presencia de Mycoplasma en la

muestra según PCR

Muestra clínica 1 Si

Muestra clínica 2 Si

Muestra clínica 3 No

Muestra clínica 4 No


50

tanto por el control positivo (Mycoplasma fermentans) como por las muestras clínicas

1 y 2, son significativamente mayores a las señales generadas por las muestras

clínicas 3 y 4, lo cual se corresponde con los datos obtenidos mediante PCR (tabla 4).

Esto permite confirmar que el sistema elaborado es sensible y que permite

monitorear la presencia/ausencia de bacterias del género Mycoplasma en muestras

clínicas de manera eficiente, rápida y con un bajo nivel de complejidad para el

manejo.

Aún cuando hasta el momento se ha comprobado que el sistema cuenta con las

características de diseño y funcionamiento adecuadas, es preciso que esta plataforma

diagnóstica sea utilizada para analizar un mayor número de muestras clínicas, de

modo que se pueda corroborar su precisión.

Figura 17. Porcentaje de colorante liberado medido a 576 nm (λex 555 nm) en presencia (de izquierda

a derecha) de ADN genómico de Mycoplasma fermentans, muestras clínicas 1 y 2 (pacientes

positivos según PCR para Mycoplasma), muestras clínicas 3 y 4 (pacientes negativos según PCR para

Mycoplasma) y Tris-‐HCl (blanco)

Tal como se señaló en la sección introductoria y como hemos observado a lo largo de

este trabajo, las MSNs son matrices muy atractivas para la construcción de sistemas

sensores debido a la facilidad de síntesis y funcionalización con moléculas orgánicas.

Mediante este estudio de manera particular, se ha logrado demostrar la capacidad

que tienen estas plataformas para convertirse en potentes herramientas diagnósticas

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

Mycoplasma fermentans

Muestra clínica 1 Muestra clínica 2 Muestra clínica 3 Muestra clínica 4 Blanco

Inte

nsid

ad d

e flu

ores

cenc

ia (

U.A

.)


51

de bajo coste y elevada sensibilidad. En este sentido, el sistema elaborado podría

utilizarse para identificar tanto microorganismos patógenos de difícil aislamiento y/o

crecimiento, como microorganismos examinados de manera rutinaria dentro de la

microbiología clínica.

Por otra parte, debemos agregar que a pesar del interés que la nanomedicina

despierta en términos de diagnóstico clínico, aún existen muchas dudas en cuanto a la

facilidad que estos sistemas puedan tener para competir con las estrategias

moleculares vigentes. Para solventar estas interrogantes en lo que respecta al

presente trabajo, sería necesario evaluar los nanosensores diseñados con un mayor

número de muestras clínicas con la intención de testar la competitividad que ofrecen

estas nuevas plataformas diagnósticas frente al uso de PCR, PCR en tiempo real,

inmunoensayos, entre otros.

Adicionalmente, quisiéramos señalar que aunque este trabajo se ha enfocado en el

desarrollo de un sistema diagnóstico específico para bacterias del género

Mycoplasma, el mismo diseño descrito puede ser empleado para la identificación de

otros microorganismos. Esto demuestra que la plataforma elaborada tienen una

posibilidad de uso mucho mayor a la detallada a lo largo del este estudio. En este

sentido, queda abierta una interesante posibilidad para dar continuidad a la presente

investigación.

V. Conclusiones

55

A partir del análisis de los resultados obtenidos se pueden extraer las siguientes

conclusiones:

1. El diagnóstico microbiológico de las infecciones causadas por micoplasmas se ha

visto limitado por las dificultades que conlleva el cultivo de estas bacterias y

consecuentemente, la ausencia de procedimientos de diagnóstico rápidos y

confiables ha propiciado que se subestime la importancia clínica de estos

microorganismos. Por ello, generar alternativas diagnósticas que permitan

identificar de manera rápida y selectiva estos microorganismos constituye un tema

prioritario dentro de la salud pública.

2. A lo largo de este estudio, hemos diseñado, sintetizado y caracterizado de manera

exitosa un nuevo nanodispositivo capaz de detectar selectivamente la presencia

ADN bacteriano procedente del género Mycoplasma. Esto se ha llevado a cabo

utilizando nanopartículas mesoporosas de sílice de tipo MCM-‐41 como soporte

inorgánico y funcionalizadas en su superficie con isocianatos. Las nanopartículas

albergan el colorante rodamina B en su interior y en la superficie se encuentran los

oligonucleótidos O1 y O2 actuando como puertas moleculares.

3. Mediante diversos ensayos se ha comprobado que el desplazamiento de la puerta

molecular está asociado únicamente al reconocimiento del ADN de bacterias del

género Mycoplasma en disolución, lo que convierte a este sistema en un poderoso

detector de la presencia/ausencia de patógenos teniendo límites de detección tan

bajos como 70 copias de ADN μL-‐1.

4. Es importante agregar que el sistema generado mediante la presente

investigación, es una plataforma de diagnóstico rápida, la cual en 30 minutos es

capaz de ofrecer un resultado acertado. Además, el sistema diseñado es sencillo de

manejar. No obstante, sería fundamental realizar un mayor número de pruebas de

contraste en las que se enfrente esta tecnología con el resto de plataformas

diagnósticas existentes en el mercado de modo que se evalúe la real posibilidad

56

que tienen estos nanodispositivos para incorporarse en la investigación

traslacional.

5. El sistema diseñado ha probado tener efectividad para el diagnóstico de bacterias

del género Mycoplasma. No obstante, debido a la alta versatilidad de la

metodología, esta plataforma diagnóstica puede ser modificada de manera sencilla

para identificar otro tipo de patógenos.

VI. Bibliografía

Bibliografía

60

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Isabel Baroja TFM

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