1. INTRODUCCION El microscopio electrnico de barrido (SEM) es un instrumento que permite la observacin y caracterizacin superficial de materiales inorgnicos y orgnicos, entregando informacin morfolgica del material analizado. A partir de l se producen distintos tipos de seal que se generan desde la muestra y se utilizan para examinar muchas de sus caractersticas. Con l se pueden realizar estudios de los aspectos morfolgicos de zonas microscpicas de los distintos materiales con los que trabajan los investigadores de la comunidad cientfica y las empresas privadas, adems del procesamiento y anlisis de las imgenes obtenidas. Las principales utilidades del SEM son la alta resolucin (~100 ), la gran profundidad de campo que le da apariencia tridimensional a las imgenes y la sencilla preparacin de las muestras. El microscopio electrnico de barrido puede estar equipado con diversos detectores, entre los que se pueden mencionar: un detector de electrones secundarios para obtener imgenes de alta resolucin SEI (Secundary Electron Image), un detector de electrones retrodispersados que permite la obtencin de imgenes de composicin y topografa de la superficie BEI (Backscattered Electron Image), y un detector de energa dispersiva EDS ( Energy Dispersive Spectrometer) permite colectar los Rayos X generados por la muestra y realizar diversos anlisis e imgenes de distribucin de elementos en superficies pulidas. 2.- PRINCIPALES APLICACIONES Las aplicaciones del microscopio electrnico de barrido son muy variadas, y van desde la industria petroqumica o la metalurgia hasta la medicina forense. Sus anlisis proporcionan datos como textura, tamao y forma de la muestra. Entre las reas de aplicacin de esta tcnica, se pueden mencionar: 1. Geologa: Investigaciones geomineras, cristalogrficas, mineralgicas y petrolgicas. Estudio morfolgico y estructural de las muestras. 2. Estudio de materiales: Caracterizacin microestructural de materiales. Identificacin, anlisis de fases cristalinas y transiciones de fases en diversos materiales tales como metales, cermicos, materiales compuestos, semiconductores, polmeros y minerales. Composicin de superficies y tamao de grano. Valoracin del deterioro de materiales, determinacin del grado de cristalinidad y presencia de defectos. Identificacin del tipo de degradacin: fatiga, corrosin, fragilizacin, etc. 3. Metalurgia: Control de calidad y estudio de fatiga de materiales, caractersticas texturales. Anlisis de fractura (fractomecnica) en materiales (Ver Figura 1), un ejemplo concreto de este tipo de aplicacin se expone en la parte de trabajo prctico.

Figura 1 Imagen de la rotura de una varilla de acero obtenida mediante un Microscopio Electrnico de Barrido.

4. Odontologa: En este campo son muchas las aplicaciones de las caracterizaciones morfolgicas que se pueden realizar con el microscopio electrnico de barrido. Una aplicacin especfica de este microscopio se obtiene al estudiar la direccionalidad de las varillas del esmalte dental [1]. El esmalte dental posee varias fases de formacin, en las cuales se van depositando elementos minerales que llegan al lugar por los vasos sanguneos circundantes, producindose la mineralizacin total en la ltima fase de su formacin. En esta etapa se forman cristales, que al depositarse toman una disposicin en todo el tejido formado, creando las varillas del esmalte, estructura principalmente inorgnica (98%), adquiriendo una disposicin muy particular de acuerdo al sector que se estudie de la pieza dentara. Estas varillas son observadas con un microscopio electrnico de barrido, notando que estas se disponen en diferentes direcciones con un slo sentido desde l limite amelodentinario a la superficie, entrecruzndose en las cspides y en ciertos sectores de las caras libres y proximales, lo que se denomina multidireccionalidad de las varillas. Para ello se extraen piezas dentaras humanas (con indicacin quirrgica), las que son metalizadas con oro-paladio y luego son estudiadas en el SEM. De este modo se puede observar la disposicin de las varillas, analizar los cambios de direcciones en el espesor del esmalte y comparar la disposicin en los distintos sectores del esmalte (oclusal, 1/3 medio y 1/3 cervical). Adems se pueden analizar a travs del SEM las alteraciones que producen los cidos producidos por la entrada de microorganismos y restos alimenticios en las superficies vestibulares de los dientes anteriores, ya que sobre ellos se produce la retencin de los materiales odontolgicos en fracturas, fisuras, ferulizaciones, etc [2]. La entrada de los microorganismos se produce, ya que para la retencin del material de restauracin, desde los comienzos de la odontologa, se han realizado tallados en forma de retencin mecnica en las piezas dentarias, formndose estos en la interfase restauracin-diente. 5. Paleontologa y Arqueologa: Caracterizacin de aspectos morfolgicos. 6. Control de Calidad: En este campo, el microscopio electrnico de barrido es de gran utilidad para el seguimiento morfolgico de procesos y su aplicacin en el control de calidad de productos de uso y consumo. Algunas industrias que lo utilizan son: 6.1. Fibras[3]: En fibras textiles el Microscopio Electrnico de Barrido se utiliza para examinar: Detalles superficiales de fibras Modificaciones en las formas de las fibras o en detalles superficiales Daado de fibras Construccin de hilos y tejidos Fractografa de fibras rotas por diferentes causas Urdimbre Dimensiones de caractersticas de fibras desde diferentes ngulos Un ejemplo de aplicacin de la SEM en fibras textiles es el caso de la diferenciacin entre la fibra de lana y las fibras denominadas especiales, tales como el mohair y el Kashmir. El precio de las fibras especiales es mayor que el de la lana, por lo que el fraude se puede presentar por etiquetar prendas de lana como compuestas por fibras especiales. La identificacin, es decir, comprobar si una fibra es lana o fibra especial se realiza en el SEM midiendo la altura de los bordes distales de las clulas cuticulares. Se admite que si estos bordes tienen una altura superior a 0,7 m la fibra es lana y si es inferior a 0,5 m se trata de una fibra especial. Ver figura 2. Otra utilidad es la deteccin de productos nocivos en ciertas fibras. La fibra de vidrio y la fibra mineral de amianto tienen algunas aplicaciones comunes en la industria. Por ejemplo

ambas se utilizan como aislantes trmicos y elctricos. El inters principal es detectar la la enfermedad denominada asbestosis, lo que hace que est altamente restringida su presencia de amianto, ya que el polvo de esta fibra es nocivo por inhalacin, produciendo aplicacin. Mediante el SEM se pueden distinguir estas fibras, ya que poseen una diferencia en dimetro, tal como se muestra en la figura 2.

Comparacin entre una lana y una fibra sintstica especial sealando con flechas la medida de los bordes distales d las clulas cuticulares con altura superior a 0,7um. Para la lana e inferior a 0,5um para la fibra especial. 6.2. Curtidos[3] Esta es una tcnica de fabricacin de cueros, mediante la cual se somete la piel de ciertos animales a una preparacin y tratamientos adecuados para transformarla en cuero, a fin de preservarla de la putrefaccin natural y de que conserve su flexibilidad y elasticidad al secarse, sin adquirir consistencia crnea. Por lo general, el cuero se somete a un proceso denominado aserrado, mediante el cual se divide en dos hojas, quedando as desdoblado en la parte correspondiente al pelo o exterior (forma de flor), de espesor uniforme, y la parte correspondiente al lado de la carne que conserva las irregularidades de espesor o grosor del cuero antes del aserrado. Por diferentes razones, la parte denominada flor est considerada de mayor calidad y por tanto es ms cara. Ver figura 3. Fig.

Fig.3 En la figura de la izquierda se muestra la superficie exterior, que al estar formada por clulas apretadas entre s, le dan un aspecto continuo (lo que le confiere una proteccin impermeable), la de la derecha revela fibras de tejido conjuntivo que aplastadas y alisadas imitan macroscpicamente la autentica superficie de la piel.

7. Peritajes: Estudios de muestras de cualquiera de las reas antes mencionadas. 8. Medicina Forense: Anlisis morfolgico de pruebas. 9. Botnica, Biomedicina y Medicina: Estudio morfolgico. 10. Estudio qumico y estructural de obras de arte, alteracin de monumentos, control de calidad, identificacin de pigmentos (restauracin, autentificacin) Como ejemplo prctico de este tipo de aplicacin, se puede ver la figura 4, donde se aprecia una muestra pictrica observada con un Microscopio Electrnico de Barrido. A partir de esta interpretacin se puede aportar una informacin especialmente valiosa para proceder a establecer la poca del cuadro, escuela pictrica y posibles intervenciones a las que ha sido sometida, tales como aplicacin de repintes, o tratamientos de restauracin anteriores

Figura 4 - Muestra pictrica observada con un Microscopio Electrnico de Barrido

11. Peritaciones Caligrficas: Estudio de trazos. 12. Electrnica: Control y calidad de partes electrnicas.

INTRODUCCION Un microscopio es, bsicamente, un sistema ptico que transforma un objeto en una imagen, la cual amplifica (magnifica) detalles caractersticos del objeto.

Con el microscopio de luz se resuelven detalles del orden del micrn, mientras que con el microscopio electrnico se alcanzan a resolver objetos del orden de los angstrom. En el microscopio electrnico, un haz de electrones incide sobre una muestra y de la interaccin de estos electrones con los tomos de la misma, surgen seales que son captadas por algn detector o bien, proyectadas directamente sobre una pantalla. Dentro de la familia de microscopios electrnicos, se encuentran el microscopio electrnico de transmisin (TEM) y el microscopio electrnico de barrido (SEM). Cada uno de ellos, permite el estudio de diferentes caractersticas de una muestra. El SEM provee informacin sobre morfologa y caractersticas de la superficie, mientras que con el TEM podemos observar la estructura interna y detalles ultraestructurales. Un gran avance se ha alcanzado con la incorporacin de tcnicas de procesamiento de imgenes para revelar detalles especficos de inters, algunos de ellos ligados a la ultraestructura de la muestra. COMPARACION ENTRE MICROSCOPIOS DE LUZ Y ELECTRONICO Los microscopios de luz y electrnico son esencialmente, idnticos. Tanto uno como otro nos permiten amplificar aquellos objetos que son indistinguibles a nuestro ojo. La diferencia fundamental entre los dos es la fuente de iluminacin. Mientras el microscopio de luz utiliza un haz de luz en el rango de las longitudes de onda del visible, el microscopio electrnico emplea un haz de electrones de muy corta longitud de onda que permite obtener una mayor resolucin. Una tabla comparativa, entre ambos microscopios se muestra a continuacin. Cabe destacar que la misma, involucra caractersticas generales de los microscopios electrnicos y no considera las diferencias particulares entre TEM y SEM. MICROSCOPIO DE LUZ Iluminacin Longitud onda Lentes Medio Resolucin Magnificacin Focalizacin Contraste Haz de luz de 2000 - 7500 Vidrio Atmsfera 2000 10 x - 2000 x Mecnica Absorcin - Reflexin MICROSCOPIO ELECTRONICO Haz de electrones 0.037 - 0.086 Electromagnticas Vaco 3 100 x x 450000

Elctrica Scattering

RESOLUCION

El concepto de resolucin est relacionado con la capacidad de distinguir detalles finos en una imagen. En otras palabras, es la distancia mnima r1 a la cual podemos distinguir, claramente, dos puntos como entidades separadas. La resolucin terica del microscopio electrnico es:

Para valores de = 0.037 y = 0.1 radianes, la resolucin nominal es 0.2 . NATURALEZA DE LAS ONDAS DE ELECTRONES De Broglie mostr que una partcula movindose a una velocidad cercana a la de la luz tena una forma de radiacin asociada con ella. Esta relacin est expresada por:

donde es la longitud de onda, h la costante de Plank, m la masa de la partcula y v su velocidad. Si la partcula es un electrn y su velocidad 1/3 de la velocidad de la luz, = 0.05 A. que es 100.000 veces ms corta que la luz verde. Por lo tanto, la resolucin de un microscopio que emplee este tipo de radiacin ser mucho mejor que la de un microscopio de luz. La naturaleza precisa de estas ondas de electrones es difcil de entender en trminos de la fsica clsica y su descripcin se hace mediante la mecnica cuntica. Las ondas de electrones se pueden pensar como un quantum o paquete de radiacin que acompaa a cada electrn en su trayectoria, es parte de l y permanece con l. Las caractersticas de estas ondas dependen de la posicin exacta de un dado electrn en el espacio y en el tiempo; puede expresarse como la probabilidad de encontrar al electrn en esa posicin. Las ondas de electrones no deben confundirse con radiacin electromagntica, como la que se produce cuando un haz electrnico interacta con la materia, pierde energa y produce una radiacin cuya longitud de onda pertenece al espectro electromagntico. MICROSCOPIO ELECTRONICO DE TRANSMISION EL INSTRUMENTO El sistema ptico-electrnico del microscopio constitudo por las siguientes partes: 1. Can de electrones 2. Sistema de lentes 3. Pantalla fluorescente electrnico de transmisin est

Estos componentes estn ensamblados en una columna vertical la cual se encuentra en alto vaco. El can de electrones, es la fuente emisora del haz de electrones. Se ubicado en la parte superior de la columna. Est constitudo por un (ctodo), un cilindro con una apertura central, llamado cilindro de Wehnelt al filamento y tiene un potencial ligeramente ms negativo que ste. El encuentra por debajo del cilindro de Wehnelt. encuentra filamento que rodea nodo se

El filamento es calentado por el pasaje de corriente (alrededor de 2800 K). Los electrones emitidos termoinicamente por el ctodo son acelerados hacia el nodo, pasan por la apertura circular central de ste y un haz de alta energa es emitido hacia la columna del microscopio. El sistema de lentes est formado por lentes condensadores objetivo, intermedia y proyectora. Las lentes condensadoras, en los microscopios, ms modernos son dos. La primera, proyecta la imagen punto de entrecruzamiento demagnificada (spot size), mientras que la segunda controla su dimetro y el ngulo de convergencia en que incide sobre la muestra. limita al haz que incide sobre la muestra. La lente objetivo forma la primera imagen, localizada debajo del especmen. Es considerada el componente ms importante del microscopio electrnico. Cualquier defecto en sta, ser magnificado y transmitido al resto del sistema ptico. Por lo tanto, de ella dependen, en gran medida, la resolucin final y la correccin de las aberraciones. Las lentes intermedia y proyectora son las encargadas de amplificar la imagen dada por la lente objetivo y proyectarla sobre la pantalla fluorescente. La pantalla del microscopio electrnico de transmisin est recubierta por una pintura de fluoruros de Zn y Cd, que fluoresce cuando es bombardeada por electrones, generando una imagen en el rango de las longitudes de onda del visible.

Mediante el microscopio electrnico de transmisin podemos estudiar la ultraestruacura de un material orgnico oinorgnico. Para esto, existen diferentes formas de operacin que posibilitan el estudio de una caracterstica en particular. Entre las aplicaciones del TEM para el estudio de materiales no- biolgicos y biolgicos podemos nombrar : 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Determinacin de estructura cristalina en minerales, metales, etc. Estudio de catalizadores. Determinacin de impurezas, precipitados,etc. Identificacin de bordes de grano e interfaces en metales. Estudio de fases y zonas cristalinas en polmeros. Determinacin de tamao de partcula en catalizadores, minerales,etc. Identificacin de planos cristalinos. Cambios estructurales de materiales sometidos a diferentes tratamientos trmicos. 9. Realizacin de estudios de histoqumica para identificxar compuestos especficos. 10. Estudios de ultraestructura de tejidos vegetales y animales. 11. Reconocimiento de virus. 12. Estudios de citoqumica. 13. Estudios de estructuras moleculares. MICROSCOPIA ELECTRONICA DE BARRIDO (SEM). El microscopio electrnico de barrido (SEM) es similar al microscopio electrnico de transmisin. Ambos tienen ciertas caractersticas comunes tales como un can de electrones donde se genera el haz de electrones, lentes condensadoras y objetivo, sistema de vaco. La diferencia principal entre ellos es la manera en que forman y magnifican la imagen. Esto hace que la informacin que se obtenga de cada uno sea

distinta. Mientras el TEM permite el estudio de la ultraestructura de muestras delgadas, el SEM posibilita conocer la morfologa superficial. En el microscopio electrnico de barrido, el haz electrnico, atraviesa la columna y llega a la muestra. Un generador de barrido es el responsable de producir el movimiento del haz , de manera que barra la muestra punto a punto. De la interaccin entre los electrones incidentes con los tomos que componen la muestra se generan seales, las cuales pueden ser captadas con detectores adecuados para cada una de ellas. El detector capta una seal y las convierte en una seal electrnica que es proyectada en un tubo de rayos catdicos (CRT). El barrido del haz est sincronizado con el barrido del CRT y produce una relacin uno a uno entre puntos de la muestra y puntos en el CRT. Un esquema del SEM se muestra en la siguiente figura.

Mediante el SEM se estudian: 1. Morfologa superficial de minerales, catalizadores, etc. 2. Electrodepsitos 3. Adherencia fibra-matrz en polmeros. 4. Cambios morfolgicos de materiales sometidos a tratamientos qumicos. 5. Formas de cristalizacin de minerales. 6. Control de calidad de catalizadores industriales. 7. Morfologa superficial interna de partculas polimricas. 8. Morfologa de tejidos u rgano animales y vegetales. 9. Estudio de molculas 10. Reconocimiento de fsiles. INTERACCION HAZ INCIDENTE - MUESTRA EN EL SEM. Naturaleza de la interaccin: Cuando el haz de electrones choca contra la muestra, ocurren interacciones entre dichos electrones y los tomos que componen la muestra. De all surgen seales tales como: electrones secundarios, electrones retrodifundidos, rayos x caractersticos, electrones Auger, catodoluminiscencia. Todas estas seales se

producen simultneamente pero cada una de ellas son captadas por detectores diferentes. Uno de los detectores ms comunes es el de electrones secundarios. Los mismos son emitidos desde la muestra como consecuencia de las ionizaciones surgidas de las interacciones inelsticas. Por esta razn, poseen baja energa (50 ev). Ellos brindan una imagen de la morfologa superficial de la muestra. UNIDADES DE MEDIDA EN MICROSCOPIA La unidad que se usa en microscopa de luz es el micrn () que es la milsima parte del milmetro. En microscopa electrnica la unidad ms conocida es el angstrom (), definido como la diez millonsima parte del milmetro. Tambin se emplea el nanometro (nm), que es la millonsima parte del micrn.

1 mm = 103 = 106 nm = 107 As, por ejemplo, la resolucin de un microscopio de luz es 0.25 2500 ; y la de un microscopio electrnico de 2.5 PEQUEA GALERA DE IMGENES DE MICROSCOPA ELECTRNICA

Detalle de epidermis de semilla de justicia. Fotografia tomada con el microscopio electrnico de barrido. (1cm=10 micras)

Micrografa electrnica de Transmisin de un polmero. (1cm=0.2 micras)

Vista general de un piojo (20X).(1cm=300 micras)

Detalle de ala de mariposa (220X). (1cm=30 micras)

Detalle de bacterias (bacilos) a 10000X. Las bacterias miden aproximadamente una micra.

Detalle de fibras de algodn (600X). (1cm= 10 micras)1. Introduccin La MEB naci en 1958por Manfred Von Arden cuando basndose en estudios experimentales construy un prototipo de microscopia de esta ndole. Sin embargo, no alcanz un completo desarrollo hasta los aos 60. Las dificultadas planteadas en el procesamiento de los especimenes biolgicos hicieron q las investigaciones realizadas sobre este material no avanzaran tanto como los estudios sobre materiales inorgnicos. Hoy da, subsanados casi todos los problemas relacionados con el proceso de las muestras, la MEB constituye un mtodo sumamente til para el estudio de la morfoestructura superficial de las muestras biolgicas y, en consecuencia, un medio complementario de anlisis q suministra importante informacin sobre la estructura de clulas y tejidos. En comparacin con la ME convencional, la MEB presenta dos ventajas: Permite observar reas mucho mayores sobre la superficie de los objetos. Puede proporcionar ms informacin sobre la estructura y composicin del objeto debido a la gran cantidad de interacciones q realizan los electrones del haz de observacin entre s y con el propio objeto de estudio. 2. Principios bsicos de la MEB En la MEB un haz de electrones emitidos por un filamento de tungsteno q acta como ctodo es dirigido hacia la muestra a travs de una columna incluida en el microscopio. Este haz se desplaza sobre la muestra realizando un barrido de su superficie q es proyectado sincrnica y simultneamente sobre la pantalla de observacin. Dependiendo de la seal detectada la informacin q proporciona el instrumento puede hacer referencia a:

Al poder de emisin de electrones secundarios arrancados de la muestra por el haz primario. A la capacidad de incluir cambios elctricos sobre un objeto q acta como semiconductor (efecto inducido). A la emisin de luminiscencia debido a la liberacin de fotones por parte del objeto sometido a la irradiacin electrnica. A la deteccin de los electrones residuales q atraviesan la superficie. Cuando la informacin hace referencia sobre todo a electrones absorbidos y al efecto de fotoluminiscencia se obtiene una imagen 3D del objeto de estudio. Los componentes bsicos del MEB son: Can de electrones: emiten los electrones q chocan contra el espcimen creando una imagen aumentada. Lentes magnticas: crean campos q dirigen y enfocan el haz de electrones. Sistema de vaco: es muy importante en el ME debido a q los electrones pueden ser desviados por el aire. Se debe hacer un vaco total (10-5Pa). Placa fotogrfica o pantalla fluorescente: se coloca detrs del objeto a visualizar para registrar la imagen aumentada. Sistema de registro: muestra la imagen q producen los electrones. Suele ser una computadora. 3. Procesamiento de las muestras Debido a la gran variedad de los materiales susceptibles de ser observados con MEB los criterios metodolgicos para su preparacin son a s mismo muy numerosos. No obstante, es posible esbozar una pauta general aplicable a muestras biolgicas. Lavado minucioso con suero salino de la superficie objeto de estudio. Fijacin del material: esta fase persigue dar una adecuada estabilidad a la muestra. Se usan fijadores qumicos del tipo de aldehdos. El ms usado es el glutaraldehido al 2.5%. La presin osmtica del fijador debe regularse usando un tampn tipo fosfato. Tb se puede usar el tampn cacodilato. El tiempo q debe permanecer la muestra en el fijador es variable y depende de la experiencia de cada laboratorio al igual q el tipo de solucin amortiguadora empleada. El tiempo suele oscilar entre 2-24h segn el tamao considerndose como tiempo medio 6h. Una vez fijadas las muestras se lavan en solucin amortiguadora, generalmente tres cambios de 10-15 min cada uno. Tratamiento postfijacin: esta fase es importante ya q previene la deformacin del secado al aire cuando no se dispone del procedimiento del punto crtico, aumenta la conductividad elctrica de la muestra y evita casi por completa la extraccin de los lpidos de las mbs durante la deshidratacin. Como agente postfijador se suele emplear el tetrxido de osmio al 1 o 2% en igual solucin amortiguadora k la usada para glutaraldehido y durante un tiempo entre 30min y 2h. Deshidratacin: es la liberacin de agua de los tejidos q debe realizarse de forma gradual en baos crecientes del agente deshidratante. Los ms usados son etanol, acetona y etilenglicol. Entre esta fase y la desecacin hay q usar lquidos intermedios.

Desecacin: es importante sealar q en MEB no vale con deshidratar es necesario conseguir una completa desecacin. Para ello se aplica casi siempre el mtodo del punto crtico q evita en gran medida los efectos de la tensin superficial. La muestra se coloca en una interfase de lquido y gas, el conjunto se lleva a una combinacin de presin y T a la cual la densidad del gas lleva a una T superior a la crtica sin modificar la presin. Todo el lquido pasar a gas sin atravesar las superficies celulares y del tejido incluyendo el contenido en la muestra con la q se evitan los defectos de arrastre y de tensin superficial q toda evaporacin supone. El procedimiento tcnico es : La muestra se pone en unas cestas con acetato de amilo, se baja la T a una inferior a 10C aadindole CO2 lquido q va a desplazar al acetato de amilo. Seguidamente se lleva la muestra al punto crtico del CO2 (31C y 74bar). Alcanzadas las condiciones se elimina el gas de la cmara y la muestra queda desecada. Montaje de las muestras: las muestras desecadas se colocan en soportes de aluminio especialmente diseados para el MEB usando como adherente sustancias conductoras como la plata coloidal. Es importante reiterar q en esta fase del proceso la manipulacin de la muestra suele ser extremadamente cuidadosa evitando daar o manchar la superficie a observar. Recubrimiento: esta ltima fase consiste en proveer a las muestras de una superficie conductora de la electricidad y del calor q facilite sin carga durante el barrido para lo cual es necesario usar carbn o metales pesados como oro, platino, aluminio... De entre las numerosas pautas existentes para el recubrimiento destaca el bombardeo inico en cmara de vaco. El procedimiento ms comn es la metalizacin con oro o doble metal con carbn y oro. Otro mtodo para obtener una superficie conductora es el recubrimiento por evaporarizacin tras calentamiento de un metal en cmara de vaco Otros mtodos ms antgenos son la inmersin simple en soluciones alcohlicas saturadas de cloruro de oro y secado al aire. Este es muy poco usado en la actualidad. 4. Variantes metodolgicas en MEB Criofijacin Sustituye a la fijacin primaria y consiste en la inmersin en lquidos criognicos (N2 lquido) evitando la movilizacin inica de las muestras. Previamente, se deposita el tejido sobre los portamuestras de barrido ya seas de aluminio o de grafito. El conjunto se sumerge en N2 lquido. Para evitar la formacin de microcristales por el importante cambio de T debe utilizarse un agente criognico intermedio como el Freon 22 lquido. En la actualidad, existen sistemas q en cmaras de vaco y a muy bajas T permiten realizar tras la criofijacin una deshidratacin progresiva q sustituye por completo al proceso convencional. Criofractura Corta o fractura las muestras a baja T tras producir un enfriamiento en N2 lquido. Proporciona una superficie q refleja fielmente las caractersticas del interior de las muestras. Tcnicas conductoras

El fin es aumentar la conductividad de las muestras biolgicas y, por tanto, la emisin de un mayor n de electrones secundarios en muestras en las q no se desean utilizar la metalizacin. Existen variantes metodolgicos de stos entre los q destaca la propuesta por Murakami q emplea la combinacin de dos cidos, el ac. tnico y tetrxido de osmio. De esta manera, las muestras no recubiertas presentan mejor resolucin y mayor contraste durante la observacin. 5. Aplicaciones de la MEB Paleontologa, cristalografa, microelectrnica, arte y ciencias de materiales, botnica, microbiologa, parasitologa, histologa y citologa. En general, tiene aplicaciones en todas aquellas ramas de la ciencia q tienen por objeto de estudio la morfoestructura de muestras, siempre q estas sean capaces de resistir un alto vaco. A continuacin, vamos a ver en sntesis diferentes aplicaciones de la MEB en biologa celular:

En el estudio de las poblaciones celulares del sistema inmunitario y sanguneo, la MEB est permitiendo tipificar nuevos patrones morfolgicos de superficie. As ocurre en las recientes descripciones de los linfocitos peludos y vellosos q definen morfolgicamente a dos formas particulares de leucemia.

Una tipificacin morfolgica similar se esta revelando importante en los estudios de proliferacin y renovacin de las poblaciones epiteliales de la morfologa cromosmica, espermetozoides, etc. Singular inters tiene la aplicacin de este tipo de microscopia a los procesos de biomineralizacin y, por tanto, a los tejidos duros al no se necesarios su decalcificacin. De este modo, ha sido posible realizar descripciones de esmalte, dentina, clculos urinarios, huesos, entre otros, tanto en condiciones normales como patolgicas y de experimentacin. Tb tiene su aplicacin tras la preparacin de moldes vasculares para conocer mejor la configuracin tridimensional, microvascular de diferentes rganos y sistemas. La MEB permite incorporar sistemas de deteccin de energa dispersiva de rayos X y electrones lo cual es til para la deteccin cualitativa y cuantitativa de distintos elementos qumicos. Permite visualizar estructuras artificiales teidas con elementos de elevado n atmico lo q posibilita la localizacin de diversas actividades enzimticas. La MEB ha proporcionado informacin sobre determinados receptores de mb. Las imgenes en 3D permiten ampliar conocimientos estructurales q quedaban parcialmente ocultos en el empleo exclusivo de la MO y MET.

FUNDAMENTOS DE LA TCNICA Cuando un haz de electrones incide sobre la superficie de un slido, tienen lugar varios fenmenos: reemisin de una parte de la radiacin incidente, emisin de luz, electrones secundarios y Auger, rayos X, etc. Todas estas seales se pueden emplear para obtener informacin sobre la naturaleza de la muestra (morfologa, composicin, estructura cristalina, estructura electrnica, etc.) y de hecho, los dos microscopios electrnicos de barrido con los que cuenta los Servicios Tcnicos de Investigacin, JEOL JSM-840 e HITACHI S-3000N, disponen de

detectores que permiten el anlisis de electrones secundarios electrones retrodispersados y rayos X caractersticos. La tcnica consiste, principalmente, en enviar un haz de electrones sobre la muestra y mediante un detector apropiado registrar el resultado de esta interaccin. El haz se desplaza sobre la muestra realizando un barrido en las direcciones X e Y de tal modo que la posicin en la que se encuentra el haz en cada momento coincide con la aparicin de brillo, proporcionalmente a la seal emitida, en un determinado punto de una pantalla. Las imgenes que se obtienen en el microscopio electrnico de barrido corresponden a electrones secundarios o electrones retrodispersados emitidos tras la interaccin con la muestra de un haz incidente de entre 5 y 30 KeV. La seal de electrones secundarios se forma en una delgada capa superficial, del orden de 50 a 100 . Al ser grande el nmero de electrones emitido se puede establecer un buen contraste. Por otra parte, al ser electrones de baja energa, menos de 50 eV, pueden ser desviados fcilmente de su trayectoria emergente inicial, y se puede obtener informacin de zonas que no estn a la vista del detector. Esta particularidad es fundamental para otorgar a esta seal la posibilidad de aportar informacin en relieve. La apariencia de la imagen es la que tendra una muestra que hubiese sido iluminada desde el detector y se estuviese observando desde el can de electrones. En cuanto a la seal de electrones retrodispersados, su principal utilidad reside en que su emisin, que se debe a choques de tipo elstico y por tanto con energa del mismo orden que la de los electrones incidentes, depende fuertemente del nmero atmico de la muestra. Esto implica que dos partes de la muestra que tengan distinta composicin se revelan con distinta intensidad aunque no exista ninguna diferencia de topografa entre ellas. Los electrones retrodispersados salen de la muestra en mayor cantidad en las direcciones prximas a la de incidencia, por lo que su deteccin se hace mejor en las proximidades del eje de incidencia. Finalmente, los Rayos X que se generan en una muestra sometida a bombardeo electrnico permiten identificar los elementos presentes y establecer su concentracin. Cuando una haz electrnico suficientemente acelerado incide sobre la superficie de un slido, se produce la ionizacin de los tomos presentes, esto es, la prdida de electrones internos. En este estado un electrn de una capa ms externa salta inmediatamente a la capa deficitaria, y rellena el hueco producido. Este salto implica una liberacin de energa, cuyo valor es igual a la diferencia entre las energas que tena cada electrn en su orbital correspondiente. Esta energa se manifiesta de dos formas: electrones Auger o rayos X y es nica para cada elemento. Cuando se representa la intensidad de esta radiacin electromagntica frente a su energa se obtiene un espectro de rayos X, constituido por una serie de picos, designados como lneas, de intensidad variable, a los que se denomina rayos X caractersticos, que est superpuesto a un fondo continuo de menor intensidad (Rayos X continuos). En algunos casos aparecen adems unas lneas satlite, asociadas a las lneas caractersticas.

APLICACIONES Las aplicaciones de la tcnica son muy numerosas tanto en Ciencia de Materiales, como en Ciencia Biomdica. Dentro de la Ciencia de Materiales destacan las aplicaciones en metalurgia, petrologa y mineraloga, materiales de construccin, materiales cermicos tradicionales y avanzados, electrnica, fractografa y estudio de superficies y composicin elemental de slidos en general. La microscopa electrnica de barrido tambin se aplica en botnica, en el estudio de cultivos celulares, en dermatologa, en odontoestomatologa y biomateriales, en hematologa, inmunologa, y en el estudio de la morfologa de preparaciones biomdicas en general.

Polen de Vrisea Incurvanta Fam. Bromeliaceae Cortesa de Mario Martnez Azorn

Radiolario Cortesa de Jos Enrique Tent Manclus. Dep. Ciencias de la Tierra

REQUISITOS Y LIMITACIONES Es fundamental que las muestras que vayan a ser observadas en MEB estn exentas de lquidos y adems que sean conductoras. Secado de las muestras: Las muestras que quieran ser investigadas mediante microscopa electrnica de barrido deben ser secadas antes de ser introducidas en el microscopio, de otro modo la baja presin en el mismo causar que el agua (y otros lquidos voltiles) se evapore saliendo violentamente del espcimen y alterando la estructura del mismo. Muestras con una rigidez inherente como metales, rocas, huesos, etc. se pueden secar al aire o en un desecador de vaco sin que su estructura sufra alteracin alguna. Sin embargo, las estructuras blandas con un alto contenido en agua se deformarn si se dejan secar al aire ya que las fuerzas de tensin superficial asociadas a la salida del agua causarn daos estructurales. Para evitar los efectos dainos que las fuerzas anteriormente mencionadas tienen en la estructura de los especimenes secados al aire, durante el proceso de secado debe pasarse el lmite entre la fase lquido-gas. Entre los mtodos que existen para conseguirlo se encuentra el mtodo del punto crtico en el cual el lquido pasa directamente a la fase gas. De este modo las fuerzas de deformacin se evitan debido a que el proceso de secado tiene lugar por encima del punto crtico del lquido, donde el lmite entre la fase lquida y la fase gas no existe. El punto crtico es aquel estado particular de un gas en el cual todava puede sufrir licuefaccin. Este estado viene determinado por la presin crtica y la temperatura crtica. Por encima de este punto el gas no puede experimentar licuefaccin debido a que el lmite entre la fase gaseosa y la fase lquida ha desparecido: En este punto el estado lquido y el estado gas son igualmente

densos. ste es el punto crtico. El lquido pasa a la fase gas sin pasar por el lmite de fases lquido-gas, y la muestra se seca sin los efectos dainos del secado en aire. Segn los valores de presin y temperatura crtica del agua, 228.5 bar y 374 C, si un espcimen contiene agua no puede ser secado mediante el mtodo del punto crtico ya que los valores tan altos de presin y temperatura podran destruirlo. As la muestra debe ser transferida a un agente apropiado, llamado fluido transicional, tal como es el dixido de carbono cuyos valores de punto crtico son considerablemente ms ventajosos, 73.8 bar y 31 C. Recubrimiento de las muestras no conductoras: Cuando se desea visualizar una muestra en un microscopio electrnico de barrido sta debe ser conductora ya que, de no ser as, se carga durante la irradiacin por una acumulacin de carga que desva el haz electrnico y, como consecuencia de ello aparecen distorsiones en la imagen. Una solucin a este problema es recubrir la muestra con una pelcula conductora, de espesor comprendido entre 10 y 25 nm. Las tcnicas empleadas para mejorar la conductividad de las muestras para su estudio al microscopio electrnico de barrido son la evaporacin trmica y el recubrimiento por sputtering. Ambas conducen a los mismos resultados pero los mecanismos son distintos. La eleccin del material con el que se va a recubrir la muestra dependen fundamentalmente del estudio que se va a realizar. As, para la observacin de imgenes de electrones secundarios el oro y el oro-paladio son los materiales que conducen a los mejores resultados; al ser elementos pesados, producen mayor emisin. Cuando lo que se pretende es realizar un estudio microanaltico es recomendable emplear carbono. El bajo nmero atmico de este elemento lo hace prcticamente transparente a los rayos X emitidos por la muestra. Tambin se emplean, a veces, aluminio, cromo, etc. El depsito de pelculas metlicas se puede realizar tanto por evaporacin trmica como por sputtering, pero cuando se recubre con carbono se utiliza habitualmente la evaporacin trmica.

DESCRIPCIN DEL EQUIPO Los dos microscopios electrnicos de barrido con los que se cuenta son:

JEOL JSM-840 El microscopio consta de un detector de electrones secundarios tipo centelleadorfotomultiplicador con resolucin de 4 nm, un detector de electrones retrodispersados tipo Si P-N con resolucin de 10 nm y un detector de rayos X tipo UHV Dewar Si(Li) de Bruker para microanlisis (EDS),capaz de detectar elementos de nmero atmico comprendido entre los del C y el U.

Para la observacin de muestras en este equipo los requisitos son que stas tengan ausencia de lquidos y que estn recubiertas con material conductor si no son conductoras.

HITACHI S-3000N El equipo consta de un detector de electrones secundarios tipo centelleador-fotomultiplicador con resolucin de 3.5 nm, un detector de electrones retrodispersados tipo semiconductor con resolucin de 5 nm y un detector de rayos X tipo XFlash 3001 de Bruker para microanlisis (EDS) y mapping, capaz de detectar elementos de nmero atmico comprendido entre los del C y el U.

Adems el equipo dispone del modo de trabajo en presin variable (para observacin de muestras no conductoras sin necesidad de recubrirlas con material conductor). Acoplada al microscopio se encuentra la unidad de criomicroscopa Oxford CT 1500 Cryostation mediante la cual se puede observar material biolgico fresco sin tratarlo previamente

Para la observacin de muestras en este equipo los requisitos son que stas tengan ausencia de lquidos y que estn recubiertas con material conductor, si no son conductoras, cuando se trabaje en el modo de alto vaco; no ser necesario en cambio cuando se trabaje en el modo de presin variable o bien con la unidad de criomicroscopa. El instrumental para la preparacin de muestras es el siguiente: Equipo de secado por punto crtico de la marca ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES, modelo EMS 850 Metalizador (Au) / Evaporador (C) de la marca BALZERS, modelo SCD 004 y otro modelo MED 020, ambos de bajo vaco.

EXPERIENCIA DEL EQUIPO Debido por un lado a la versatilidad de la tcnica y a que est

MICROSCOPIO DE TRANSMISIONUn microscopio electrnico de transmisin (TEM, por sus siglas en ingls, o MET, en espaol) es un microscopio que utiliza un haz de electrones para visualizar un objeto, debido a que la potencia amplificadora de un microscopio ptico est limitada por la longitud de onda de la luz visible. Lo caracterstico de este microscopio es el uso de una muestra ultrafina y que la imagen se obtenga de los electrones que atraviesan la muestra. Los microscopios electrnicos de transmisin pueden aumentar un objeto hasta un milln de veces.

ESTRUCTURA

Debido a que los electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz visible, pueden mostrar estructuras mucho ms pequeas. Las partes principales de un microscopio electrnico de transmisin son:

Can de electrones, que emite los electrones que chocan o atraviesan el espcimen (dependiendo que tipo de microscopio electrnico es), creando una imagen aumentada. Lentes magnticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones, ya que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios pticos no funcionan con los electrones. Sistema de vaco es una parte muy importante del microscopio electrnico. Debido a que los electrones pueden ser desviados por las molculas del aire, se debe hacer un vaco casi total en el interior de un microscopio de estas caractersticas. Placa fotogrfica o pantalla fluorescente que se coloca detrs del objeto a visualizar para registrar la imagen aumentada. Sistema de registro que muestra la imagen que producen los electrones, que suele ser una computadora.

El microscopio electrnico de transmisin emite un haz de electrones dirigido hacia el objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra. CAON CDE ELECTRONES De arriba a abajo, el TEM consiste en una fuente de emisin, que puede ser un filamento de tungsteno o bien una fuente de hexaboruro de lantano (LaB6). Para el caso del tungsteno el filamento puede ser o bien en la forma de una horquilla de pelo o bien pequeo y en forma de pa. Las fuentes de LaB6 utilizan un pequeo monocristal. Conectando dicho can a una fuente de alto voltaje (~120kV para muchas aplicaciones) comenzar a emitir electrones hacia el vaco. Esta extraccin de electrones suele reforzarse con la ayuda de un cilindro Wehnelt. Una vez extrados, las lentes de la parte superior del TEM manipulan los haces de electrones permitiendo su focalizacin al tamao deseado y su localizacin sobre la muestra. La manipulacin de los electrones se consigue mediante la combinacin de dos efectos fsicos. La interaccin de los electrones con un campo magntico hace que estos se muevan de acuerdo a la frmula vectorial F= (q.v) x B (siendo v y B, el vector velocidad del electro, B el vector campo magntico y "x" el producto vectorial). Este efecto permite que los electrones emitidos puedan ser manipulados por medio de electroimanes. Esta tcnica permite la formacin de una lente magntica de distancia focal variable, dependiendo de la distribucin del flujo magntico. Adems un campo elctrico puede deflectar la trayectoria de los electrones en un ngulo fijo. Mediante dos deflexiones seguidas pueden desplazarse

lateralmente las trayectorias de los electrones. Esta tcnica permite el desplazamiento lateral de los haces de electrones en el TEM, siendo esta operacin especialmente importante para el barrido de los haces en la variante STEM. De la combinacin de estos dos efectos as como del empleo de un sistema de visualizacin (tal como una pantalla de fsforo) se obtiene el nivel de control de los haces requerido para la operacin del TEM. Las lentes del TEM permiten realizar la convergencia de los haces y el control del ngulo de la misma. Dicho control se ejerce modificando la cantidad de corriente que fluye a travs de las lentes cuadrupolares y hexapolares y permite modificar los aumentos del TEM. La lente cuadrupolar consiste en un conjunto de cuatro bobinas situadas en los vrtices de un cuadrado. La lente hexapolar simplemente incrementa el grado de simetra del campo resultante. Tpicamente un TEM contiene tres conjuntos de lentes con muchas posibles variantes en la configuracin de las lentes, en particular la de TEM con filtrado energtico o EFTEM. Los conjuntos se denominan respectivamente lentes condensadoras o condensador, lentes de objetivo o simplemente objetivo y lentes de proyeccin o proyector. Las lentes condensadoras se encargan de la formacin inicial del haz tras la emisin de los electrones. Las lentes de objetivo focalizan el haz sobre la muestra y finalmente las lentes de proyeccin se encargan de expandir el haz reflejado hacia la pantalla de fsforo u otro dispositivo de visualizacin tal como pelcula. Los aumentos del TEM vienen dados por la razn de las distancias entre la muestra y el plano imagen del objetivo. Es de apreciar que la configuracin de un TEM vara significativamente segn su implementacin. As algunos fabricantes usan configuraciones especiales de lentes, tales como en instrumentos corregidos de aberracin esfrica, en particular en aplicaciones de alto voltaje en TEM de emisin de campo. El sistema de visualizacin en un TEM puede consistir en una pantalla de fsforo para observacin directa por el operador y opcionalmente en un sistema de registro de imgenes tales como pelcula o una retina CCD combinada con una pantalla de fsforo. Normalmente estos sistemas de visualizacin pueden ser intercambiados

Sistema de vacoPara conseguir el flujo ininterrumpido de electrones, el TEM debe operar a bajas presiones, tpicamente en el orden de 10 4 a 10 8 kPa. La necesidad de esto se debe a dos razones: primero, permitir una diferencia de voltaje entre el ctodo y tierra sin que se produzca un arco voltaico. Segundo, reducir la frecuencia de las colisiones de los electrones con los tomos del aire a niveles despreciables. Ya que el TEM, contrariamente a un CRT, es un sistema que debe permitir la reposicin de componentes, la insercin de muestras y, particularmente en modelos antiguos, el cambio de carrete de pelcula, se hace imprescindible la posibilidad de reproducir el vaco regularmente. Por ello los TEMs estn equipados con sistemas de bombeo completos y su sellado de vaco no es permanente.

El sistema de visualizacin en un TEM puede consistir en una pantalla de fsforo para observacin directa por el operador y opcionalmente en un sistema de registro de imgenes tales como pelcula o una retina CCD combinada con una pantalla de fsforo. Normalmente estos sistemas de visualizacin pueden ser intercambiados a conveniencia del operador.

Procedimiento para su usoPara utilizar un microscopio electrnico de transmisin debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de ngstroms. Los microscopios electrnicos de transmisin pueden aumentar un objeto hasta un milln de veces.

Base tericaTericamente la resolucin mxima d alcanzable con un microscopio ptico se encuentra en principio limitada por la longitud de onda de la luz que se utiliza para examinar la muestra, y por la apertura numrica NA del sistema.

Los fsicos de principios del siglo XX teorizaron sobre posibles maneras de superar las limitaciones impuestas por la relativamente grande longitud de onda de la luz visible (de 400 a 700 nm) mediante el uso de electrones. Como toda la materia, los electrones exhiben propiedades tanto de onda como de partcula (como ya propuso Louis-Victor de Broglie. Como consecuencia se puede hacer que un haz de electrones se comporte como un haz de radiacin electromagntica. La longitud de onda del electrn se obtiene igualando la ecuacin de de Broglie a la energa cintica de un electrn. Debe introducirse una correccin relativista adicional, ya que los electrones en un equipo TEM alcanzan velocidades prximas a la de la luz c.

En un microscopio electrnico los electrones se producen generalmente en un filamento, normalmente de tungsteno, parecido al de una bombilla, mediante un proceso conocido como emisin termoinica o bien mediante emisin de campo. Los electrones emitidos se aceleran entonces con ayuda de un potencial elctrico (medido en V, o voltios) y se focalizan mediante lentes electrostticas o electromagnticas.

HistoriaEl primer microscopio electrnico de transmisin fue desarrollado entre 1931 y 1933 por Ernst Ruska y sus colaboradores. La ptica bsica de ese primer microscopio electrnico se

mantiene hasta nuestros das; los cambios en los microscopios modernos consisten en adicionar ms lentes para incrementar el mbito de aumentos y darle mayor versatilidad. El primer microscopio electrnico de transmisin comercial lo construy Siemens en 1939...

AplicacionesLa principal funcin del microscopio electrnico de transmisin es estudio de los metales y minerales y el estudio de las clulas a nivel molecular. Siendo as un papel muy importante en la industria de la metalurgia. A su vez se utiliza en la microbiologa, para observar la estructura de los virus. Tambin es usado en Anatoma patolgica, para diagnosticar partiendo de la ultraestructura celular.

Comparacin de la formacin de la imagen en un microscopio de transmisin ptica, un microscopio electrnico de transmisin (TEM), un microscopio electrnico de barrido (SEM) y un tubo de rayos catdicos (CRT) de pantalla de TV.

POLIMERO

MITOCONDRIA