LEMUS VARELA MARIA DE LOURDES -...
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UNIVERSIDAD DE COLIMA FACULTAD DE MEDICINA TRATAMIENTO FARMACOLÓGICO PRENATAL EN UN MODELO EXPERIMENTAL DE HERNIA DIAFRAGMÁTICA CONGÉNITA Para obtener el grado de Doctor en Ciencias Médicas PRESENTA M. en C. María de Lourdes Lemus Varela ASESOR BÁSICO Dr. en C. Guillermo M. Zúñiga González Centro de Investigación Biomédica de Occidente Instituto Mexicano del Seguro Social ASESOR CLÍNICO Dr. en C. Valery Melnikov Universidad de Colima Colima, Colima, enero del 2009
Transcript of LEMUS VARELA MARIA DE LOURDES -...
UNIVERSIDAD DE COLIMA
FACULTAD DE MEDICINA
TRATAMIENTO FARMACOLÓGICO PRENATAL EN UN MODELO
EXPERIMENTAL DE HERNIA DIAFRAGMÁTICA CONGÉNITA
Para obtener el grado de
Doctor en Ciencias Médicas
PRESENTA
M. en C. María de Lourdes Lemus Varela
ASESOR BÁSICO
Dr. en C. Guillermo M. Zúñiga González
Centro de Investigación Biomédica de Occidente
Instituto Mexicano del Seguro Social
ASESOR CLÍNICO
Dr. en C. Valery Melnikov
Universidad de Colima
Colima, Colima, enero del 2009
II
III
AGRADECIMIENTOS
Al Doctorado en Ciencias Médicas
Universidad de Colima
Al Laboratorio de Mutagénesis
Centro de Investigación Biomédica de Occidente
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT)
Becario número: 219418
Al Instituto Mexicano del Seguro Social
Al Fondo de Fomento a la Investigación (FOFOI)
Financiamiento Institucional: 2006/1A/I/031
Al Miami Children’s Hospital & Sheridan Health Corporation
Grants 2007 y 2008
Al Ing. Rogelio Troyo Sanromán
Coordinador de Bioinformática, División de Disciplinas Básicas
Centro Universitario de Ciencias de la Salud, Universidad de Guadalajara
A los colaboradores
Dra. en C. Belinda Gómez Meda
Dra. en C. Ana Lourdes Zamora Perez
M. en C. Juan Manuel Ornelas Aguirre
M. E. Amed Soliz
IV
PRODUCTOS GENERADOS
Distinciones
El presente trabajo fue presentado en formato oral el 20 de septiembre del 2008, en el
V Congreso Iberoamericano de Neonatología – SIBEN y obtuvo el segundo lugar en la
categoría de trabajos experimentales.
Premio: Segundo lugar en trabajos experimentales en un Congreso
Internacional.
V
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
Resumen del V Congreso Anual SIBEN ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
Greetings!
Hace pocos días finalizó el V Congreso anual de SIBEN en Mar del Plata, Argentina.
Es un placer como presidente de la Junta compartir una síntesis de algunos sucesos de trascendencia ocurridos en el mismo: El esfuerzo del grupo organizador ha sido recompensado en creces por la convocatoria lograda: el número alcanzado de 1490 asistentes inscriptos, representando a 30 países, superó nuestras expectativas.
Fueron presentados y discutidos 171 trabajos científicos: 47 en forma oral, y el resto en pósters. Autores de nueve de estos trabajos fueron premiados por SIBEN:
Primer y segundo premio al mejor trabajo experimental: Dra. Marta Rogido (USA) y Dra. María de Lourdes Lemus Varela (México) respectivamente; premio a la mejor presentación oral: Dr. Dan Waisman (Israel); primer y segundo premio al mejor trabajo clínico epidemiológico: Dra. Galviz Clara (Colombia) y Dr. Gustavo Rivara Dávila (Perú) respectivamente; Premio al mejor trabajo en sesión oral de póster: Dra. Lucrecia Bossi (Argentina); primer y segundo premio póster: Dr. José Rodríguez Pérez (Brasil) y Dra. Verónica Favareto (Argentina) y premio para mejor diseño póster Dra. Yolanda Pérez Saldeño (España).
SIBEN se enriqueció con dos nuevos miembros de honor. Durante este Congreso recibieron el reconocimiento por sus trayectorias y aportes a la neonatología, los profesores Enzo Dueñas de Cuba y Roderic Phibbs de USA.
Este año se realizó la reunión de Consenso Clínico en relación a Manejo Hemodinámico en el Recién Nacido. En el mismo hubo 45 participantes de 17 países. Se trabajó en la idea de elaborar en consenso una guía y recomendaciones de todos los temas de relevancia clínica relacionados a hemodinamia neonatal para luego publicarlo y darle amplia difusión en el futuro.
Con base en reuniones anuales previas, este Congreso ha resultado en el continuo crecimiento de nuestra Sociedad. Como presidente de la Junta me enorgullezco en compartir este logro que es de todos.
Un saludo muy cordial, con gratitud
Dr Augusto Sola Presidente de SIBEN Octubre 2008.
VI
Presentación en formato cartel en el XIV Foro de Investigación en Salud del Instituto
Mexicano del Seguro Social, que se llevo a cabo del 28 al 30 de mayo del 2008 en
Bahía de San Carlos, Sonora.
Constancia de presentación en el XIV Foro Norte IMS S, Bahía de San Carlos,
Sonora.
VII
Presentación en el Congreso Internacional de Investigación Pediátrica: Pediatric
Academic Societies & Society for Pediatric Research, que se llevó a cabo del 2 al 6 de
mayo del 2008 en Honolulu, Hawaii, USA. Se presentó en formato cartel el 5 de mayo:
Author Listing for "Lemus-Varela"
[5848.7] Antenatal Pharmacology Treatment in Rats with Congenital Diaphragmatic Hernia
Authors: Lourdes M. Lemus-Varela, Belinda C. Gomez-Meda, Ana L. Zamora-Perez, Jose M. Ornelas-Aguirre, Barry Chandler, Soliz Amed, Valery Melnikov, Guillermo M. Zuniga-Gonzalez. First author is a Ph.D student.
Date: Monday, May 5, 2008
Session Info: Poster Session: Neonatology (3:00 PM - 6:45 PM)
Presentation Time: 03:00 PM
Room: Halls A-C
Board Number: 682
VIII
ÍNDICE
Página
RESUMEN 1
SUMMARY 2
INTRODUCCIÓN 3
♦ Prevalencia y etiología 4
♦ Embriología y patogénesis 5
♦ Diagnóstico prenatal 9
♦ Pronóstico 10
♦ Terapeútica fetal 11
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 16
JUSTIFICACIÓN 18
OBJETIVOS 20
HIPÓTESIS 21
MATERIAL Y MÉTODOS 22
♦ Diseño del estudio y modelo experimental 22
♦ Intervención farmacológica prenatal 22
♦ Cesárea y preparación de tejido pulmonar 23
♦ Evaluación patológica 24
♦ Cálculo de muestra 26
♦ Consideraciones éticas y análisis estadístico 28
♦ Operacionalización de variables 29
RESULTADOS 30
DISCUSIÓN 44
CONCLUSIONES 48
PERSPECTIVAS 49
ANEXOS 51
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 55
IX
ÍNDICE DE CUADROS Y FIGURAS
CUADROS
Página
Cuadro 1. Etapas de desarrollo pulmonar. 8
Cuadro 2. Relación peso bloque cardiopulmonar/peso corporal
y dimensiones pulmonares en grupo control negativo (placebo)
y grupo control positivo (nitrofén).
31
Cuadro 3. Relación pared/luz arterial grupo 2 ó nitrofén versus
grupo 3 ó nitrofén + sildenafil.
36
Cuadro 4. Fibrosis intersticial en el grupo 2 ó nitrofén versus
grupo 4 ó nitrofén + bosentán.
38
Cuadro 5. Relación pared/luz arterial grupo 2 ó nitrofén versus
grupo 5 ó nitrofén + sildenafil + bosentán.
40
FIGURAS
Figura 1. Esquematización de la Hernia Diafragmática
Congénita.
3
Figura 2. Etapas sucesivas del desarrollo del tabique
traqueoesofágico.
5
Figura 3. Remodelación vascular pulmonar. 7
Figura 4. Diagnóstico prenatal de Hernia Diafragmática
Congénita.
9
Figura 5. Oclusión traqueal endoluminal fetal. 12
Figura 6. Fotografías representativas de la metodología. 23
Figura 7. Fotografías representativas de hipoplasia pulmonar. 30
X
Figura 8. Espesor de la pared arterial en el grupo control
negativo o placebo y control positivo o nitrofén.
32
Figura 9. Conteo alveolar radial en el grupo control negativo o
placebo y grupo control positivo o nitrofén.
33
Figura 10. Bronquiolos terminales en grupo control negativo o
placebo y control positivo o nitrofén.
34
Figura 11. Espesor de la pared arterial en grupo 2 ó nitrofén
versus grupo 3 ó nitrofén + sildenafil.
35
Figura 12. Bronquiolos terminales en el grupo 2 ó nitrofén
versus grupo 4 ó nitrofén + bosentán.
37
Figura 13. Bronquiolos terminales en el grupo 2 ó nitrofén
versus grupo 5 ó nitrofén + sildenafil + bosentán.
38
Figura 14. Espesor de la pared arterial en grupo 2 ó nitrofén
versus grupo 5 ó nitrofén + sildenafil + bosentán.
39
Figura 15. Conteo alveolar radial en los grupos de estudio. 41
Figura 16. Intersepto linear medio en los grupos de estudio. 42
1
RESUMEN
Titulo. Tratamiento farmacológico prenatal en un modelo experimental de Hernia
Diafragmática Congénita (HDC).
Introducción. La hipoplasia pulmonar y la Hipertensión Pulmonar Persistente, son
los principales factores que limitan la sobrevida en la HDC.
Objetivo. Determinar si la administración prenatal de sildenafil y/o bosentán, atenúa
la remodelación vascular, promueve ramificación bronquial y favorece la
alveologénesis en un modelo experimental de HDC.
Material y Métodos. Estudio experimental, aleatorizado y cegado. Mediante la
administración de nitrofén a ratas Wistar gestantes, se indujo HDC en las crías, las
ratas gestantes se distribuyeron en 5 grupos al azar: 1) control; 2) nitrofén; 3)
nitrofén+sildenafil; 4) nitrofén+bosentán y 5) nitrofén+sildenafil+bosentán. En el día
postconcepcional (DPC) 9 se administró, mediante sonda orogástrica, 100 mg de
nitrofén para inducir HDC, mientras que el sildenafil a 100 mg/Kg/día y el bosentán a
30 mg/Kg/día, se administraron vía oral en los DPC 16 a 20.
Resultados. Las crías que desarrollaron HDC presentaron grave hipoplasia
pulmonar (relación peso bloque cardiopulmonar/peso corporal: 0.0261±0.0028 contra
0.0393±0.0054 en los controles) (p=0.0001); el grupo 3 (sildenafil) mostró
disminución significativa en la muscularización vascular (3.2±0.75µ contra 4.5±0.67µ
del grupo 2: nitrofén) (p=0.001), consecuentemente mejoró la relación pared/luz
arterial (p=0.03). En el grupo 4 (bosentán) se encontró incremento significativo
(p=0.002) de bronquiolos terminales (12.9±3.4 contra 8.2±1.7 del grupo 2: nitrofén).
Igualmente, en el grupo 5 (nitrofén+sildenafil+bosentán), se encontró incremento
significativo en los bronquiolos terminales (13.5±2.2 contra 8.2±1.7 del grupo 2)
(p=0.0001) y disminución en el espesor de la pared arterial.
Conclusiones. El tratamiento prenatal con sildenafil atenúa la remodelación
vascular, mientras que el bosentán promueve el desarrollo de bronquiolos terminales,
en HDC inducida por nitrofén.
2
SUMMARY
Title. Antenatal pharmacology treatment in rats with Congenital Diafhragmatic Hernia
(CDH).
Background. Lung hipoplasia, Pulmonary Persistent Hypertension of the Newborn
and it´s morphological changes are the main features in CDH, pathology with high
morbility and mortality.
Objective. To determine if antenatal sildenafil and/or bosentan attenuates vascular
remodeling, promotes branching and improve alveologenesis, in experimental CDH.
Design/Methods. Experimental trial randomized and blinded. Nitrofen (100 mg) was
gavaged to pregnant rats at day post-conception (DPC) 9, to induce CDH and were
randomized to 5 groups: 1) control; 2) nitrofen; 3) nitrofen+sildenafil 100 mg/Kg/day
DPC 16 to 20; 4) nitrofen+bosentan 30mg/Kg/day, DPC 16 to 20 and 5)
nitrofen+bosentan+sildenafil, the same doses and administration days.
Results. The offspring with CDH was characterized by severe lung hypoplasia (lung
weight to body weight ratio: 0.0261±0.0028 in nitrofen group versus 0.0393±0.0054 in
controls (p=0.0001). In nitrofen+sildenafil group, decreased pulmonary arterial wall
thickness, 3.2±0.75µ versus 4.5±0.67µ in nitrofen group (p=0.02). Nitrofen+bosentan
group increased terminal bronchioles 12.9±3.4 versus 8.2±1.7 in nitrofen group
(p=0.002). Nitrofen+sildenafil+bosentán group, showed significant differences
(p=0.0001) in terminal bronchioles, 13.5±2.2 contra 8.2±1.7 in nitrofen group, also
decresead pulmonary arterial wall thickness.
Conclusion. Antenatal treatment with sildenafil attenuates vascular remodeling,
bosentan promotes terminal bronchioles development in experimental CDH in rats.
3
INTRODUCCIÓN
La Hernia Diafragmática Congénita (HDC) es una de las malformaciones más graves,
es consecuencia del desarrollo anormal del diafragma fetal, lo cual permite que las
vísceras abdominales invadan la cavidad torácica e interfieran con el adecuado
desarrollo pulmonar (Figura 1), principalmente produce hipoplasia pulmonar que se
caracteriza por disminución en el número de vías aéreas, acompañada de
disminución también en el número de vasos, con incremento en la adventicia y media
de la pared de los mismos lo cual resulta en Hipertensión Pulmonar Persistente,
muchas veces intratable, esto explica la elevada morbilidad y mortalidad que se
asocian a esta grave patología 1-3.
Figura 1. Esquematización de la Hernia Diafragmátic a Congénita
Figura 1A: Se muestra situación anatómica anormal del intestino delgado en cavidad
torácica, lo cual interrumpe el correcto desarrollo pulmonar (hipoplasia pulmonar); 1B: se
observa en la radiografía póstero-anterior de tórax, presencia de asas intestinales dentro de
cavidad tóracica y evidente rechazo pulmonar y de estructuras mediastinales.
Tomado de: 1A: Sucheston & Cannon. Congenital Malformations. Davis Co., Philadelphia.
1973. 1B: archivo fotográfico personal.
A B Hernia Diafragmática Congénita
4
Prevalencia y Etiología
La HDC ocurre en 1 de 2,500 nacidos vivos 4 y afecta aproximadamente a 1,100
recién nacidos por año en Estados Unidos de Norteamérica 5. La etiología de la HDC
es pobremente comprendida, si bien es una condición que se presenta usualmente
de manera esporádica, en 5 a 10 % de los casos es posible documentar etiología
cromosómica, especialmente aneuploidías y alrededor del 50% de los fetos
afectados se asocian con otras anormalidades cromosómicas no pulmonares,
principalmente trisomía 18, trisomía 13, Síndrome Pallister-Killian, tetrasomía 12p por
mosaicismo, además pueden presentarse otras alteraciones como defectos
craneoespinales, cardiopatías y otros síndromes, tales como el Síndrome de Fryns,
Síndrome de Lange y Síndrome de Marfan 6-8.
Reportes recientes de la literatura informan que el Sistema Retinoide está
involucrado en la etiología de la HDC 9, ya que se han encontrado niveles
plasmáticos significativamente bajos de retinol en madres cuyos recién nacidos
presentaron HDC, comparativamente con aquellas madres de recién nacidos sanos.
Aparentemente se debe a disminución en la expresión de la enzima _iogénicos_ada-
2-retinal, necesaria para convertir el retinaldehído en ácido retinoico, el cual
desempeña un papel importante en el desarrollo del precursor diafragmático
conocido como pliegue pleuroperitoneal 10.
Se ha descrito que la interrupción en la señalización del ácido retinoico, durante el
desarrollo embriológico temprano, ocasiona anormalidades graves en el tracto
respiratorio, incluida la agenesia pulmonar; estudios previos sugieren que podría
deberse a falla selectiva para inducir crecimiento de fibroblastos, se ha demostrado
disminución en la expresión del factor 10 de crecimiento de fibroblastos, (Fgf-10, por
sus siglas en inglés: Fibroblast growth factor-10), en el área de las células del
intestino anterior, que al invaginarse dará lugar a una pequeña yema de tejido
endodérmico, a partir de la cual se formaran los pulmones 11.
Ackerman y su grupo han establecido que una mutación en el gen Fog2 (por sus
siglas en inglés: Friend of gata 2) causa anormalidades en el desarrollo diafragmático
y pulmones pequeños, tanto en humano como en modelo experimental 12.
5
Embriología y Patogénesis
El desarrollo embriológico del diafragma se completa en la semana 9 de gestación,
en presencia de alteraciones en este desarrollo, la herniación de las vísceras
abdominales ocurre entre las 10 y 12 semanas de gestación, cuando el intestino
normalmente debe retornar a la cavidad abdominal. El desarrollo embriológico del
diafragma y del pulmón está interrelacionado. El epitelio del pulmón y de la vía aérea,
se desarrolla originalmente como dos brotes pequeños de células intestinales
endodérmicamente derivadas, mientras que el resto del intestino se separa
longitudinalmente en esófago y tráquea (Tabique traqueoesofágico) 13 (Figura 2).
Figura 2. Etapas sucesivas del desarrollo del tabiq ue traqueoesofágico.
Figura 2A, B y C: Muestran vistas laterales de la parte caudal de la faringe primitiva, se
observa el divertículo laringotraqueal y la división del intestino anterior en el tubo esofágico y
laringotraqueal. 2D, E y F: Cortes transversales que ilustran la formación del tabique
traqueoesofágico y la separación del intestino anterior en tubo laringotraqueal y esófago.
Tomado de: Moore & Persaud. Embriología Clínica. 7ª ed. Mc Graw Hill Philadelphia. 2004.
6
La morfogénesis bronquial está en coordinación con el desarrollo vascular, inicia con
una estructura que semeja las ramas de un árbol, de componentes tubulares
epiteliales, que se forma y diferencia para producir las vías aéreas y los alvéolos; en
la regulación de estados iniciales de desarrollo pulmonar se han implicado al Fgf-10,
proteínas morfogenéticas óseas, ácido retinoico y varios factores de transcripción 14.
El diafragma se integra por la fusión del septum transverso, de las membranas
pleuroperitoneales apareadas, del mesénquima que se presenta adyacente al
esófago y del crecimiento hacia adentro de músculos de la pared corporal. Se
proponía que defectos en la fusión de estos cuatro componentes, daban lugar al
defecto diafragmático. Babiuk y su grupo utilizaron marcadores inmunohistoquímicos
de los precursores del músculo, en conjunto con ratones mutantes para examinar la
embriogénesis diafragma-frénico, y encontraron que las células y axones _iogénicos
se unen dentro del pliegue pleuroperitoneal y se expanden para formar el
componente neuromuscular del diafragma 15.
El modelo experimental de HDC ampliamente desarrollado en ratas, resultó
solamente en defectos en la formación de este sustrato de mesénquima en el pliegue
pleuroperitoneal. La relación entre el diafragma en desarrollo y el pulmón ha sido
tema de intenso esfuerzo del laboratorio, una de las principales preguntas es: ¿Cual
aparece primero, el defecto diafragmático o la hipoplasia pulmonar? 15.
En el humano, el árbol bronquial se ha desarrollado completamente a la semana 16
de gestación, pero los alvéolos continúan desarrollándose aún después del
nacimiento e incrementan tanto en número como en tamaño hasta que el crecimiento
de la caja torácica se completa en la edad adulta. El desarrollo de los vasos que
irrigan estas estructuras acinares (vasos intra-acinares) se lleva a cabo en forma
paralela y secuenciada, así como el crecimiento de los vasos preacinares sigue el
desarrollo de las vías aéreas 16.
La HDC se caracteriza por acompañarse de graves cambios morfológicos y
estructurales pulmonares: existe marcada reducción en vías aéreas, alvéolos y
vasos, tanto en humanos como en modelo experimental con HDC, se observa
número reducido en las generaciones de vías aéreas, los alvéolos son pocos y tienen
engrosamiento del septum o pared, existe arquitectura anormal de los acinos
7
respiratorios e incremento de tejido intersticial. Consecuentemente, disminución
grave de los espacios aéreos y del área de superficie del intercambio gaseoso.
Paralelo a estos cambios en vías aéreas, la vasculatura pulmonar se afecta
considerablemente, muestra número reducido de arterias pulmonares por unidad de
volumen pulmonar y dichas arterias pulmonares presentan engrosamiento de la
adventicia e hiperplasia de la capa media, es decir remodelación vascular, que es el
punto cardinal de la Hipertensión Pulmonar Persistente (Figura 3), las arterias
intrapulmonares son excesivamente muscularizadas, sobre todo periféricamente y en
el nivel bajo de las pequeñas arteriolas intra-acinares. Ambos pulmones están
afectados, pero mayormente el ipsilateral 17-21.
Figura 3. Remodelación vascular pulmonar.
Figura 3: Fotografía de microscopia electrónica que muestra gran engrosamiento del espesor
de la pared arterial pulmonar, se observa un trombo dentro de la luz vascular.
Tomada de: archivo fotográfico de el Dr. Guillermo Gutiérrez Calleros.
8
Existen varias teorías acerca de la patogénesis del defecto diafragmático, tales como
el daño primario del pulmón ipsilateral o alteraciones en la inervación diafragmática
(nervio frénico) 22 y anormalidad en el cierre del canal pleuroperitoneal 23.
Se comenta además una hipótesis de “doble golpe” de acuerdo a la cual, el primer
daño afecta la morfogénesis bronquial del pulmón previo al desarrollo diafragmático y
un segundo daño es la compresión pulmonar debido a un desarrollo diafragmático
alterado que permite la herniación de vísceras abdominales 24,25.
Los eventos de crecimiento y desarrollo antenatal pulmonar, se dividen en cinco
etapas (Cuadro 1), cada una de ellas, es el resultado de complejos eventos
estrechamente regulados por factores genéticos, hormonales, físicos y ambientales.
El líquido fetal pulmonar y los movimientos respiratorios fetales, representan los
principales determinantes del desarrollo pulmonar 26.
Cuadro 1. Etapas de desarrollo pulmonar
Etapa Tiempo Eventos
Embriónica 0-7 semanas Formación de yemas pulmonares, traquea
y bronquios.
Pseudoglandular 7 a 17 semanas Formación de vías aéreas de conducción,
red vascular y diferenciación de células.
Canalicular 17 a 27 semanas Inicio de acinos y bronquiolos, formación
de barrera alveolo/capilar.
Sacular 28 a 36 semanas División de vías aéreas, incremento en la
superficie de intercambio gaseoso.
Alveolar 36 semanas a 8 años Desarrollo alveolar marcado, con doble
red capilar.
9
Diagnóstico Prenatal
En los últimos años la habilidad para diagnosticar prenatalmente la HDC ha mejorado
notablemente y gracias al apoyo tecnológico, actualmente es posible por medio de
ultrasonografía bidimensional, tridimensional, tetradimensional 27 y/o imágenes de
resonancia magnética, documentar HDC a edades gestacionales realmente
tempranas (Figura 4), con lo cual se presentan oportunidades de intervenciones
terapéuticas prenatales, así como la posibilidad de derivar a la madre a un centro de
tercer nivel de atención, que cuente con las diferentes modalidades terapéuticas
propuestas para la atención del recién nacido con HDC, sin embargo, esto no ha
representado impacto en la elevada mortalidad que se asocia a esta patología 28-31.
Prenatalmente el diafragma se observa por ultrasonografía como un espacio
hipoecogénico entre el tórax y el abdomen. La HDC puede ser diagnosticada al
observar ultrasonográficamente el estómago, el intestino y/o el hígado dentro del
tórax, asociado a desviación mediastinal hacia el lado contralateral. Cerca del 75%
de los casos cursan con polihidramnios, usualmente después de las 25 semanas de
gestación, a consecuencia de la compresión esofágica fetal por los órganos
abdominales herniados. El principal diagnóstico diferencial de la HDC es con
Enfermedad Quística Pulmonar 32.
Figura 4. Diagnóstico prenatal de Hernia Diafragmát ica Congénita
Figura 4A: Ecosonograma fetal a las 30 semanas de edad gestacional, hacia la derecha
extremidad cefálica (EC), la línea punteada señala el diafragma, por encima del mismo, en
EC
A B
10
cavidad torácica se ubica anormalmente el estómago (E), a su lado el corazón (C) en la parte
inferior y como referencia la vejiga (V); Figura 4B: imagen de resonancia magnética sagital
(T2-WI) a las 25 semanas de edad gestacional, que muestra herniación del hígado a la
cavidad torácica (Li).
Tomadas de: 4A; archivo fotográfico personal. 4B: Cannie M. Eur Radial. 2008; 18: 1364-
1374.
Pronóstico
La HDC es una de las patologías congénitas que representa un gran reto en la
Unidad de Cuidados Intensivos Neonatales (UCIN) y no obstante los avances
médicos, tecnológicos y manejo agresivo multidisciplinario, la mortalidad en estos
neonatos permanece elevada, pues en forma general se reporta del 50% y aquellos
que sobreviven frecuentemente presentan severa morbilidad neurologica, respiratoria
y/o digestiva 33.
La sobrevida postnatal en HDC es baja en aquellos pacientes con otras
malformaciones asociadas, es a menudo letal en el período neonatal temprano y en
recién nacidos con HDC aislada (sin otras malformaciones agregadas), la sobrevida
se reporta entre el 50 y 70% en centros de atención de tercer nivel especializados 34,35.
Algunas series reportan sobrevida hasta de 80%, sin embargo, la mortalidad prenatal
o neonatal temprana es excluida en esta casuística 36,37.
El principal predictor prenatal pronóstico es la presencia de malformaciones
agregadas que pueden ser diagnosticadas por ultrasonografía o por cariotipo fetal.
En los pacientes con HDC aislada, esencialmente depende del grado de compresión
pulmonar por las vísceras abdominales herniadas, los datos muestran que la
mortalidad es sustancialmente elevada si el hígado está herniado en tórax 38. Muchos
factores pronóstico basados en ultrasonido bidimensional convencional han sido
evaluados, como la relación ventrículo izquierdo y derecho 39, relación diámetro
pulmonar y circunferencia torácica 40, volumen de líquido amniótico y posición de
estómago y mediastino 41. Otros autores han propuesto escalas de pronóstico que
incluyen peso al nacer, calificación de Apgar e índice de McGoon, el cual evalúa la
relación entre los diámetros de la arteria pulmonar y la aorta descendente, de tal
11
forma que por separado, el peso inferior a 2,755 g e índice de McGoon superior a
1.25, predice mortalidad del 80% (sensibilidad: 70 y 73% y especificidad 74 y 78%,
respectivamente) 42.
Se han propuesto además como factores pronóstico las mediciones de los diámetros
de arterias pulmonares 43 ó ultrasonido Doppler para medir flujo de las mismas 44.
La medición ultrasonográfica de la relación área pulmonar y circunferencia cefálica
ha sido el método más extensamente explorado como predictor antenatal de la
severidad de la hipoplasia pulmonar en los casos de HDC 45, de tal manera que una
relación área pulmonar, circunferencia cefálica de 1.6 ó mayor, predice mortalidad
del 80%, medida entre 22 y 28 semanas de edad gestacional 38,46.
Recientemente como se comento previamente, se han introducido el ultrasonido
tridimensional y tetradimensional, así como las imágenes por resonancia magnética,
y es posible que con estas técnicas la evaluación del área pulmonar sea más exacta 47,48.
Terapéutica fetal
La corrección antenatal del defecto favorece el crecimiento pulmonar y
consecuentemente el pronóstico; varios intentos de reparación anatómica se han
realizado por medio de cirugía in utero (cirugía fetal), en las décadas de los años
ochenta y noventa 49,50, pero han sido abandonados por la elevada invasión materno-
fetal, no es aplicable en casos con herniación intratorácica hepática (grupo de alta
mortalidad postnatal) y porque en ensayos clínicos aleatorizados la sobrevida no fue
mayor que en aquellos pacientes manejados convencionalmente en la etapa
postnatal, con lo cual éticamente fue cuestionado severamente 51,52.
Existe un abordaje de terapia fetal en HDC menos invasivo y promisorio, la oclusión
temporal de la traquea fetal, la racionalización de esta terapia se deriva de los
hallazgos en el Síndrome de Obstrucción Congénita de Vías Aéreas, el cual se
asocia a excesivo crecimiento pulmonar. En estudios con modelo experimental se ha
demostrado que la oclusión traqueal evita la salida de líquido pulmonar, lo que
conduce a estiramiento pulmonar y crecimiento acelerado de vías aéreas pulmonares
y vasos pulmonares 53. La oclusión traqueal endoluminal fetal percutánea, se ha
12
considerado como una terapia fetal mínimamente invasiva, que permite la colocación
de un balón entre la semana 26 y 28 de gestación a través de una incisión en el
vientre materno de 3.3 mm 54 (Figura 5), sin embargo, el grupo de Seph A, informó
que este procedimiento no mejora la sobrevida ni la morbilidad 55.
Figura 5. Oclusión traqueal endoluminal fetal
Figura 5: Se esquematiza el procedimiento de oclusión traqueal endoluminal fetal
percutánea, guiados por ecosonografía fetal.
Tomada de: Done E. Prenat Diagn. 2008; 28: 581-591.
Existen informes de resultados preliminares alentadores de oclusión traqueal
endoscópica por fetoscopía percutánea, sin embargo, los criterios de selección y el
tiempo de oclusión traqueal permanecen inciertos 56,57.
Se han propuesto también intervenciones farmacológicas prenatales, entre las que
destaca la vitamina A, de importancia fundamental para el desarrollo pulmonar.
Existen informes acerca de la administración prenatal de vitamina A en modelo
experimental de HDC, lo cual promueve crecimiento pulmonar y además disminuye
la incidencia de esta patología 58-61. La administración antenatal de glucocorticoides
mejora la distensibilidad pulmonar y oxigenación arterial en corderos con HDC
sometidos a oclusión traqueal 62. Otros autores han descrito que la administración
13
prenatal de dexametasona promueve cambios estructurales pulmonares positivos y
mejora la sobrevida 63-64.
Estudios recientes informan que la administración antenatalmente de tetrandrine
mejora el crecimiento pulmonar y la remodelación vascular, cuyo mecanismo
aparentemente se debe a la disminución en la expresión del factor de crecimiento
epidérmico y de la endotelina-1 (ET-1) 65,56.
La endotelina es uno de los más potentes vasocontrictores que actúa también como
agente promitogénico y con actividad broncopulmonar. La endotelina actúa
directamente sobre receptores específicos: ET-A y ET-B. Se han descrito niveles
plasmáticos elevados de ET-1 en ocho recién nacidos con HDC comparados con 15
controles o recién nacidos sanos, además ellos establecieron correlación directa
entre los niveles plasmáticos de ET-1, Hipertensión Pulmonar Persistente y
sobrevida a las 48 h de edad postnatal y sugirieron a partir de entonces que la ET-1
es un importante mediador involucrado en la fisiopatología de la HDC 67.
Se ha documentado elevada expresión de ET-1 también en modelo experimental de
HDC, 68,69. La ET-1, potencializa el efecto de mitógenos, como el factor de
crecimiento epidérmico en las células del músculo liso de las vías aéreas de los
humanos y han encontrado que al administrar antagonistas selectivos de la ET-A se
inhibe la proliferación de estas células 70.
Con base en las propiedades biológicas específicas de la ET-1, como regulación en
el tono vasomotor, proliferación de músculo liso vascular, fibrosis, hipertrofia
cardiaca, vascular e inflamación, se han desarrollado recientemente fármacos
antagonistas de los receptores ET-A y ET-B como el bosentán que bloquea
completamente sus propiedades, por lo que serían agentes terapéuticos potenciales
en pacientes con HDC 71.
La forma más eficaz de bloquear el sistema ET-1 es con la administración de
antagonistas de ambos receptores ET-A y ET-B, el bosentán un fármaco oralmente
activo, antagonista dual o mixto de estos receptores, se ha utilizado a razón de 30
mg/Kg/día, con éxito en pacientes pediátricos con Hipertensión Arterial Pulmonar 72,73, y se ha observado que moderan significativamente los cambios morfológicos
vasculares 74,75.
14
En 1996 Boolell y colaboradores 76,77, describieron el uso del original y altamente
selectivo inhibidor de la fosfodiesterasa-5 (PDE-5, por sus siglas en inglés): sildenafil,
para el tratamiento de disfunción eréctil en varones. Este vasodilatador ha sido
utilizado recientemente como alternativa terapéutica para dilatar la vasculatura
pulmonar, ya que ofrece pocos o nulos efectos adversos sistémicos 78.
El citrato de sildenafil, potente, selectivo y altamente especifico inhibidor de la PDE-5,
da lugar a elevación en los niveles del segundo mensajero del óxido nítrico
endógeno, el monofosfato de guanosina cíclico (GMPc), que a través de la proteína
cinasa G incrementa la apertura de canales de potasio, lo cual conduce a la
relajación de la vasculatura pulmonar 79-82.
Se ha demostrado en modelo experimental que el sildenafil incrementa la densidad
capilar pulmonar, preserva el crecimiento alveolar, promueve angiogénesis pulmonar
y en general facilita el desarrollo pulmonar 83.
Aunque el bosentán no es un antagonista selectivo, ya que bloquea ambos
receptores (ET-A y ET-B), es un agente candidato para ser administrado durante la
gestación para bloquear el sistema endotelina, lo cual podría ejercer una acción
benéfica en la fisiopatología de la HDC, al igual que el sildenafil, potente inhibidor de
la PDE-5, con lo cual se promueve acumulación del GMPc en las células del músculo
liso 84.
El modelo experimental de HDC más estudiado, validado y citado, es en rata
mediante la administración vía oral de nitrofén (2,4-diclorofenil-p-nitrofénil éter), que
ejerce efecto teratogénico cuando se administra a ratas gestantes entre los 9 y 11
días de gestación y da lugar a HDC en descendientes. Keijzer y colaboradores han
demostrado que el nitrofén produce efecto directo negativo sobre el pulmón en
desarrollo, debido a que interfiere con la morfogénesis de ramificación e interrumpe
la diferenciación y proliferación de células epiteliales en pulmones de las ratas
expuestas 85.
La embriotoxicidad del herbicida nitrofén en las ratas se ha descrito desde hace más
de tres décadas. Los cambios vasculares pulmonares en este modelo son
fuertemente compatibles a los encontrados en neonatos humanos con HDC, por lo
cual se ha utilizado ampliamente como modelo experimental idóneo para investigar
15
los cambios morfológicos, bioquímicos y fisiopatogénicos que suceden en la HDC,
así como para buscar alternativas terapéuticas para esta grave patología 86.
En este modelo experimental de HDC se ha demostrado que la hipoplasia pulmonar
resulta de un proceso dinámico complejo, asociado a determinantes gestacionales
tempranos y tardíos, los tempranos aparentemente son secundarios a disturbios
moleculares con base en factores genéticos y ambientales que afectan
predominantemente la etapa pseudoglandular de desarrollo pulmonar (ramificación) y
los determinantes tardíos se relacionan a la compresión mecánica secundaria a la
herniación de vísceras abdominales a la cavidad torácica, lo cual afecta
esencialmente el período canalicular, sacular y alveolar del desarrollo pulmonar 4.
El mecanismo de acción fundamental del nitrofén radica en la inhibición de la
deshidrogenasa-2 retinal, enzima necesaria para convertir el retinaldehído en ácido
retinoico el cual participa en el desarrollo del diafragma fetal. Estos datos apoyan la
hipótesis de que las alteraciones en el sistema retinoide están involucradas en la
etiología de HDC 87.
16
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
La HDC resulta de falla en el cierre del canal pleuroperitoneal in utero, que sucede
entre la semana 8 y 10 de la gestación. El contenido intra-abdomial herniado dentro
de la cavidad torácica, conduce no solamente a desarrollo hipoplásico pulmonar
ipsilateral, sino también a desarrollo y función anormal cardiaca y del pulmón
contralateral. El 85% de las HDC se presentan del lado izquierdo y se caracterizan
por presentar un defecto posterolateral diafragmático. La HDC ocasiona riesgos
substanciales en morbilidad y mortalidad, se informa que entre 50 y 60% de los
recién nacidos con HDC fallecen en el período neonatal inmediato y los
sobrevivientes a menudo presentan alteraciones cardiopulmonares y neurológicas a
lo largo de su vida 88, 89.
Los neonatos con HDC fallecen principalmente por hipoplasia pulmonar e
Hipertensión Pulmonar Persistente secundaria, sin embargo, cabe mencionar que los
defectos cardiacos concomitantes contribuyen en la mortalidad de una subpoblación
de recién nacidos con HDC 21. La importancia del desarrollo vascular anormal o
remodelación vascular, como fundamental determinante en la sobrevida de los
pacientes con HDC, ha sido investigada y se han encontrado anormalidades en los
vasos pulmonares tanto de modelos experimentales como en recién nacidos con
HDC, principalmente engrosamiento de la pared de los vasos pulmonares y
muscularización de las arterias pequeñas peribronquiales, uno de los factores que
influye en el desarrollo vascular es el factor de crecimiento vascular endotelial, cuya
expresión se ha encontrado disminuida en pulmones hipoplásicos 19, 90.
En neonatos con HDC se ha demostrado reducción considerable en el número de
alvéolos y en el volumen pulmonar, lo cual se ha asociado a elevada presión parcial
de bióxido de carbono en sangre arterial (PaCO2), hipoxemia, acidosis y la necesidad
de soporte ventilatorio alto. La hipoplasia pulmonar se asocia no solamente con
crecimiento y desarrollo estructural anormal de las vías aéreas y unidades
respiratorias o alvéolos, sino también con crecimiento y desarrollo alterado de la
vasculatura pulmonar. Se ha demostrado que la disminución en la distensibilidad
17
pulmonar es explicada por la hipoplasia pulmonar y no por deficiencia en la
producción o liberación de surfactante 20.
La mayor parte de los estudios en relación a esta patología se han enfocado a
diferentes modalidades terapéuticas, tanto prenatales como postnatales, de estas
últimas, la ventilación convencional gentil, la ventilación de alta frecuencia oscilatoria
o tipo jet, administración intratraqueal de surfactante exógeno, óxido nítrico inhalado,
oxigenador de membrana extracorpórea (ECMO, por sus siglas en inglés:
Extracorporeal membrane oxigenator) por mencionar algunas, mientras que
prenatalmente se han propuesto procedimientos invasivos in utero, como ligadura u
oclusión traqueal para favorecer el desarrollo pulmonar, administración prenatal de
corticoesteroides, de hormona liberadora de la tiroestimulante, vitamina A y fasudil,
no obstante algunos centros han descrito mejoría discreta en la sobrevida con
algunos de estos abordajes de manejo, la mortalidad persiste elevada, se ha
reportado por algunos centros hasta del 80%, por lo cual la HDC constituye un
problema serio en las UCIN, a pesar de los grandes avances médicos y tecnológicos
en estas áreas 91-93.
Históricamente, el manejo de esta patología ha sido difícil, complicado y en muchos
de los casos infructuoso, atribuido mayormente a las modificaciones graves en la
arquitectura pulmonar que suceden durante las etapas de desarrollo pulmonar
prenatalmente, por lo cual recientemente se han propuesto intervenciones prenatales
farmacológicas que atenúen estos cambios estructurales pulmonares y que impacten
en la sobrevida. Por ello, en el presente se propone que la modulación del
monofosfato de guanosina cíclico (GMPc) y de la endotelina mediante sildenafil y
bosentán respectivamente, podrían ser atenuados estos cambios morfológicos
pulmonares, tanto en vasculatura (remodelación vascular) como en vías aéreas 71,72,75,78,83.
Con base en lo anterior surgió la siguiente pregunta de investigación :
¿Son eficaces el sildenafil y el bosentán, administrados por separado y combinados,
para el tratamiento farmacológico prenatal de la HDC en un modelo experimental?
18
JUSTIFICACIÓN
Magnitud del problema
La HDC es una de las patologías de mayor impacto sobre la morbilidad y mortalidad
neonatal en las salas de cuidados intensivos neonatales.
En la UCIN del Hospital de Pediatría del Centro Médico Nacional de Occidente,
Instituto Mexicano del Seguro Social (IMSS), se cuenta con alrededor de 600
ingresos anuales, es un hospital de concentración y se reciben pacientes de diversas
poblaciones de Jalisco, así como de cinco estados de la República Mexicana. La
incidencia de la HDC, descrita en un período analizado entre marzo del 2002 a
diciembre del 2003, fue de 0.9 por cada 100 ingresos 94. En un informe reciente del
Hospital Siglo XXI del IMSS, de 65 recién nacidos con HDC, la mortalidad fue del
40% y la causa principal fue la Hipertensión Pulmonar Persistente del Recién Nacido,
secundaria a la remodelación vascular 95.
Trascendencia
El abordaje terapéutico de un paciente con HDC representa uno de los mayores
retos para el Neonatólogo debido a la elevada mortalidad a la que se asocia, por lo
cual se continúa en la búsqueda de alternativas terapéuticas.
Actualmente es posible diagnosticar HDC mediante utrasonografía en el primer
trimestre del embarazo, con lo cual se ha abierto la posibilidad para diferentes
intervenciones prenatales, como la reparación quirúrgica del defecto diafragmático
fetal in utero, procedimiento que se ha abandonado por la elevada incidencia de
trabajo de parto pretérmino y morbi-mortalidad. Se ha intentado también oclusión
traqueal por medio de intervención laparoscópica, para promover crecimiento
pulmonar prenatal, sin embargo, los resultados hasta el momento no han demostrado
impacto en la sobrevida 96.
Vulnerabilidad
Dada la elevada morbilidad y mortalidad que acompaña a la HDC, la poca
accesibilidad a algunas opciones de manejo tanto prenatales como postnatales en
19
países económicamente emergentes como el nuestro y el no contar con otras
terapias alternativas como ECMO, ventilación de alta frecuencia oscilatoria y óxido
nítrico, es importante investigar sobre intervenciones farmacológicas prenatales.
Factibilidad
En el Centro de Investigación Biomédica de Occidente del Instituto Mexicano del
Seguro Socia (IMSS), se registro y aprobó para su ejecución el presente trabajo de
investigación y se le otorgo el número de dictamen: 1305-2006-02 (anexo 1) en dicho
sitio se desarrolló el experimento, se estandarizó e implementó el modelo
experimental
El presente trabajo de investigación contó con financiamiento intrainstitucional por
concurso de parte del Fondo de Fomento a la Investigación, IMSS, con Número de
registro FOFOI: 2006/1A/I/031, (anexo 2) y extrainstitucional, como respuesta a la
convocatoria para someter a concurso los resultados preliminares en el Miami
Children’s Hospital de Miami Florida, USA, en colaboración con Sheridan Health
Corporation y fue otorgado en 2007 y 2008 (anexos 3 y 4), lo cual permitió la compra
del herbicida nitrofén y de tabletas de bosentán entre otros insumos. El sildenafil en
tabletas de 50 mg se encuentra en el cuadro básico del IMSS, con clave 4308.
20
OBJETIVOS
Objetivo general
Determinar si la administración prenatal de sildenafil y/o bosentán atenúa la
remodelación vascular, promueve ramificación bronquial y favorece la alveolarización
en un modelo experimental de HDC.
Objetivos particulares
a) Desarrollar el modelo experimental de HDC.
b) Demostrar macroscópica y microscópicamente la hipoplasia pulmonar.
c) Conocer la relación peso bloque cardiopulmonar/peso corporal.
d) Comparar el espesor de los vasos arteriales pulmonares y consecuentemente la
luz o diámetro interno de los mismos entre los diferentes grupos de estudio.
e) Determinar fibrosis intersticial pulmonar.
f) Evaluar ramificación de vías aéreas entre los grupos de estudio.
g) Estimar alveolarización y características morfométricas alveolares en los grupos
de estudio.
21
HIPÓTESIS
La administración prenatal de sildenafil y/o bosentán atenúa los cambios
morfológicos o estructurales pulmonares, la remodelación vascular, promueve la
ramificación bronquial y favorece la alveolarización en un modelo experimental de
HDC.
22
MATERIAL Y MÉTODOS
El presente trabajo de investigación fue registrado y aprobado para su ejecución por
el Comité Local de Investigación del Centro de Investigación Biomédica de
Occidente, IMSS, y se le otorgó el número de dictamen 1305-2006-02 (anexo 1).
Diseño del estudio
Se trata de un estudio experimental, aleatorizado y cegado.
Modelo experimental
Se utilizaron ratas hembras Wistar adultas, las cuales fueron apareadas con machos
de la misma cepa y por medio de lavado y frotis vaginal, se consideró día
postconcepcional 0 (DPC 0) cuando se encontraron espermatozoides en dicho frotis 10. En el DPC 9, mediante cánula orogástrica se administró 100 mg de nitrofén (2,4-
diclorofenil-p-nitrofenil éter, CAS No. 1836-75-5; Supelco®) previamente disuelto o
reconstituido en 1 cc de aceite de olivo 10 y mezclado con un sonicador Virtis,
VirSonic 100®, excepto al grupo control o testigo negativo (grupo1).
Intervención farmacológica prenatal
Se integraron al azar 5 grupos con ratas gestantes:
� Grupo 1 (testigo negativo).- se administró 1 mL de aceite de olivo vía oral (VO) el
DPC 9 y 1 mL de solución glucosada al 5% durante los DPC 16 al 20.
� Grupo 2 (testigo positivo).- cada rata gestante recibió 100 mg de nitrofén 24 VO el
DPC 9, reconstituido en 1 mL de aceite de olivo y 1 mL de solución glucosada al
5% VO los DPC 16 al 20.
� Grupo 3 .- se administraron 100 mg de nitrofén a cada rata gestante VO el DPC 9,
reconstituido en 1 mL de aceite de olivo, así como 100 mg de sildenafil 79-82 por
Kg de peso y por dosis, diluido en 1 mL de solución glucosada al 5% VO durante
los DPC 16 al 20.
23
� Grupo 4 .- recibieron 100 mg de nitrofén VO el DPC 9, reconstituido en 1 mL de
aceite de olivo, así como 30 mg de bosentán 84 por Kg de peso y por dosis VO,
diluido en 1 mL de solución glucosada al 5%, en los DPC16 al 20.
� Grupo 5 .- se administraron 100 mg de nitrofén a cada rata gestante VO el DPC 9,
reconstituido en 1 mL de aceite de olivo, así como 100 mg de sildenafil por Kg y
por dosis y 30 mg de bosentán por Kg y por dosis, diluido cada uno en 0.5 mL de
solución glucosada al 5%, administrado VO en dosis separadas, durante los
DPC16 al 20.
Cesárea y preparación de tejido pulmonar
En el día 21 de gestación, previa administración de 50 mg de pentobarbital por Kg y
por dosis, intra-peritonealmente, se realizó cesárea 87 para obtener los productos vía
abdominal, los cuales fueron sacrificados y pesados con una balanza digital portátil
(CS-200 Ohaus®). Mediante laparotomía bajo microscopio binocular quirúrgico (Carl
Zeiss® OPMI 1, microscopio para microcirugía, Germany) se evaluó el defecto
diafragmático y/o desarrollo de HDC y a través de esternotomía, se disecó el bloque
cardiopulmonar, el cual fue pesado con una balanza analítica digital (Explorer
Ohaus®), se tomaron dimensiones de largo y ancho en ambos pulmones. Se colocó
el bloque cardiopulmonar en formol amortiguado (bufferizado) al 10% y
posteriormente fue embebido en bloque de parafina 87 (Figura 6).
Figura 6. Fotografías representativas de la metodol ogía.
A B C D
E F G
24
Figura 6A: Cesárea, 6B: Peso de las crías obtenidas por cesárea, 6C: Disección bajo
microscopio binocular quirúrgico, 6D: Laparotomía y esternotomía, 6E: Peso del bloque
cardiopulmonar, 6F: Bloque cardiopulmonar de características normales y 6G: Laminillas y
bloque de parafina.
Se realizaron cortes con micrótomo (Leica®, serie 050131379, cat. 14050237993) del
parénquima pulmonar de 4µ, se montaron en portaobjetos que fueron codificados
con lápiz de punta de diamante y posteriormente teñidos con hematoxilina y eosina,
PAS (ácido periódico de Shift) y con tricrómico de Masson, en total tres laminillas por
cada bloque cardiopulmonar, para observación análisis y lectura al microscopio
(Olympus® BX51) equipado con micrómetro óptico y analizador de imágenes (Image-
pro® Plus, MediaCybernetics), por parte de el Médico Patólogo.
Evaluación patológica
Las mediciones fueron realizadas por un observador experto (Médico Patólogo),
quien ignoraba a cual grupo pertenecían las laminillas.
Se utilizó un microscopio Olympus® BX51 equipado con analizador de imágenes
(Image-pro® plus, MediaCybernetics) y se midieron:
� Espesor en micras de la pared arterial.
� Diámetro en micras de la luz arterial.
� Relación pared/luz arterial pulmonar.
� Fibrosis del tejido intersticial pulmonar.
� Promedio de bronquiolos terminales.
� Conteo alveolar radial *.
� Cálculo del intersepto linear promedio **.
Tanto el espesor de la pared arterial como el diámetro de la luz de la misma fueron
medidos y expresados en µ, en 10 campos y se promediaron, posteriormente se
obtuvo la relación pared/luz arterial pulmonar. Se eligieron vasos arteriales
periféricos cercanos a los bronquiolos para realizar estas mediciones ya que los
primeros cambios en espesor de la pared arterial se presentan en la periferia 17-21.
25
En relación a la evaluación de la fibrosis del tejido intersticial pulmonar, obedeció a la
imagen subjetiva que el Médico Patólogo percibió, mediante la tinción de tricrómico
de Masson que se acercaba a la siguiente descripción:
a. Fibrosis leve: Aquella que no supera en 25% del total de 10 campos evaluados y
dispersa en el intersticio sin formar cúmulos o agregados.
b. Fibrosis moderada: Aquella que no supera en 50% del total de 10 campos
evaluados y dispersa en el intersticio sin formar cúmulos o agregados.
c. Fibrosis severa: Aquella que supera en 50% del total de 10 campos evaluados
dispersa en el intersticio o formando cúmulos o agregados concéntricos alrededor
de los vasos y bronquios.
Los bronquiolos terminales fueron contados en 10 campos de la periferia y
posteriormente se promediaron.
La alveolarización fue evaluada mediante el conteo alveolar radial (RAC, por sus
siglas en inglés: Radial alveolar count) y las características morfológicas de los
alvéolos, por medio del intercepto linear medio (MLI, por sus siglas en inglés: Mean
linear intercept); ante la disminución del número de alvéolos se ha demostrado
reducción del RAC e incremento del MLI 97.
* Conteo alveolar radial. Es un método estandarizado y utilizado ampliamente para
estimar la cantidad de alvéolos, fue introducido en 1960 por Emery y Mithal, para
esta medición se precisa ubicar un bronquiolo terminal o respiratorio que se identifica
por estar cubierto de epitelio en forma parcial, a partir del centro del mismo, se traza
una línea perpendicular hasta la pleura o al tejido conectivo ínterlobular y se cuenta
el número de alvéolos que cruzan o atraviesan dicha línea perpendicular, este
parámetro se examina en 10 campos de cada caso a 40X de aumento y se obtiene el
promedio 98-100.
**Cálculo del intersepto linear promedio. Método para evaluar características
morfométricas de los espacios aéreos que estima indirectamente el tamaño de los
alvéolos, mediante la distancia entre las paredes alveolares o septos alveolares. Se
trazan 6 líneas, se cuenta el número de interseptos que las cruzan y se aplica la
siguiente fórmula: 97
MLI= 2 * ltot/Ix.
26
Donde:
ltot: La suma de la distancia de todas las líneas trazadas en el área, Ix es el número
total de intersecciones (paredes alveolares) que cruzan la línea trazada 101,102.
Acerca de la dosis de sildenafil utilizada en el presente estudio (100 mg/Kg), fue
elegida con base en informes bibliográficos previos, los cuales mencionan que la
dosis/respuesta efectiva de sildenafil en el modelo experimental utilizado es 100 mg
por Kg, aunque considerablemente mayor a la dosis apropiada en humanos, se ha
demostrado que en estudios in vivo en ratas produce concentraciones plasmáticas
comparables a los niveles séricos obtenidos en humanos cuando reciben 1 mg por
Kg 103, lo cual aunado a los estudios de farmacocinética y farmacodinamia del
fármaco, refleja que el metabolismo de sildenafil en ratas es 100 veces mayor que en
el humano 104.
Algunos informes han descrito alto rango del metabolismo hepático del sildenafil en
rata, con lo cual la administración de 100 mg por Kg ha permitido que se alcancen
niveles plasmáticos apropiados para obtener el efecto deseado 83,105,106.
Cálculo de muestra
Una vez que se obtuvieron resultados preliminares, se utilizó una fórmula para
calcular el tamaño de muestra cuando se espera encontrar diferencia de promedios y
se conoce la desviación estándar, dada una confiabilidad y un poder. La variable
utilizada para este cálculo fue el espesor de la pared arterial, a partir de una muestra
piloto previa.
n = S12+ S2
2 (z1-α/2+z1-β) 2
(X1 - X2)2
Donde:
S1= Desviación estándar de la población control.
S2= Desviación estándar de la población experimental.
X1= Promedio de la población control.
X2= Promedio de la población experimental.
27
(X1–X2)= Diferencia de medias esperadas que desea ser contrastada.
α= Nivel de significancia o probabilidad de error tipo 1.
1-α/2= Percentil bilateral para el nivel de significancia asignado.
Z0.975= Z de la distribución normal estandarizada que deja un área de 0.9750 a la
izquierda, lo que implica confiabilidad de 95.0%.
β= Probabilidad de error tipo 2.
1-β= Percentil unilateral para la beta (β) asignada.
Z0.80= Z de la distribución normal estandarizada que deja un área de 0.8000 a la
izquierda, que implica un poder de 80.0%.
Despejando:
α= 0.05 z1 - α/2 = Z0.975 = 1.96
β= 0.8 z1 - β = Z0.8 = 0.842
n= 1.252 + 0.702 (1.96 + 0.84)2
(4.25 – 3.0)2
n= 10.31028 n= 12 crías por grupo
Tamaño de muestra mínimo necesario que asegura, con probabilidad de 0.95
(confiabilidad del 95%), que si la diferencia que se desea contrastar es verdadera, el
estudio lo confirme y que si esta diferencia no es cierta, el estudio confirme que la
diferencia no es de la magnitud que se plantea, con probabilidad de 0.80 (poder de
80%).
Departamento dónde se desarrolló el proyecto
Laboratorio de Mutagénesis, Centro de Investigación Biomédica de Occidente,
Instituto Mexicano del Seguro Social, Guadalajara, Jalisco.
n= 12
28
Consideraciones éticas
El experimento fue realizado de acuerdo a las Normas Institucionales y
Gubernamentales para el uso y manejo ético de los animales de experimentación
(NOM-062-ZOO-2001). Asimismo, una vez concluida la fase experimental, los
animales utilizados fueron entregados a los responsables del bioterio, quienes
decidieron el destino final de los animales.
Análisis estadístico
Los datos cuantitativos se presentan como promedio±desviación estándar. Mediante
la prueba de Kolmogorov-Smirnov se evaluó la distribución de los datos; la cual
resultó significativa en la gran mayoría de las variables, esto significa que los datos
no presentaron distribución normal, por lo cual fueron analizados con estadística
inferencial no paramétrica y la n o tamaño de muestra calculada para cada grupo
(n=12) fortalece esta decisión. Las comparaciones se hicieron mediante la prueba de
Mann-Whitney para muestras independientes, entre el grupo placebo o control
negativo versus el grupo control positivo o nitrofén, para demostrar el modelo
experimental de HDC. Así mismo se compararon el grupo control positivo o nitrofén
versus los grupos 3 (sildenafil), 4 (Bosentán) y 5 (sildenafil y bosentán). Para las
variables cualitativas se realizó la prueba exacta de Fisher entre el control negativo o
placebo y control positivo o nitrofén, de igual forma el control positivo se comparó con
los grupos tratados 3, 4 y 5 y en los casos en que la variable estudiada tuvo más de
dos categorías o niveles se realizó χ2.
Para analizar la probabilidad de interacción entre los diferentes tratamientos se
realizó un modelo de regresión.
Se considero un valor estadísticamente significativo cuando p fue < 0.05 y un nivel de
confianza de 95%.
Se utilizó el paquete estadístico SPSS (Statistical package for the social sciences,
por sus siglas en inglés) versión 15.
29
OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES
Variable Tipo de
variable
Unidad de
medida
Escala Estadístico
Peso corporal Continua Gramos Cuantitativa
continua
Medidas de tendencia
central
Peso bloque
cardiopulmonar
Continua Miligramos Cuantitativa
continua
Estadística de
diferenciación
Relación peso bloque
cardiopulmonar/peso
corporal
Discreta Frecuencia Cuantitativa
Continua
Estadística de
diferenciación
Dimensiones pulmón
derecho
Continua Milimetros Cuantitativa
continua
Estadística de
diferenciación
Dimensiones pulmón
izquierdo
Continua Milimetros Cuantitativa
continua
Estadística de
diferenciación
Espesor de pared arterial Continua Micras Cuantitativa
continua
Estadística de
diferenciación
Diámetro de la luz arterial Continua Micras Cuantitativa
continua
Estadística de
diferenciación
Relación pared/luz arterial Continua Frecuencia Cuantitativa
continua
Estadistica de
diferenciación
Fibrosis intersticial
pulmonar
Nominal Escala Cualitativa Estadística de
diferenciación
Promedio de bronquiolos Continua Frecuencia Cuantitativa
continua
Estadística de
diferenciación
Conteo alveolar radial
(RAC)
Continua Frecuencia Cuantitativa
continua
Estadística de
diferenciación
Intersepto linear medio
(LMI)
Continua Frecuencia Cuantitativa
continua
Estadística de
diferenciación
30
RESULTADOS
El modelo experimental de HDC se ha reproducido fielmente en el presente estudio;
las crías que desarrollaron HDC se caracterizaron por presentar hipoplasia pulmonar
izquierda significativa (Figura 7), evaluado mediante la disminución en la relación
peso bloque cardiopulmonar/peso corporal en las crías expuestas a nitrofén:
0.0261±0.0028 en contraste con el grupo control negativo o placebo: 0.0393±0.0054
(p=0.0001) y confirmado por las dimensiones del pulmón izquierdo,
significativamente menores (p=0.0001) en las crías expuestas a nitrofén: 4.5±0.91
mm de largo y 2.5±0.49 mm de ancho, contra 8.1±0.93 mm de largo y 3.2±0.45 mm
de ancho (p=0.003) en las crías que recibieron placebo (Cuadro 2).
Figura 7. Fotografías representativas de hipoplasia pulmonar.
Figura 7A: Bloque cardiopulmonar con dimensiones dentro de límites normales. 7B: bloque
cardiopulmonar con hipoplasia del pulmón izquierdo.
A B
31
Cuadro 2. Relación peso bloque cardiopulmonar/peso corporal y
dimensiones pulmonares del grupo control negativo o placebo
(n=12) y grupo control positivo o nitrofén (n=12)
Grupo Relación peso
BCP/ peso corporal
Dimensione s
pulmón izq.
largo (mm)
Dimensiones
pulmón izq.
ancho (mm)
1: Control Negativo
(placebo)
2: Control positivo
(nitrofén)
0.0389±0.0054
0.0261±0.0028
8.1±0.93
4.5±0.91
3.2±0.45
2.5±0.49
Valor de p 0.0001 0.0001 0.003
BCP: Bloque cardiopulmonar; izq: izquierdo.
32
0
1
2
3
4
5
6
El modelo de HDC ha sido reproducible y semeja en gran medida el punto cardinal
de la HDC, la remodelación vascular, tal como se demuestra en la Figura 8, ya que
se encontró mayor espesor de la pared arterial medida en micras en el grupo positivo
o nitrofén (4.5±0.67µ), lo cual traduce incremento en la muscularización vascular, en
comparación con el grupo control negativo o placebo (3.0±1.2µ), diferencia que
resultó ser significativa (p=0.004).
Figura 8. A: Gráfica que muestra promedio y desviación estándar del espesor de la pared
arterial (µ) de ambos grupos, control negativo o placebo (n=12) y control positivo o nitrofén
(n=12). B: microfotografía representativa del aumento de espesor de la pared arterial, se
observa además disminución alveolar (Tinción hematoxilina y eosina, 40X).
3.0±1.2µ
4.5±0.67µ
µ
Placebo Nitrofén
p=0.004
A B
33
0
1
2
3
4
5
6
7
8
La alveolarización disminuyó significativamente (p=0.001) en las crías que
desarrollaron HDC en contraste con las crías sin HDC del grupo control negativo o
placebo, como se muestra en la Figura 9, el conteo alveolar radial (RAC) en el grupo
control negativo fue en promedio 5.46 ± 1.6 y en el grupo control positivo el cual
recibió nitrofén descendió a 3.1 ± 1.0.
Figura 9. A: Se muestra promedio y desviación estándar del número de alvéolos obtenidos
mediante el método de conteo alveolar radial (RAC), del grupo control negativo o placebo
(n=12) versus control positivo (n=12). B: Microfotografía representativa del grupo control
positivo o sildenafil que muestra disminución de los espacios aéreos (Hematoxilina y eosina,
10X).
Placebo Nitrofén
3.1±.1.0
5.4±1.6
Fre
cuen
cia
p=0.001
A B
34
0
10
20
Otro de los hallazgos morfológicos característicos de la patología (HDC), además de
la disminución en la alveolarización, es el compromiso en la ramificación bronquiolar,
en el presente, se encontró franca disminución en bronquiolos terminales en las crías
con HDC del grupo control positivo o nitrofén, como se muestra en la figura 10.
Figura 10. A: La gráfica muestra promedios y desviación estándar de los bronquiolos
terminales en grupo control negativo o placebo y del grupo control positivo o nitrofén. B:
Imagen representativa del grupo control positivo, en la cual se observan bronquiolos
ectásicos y escasos (Hematoxilina y eosina, 40X).
Placebo Nitrofén
Fre
cuen
cia
11.2±1.9
8.2±1.7
p=0.001
A B
35
0
1
2
3
4
5
6
En relación a los grupos de estudio que recibieron las intervenciones farmacológicas,
sildenafil y bosentán, se encontró lo siguiente:
En las crías con HDC cuyas madres recibieron sildenafil (grupo 3) hubo disminución
significativa (p=0.001) en el espesor de la pared arterial medida en micras, las crías
con HDC sin intervención farmacológica presentaron 4.5±0.67µ de espesor mientras
que las recibieron sildenafil presentaron 3.2±0.75µ, tal como se muestra en la Figura
11.
Figura 11. A: Se muestran diferencias significativas en el grosor de la pared arterial, mayor
en el grupo control positivo (n=12) o nitrofén (N) sin intervención farmacológica, en contraste
con el grupo 3 (n=12) que recibió además del nitrofén sildenafil (N+S) prenatalmente (grupo
3). B: Microfotografía representativa del grupo 3, cuya intervención farmacológica fue el
sildenafil, que ejemplifica la disminución en el espesor de la pared arterial (flecha ����;
hematoxilina y eosina, 40X).
En consecuencia a la disminución en el espesor de la pared arterial del grupo que
recibió sildenafil se mejoró significativamente (p=0.03) la relación pared/luz arterial,
como se puede observar en el Cuadro 3, donde se muestra mejor relación pared/luz
arterial en el grupo que recibió sildenafil (grupo 3).
3.2±0.75µ
4.5±0.67µ
p=0.001
µ
N N+S
A B
����
36
Cuadro 3. Relación pared/luz arterial del grupo 2 ó nitrofén sin
intervención farmacológica (n=12) versus grupo 3 ó nitrofen +
sildenafil (n=12)
Relación pared/luz
arterial
Grupo 2: Nitrofen
n (%)
Grupo 3: Nitrofén + sildenafil
n (%)
1:1 5 (41.7) 1 (8.3)
1:2 6 (50) 8 (66.7)
1:3 1 (8.3) 3 (25)
p=0.03
37
0
10
20
Respecto al grupo 4 que recibió bosentán como intervención farmacológica, se
encontró incremento estadísticamente significativo (p=0.002) en los bronquiolos
terminales, como se muestra en la figura 12, ya que el grupo control positivo o
nitrofén presentó 8.2 ± 1.7, mientras que el grupo 4 ó nitrofén + bosentán presentó
12.9 ± 3.4.
Figura 12. A: Se gráfica la cantidad de bronquiolos terminales en promedio con sus
respectivas desviaciones estándar, en el grupo control positivo n=12 (nitrofén sin
intervención farmacológica; N) contra el grupo 4 ó nitrofén + bosentán n=12 (N+B). B:
Microfotografía representativa en la cual se observa incremento de bronquiolos terminales.
(Hematoxilina y eosina, 10X).
En este mismo grupo 4, se encontró disminución significativa (p=0.02) en la fibrosis
intersticial, en aquellas crías con HDC que recibieron bosentán (grupo 4) en
contraste con las crías con HDC y sin intervención farmacológica del grupo 2
(nitrofén), como se observa en el cuadro 4.
Fre
cuen
cia
N
p=0.002
8.2±1.7
12.9±3.4
N+B
A B
38
0
10
20
Cuadro 4. Fibrosis intersticial en el grupo 2 ó nitrofén (n=1 2) versus
grupo 4 ó nitrofén + bosentán
Fibrosis intersticial Grupo 2: Nitrofen
n (%)
Grupo 4: Nitrofén + bosentán
n (%)
Leve 5 (41.7) 11 (91.7)
Moderada 7 (58.3) 1 (8.3)
p=0.02
El grupo 5 que recibió ambas intervenciones farmacológicas, también mostró
incremento significativo (p=0.0001) en bronquiolos terminales, respecto al control
positivo ó nitrofén; que presentó 8.2±1.7, mientras que el grupo 5 (nitrofén + sildenafil
+ bosentán; presentó 13.5±2.2. (Figura 13).
Figura 13. A: Se grafican promedio y desviación estándar de bronquiolos terminales en las
crías del grupo 2 (n=12) que fueron expuestas a nitrofén (N) únicamente, comparativamente
con el grupo 5 (n=12) que recibió las dos intervenciones farmacológicas propuestas,
sildenafil + bosentán (N+S+B). B: Microfotografía que representa los cambios positivos en el
promedio de bronquiolos terciarios (Hematoxilina y eosina, 40X).
Fre
cuen
cia
N+S+B N
P=0.0001
13.5±2.2
8.2±1.7
A B
39
0
1
2
3
4
5
6
Así mismo en relación al espesor de la pared arterial, se encontró disminución
estadísticamente significativa (p=0.005) en el grupo 5 que recibió ambas
intervenciones farmacológicas, nitrofén + sildenafil + bosentán, (N+S+B), el cual
presentó 3.4 ± 1.6 µ mientras que el grupo control positivo ó nitrofen (N), 4.5 ± .67 µ,
como se muestra en la figura 14.
Figura 14. A: Se muestran promedios y desviaciones estándar del grupo 2 (n=12) ó control
positivo (nitrofen), contrastado con el grupo 5 (n=12) que recibió ambas intervenciones
(nitrofén + sildenafil + bosentán N+S+B). B: Se observa disminución en el espesor de la
pared arterial (flecha ����) en esta microfotografía representativa del grupo 5 (Hematoxilina y
eosina, 40X).
En consecuencia a esta disminución del espesor de la pared arterial, mejoró la
relación pared/luz arterial en el grupo 5 que recibió las dos intervenciones
farmacológicas, en contraste con el grupo testigo positivo, diferencia que fue
estadísticamente significativa (p=0.007; cuadro 5).
N N+S+B
P=0.005
µ
4.5±.67µ 3.4±1.6µ
A B
����
40
Cuadro 5. Relación pared/luz arterial del grupo 2 ó nitrofén sin
intervención farmacológica (n=12) versus grupo 5 ó nitrofen +
sildenafil + bosentán (n=12)
Relación pared/luz
arterial
Grupo 2: Nitrofen
n (%)
Grupo 5: Nitrofén +
sildenafil + bosentán
n (%)
1:1 5 (41.7) 0 (0)
1:2 6 (50) 10 (83.3)
1:3 1 (8.3) 1 (4.2)
p=0.007
Finalmente en relación a la alveolarización, la cual fue evaluada mediante el método
de RAC y las características morfométricas alveolares, evaluadas por medio del
intersepto linear medio (MLI, por sus siglas en inglés), no se encontraron diferencias
significativas entre los grupos que recibieron nitrofén solamente (grupo 2 o control
positivo) versus nitrofén + intervenciones farmacológicas (grupos 3, 4 y 5),
representado en forma gráfica en las Figuras 15 y 16.
41
0
1
2
3
4
5
Figura 15. Se presenta en forma gráfica el número de alvéolos (RAC) en cantidades muy
similares entre los grupos de estudio. N: Nitrofen; N+S: Nitrofén + Sildenafil; N+B: Nitrofén +
N N+S N+B N+S+B
N N+S
Fre
cuen
cia
N+B N+S+B
3.1±1.0
2.0±.37 2.1±.54
2.0±.39
42
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Bosentán y N+S+B: Nitrofén + Sildenafil + Bosentán. En la parte inferior se muestran
microfotografías representativas de cada uno de los grupos de estudio (n=12 en cada grupo).
Figura 16. En los grupos de estudio se muestra el comportamiento similar del intersepto
linear medio (MLI) entre grupos. N Nitrofen; N+S Nitrofén + Sildenafil; N+B Nitrofén +
N N+S N+B N+B+S
N+S+B N+B
N+S N
Fre
cuen
cia
49.3±13.7 49.2±8.4
57±11.3 57.5±11.3
43
Bosentán; N+S+B Nitrofén + Sildenafil + Bosentán y en la parte inferior de la gráfica. se
muestran microfotografías representativas de cada grupo de estudio (n=12 en cada grupo).
En un modelo de regresión se descartó interacción entre grupos en relación a
espesor arterial y bronquiolos terminales. Se evaluó el espesor de la pared arterial
pulmonar en micras, en función de los tratamientos sildenafil y bosentán (grupos 3 y
4) y sildenafil + bosentán (grupo 5), el único factor que resultó ser significativo fue el
sildenafil con coeficiente de regresión de -0.79 y significancia de 0.015, lo cual
implica que las crías con HDC que recibieron sildenafil disminuyeron el espesor de la
pared arterial en la magnitud de dicho coeficiente de regresión; así mismo, en
relación al incremento de bronquiolos terminales, solamente el bosentán resultó
significativo con coeficiente de regresión de 4.646 con p=0.001, es decir que el grupo
que recibió bosentán presentó incremento de bronquiolos terminales en la magnitud
del coeficiente de regresión mencionado, no así el grupo que recibió sildenafil.
44
DISCUSIÓN
El desarrollo de un modelo animal apropiado de HDC, el cual permitió simular
estrechamente los cambios morfológicos macroscópicos y microscópicos de esta
patología en el recién nacido, fue esencial en el presente trabajo.
En las crías cuyas madres recibieron nitrofén en el DPC 9, se documentó HDC
durante la disección bajo microscopio binocular para microcirugía; primeramente se
identificó el defecto diafragmático por el cual migran las vísceras abdominales a la
cavidad torácica, posteriormente se encontró estomago, asas intestinales y/o hígado,
tal como sucede en el neonato 24,25, consecuentemente se ha demostrado la
hipoplasia pulmonar izquierda, que ha sido muy evidente a simple vista en muchos
de los casos y se ha confirmado en forma objetiva por la medición de ambos
pulmones, ya que se encontraron dimensiones menores en el pulmón izquierdo de
las crías que desarrollaron HDC, comparativamente con aquellas que no la
desarrollaron, diferencia que fue estadísticamente significativa (p=0.0001) y no se
observó en el pulmón derecho (Cuadro 2).
Así mismo, las crías con HDC se caracterizaron por presentar significativamente
(p=0.0001) menor relación peso bloque cardiopulmonar/peso corporal en relación a
las crías del grupo 1 (control negativo ó placebo) que no desarrollaron HDC, hecho
que concuerda con estudios previos en los cuales utilizaron modelo experimental de
HDC 105,106 (Cuadro 2).
Los hallazgos morfológicos en las crías de las ratas gestantes que recibieron nitrofén
fueron consistentes con reportes previos de la literatura 107. El análisis
histopatológico de las laminillas reveló engrosamiento de la pared de los vasos
arteriales pulmonares de las crías con HDC que fueron expuestas a nitrofén en
contraste con aquellos del grupo control o placebo (Figura 8), dicho incremento del
grosor de los vasos arteriales pulmonares se ha considerado un marcador subrogado
de remodelación vascular en HDC y en Hipertensión Pulmonar Persistente del
Recién Nacido (HPPRN) 105.
Además del engrosamiento de la pared arterial, en el modelo de HDC se encontró
reducción significativa tanto en los espacios aéreos como en la ramificación bronquial
45
(Figuras 9 y 10), condición sine qua non de la hipoplasia pulmonar, en conjunto estos
cambios morfológicos y estructurales histopatológicos pulmonares que se han
documentado en el presente trabajo, representan la característica principal de la
HDC y explican en gran parte su fisiopatología 108; así mismo, confirman la fiel
reproducción del modelo.
En los grupos de estudio tratados (grupos 3, 4 y 5), que recibieron las intervenciones
farmacológicas propuestas, sildenafil y/o bosentán, se consiguió atenuar los cambios
morfológicos y estructurales pulmonares, especialmente el desarrollo anormal de la
pared vascular pulmonar, que ocasiona HPPRN en los pacientes con HDC y que
dicho sea de paso, representa la principal causa de muerte en estos pacientes 109,110.
Y así, en el grupo 3 que recibió sildenafil se encontró disminución significativa
(p=0.001) en el espesor de la pared arterial medida en micras (Figura 11), con lo cual
se moderó la disminución en la luz de los vasos, expresado como relación pared/luz
arterial (Cuadro 3), hallazgo importante reportado previamente en modelo
experimental de HDC por Roubliova y su grupo 111.
En otras palabras, el sildenafil administrado prenatalmente atenúo la remodelación
vascular, con lo cual esperaríamos menor reactividad en el tono vascular pulmonar
postnatalmente y probablemente, mejor respuesta a las estrategias terapéuticas
propuestas, como el óxido nítrico inhalado 112–114, ya que en los neonatos con
HPPRN, secundaria a HDC, son considerados “no respondedores” a este
vasodilatador selectivo de la vasculatura pulmonar 115,116.
En estudios recientes realizados en corderos recién nacidos que viven en grandes
alturas sobre el nivel del mar (3600 m) y que desarrollan Hipertensión Pulmonar,
atribuida a elevada expresión y actividad de la fosfodiesterasa 5, motivo por el cual
fueron tratados con sildenafil intravenoso en infusión a razón de 16.6 µg/Kg/min, se
encontró mayor capacidad contráctil de los vasos pulmonares con elevación de la
dilatación máxima de los mismos 117.
Dentro del desarrollo, el patrón de ramificación permanece como una de las
principales características de crecimiento y desarrollo orgánico, la ramificación
pulmonar permite que se lleve a cabo eficientemente el mecanismo de intercambio
de gases del ambiente al organismo y viceversa, este proceso de desarrollo
46
primariamente ocurre in utero y se ha demostrado que se restringe
considerablemente en neonatos portadores de HDC. En humanos, la ramificación
bronquiolar pulmonar se completa alrededor de la semana 27 de gestación durante la
etapa canalicular y en ratas se completa alrededor del día 18 postconcepcional 110;
en los grupos 4 y 5 que recibieron en los DPC 16 al 20 el bosentán (bloqueador de la
endotelina) se favoreció significativamente el desarrollo de bronquiolos terminales ó
terciarios, como se observa en la Figura 12, los cuales están recubiertos de un
epitelio capaz de llevar a cabo correctamente el intercambio gaseoso.
Dentro de la mejoría observada en la arquitectura pulmonar, en el grupo 4 que
recibió bosentán se encontró disminución significativa (p=0.02) en la fibrosis
intersticial pulmonar, en contraste con el grupo 2 ó control positivo sin intervención
farmacológica (Cuadro 4), sin embargo, es menester mencionar que en el presente
trabajo para la evaluación de la fibrosis intersticial pulmonar se utilizó un método
subjetivo o cualitativo, resultaría deseable evaluar en forma más precisa dicha
fibrosis pulmonar mediante otras alternativas de manera cuantitativa, como la
inmunohistoquímica 118, 119.
En el grupo 5 que recibió ambas intervenciones farmacológicas propuestas (sildenafil
y bosentán) también se observo incremento en bronquiolos terminales o terciarios
como en el grupo 4 que solamente recibió bosentán (Figuras 12 y 13). Este
incremento de bronquiolos terminales o respiratorios repercutiría directamente en la
función vital (intercambio de gases), gravemente comprometida en pacientes con
HDC.
Otro hallazgo significativo en el grupo 5, el cual recibió las dos intervenciones
farmacológicas, fue la disminución en el espesor de la musculatura vascular (Figura
14) en consecuencia mejoró la relación pared/luz arterial (Cuadro 5).
En el humano, el desarrollo de los alvéolos comienza alrededor de la semana 36 de
gestación, continúa en la vida postnatal e inicia con la aparición de septums
alveolares, los cuales se dividen en sacos aéreos primitivos en la etapa sacular del
desarrollo pulmonar, posteriormente se forman pequeñas unidades esféricas que
darán lugar a los alvéolos propiamente dichos, en la etapa alveolar de desarrollo
pulmonar, a partir de la cual y hasta los primeros años de la vida, se multiplica
47
considerablemente esta área de intercambio gaseoso y disminuye el diámetro de
estos espacios aéreos. La remodelación final de las estructuras alveolares se
alcanza hasta la edad adulta 120. Este fundamental evento de desarrollo pulmonar
necesario para llevar a cabo el intercambio gaseoso, se interrumpe en presencia de
HDC.
En la rata, modelo experimental empleado en el presente trabajo, el desarrollo
alveolar inicia al término de la gestación, con incremento en la multiplicación de los
sacos alveolares en el día 3 y 8 postnatal; la expansión de la población alveolar
continúa agudamente hasta el primer mes de edad, pero persiste hasta la edad
adulta 102, situación que explicaría en parte el motivo por el cual no se encontraron
cambios en sentido positivo en la alveolarización con las intervenciones
farmacológicas propuestas (Figuras 15 y 16), ya que como se comentó en la
metodología, se interrumpió la gestación vía cesárea al día 21 postconcepcional y las
crías fueron sacrificadas justamente al inicio de la etapa de desarrollo alveolar, por lo
que consideramos que con la metodología empleada se limitó la apropiada
evaluación de la alveolarización, ya que si bien se ha informado recientemente que
las técnicas de evaluación alveolar que se utilizaron aquí, el RAC y el MLI, ofrecen
amplia confiabilidad para estimar el número y las características morfométricas de
estas estructuras 121, se considera que tanto el momento, como la vía de nacimiento,
así como el que no hayan presentado esfuerzo respiratorio, influyó en forma negativa
en esta evaluación.
Se descarto interacción entre los grupos de estudio, mediante un modelo de
regresión, la administración prenatal de sildenafil (grupo 3) no modifico la cantidad de
bronquiolos terminales, mientras que el grupo 4 que recibió bosentán, mostró
incremento significativo de los mismos. Así mismo el grupo que recibió bosentán
(grupo 4) no modifico el espesor de la pared arterial, como se observo en el grupo 3
que recibió sildenafil.
48
CONCLUSIONES
� Se logró reproducir fielmente el modelo de HDC.
� El tratamiento prenatal con sildenafil atenúa la remodelación vascular pulmonar
en la HDC.
� La administración prenatal de bosentán, incrementa la densidad de los
bronquiolos terminales.
� El bosentán mejoró la arquitectura pulmonar.
� La combinación de ambas intervenciones farmacológicas, sildenafil y bosentán,
promueve la formación de vías respiratorias terminales y atenúa el incremento en
el espesor de la pared arterial pulmonar.
� En el presente trabajo y con la metodología empleada no se encontró mejoría en
la alveolarización.
49
PERSPECTIVAS
El presente trabajo de tesis, en el cual se ha logrado desarrollar el modelo
experimental de HDC, brinda la apertura de una línea de investigación acerca de
intervenciones farmacológicas prenatales en esta grave patología de elevada
mortalidad, como la administración de fármacos que biológicamente no representen
ningún tipo de riesgo en humanos, especialmente en mujeres gestantes, ya que a
partir de los hallazgos comentados previamente, se plantea la posibilidad de probar
otros compuestos como la L-citrulina, aminoácido no esencial, precursor del óxido
nítrico que representaría una innovadora propuesta para atenuar cambios
morfológicos característicos de esta patología, especialmente en remodelación
vascular.
Con base a las sugerencias obtenidas en presentaciones de resultados preliminares
en foros nacionales e internacionales, así como en seminarios de investigación, se
plantea la posibilidad de utilizar herramientas metodológicas alternativas
especialmente en la evaluación patológica, que ofrecen mayor precisión como la
técnica de inmunohistoquímica para evaluar cuantitativamente fibrosis intersticial 118,
119. Así mismo existe la posibilidad de determinar expresión del factor de crecimiento
vascular endotelial en el parénquima pulmonar de los bloques cardiopulmonares
embebidos en parafina de los cinco grupos de estudio, mediante RT-PCR (por sus
siglas en inglés: Trascripción reversa – reacción en cadena de la polimerasa) 122,
igualmente, evaluar la expresión de endotelina 123 y elastina, esta última es una
proteína de matriz extracelular, responsable de la elasticidad vascular 124 y se
determinarían mediante el mismo método.
Recientemente se ha reportado mayor objetividad y precisión en las mediciones
cuantitativas y morfológicas de espacios aéreos, paredes de los mismos, bronquiolos
y vasos mediante mediciones estereológicas 120. La estereología es una ciencia
multidisciplinar que dicta reglas de muestreo geométrico para estimar cantidades
definidas en objetos espaciales (como estructuras biológicas o minerales), tales
como volúmenes, número de células, poros o inclusiones, superficies, longitud de
fibras, filamentos o dendritas neuronales, por mencionar algunas 125. Con los
50
avances en la tecnología, actualmente existen múltiples alternativas metodológicas
aplicables a la presente línea de investigación.
Se ha integrado el primer “borrador” del manuscrito con fines de enviar a evaluación
para su publicación, actualmente en revisión por parte del grupo de investigación.
51
ANEXO 1
52
ANEXO 2
53
ANEXO 3
54
ANEXO 4
55
REFERENCIAS
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