PRÁCTICA N°4.docx

7/21/2019 PRCTICA N4.docx

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I. INTRODUCCION

Se considera como antimicrobiana cualquier sustancia con capacidad de matar o

al menos de inhibir el crecimiento de los microorganismos y que sea susceptible

de utilizacin como tratamiento en los pacientes. Pueden ser naturales, sintticos

o semisintticos (modificacin qumica de un compuesto natural). La historia

moderna de los antibiticos comienza con el descubrimiento de sustancias

presentes en unos microorganismos capaces de matar a otros microorganismos.

La utilizacin de antibiticos supuso un avance enorme en la esperanza de vida de

las personas que padecan procesos infecciosos, aunque tambin supuso un

aumento en los niveles de resistencia antibitica.

El antibiograma es la prueba microbiolgica que se realiza para determinar la

susceptibilidad (sensibilidad o resistencia) de una bacteria a un grupo de

antibiticos. Es la principal prueba que determina el tratamiento especfico o

dirigido de las enfermedades de origen infeccioso.

El momento de empezar el tratamiento de un paciente que cursa una infeccin, se

inicia en base a los microorganismos ms frecuentes causantes de la patologa en

cuestin y la susceptibilidad a antibiticos previamente establecidos en estudios

previos, informacin presente en las guas de manejo de infecciones, este

tratamiento sin el aislamiento de germen causante del cuadro se denomina

tratamiento emprico.

Los antibiogramas son mtodos in vitro que determinan la susceptibilidad de los

microorganismos a una variedad de agentes antimicrobianos, bajo condiciones de

laboratorio especfica y estandarizada. La meta principal del estudio de

susceptibilidad es proveer al clnico algunas recomendaciones sobre la terapia que

puede ser ms apropiada en pacientes con una infeccin especfica.


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II. OBJETIVOS

Demostrar la sensibilidad in vitro de los microorganismos frente a los

antibiticos.

III. FUNDAMENTO TEORICO

El primer objetivo del antibiograma es el de medir la sensibilidad de una

cepa bacteriana que se sospecha es la responsable de una infeccin a

uno o varios antibiticos. En efecto, la sensibilidad in vitro es uno de los

requisitos previos para la eficacia in vivo de un tratamiento antibitico. El

antibiograma sirve, en primer lugar, para orientar las decisiones

teraputicas individuales.

El segundo objetivo del antibiograma es el de seguir la evolucin de las

resistencias bacterianas. Gracias a este seguimiento epidemiolgico, a

escala de un servicio, un centro de atencin mdica, una regin o un

pas, es como puede adaptarse la antibioterapia emprica, revisarse

regularmente los espectros clnicos de los antibiticos y adoptarse

ciertas decisiones sanitarias, como el establecimiento de programas de

prevencin en los hospitales.

Sensibi l idad bacteriana a los antib it icos

La determinacin de la Concentracin Inhibidora Mnima (CIM) es la base de la

medida de la sensibilidad de una bacteria a un determinado antibitico. La CIM

se define como la menor concentracin de una gama de diluciones de

antibitico que provoca una inhibicin de cualquier crecimiento bacteriano

visible. Es el valor fundamental de referencia que permite establecer una

escala de actividad del antibitico frente a diferentes especies bacterianas.

Hay diferentes tcnicas de laboratorio que permiten medir o calcular de rutina,

y de manera semicuantitativa, las CIM (mtodos manuales y mtodos

automatizados o semiautomatizados). Estos diferentes mtodos de rutina


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permiten categorizar una cierta cepa bacteriana en funcin de su sensibilidad

frente al antibitico probado. Esta cepa se denomina Sensible (S), Intermedia

(I) o Resistente (R) al antibitico.

Para un determinado antibitico, una cepa bacteriana es, segn la NCCLS:

Sensible, si existe una buena probabilidad de xito

teraputico en el caso de un tratamiento a la dosis habitual.

Resistente, si la probabilidad de xito teraputico es nula o

muy reducida. No es de esperar ningn efecto teraputico sea

cual fuere el tipo de tratamiento.

Intermedia, cuando el xito teraputico es imprevisible. Se

puede conseguir efecto teraputico en ciertas condiciones

(fuertes concentraciones locales o aumento de la posologa).

Ciertas molculas son representativas de un grupo de antibiticos. Los

resultados (S, I, R) obtenidos con estas molculas pueden ser ampliados a los

antibiticos del grupo, que en ese caso no es necesario ensayar (Ejemplo:

Equivalencia entre la cefalotina que se ensaya y las restantes cefalosporinas

de 1 generacin que no es necesario probar, ya que el resultado puede

deducirse del obtenido en la cefalotina).

Este hecho permite ensayar un nmero reducido de antibiticos, sin limitar por

ello las posibilidades teraputicas.

Resistencia bacteriana

Cada antibitico se caracteriza por un espectro natural de actividad

antibacteriana. Este espectro comprende las especies bacterianas que, en su

estado natural, sufren una inhibicin de su crecimiento por concentraciones de

su antibitico susceptibles de ser alcanzadas in vivo. A estas especies

bacterianas se les dice naturalmente sensibles a dicho antibitico. Las

especies bacterianas que no se encuentran incluidas dentro de dicho espectro

se denominan naturalmente resistentes.


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El antibitico no crea resistencia, pero selecciona las bacterias resistentes

eliminando las sensibles. Es lo que se conoce con el nombre de presin de

seleccin. El aumento de la frecuencia de las cepas resistentes va unido cas

siempre al uso intensivo del antibitico en cuestin.

La resistencia naturales un carcter constante de todas las cepas de una

misma especie bacteriana. El conocimiento de las resistencias naturales

permite prever la inactivdad de la molcula frente a bacterias identificadas

(despus del crecimiento) o sospechosas (en caso de antiboterapia emprica).

En ocasiones, constituye una ayuda para la identificacin, puesto que certas

especies se caracterizan por sus resistencias naturales. Ejemplos: Resistencia

natural del Proteus mirabilis a las tetraciclinas y a la colistina. Resistencia

natural de la Klebsiella pneumoniae a las penicilinas (ampicilina, amoxicilina).

La resistencia adquridaes una caracterstica propia de ciertas cepas,

dentro de una especie bacteriana naturalmente sensible, cuyo patrimonio

gentico ha sido modificado por mutacin o adquisicin de genes.

Contrariamente a las resistencias naturales, las resistencias adquiridas son

evolutivas, y su frecuencia depende a menudo de la utilizacin de los

antibiticos. En el caso de numerosas especies bacterianas, y teniendo en

cuenta la evolucin de las resistencias adquiridas, el espectro natural de

actividad no es ya suficente para guiar la eleccin de un tratamiento

antibitico. En ese caso, se hace indispensable el antibiograma.

Una resistencia cruzada es cuando se debe a un mismo mecanismo de

resistencia. En general, afecta a varios antibiticos dentro de una misma

familia (Ejemplo: La resistencia a la oxacilina en los estafilococos se cruza con

todas los -lactmicos). En ciertos casos, puede afectar a antibiticos de

familias diferentes (Ejemplo: La resistencia por impermeabilidad a las ciclinas

se cruza con la resistencia al coloranfenicol y al trimetoprima).

Un resistencia asociadaes cuando afecta a varios antibiticos de familias

dferentes. En general, se debe a la. asociacin de varios mecanismos de

resistencia (Ejemplo: La resistencia de los estafiolococos a la oxacilina va


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frecuentemente asociada a las quinolonas, aminoglicsidos, macrolidos y

ciclinas).

Con el fin de tener en cuenta la evolucin de las resistencias adquiridas y, por

consiguiente, proporcionar a los mdicos datos tiles cuando deben proceder ala eleccin emprica de una antibioterapia, la nocin de espectro clnico

completa la de espectro natural. Definido para cada antibitico, este espectro

clnico se incluye en el Resumen de las Caractersticas del Producto (RCP).

Este espectro integra no solamente datos bacteriolgicos (espectro natural,

frecuenca de las resistencias adquiridas), sino tambin datos farmacocinticos

y clnicos (las especies descritras en el espectro son aquellas para las que se

ha demostrado la actividad clnica del producto). El espectro clnico se revisa

regularmente para tener en cuenta la evolucin de las resistencias adquiridas.

Mtodos automatizados

La mayora de estos novedosos mtodos utilizan sistemas de microdilucin en medio

lquido sobre microplacas con pocillos en "U" e interpretan el crecimiento bacteriano en los

diferentes pocillos por medio de un autoanalizador (mediciones por turbidez o

fluorescencia) o, en el caso de los sistemas ms sencillos, por simple lectura ptica del

tcnico a travs de un visor invertido de espejo.
http://www.danival.org/microclin/antibiot/img/resist01.jpghttp://www.danival.org/microclin/antibiot/img/resist02.jpghttp://www.danival.org/microclin/antibiot/img/resist01.jpghttp://www.danival.org/microclin/antibiot/img/resist02.jpg


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Su manipulacin suele ser fcil y rpida, generalmente automatizada o semiautomatizada,

lo que los convierte en mtodos ideales para grandes volmenes de trabajo. Una de sus

grandes limitaciones es que slo ofrecen garanta para investigar microorganismos de

crecimiento rpido y que no tengan requerimientos especiales.

Antibiograma realizado por mtodo automtico

En esta fotografa se muestra un ejemplo de antibiograma realizado por un mtodo

automatizado.

En la imagen de la izquierda se muestra una vista general de una microplaca para

autoanalizador que incluye fase de identificacin y fase de antibiograma (panel microScan).

Las tres filas superiores de la microplaca son la zona de "identificacin" del

microorganismo, las cinco filas inferiores son el apartado "antibiograma".

La foto de la derecha, un plano ms cercano de la mitad inferior izquierda de la microplaca,

permite observar con ms detalle algunas filas de pocillos con diluciones seriadas de

algunos antibiticos. La dosificacin de cada antibitico aumenta, en cada fila, de izquierda

a derecha (obsrvese los rtulos bajo cada pocillo: 8-16 ... 1-2-8-16 ... 2-8-32). Los pocillos

que en la imagen muestran un color verde intenso tienen crecimiento bacteriano, o sea, el

antibitico en cuestin no impide el desarrollo del microorganismo a estudio. Los pocillos

transparentes marcaran los puntos de inhibicin de cada antibitico.

IV. MATERIALES

Cultivo de escherichia ecoli

Placas con agar Mueller- Hinton

Discos de sensibilidad

SSF

Pipetas

Hisopos

Regla


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V. PROCEDIMIENTO

Preparar 2 placas Petri con agar Mueller Hinton.

A partir de un cultivo fresco de las bacterias que hay que ensayar (E.

coli, Staphilococcus), inocular un raspado de la muestra en un tubo con

solvente.

Esterilizar la aza

bacteriolgica

a. Muestras frescasde la bacteria.

b. solvente a

utilizar

a. Tomar un raspado de la muestra (E. coli;

staphylococcus).

b. Colocarlo en el frasco con solvente (S.S.F)

Placas Petri con Agar

Mueller - Hinton


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Inocular la superficie de una placa de agar Mueller-Hinton con el hisopo

pasndolo uniformemente por toda la superficie en tres direcciones,

cubriendo as toda la superficie de las placas (1. E. coli; 2.

Staphylococcus).

Colocar el disco de antibitico (con pinzas estriles) sobre la superficie

del agar y apretarlo suavemente sobre la superficie del medio.

Hisopos

Finalmente, pasar el

hisopo por el reborde de

la placa.

Antibiticos a

utilizar en prctica

Esterilizar la

pinza

Tomar un disco

antibitico del frasco

(ATM, CRO, GM y IMA)

Colocarla sobre la

superficie del agar Mueller-

Hinton.

Colocar los 4 antibiticos sobre

ambas placas:

1. E. coli; 2. Staphylococcus.

Dejar secar 10 min con la tapa algo abierta (junto al mechero).


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Los discos no deben estar a menos de 15 mm de los bordes de la placa

y a unos 20 mm uno de otro para que no se superpongan las zonas de

inhibicin. (No mover los discos una vez implantados).

VI. RESULTADOS


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VII. DISCUSIONES

1. No basta con ver si las bacterias han crecido o no alrededor del antibitico

para saber si son o no sensibles. Hay que saber cuanto no han crecido.

Solo si el halo de inhibicin es suficientemente grande, usando elantibitico a la concentracin teraputica la que el antibitico puede

alcanzar en el lugar de la infeccin sin que se produzcan efectos txicos o

secundarios, se dice que la bacteria es sensible al antibitico. Por eso se

mide el efecto y se consultan las tablas.

2. Una vez sembrada una placa de un medio de cultivo adecuado y

colocados los distintos discos impregnados de antibitico y una vez

colocada a incubacin en la estufa durante unas horas, se procede a la

lectura de los resultados, que puede hacerse a intervalos peridicos,

basada en la medicin del halo de inhibicin. Segn la amplitud de este

halo los grmenes se clasifican en:

-RESISTENTES

-SENSIBLES

-MUY SENSIBLES

Debe tenerse presente que el dimetro del halo de inhibicin dependetambin de la difusibilidad del antibitico y, por tanto, no es una medida

absoluta de la eficacia.


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VIII. CONCLUSIONES

1. El antibiograma es la mnima concentracin de un antimicrobiano que

inhibe la multiplicacin y crecimiento visible de una cepa bacteriana en un

medio de cultivo.2. Mediante un antibiograma podemos establecer que tratamiento ser el ms

adecuado para el paciente afectado por una infeccin por la bacteria que

estemos estudiando.

3. Gracias a esta prctica aprendimos a realizar todo elprocedimiento para co

nocer la sensibilidad de un microorganismo a algn medicamento

determinado, realizando los procedimientos para encontrar la CMI y la CMB

mediante los mtodos de dilucin.

4. Los datos que proporciona el antibiograma son muy valiosos pero su

aplicacin no es tan sencilla. Para la prescripcin correcta de los

antibiticos hay que tener en cuenta siempre la naturaleza del proceso

infeccioso, el mecanismo de accin del antibitico, la toxicidad, las posibles

sensibilizaciones del paciente, la va de administracin, etc.

5. El antibiograma permite determinar in vitro la susceptibilidad de una cepa

bacteriana a varios antimicrobianos que son opciones de tratamiento para

ese agente infeccioso.

IX. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

Sham D. The role of clinical microbiology in the control and surveillance

of antimicrobial resistance. ASM News. 1996;62:25-9.

Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). Performance standards

for antimicrobial susceptibility testing; eighteenth informational

supplement. CLSI document M100-S19. Wayne, PA: CLSI; 2009.

http://www.danival.org/microclin/antibiot/_madre_antibiot.html
http://www.danival.org/microclin/antibiot/_madre_antibiot.htmlhttp://www.danival.org/microclin/antibiot/_madre_antibiot.html


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X. CUESTIONARIO

1. Qu opinara usted, si dentro de un ntido halo de observacin

desarrollan varias colonias?

Si aparece alguna colonia dentro de los halos, esto se debe a mutaciones

espontneas que hacen a algunas bacterias resistentes.

Cuando aparecen colonias dentro del halo, puede tratarse de mutantes

resistentes, contaminaciones, poblaciones heterogneas o cultivos mixtos y

conviene volver a identificarlas y realizar otra vez el ensayo de sensibilidad

antimicrobiana. Como regla general, no debe considerarse aquellas colonias

diminutas que aparecen en el halo de inhibicin y que han sido visualizadas

mediante luz transmitida o con ayuda de una lupa, a excepcin de

estafilococos resistentes a oxacilina o enterococos resistentes a vancomicina.

2. Qu factor tomara en cuenta para elegir un antibitico, adems del

resultado del antibiograma?

Factores microbiolgicos: Tipo de agente infeccioso y mecanismos de

resistencia descritos previamente en su especie.

Factores farmacolgicos: Tipo de antimicrobiano y parmetros de absorcin,

distribucin y eliminacin.

Factores del paciente: Tipo de infeccin. Factores de riesgo y estado general

de salud. Situacin inmunolgica e hipersensibilidad.

Experiencia anterior referente a los patrones de resistencia antibitica ms

habituales para cada especie.

3. Qu opinara si los discos antibiticos pertenecientes a un lote

producen efecto frente a un germen y discos del mismo antibitico de

otro lote no producen efecto alguno?

Se dira que es resistente se refiere a aquellos microorganismos que no se

inhiben por las concentraciones habitualmente alcanzadas en sangre/tejidos


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del correspondiente antimicrobiano, o a aquellos microorganismos en los que

existen

mecanismos de resistencias especficos para el agente estudiado en los que

no ha habido una adecuada respuesta clnica cuando se ha usado como

tratamiento el correspondiente antimicrobiano y con respecto al otro lote

diramos que es trmino sensible indica que la infeccin ocasionada por la

cepa para la que se ha determinado la CMI o su correspondiente halo de

inhibicin puede tratarse de forma adecuada empleando las dosis habituales

de antimicrobiano, en funcin del tipo de infeccin y de la especie considerada.

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