FRAGILIDAD OSMOTICA

OBJETIVO: Determinar la Fragilidad Osmótica de los eritrocitos a determinadas concentraciones de NaCl.

INTRODUCCIÓN

Fragilidad osmótica

Si una membrana separa dos soluciones que se encuentran en diferentes concentraciones de solutos, la diferencia de presión osmótica causa un flujo en sentido opuesto al de la presión.

El intercambio catiónico que produce la célula esta determinado por las propiedades de la membrana del hematíe, que controla el flujo pasivo de iones y la competencia metabólica de la célula, que determina a su vez el bombeo activo de los cationes contra los gradientes de concentración.(2)

Tanto el liquido intracelular como extracelular contienen proteínas no difusibles a través de la membrana debido a su gran tamaño. En condiciones normales no hay movimiento transmembranal de agua debido a que la osmolaridad total y la concentración de solutos no difusibles es igual a ambos lados de las membranas, en otras palabras, los líquidos intra y extracelulares son isoosmoticos e isotónicos entre si. Esta situación sin embargo, se puede alterar cuando disminuye la concentración de proteínas en el plasma sanguíneo como consecuente perdida de proteínas en la orina. Al disminuir la concentración de proteínas, este se hace hipotónico respecto del líquido circundante, el que a su vez se hace hipertónico respecto al anterior. (2)

Los términos hipertónico, hipotónico e isotónico, se refieren a los movimientos de agua que causan las perspectivas soluciones.

La fragilidad osmótica de los hematíes refleja su capacidad de captar una cierta cantidad de agua antes de la lisis. Viene dada por el cociente volumen/área de superficie. La capacidad del hematíe normal para soportar la hipotonicidad se debe a su forma bicóncava, que permite que la célula incremente su volumen en cerca de un 70% antes de que la superficie de su membrana se distienda; una vez que se alcanza este limite se produce lisis.(1)

Cuando existe una alteración de la forma, como por ejemplo, en la esferocitosis hereditaria, este limite disminuye y la hemolisis ocurre en presencia de soluciones salinas mas concentradas.(3)

El aumento de la fragilidad osmótica de los hematíes normales que se produce se debe a la hinchazón de las células asociadas con una acumulación de sodio que excede la perdida de potasio. Otra causa está relacionado con el incremento de la osmolaridad interna de los eritrocito por el reemplazo del polianión 2,3-DPG por Cl-, que ejerce aproximadamente 3.7 veces más efecto osmótico.(1)

El test de fragilidad osmótica que consiste en mezclar sangre del paciente con soluciones decrecientes de NaCL y medir la hemolisis que se produce para cada una de alas. Prueba se basa en la pobre capacidad del esferocito para soportar la hipotonía del medio externo.

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FRAGILIDAD OSMOTICA

La medición de la fragilidad osmótica eritrocitaria nos da una información valiosa sobre la normalidad de los hematíes del paciente, ya que un resultado anormal indica la presencia de una anomalía.(4)

El aumento de la fragilidad osmótica o la reducción de resistencia a la hemolisis es un rasgo de los esferocito, por los tanto esta prueba puede indicar esferocitosis congénita, anemia hemolítica idiopática adquirida, enfermedad hemolítica isoinmune del recién nacido, y otras anemias hemolíticas, por consiguiente se muestra un cuadro de enfermedades identificadas de acuerdo al aumento o disminución de la fragilidad osmótica. (6)

ENFERMEDADES QUE CURSAN CON ALTERACIONES DE FOEAUMENTO DE LA FOE DISMINUCION DE LA FOE

Esferocitosis hereditaria TalasemiasEstomatocitosis congénita o hidrocitosis Anemia ferropenicasAnemia hemolítica autoinmune con esferocitosis Hemoglobina SAnemia hemolítica microangiopatica Hemoglobina C

FARMACOS QUE AFECTAN LOS GLOBULOS ROJOS SULONAMIDAS Sulfametoxazol, sulfacetamida, silfanilamidaSULFONAS Dapsona, tiazolesulfonaNITROFURANOS NitrofuratoinaANALGESICO AcetanilidaDIVERSOS Azul de metileno, fenilhidrazina, naftaleno.

Comúnmente estas drogas están asociadas a hemolisis por oxidación.

A veces el fármaco actúa como un hapteno y el eritrocito actúa como un portador. En este caso, se producen anticuerpos fijadores de complemento que provocan la aparición de la hemolisis intravascular. Otras veces el anticuerpo es una IgG no fijadora de complemento dirigida contra el fármaco y se produce una anemia parecida a la provocada por anticuerpos calientes, con hemolisis extravascular.

Una alteración importante que causa hemolisis eritrocitaria es la deficiencia de glucosa-6- fosfato deshidrogenasa (6GDP), las alteraciones de las enzimas que intervienen en el cortocircuito de la hexosa o en el metabolismo del glutatión, disminuye la capacidad de los eritrocitos para protegerse de la lesión oxidativa que los fármacos provocan y por consiguiente causan una anemia hemolítica.

La 6GDP es un compuesto  comprometido en diversos procesos fisiológicos, por ejemplo defensa antioxidante. GSH son los responsables del potencial redox efectivo para proteger del estrés oxidativo tanto a los grupos sulfhidrilo de la membrana celular, como a las enzimas y a la hemoglobina que compromete la supervivencia del eritrocito

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El mecanismo exacto de destrucción de los glóbulos rojos por estos fármacos todavía no está esclarecido. Compuestos como el azul de metileno y el monosulfato de fenacina oxidan directamente el NADPH a NADP+. Otros como el ascorbato, la nitrofurantoína y el doxorubicina oxidan el GSH. Hay otros compuestos químicos como la primaquina y el daunorubicina que oxidan tanto al NADPH como al GSH. Los episodios típicos de hemólisis se producen de 1 a 3 d después de la administración del fármaco.

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FUNDAMENTO

La membrana eritrocitaria es semipermeable, es decir, permite el libre paso de agua a través, pero restringe el de ciertos solutos iónicos (Cl, K, Na). La medida de la capacidad de una población de eritrocitos para resistir el efecto hipotónico del medio se denomina fragilidad osmótica eritrocitaria. Por lo tanto ciertas soluciones producen cambios en los eritrocitos.(3)

Hipertonía

Si se colocan glóbulos rojos en una solución hipertónica, es decir, de concentración iónica superior en el exterior de la célula, a la del interior de esta misma, se produce un flujo de agua desde el interior de la célula hacia el exterior, por lo tanto pierde agua y de deshidrata, esto produce el efecto conocido como crenación de las células, lo que significa que adquiere un aspecto dentado por diminución de su volumen.

Isotonía

Si las células son colocadas en una solución hipotónica con respecto a la concentración interna se produce el efecto contrario, es decir el ingreso de agua a la célula y por consecuencia, una hidratación del eritrocito.

Hipotonía

Si la hipotonía del medio supera cierto límite, las células se hinchan por efecto del aumento de volumen llegando eventualmente a romper la membrana, se aprecia una alteración de la membrana por la cual se produce una salida masiva de la hemoglobina hacia el medio. El proceso de ruptura de la pared celular se denomina hemolisis, cuando la hipotonía es absoluta la hemolisis es del 100%.

Por estos motivos es importante cuando una persona requiere que se le suministran soluciones intravenosas están sean isotónicas con los fluidos intracelulares. Si esta precaución no es tenida en cuenta se puede producir la crenación o la hemolisis con graves consecuencias para la salud del paciente.(4)

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MATERIAL Y REACTIVOS

Espectrofotómetro

Tubos de ensaye

Material para venopuncion.

Pipetas

Puntillas

Muestra hematológica

Solución salina amortiguadora NaCl.

Nota: concentración de solución salina a utilizar.

0.9%

0.85%

0.55%

0.50%

0.45%

0.33%

0.10%

PROCEDIMIENTO

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FRAGILIDAD OSMOTICA

1.- obtener una muestra hematológica en un tubo con anticoagulante.

2.- preparar las soluciones salinas con sus respectivas concentraciones y colocando 5 ml de las diferentes concentraciones en 7 tubos.

Nota: se coloco 5 ml de solución salina 0.9% en un tubo de ensaye el cual se utilizo como blanco para la calibración del espectrofotómetro.

3.- agregar a cada tubo 0.05 ml de la muestra hematológica, mezclando inmediatamente y dejar reposar por 30 minutos.

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Se preparan las soluciones a diferentes concentraciones.

Se coloca 5 ml de solución salina a diferentes concentraciones en cada tubo de ensaye

FRAGILIDAD OSMOTICA

Nota: este paso se realizo por duplicado, ya que se tomo muestra de otro compañero, para observar posteriormente la diferencia de absorbancia.

4.- mezclar nuevamente y centrifugar a 2000 rpm durante 3 minutos.

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Esta imagen muestra la coloración que toman al momento de mezclar las soluciones salinas con la sangre.

Respectivamente se coloco 0.05 ml de muestra biológica a cada tuvo con las diferentes concentraciones de NaCL

Se mezclaron bien las muestra, teniendo la precaución de colocarle un trozo de papel parafilm para que no se derramara la muestra, y se mezclara mas uniformemente.

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5.- aspirar el sobrenadante (no decantar), y leer la absorbancia de cada tubo en el espectrofotómetro.

RESULTADO

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Se absorbe el sobrenadante cuidando no mezclar la muestra con el sedimento

Se coloca aprox. 1 ml de muestra en las cubetillas respectivas del espectro, teniendo la precaución de que estas se encuentren en buen estado sin ralladuras, ni sucias.

Se colocan las cubetillas en orden dentro del espectro.Se procede a leer las

muestras con diferentes concentraciones de NaCL.

Las mezclas se colocan en la centrifuga, esto con el fin de sedimentar el resto de células rojas que no hayan tenido reacción con las soluciones salinas y así poder obtener un sobrenadante que se utilizara posteriormente.

FRAGILIDAD OSMOTICA

CONCENTRACIONES % DULCE X

0.9%

0.85% 0.043 0.032

0.55% 0.048 0,059

0.50% 1.029 1.050

0.45% 1.093 1.061

0.33% 1.116 1.068

0.10% 0.514 0.510

OBSERVACIONES

La concentración 0.33% se utilizara como el 100% de hemolisis, ya que la concentración 0.10% no dio la absorbancia requerida, seguramente por contaminación el momento de preparar la solución salina con su respectiva concentración.

VER HOJA ANEXA

CONCLUSION

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ABSORBANCIA

FRAGILIDAD OSMOTICA

La prueba de Fragilidad Osmótica es un test que ayuda a determinar, la susceptibilidad de los eritrocitos a deformaciones, descubriendo la capacidad del glóbulo rojo en absorber agua sin explotar, probada con diferentes concentraciones de solución salina, ya sea isoosmoticas, hipotónicas o hipertónicas.

El test puede realizarse por investigación medica de salud, sospecha de enfermedad o toxicidad, de igual manera para determinar la efectividad del ciertos medicamentos, algunos antes mencionados.

Este test tiene un papel importante en la identificación de ciertas enfermedades, donde la mas recurrente es la esferocitosis, aunque el incremento en la fragilidad es una propiedad de la forma relativamente esferoide de la célula y es independiente de la causa de la esferocitosis, aunque conociendo las concentraciones de la solución a la que se exponen los glóbulo rojos, se determina con veracidad la presencia de esta enfermedad o de algún otro padecimiento.

Existen otras pruebas que se basan en principio similares, como el test de autohemolisis, la lisis en glicerol acidificado o el estudio de la deformabilidad eritrocitaria. (5)

BIBLIOGRAFIA

1) Lewis, S. “ Dacie And Lewis Hematologia Practica”.(10ª Edición).Edit. Elsevier España. Pag 183.2) Julio, E. & Garcia, J.(1998). “Fisiologia I. Celulas, Organos Y Sistemas”. Impreso En Mexico.

Pag. 121.3) Lluis, J. & Corrons, J.(2006). “Manual De Tecnicas De Laboratorio En Hematologia”.(3ª

Edición). Edit. Elsevier Masson. Pag. 469.4) Eduardo, J.; Hector, S. &Oscar, H. (2006).“Qumica General”.(2ª Edicion). Edit. Universidad

Nacional De Litoral.5) Jesus, F. & Fermin, M.“ Hematología, Manual Básico Razoinado”. (3ª Edición). Edit. Elsevier

España. Pag. 316) Miale, J. “Hematologia: Medicina De Laoratorio”.(6ª Edición). Edit. Reverte. Pag, 650.

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