Seminario 7-Inhibicion enzimatica

5/16/2018 Seminario 7-Inhibicion enzimatica - slidepdf.com

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Inhibición enzimática

La actividad de una enzima puede ser disminuida o eliminada completamente por la

acción de ciertas sustancias a las cuales se las conoce con el nombre genérico de

inhibidores enzimáticos. Debemos aclarar que no deben ser incluidos en este grupode sustancias, aquellos agentes que producen simplemente una destrucción irreversible

de la enzima, como podrían ser todos aquellos que conducen a su desnaturalización,

como por ejemplo los ácidos fuertes.

La inhibición enzimática es de gran importancia fisiológica, ya que a veces la inhibición

de una sola enzima que forma parte de una cadena de reacciones metabólicas puede

inhibir por completo a todo el proceso metabólico involucrado y ejercer en esa forma un

efecto profundo y a veces fatal sobre el organismo. De más está recalcar la importancia

que este fenómeno tiene en farmacología y toxicología como así también en el

desarrollo de herbicidas e insecticidas. De ahí que el estudio del mecanismo de acción

de los inhibidores se haya constituido en una de las más exploradas de la enzimología

práctica.

Los inhibidores pueden clasificarse en dos grandes grupos:

1) Irreversibles. 2) Reversibles

i) competitivosii) no competitivos

En el primer caso la enzima no recobra su actividad por remoción del inhibidor libre.

Esto es debido a que el inhibidor irreversible, actúa por lo general modificando

irreversiblemente o aún destruyendo algunos de los grupos esenciales del centro activo.

En el segundo caso, la enzima recobra su actividad por remoción del inhibidor libre (por

ejemplo por simple diálisis). Lo cual demuestra que hay un equilibrio entre el inhibidor

libre y la enzima. Ejemplos de uno y otro tipo de inhibidores los encontramos entre

los llamados reactivos de tioles. Estas sustancias tienen la particularidad de reaccionar

específicamente con grupos sulfhidrilos de las proteinas, aportados por los grupos

laterales correspondientes a los residuos de cisteína. Existen ciertas enzimas que

requieren para actuar que algunos de esos grupos sulfhidrilos estén libres. Es evidente

que en esos casos los reactivos de tioles, al bloquear los grupos sulfhdrilos esenciales de

estas enzimas, pueden actuar como inhibidores. Entre algunos reactivos de tioles

podemos mencionar al p-cloromercuribenzoato y el alquilante iodoacetato, que

ejemplifican a un inhibidor reversible y aun inhibidor irreversible respectivamente.Ambos reaccionan con los grupos sulfhidrilos libres (-SH) de las proteinas, pero en

tanto que el primer lo hace formando un complejo reversible (mercaptida), el segundo

forma un carboximetil-derivado de gran estabilidad, incapaz de disociarse.

Cl-Hg COO- Hg COO- + ClH

Enzima Enzima inactivaP-cloromecuribenzoato

↔



En el primer caso, una vez establecido el equilibrio, si se elimina el p-

cloromercuribenzoato, la reacción, por el principio de acción en masa, se va a desplazar

hacia la izquierda, disociándose el complejo enzima-inhibidor en enzima libre e

inhibidor. Si la eliminación es total, toda la enzima recuperará su forma libre activa.

En cambio, en el segundo caso, una vez formado el carboximetil-derivado, es imposibledisociarlo dada su extraordinaria estabilidad, por ende, la eliminación del exceso del

inhibidor será ineficaz para hacer recuperar la actividad original.

Otro ejemplo de inhibición irreversible es el representado por los llamados gases

neurotóxicos que se desarrollaron durante la 2ª guerra mundial, para ser utilizados como

gases de guerra.

Son sustancias que reaccionan con el grupo alcohólico del resto lateral correspondiente

a la serina de algunas enzimas que tienen un hidroxilo en el centro activo y que es

necesario para que la enzima presente actividad.

Una enzima de ese tipo es la acetilcolinestearasa que interviene en los procesos de

transmisión del impulso nervioso, causando entre otros efectos, parálisis de los

músculos estriados.

acetilcolinestearasaAcetilcolina + H2O↔ colina + acetato

Una de las primeras sustancias que se utilizó con es fin es el diisopropilfluorofosfato

que reacciona con la enzima en la siguiente forma.



Se lo utilizó también como insecticida (pertenece al grupo de los organofosforados). Es

muy efectivo pero sumamente peligroso por su volatilidad.

Vamos ahora a referirnos exclusivamente a la inhibición reversible en la cual el

inhibidor también interactúa con algún grupo esencial de la enzima, pero haciéndolo en

forma reversible. Las distintas formas de interacciones se traducen en varios tipos deinhibición perfectamente diferenciables experimentalmente. Los dos tipos más comunes

son la competitiva y la no competitiva.

En la inhibición competitiva el inhibidor se combina reversiblemente con la enzima en

el sitio por el cual se debería unir el sustrato, impidiendo por lo tanto la formación del

complejo activo enzima-

sustrato. De ahí el nombre de

competitiva porque

efectivamente tanto el

inhibidor como el sustrato

compiten por el mismo sitio y

tratan de desplazarsemutuamente de la enzima. Las

posibles formas de reaccionar

del sustrato y el inhibidor con

la enzima pueden presentarse

por las ecuaciones:

Por ello este tipo de inhibición se caracteriza en que puede disminuirse

considerablemente aumentando la concentración de sustrato.

En este tipo de inhibidores se incluyen sustancias que estructuralmente son muy

parecidas al sustrato y que por lo pueden ocupar el lugar que ocuparía el mismo sobre la

enzima pero que no pueden ser atacas por la misma.

Un ejemplo clásico de este tipo de inhibición es el de la inhibición de la succinatodeshidrogenasa, enzima que tiene por sustrato el ácido succínico, por otras sustancias

estructuralmente parecidas al ácido succínico, como el ácido malónico, el ácido oxálico,

y el ácido glutárico.

Ácido succínico

Ácido malónico

Ácido oxálico

Ácido glutárico

Ácido succínico

Ácido malónico

Ácido oxálico

Ácido glutárico



En la inhibición no competitiva, se postula que el inhibidor se une con la enzima en

otro sitio, que no es aquel por el cual se une el sustrato. Por esa razón la unión del

sustrato con la enzima no es

afectada por la presencia del

inhibidor y se puede formar

entones un complejo enzima-sustrato-inhibidor. Pero este

complejo es catalíticamente

inactivo y no puede escindirse en

productos de la reacción y

complejo enzima-inhibidor. En

este caso, las posibles formas de

reaccionar del sustrato y el

inhibidor con la enzima se

representan por las ecuaciones

siguientes.

Este tipo de inhibición se caracteriza entonces porque no puede ser revertido por unaumento de la concentración de sustrato. El sustrato no puede desplazar al inhibidor

unido a la enzima. Experimentalmente ambos tipos de inhibición pueden distinguirse

fundamentalmente mediante la aplicación del método de Lineweaver y Burk antes

descripto a la reacción enzimática con y sin inhibidor en cuyos respectivos casos se

obtendrán los gráficos indicados en las figuras siguientes.

Como puede apreciarse en el gráfico, en el caso de la inhibición competitiva la Vmáx

para una dada cantidad de enzima no se modifica por el agregado de inhibidor porque

agregando una concentración lo suficientemente grande de sustrato se puede desplazar

completamente al inhibidor. Sin embargo, el Km aumenta porque la presencia del

inhibidor hace que se necesite una mayor cantidad de sustrato para saturar a la enzima

que la que se necesitaría si el inhibidor no estuviera presente.

En contraposicion a lo anterior, en la inhibición no competitiva, el inhibidor disminuye

el valor de la Vmáx sin modificar la Km ya que la unión del sustrato a la enzima noestá alterada por la simultánea unión del inhibidor.

Sin inhibidor

1/(S)-1/Km -1/Km inh

0

1/Vo

1/Vmáx

Sin inhibidor Vmáx

Vmáx/2

Km Km inh(sustrato)

10

Vo

sin inhibidor

con inhibidor

Michaelis-Menten Lineweaver-Burk

Inhibición competitiva

Sin inhibidor

1/(S)-1/Km -1/Km inh

0

1/Vo

1/Vmáx

Sin inhibidor Vmáx

Vmáx/2

Km Km inh(sustrato)

10

Vo

sin inhibidor

con inhibidor


Inhibición competitiva



En resumen.

Tipo deInhibicion

reversible

Sitio de unión de la

enzima

En presencia

del inhibidor

esquema

competitiva

- La unión del substrato y

del inhibidor son

mutuamente excluyentes

- A muy altas

concentraciones de

sustrato desaparece la

inhibición

- Por lo general, el

inhibidor competitivo esun análogo químico del

substrato.

- el valor deKm aumenta

- Se mantieneel valor deVmáx

no

competitiva

- Se une a un lugar

diferente del sitio activo la

enzima

- Se une a la enzima libre

y también al complejo

enzima-sustrato

- El valor deKm semantiene

- Disminuye elvalor deVmáx

1/(S)

1/Vo

-1/Km

1/Vmáx inh

1/Vmáx

(sustrato)

Vo


Inhibición NO competitiva

Vmáx

Vmáx/2

Vmáx inh

Vmáx inh/2

Km = Km inh

sin inhibidor

con inhibidor

sin inhibidor

con inhibidor

1/(S)

1/Vo

-1/Km

1/Vmáx inh

1/Vmáx

(sustrato)

Vo


Inhibición NO competitiva

Vmáx

Vmáx/2

Vmáx inh

Vmáx inh/2

Km = Km inh

sin inhibidor

con inhibidor

sin inhibidor

con inhibidor



Enzimas alostéricas

Las enzimas a las cuales nos hemos referido hasta este momento, enzimas michaelianas,

corresponden a lo que se ha dado en llamar enzimas clásicas. Pero además existen

ciertas enzimas con características regulatorias que poseen propiedades que las

distinguen de las primera y que e denominan enzimas alostéricas.

Las enzimas alostéricas como las clásicas reconocen y se asocian en su centro activo a

un sustrato específico y catalizan su conversión en productos. Pero además estas

enzimas tienen la propiedad de reconocer selectivamente a uno o varios compuestos

distintos del sustrato cuya asociación reversible con la proteina tiene por efecto

modificar su actividad frente al sustrato, ya sea activándolo o inhibiéndolo, sin

participar en nada en la reacción en sí. Dichos compuestos que reciben el nombre de

efectores o moduladores alostéricos interaccionan con la enzima en un sitio distinto y

generalmente distante del centro activo que recibe el nombre de sitio alostérico. Se

acepta que la asociación del efector alostérico a la proteina en el sitio alostérico

produce una alteración de la configuración espacial de la enzima (transición alostérica)

que se transmite al centro activo modificándolo de tal manera que la actividad de la

enzima aumenta o disminuye según se trate de un efector o modulador alostérico

positivo o negativo respectivamente.

Las enzimas alostéricas tienen por lo general una estructura proteica más compleja que

la de las enzimas no regulables, están constituídas por subunidades. Además puden

responder a la acción de más de un efector alostérico (positivos y negativos), en cuyo

caso poseen en su estructura un sitio alostérico distinto para cada uno de ellos.

Desde ese punto de vista las enzimas alostéricas pueden clasificar en tres grandes

grupos:

a) Homotróficas: en las cuales el mismo sustrato puede actual como modulador,generalmente positivo.

b) Heterotróficas: aquellas que son moduladas positiva o negativamente por

sustancias distintas del sustrato para cada una de las cuales la enzima posee un

sitio específico de reconocimiento, y

c) Homotróficas-heterotróficas: responden a efectos regulatorios del mismo

sustrato y de sustancias distintas del mismo

Desde el punto de vista metabólico, estas enzimas, que generalmente catalizan

reacciones prácticamente irreversibles, se encuentran ubicadas estratégicamente en

ciertos puntos de las vías metabólicas, de tal manera que su regulación coopera enforma efectiva en la economía general de la célula. Así por ejemplo las encontramos

como primera enzima de una secuencia de reacciones de tal manera que su activación o



inhibición aumente o disminuya respectivamente la velocidad de toda la vía metabólica

involucrada de acuerdo a las necesidades de la célula.

Modelos para las enzimas alostéricas

Se han propuesto algunos modelos para interpretar las interacciones entre la proteina, elsustrato y el o los efectos de las enzimas alostéricas. Entre ellos vamos a describir

brevemente los debidos a Monod, Wyman y Changeux (1965) y a Koshland,Nemethy y Filmes (1966).

El primero de ellos, conocido con el nombre de modelo concertado simétrico, parte

del supuesto de que la proteina regulatoria (oligómero) consiste de dos o más

subunidades idénticas (protómeros) que se asocian de tal manera que la molécula posea

por lo menos un eje de simetría. Cada subunidad contiene un sitio de unión para cada

sustrato y efector manteniéndose la simetría de la molécula. Cada subunidad puede

existir en dos estados conformacionales distintos denominados estados R y T, que

difieren en la posibilidad que poseen de unirse al o los sustratos y los efectores. Así R

tiene afinidad por el sustrato mientras que T tiene baja afinidad por el mismo. Latransición de una conformación de una subunidad es concertada con la correspondiente

transición en las subunidades vecinas de tal manera que todas las subunidades se

encuentren en el mismo estado conformacioneal simultáneamente y la simetría

molecular se mantenga. Por otra parte el equilibrio entre la forma R y la forma T, se

establece en ausencia de los sustratos y efectores.

En la figura se representaesquemáticamente este modelo para

una proteina oligométrica

constituida por dos subunidades en

la cual sustrato S y el efector

positivo A se unen sólo al estado R,

mientras que el inhibidor I lo hace

exclusivamente al estado T. En

ausencia de sustrato y activador el

equilibrio entre los estados T y R

está desplazado hacia el estado T, es

decir la mayor parte de lasmoléculas de la enzima se



encuentran al estado T, pero al agregarse el sustrato S o el activador A, y al unirse

selectivamente estos ligandos a las moléculas que se encuentran en el estado R, el

equilibrio se desplaza en este sentido. Como la transición entre las formas T y R para

las subunidades es concertada, es suficiente la unión de la molécula de sustrato o

activador a una sola de las subunidades para que la otra quede en la forma R dejando de

esa forma disponible otro sitio de más alta afinidad para el sustrato. Cuanto mássustrato o activador se agregue mayor será el número de oligómeros en la forma R,

observándose en consecuencia lo que se denomina un efecto coorperativo positivo del

estrato y del activador, que se traduce en una curva de saturación sigmoide. En el

primer caso (sustrato) y de acuerdo a lo que se indicó anteriormente el efecto será

homotrófico cooperativo o positivo y en el segundo caso (activador), heterotrófico

cooperativo o positivo. Pero si se agrega activador en cantidad suficiente, el equilibrio

quedará totalmente desplazado hacia la forma R, y todas las moléculas del oligómero

estarán exclusivamente en esa forma y la adición del sustrato en ese caso, no podrá

producir un mayor desplazamiento del equilibrio, comportándose entonces el sistema

como un sistema para el cual es válido un tratamiento cinético del tipo Michaelis-

Menten, obteniéndose entonces una curva de saturación para el sustrato de tipohiperbólico.

En contraste con lo que ocurre con el sustrato y el activador, el inhibidor se une

exclusivamente a la forman T. Si debido a la presencia de sustrato en concentración

saturante, la enzima se encontraba originalmente casi exclusivamente en el estado R, el

agregado de inhibidor producirá un desplazamiento hacia la forma T y por ende la

curva de saturación para el sustrato se hará más sigmoide a medida que aumenta la

concentración del inhibidor. El efecto en este caso será heterotrófico negativo (del

inhibidor con respecto al sustrato).

El modelo de Koshland, Nemethy y Filmer también denominado secuencial se basa en

la explicada teoría del ajuste inducido. El modelo establece que la unión de un ligando

(sustrato, activador o inhibidor) a una de las subunidades de la molécula enzimática

oligométrica, produce un cambio conformacional de dicha subunidad. Esa distorsión

en una subunidad puede afectar secuencialmente la estabilidad y configuración de las

subunidades vecinas, en la misma forma que la distorsión de una parte de una cadena

polipeptídica, aumentando o disminuyendo la afinidad de las mismas por el sustrato.

La figura siguiente ilustra lo dicho para el caso de una enzima alostérica que posee dos

subunidades, cada una de ellas capaz de unirse a una molécula de sustrato y que

presenta un efecto homotrófico positivo de S sobre S.

En el modelo secuencial las interacciones entre las subunidades son posibles

estando las subunidades en distintos estados conformacionales.



En el modelo concertado sólo serían posibles los

estados AA y BB de la figura anterior y no el híbrido

AB, los cuales por otra parte deben preexistir actuando

el ligando como estabilizador del estado al cual se une

preferencialmente. En cambio el modelo secuencial si

bien no descarta la posibilidad extrema de un cambiosimultáneo en todas las subunidades, sostiene

preferentemente la existencia de cambios secuenciales

en la conformación de las subunidades inducidas por la

unión del o los ligandos, con la posibilidad de ocurrencia de estados conformacionales

híbridos cuando la proteina está parcialmente saturada.

Enzimas alostéricas- Las enzimas alostéricas presentan estructura cuaternaria.

- Tienen diferentes sitios activos, unen más de una molécula de sustrato

- La unión del sustrato es cooperativa- La curva de velocidad en función de la (s) presenta una forma sigmoidea

- Pequeños cambios en la concentración del modulador se asocian con

grandes cambios en la actividad de la enzima

Regulación enzimática

Cuanto más se avanza en el conocimiento de la bioquímica celular, especialmente por

los aportes hechos en los últimos años por la biología molecular, más se afianza el

concepto enunciado oportunamente por Changeux, de equiparar el funcionamiento deuna célula al de una “verdadera fábrica química automática diseñada para aprovechar

lo más eficientemente la energía disponible”. En efecto, en una fábrica automática

coexisten varias líneas de producción que trabajan simultáneamente en forma

concertada y que se regulan a sí mismas y entre ellas por medio de controles

automáticos, consistentes en circuitos electrónicos específicos de retroalimentación.

Estos principios pueden aplicarse también a los seres vivos, Así, el funcionamiento de

la célula más sencilla, implica la existencia de una verdadera maraña de procesos

metabólicos consistentes en secuencias de reacciones químicas catalizadas por enzimas

específicas. Cada una de estas vías metabólicas sería equiparable a las mencionadas

líneas de producción de la fábrica automática y las máquinas elementales de la fábrica

celular serían las mencionadas enzimas. Existen en principio cuatro formas posibles deque la célula controle la velocidad de funcionamiento de dichas vías metabólicas:

1) DISPONIBILIDAD DE SUSTRATO Como ya hemos indicado, la actividad de la enzima guarda proporcionalidad con los

niveles de sustrato. Estos determinan la mayor o menor velocidad en la actividad

enzimática. Al aumentar la concentración de sustrato, en la célula aumenta su

utilización y viceversa. Generalmete el sustrato debe ingresar a la célula o al interior de

una organela. Ejemplo: β-oxidación y síntesis de cuerpos cetónicos.

2) MODIFICACIÓN COVALENTEMuchas enzimas son reguladas por el agregado o sustracción de grupos unidos

covalentemente a la misma.



La regulación covalente más frecuente se realiza por modificación de los residuos de

tirosina, serina y/o treonina de las enzimas por un proceso de unión o eliminación de

grupos fosfatos. Existen también enzimas cuya actividad es modulada por la inserción

covalente de otros grupos., como se muestra en la siguiente tabla.

En la siguente tabla se dan ejemplos de algunas enzimas cuyas actividades estan

reguladas por modificación covalente que implica fosfo- desfosforilaciones.



3) MODULACIÓN ALOSTÉRICA.

Ya se describió anteriormente. Algunos casos

particulares dan origen a diferentes modos

regulatorios. En algunas vías metabólicas, la

enzima que cataliza la primera etapa de la serie

suele ser inhibida por el producto de la última.Cuando la concentración de ese producto final

aumenta, ello indica que su elaboración excede las

necesidades y se frena el funcionamiento de la vía

reduciendo la actividad de la enzima reguladora.

Se habla de un proceso de retroinhibición.

También puede suceder que una enzima sea

estimulada por algún agente que se acumula en el

medio. Cuando existe un exceso de sustrato, él

mismo promueve su utilización activando a la

enzima.

4) INDUCCIÓN O REPRESIÓN DE LA SINTÉSIS DE LA ENZIMA.Implica el control de la síntesis de las enzimas regulatorias involucradas en un camino

metabólico. Se habla entonces de inducción enzimática o represión enzimática según

que la velocidad de producción de una dada enzima, o de un conjunto de enzimas

metabólicamente relacionadas, y por ende su concentración celular, sea aumentada o

disminuída respectivamente como respuesta a las necesidades de la célula, actuando

por lo general un metabolito particular como señal desencadenante del proceso. En el

caso de la inducción, ese metabolito puede ser el mismo sustrato de la enzima(metabolito inductor), y en la represión, el producto final de la vía metabólica de la cual

la enzima reprimida forma parte (metabolito represor). Este mecanismo es mucho más

lento que los anteriores ya que implica la síntesis o degradación de las enzimas

involucradas.

E1 E2 E3 E4

S1→ A→B→ C→ P

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E1 E2 E3 E4

S1→ X→Y→ Z→ P

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