TEMA5.

DIAGNOSTICO DE VESTIGIOS DE SANGRE EN EL LABORATORIO DE BIOLOGÍA

FORENSE. PRUEBAS DE ORIENTACIÓN Y CERTEZA, TÉCNICAS ANALÍTICAS DE

ELECCIÓN. INTERPRETACIÓN Y SU VALORACIÓN BIOLÓGICA FORENSE.

Actualmente se estudia un número suficiente de marcadores para distinguir unas muestras de

otras. La mayoría de laboratorios forenses utilizan los mismos marcadores con el fin de

intercambiar datos sin tener que reanalizar las muestras.

CONCEPTO DE MUESTRAS DUBITADAS E INDUBITADAS

Para que una pericia genético biológica sea concluyente es imprescindible desarrollar el

análisis en dos tipos de muestras:

a) Muestras dubitadas o evidencias: son restos biológicos de procedencia desconocida, es

decir, no sabemos a quién pertenecen (por ejemplo las muestras recogidas en la escena del

delito o de un cadáver sin identificar).

b) Muestras indubitadas o de referencia: son restos biológicos de procedencia conocida,

es decir, sabemos a quién pertenecen (por ejemplo la sangre tomada de un cadáver

identificado, o las muestras tomadas a familiares de un desaparecido).

La analítica de ADN se ha denominado en múltiples ocasiones «huella genética»; este término

no debe llevarnos a confusión pues, si bien es verdad que cada individuo presenta un ADN

diferente (como en el caso de las huellas dactilares), no existe una base de datos formada por

las características genéticas de cada individuo que vive en España (a diferencia de la huella

dactilar, de la cual existe un registro del índice derecho de todas las persona con DNI). Por este

motivo, sólo podremos identificar las evidencias biológicas si disponemos de muestras de

referencia para su comparación.

Los tipos de muestras dubitadas más frecuentemente analizadas por técnicas genético

moleculares son: sangre (habitualmente en forma de mancha), semen (lavados vaginales o

manchas sobre prendas de la víctima), saliva (colillas de cigarrillo, chicles, sobres y sellos),

pelos, uñas, tejidos blandos, restos óseos y dentarios (estos últimos relacionados

fundamentalmente con la identificación de cadáveres).

El tipo de muestras indubitadas más habituales son sangre y saliva (frotis bucal). No es

necesario que las muestras de referencia sean del mismo tipo que las evidencias, es decir,

podremos comparar distintos tipos de restos biológicos entre sí ya que el ADN es igual (salvo

excepciones) en todos tejidos de un mismo individuo.

Podemos diferenciar tres etapas principales en el análisis de una muestra forense: (i) pruebas

preliminares para determinar la naturaleza y el organismo de procedencia de la muestra; (ii)

análisis del ADN presente en la muestra con fines identificadores y (iii) análisis e interpretación

de los resultados obtenidos.

Existen fundamentalmente tres tipos de pruebas preliminares:

a) Orientativas: se trata de técnicas que nos revelan la posible naturaleza de la mancha pero

no nos la aseguran, es decir, sirven sólo para descartar, pero no para concluir. Por ejemplo, la

llamada reacción de Adler es una sencilla prueba colorimétrica que si resulta positiva nos

orienta a pensar que estamos ante una mancha de sangre, pero sin poder asegurarlo pues

existen otras sustancias (jugos vegetales, óxido, lejía) que también dan positiva esta reacción.

Si la prueba resulta negativa podremos asegurar que el resto que estamos analizando no es

sangre. Estas pruebas son sencillas de realizar, son de bajo coste, muy rápidas, y nos ayudan a

seleccionar las manchas a analizar.

b) De certeza: nos permiten determinar el tipo de resto biológico analizado con seguridad. La

detección de hemoglobina en la muestra para determinación de sangre o la visualización al

microscopio de espermatozoides para la determinación de semen son algunos ejemplos.

c) Específicas: nos permiten determinar el tipo de organismo al que pertenece el resto

biológico. Una vez que hemos determinado el tipo de muestra que hemos de analizar, interesa

saber si se trata de una muestra humana o no. Existen principalmente dos tipos de pruebas

específicas: unas basadas reacciones antígeno-anticuerpo y otras basadas en el estudio de

ciertas regiones del ADN, si bien, en cierto tipo de muestras (pelos, restos óseos) puede

realizarse un estudio de las características morfológicas para determinar el tipo de organismo.

En el caso de que nos encontremos ante una muestra de origen animal, normalmente los

análisis terminarán en este punto a no ser que el objetivo sea precisamente determinar la

especie (por ejemplo, en caso de delitos ecológicos y de caza furtiva). En el caso de muestras

de origen humano se procederá a realizar la segunda etapa del estudio destinada a

individualizar la muestra mediante técnicas de ADN.

Conviene señalar que en determinadas ocasiones no es posible determinar el tipo de resto

biológico hallado por la escasa cantidad de muestra disponible. En estos casos se suele

proceder directamente a realizar los estudios de ADN para intentar individualizar la muestra.

ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS

Una vez que se ha finalizado el estudio molecular propiamente dicho se procede al análisis de

los resultados obtenidos. Podemos encontrarnos con dos situaciones:

1. Que dispongamos de muestras indubitadas de referencia para cotejar con las evidencias.

2. Que no tengamos acceso a muestras de referencia para comparar.

En el caso de que nos encontremos ante la primera situación, el resultado de la comparación

entre muestras dubitadas e indubitadas puede ser de dos tipos:

1.1 Coincidencia o compatibilidad: el perfil genético evidenciado en ambos tipos de muestras

es coincidente (criminalística) o compatible (paternidades) . En este caso se ha de valorar

estadísticamente si la coincidencia es debida al azar o a que realmente la evidencia biológica

pertenece al individuo de referencia. Es evidente que este análisis depende «a priori» del

número de marcadores analizados en las muestras y una vez realizado el análisis, de lo

frecuente o no que sean los alelos de cada marcador (por ejemplo, en el hipotético caso de

que estudiáramos el grupo sanguíneo, el grupo 0 es muy frecuente en nuestra población por lo

que este resultado se ha de valorar con menor «fuerza» que si obtenemos un grupo AB,

mucho menos frecuente). Por esta razón, los laboratorios analizan de rutina en cada muestra

una batería de marcadores con elevado poder de discriminación.

1.2 No coincidencia o incompatibilidad: el perfil genético evidenciado en las muestras

dubitadas no coincide con el de la muestra indubitada; o bien, en casos de paternidad, el

supuesto padre no comparte alelos con el hijo (incompatibilidad). En estos casos no es

necesario realizar una valoración estadística pues la exclusión se informa con seguridad.

En los casos donde no disponemos de muestras de referencia para comparar con las

evidencias podemos introducir los perfiles genéticos obtenidos en una base de datos de

perfiles anónimos. Esto nos permitirá relacionar distintos delitos entre sí, facilitando así la

investigación policial y judicial en hechos reincidentes como violaciones y robos. Actualmente

algunos laboratorios poseen sus propias bases de datos de evidencias, pero sería deseable

que se unificaran criterios así como la información contenida en cada una de ellas con el fin de

intercambiar datos de forma rutinaria. Por otro lado, en otros países ya existe una legislación

sobre la introducción de perfiles genéticos de carácter indubitado relacionados con

prácticamente todos o cierto tipo de delitos (según el país); en España sería necesario que

existiera un marco legal con el fin de evitar la pérdida de información que proporcionarían

dichos perfiles.

Además de las bases de datos de perfiles genéticos anónimos obtenidos a partir de las

evidencias, existen bases de datos de perfiles procedentes de cadáveres sin identificar y de

familiares de desaparecidos que dieron su consentimiento para el análisis de su ADN. Con

estas bases de datos los laboratorios pretenden facilitar la difícil tarea de identificar cuando no

existen otros medios que el análisis genético

PROBLEMÁTICA DE LAS MUESTRAS BIOLÓGICAS

Ya hemos visto que, actualmente, para determinar a qué individuo pertenece una muestra

biológica, se recurre al estudio de sus polimorfismos de ADN y ya hemos descrito todas las

fases analíticas que se han de realizar (extracción, cuantificación, amplificación y tipaje), pero

creemos conveniente apuntar la problemática del día a día del laboratorio en las diferentes

etapas del análisis de estos polimorfismos.

Las muestras indubitadas que pertenecen a individuos vivos no suelen dar problemas en el

análisis genético si fueron recogidas y enviadas al laboratorio en condiciones óptimas. Sin

embargo, las evidencias con carácter dubitado pueden sufrir una serie de modificaciones que

dependerán no sólo del tiempo transcurrido hasta el momento de su estudio, sino de las

condiciones ambientales a las cuales se vieron sometidas, de la cantidad de muestra, del

soporte en el cual se encuentran, del lugar de procedencia y del tipo de muestra biológica.

De todos los tipos de muestras biológicas que se analizan diariamente en el laboratorio

forense, quizá sean las de sangre las más agradecidas.

Sin embargo algunas veces también dan problemas.

La sangre podemos hallarla bien en estado líquido o en forma de mancha. La sangre líquida

bien conservada no ofrece ningún tipo de problema, pero no es raro que al laboratorio llegue

sangre putrefacta bien porque se ha estropeado durante el transporte o bien porque

pertenece a un cadáver en el cual se ha iniciado la descomposición. Para evitar el primer

problema es conveniente realizar una mancha sobre una gasa antes de proceder al transporte

de la muestra y para el segundo no queda más remedio que tratar de buscar otra muestra para

el análisis, bien sea un tejido blando, uñas, o un resto óseo, dependiendo del estado de

conservación del cuerpo. Por el contrario, la sangre en forma de mancha se conserva más

fácilmente y puede analizarse tras varios años si las condiciones de secado fueron adecuadas.

Quizá las manchas sobre cueros, maderas tratadas, restos vegetales y tierras sean de las más

críticas pues estos materiales tienen diferentes grados de absorción y en ellos se encuentran

presentes gran cantidad de inhibidores de la PCR como los taninos, que impiden que la

reacción funcione.

La investigación de manchas de sangre sigue ocupando un lugar preferente en Criminalística.

Tradicionalmente, se ha venido realizando un sistema de investigación que incluye la

realización de los siguientes diagnósticos [1]:

1.- Orientación.

2.- Certeza.

3.- Especie.

4.- Individual (grupos, ADN, sexo).

5.- Otros (antigüedad, lugar de procedencia, etc.).

MANCHAS:

Según la clasificaciónde Simonin se dividen en:

. Manchas de proyección

. Manchas de escurrimineto

. Manchas de contacto

. Manchas de impregnación

. Manchas de limpieza

ASPECTO:

Ennegrece con el tiempo. Si no son visibles se emplea Luminol.

Ventajas

Efecto luminiscente en la oscuridad. No altera la mancha. Luego puede seguir su análisis sin

ningún problema.

Desventajas

Sensible al tiempo (usar inmediatamente a la preparación). Producto comercial (costo elevado

PRUEBAS DE CERTEZA

Específicas y poco sensibles. Manifiesta elementos formes o hemoglobina.

1. Técnicas microscopicas: muestra elementos formes de la sangre.

2. Tecnicas microquimicas o cristalograficas.

Cristales deTeichman

Cristales deTakayama (En caso Teichman sea negativo)

3. Técnicas cristalográficas:

4. Técnicas Espectrofotométricas: Espectro de absorción de hemoglobina

5. Tecnicas cromatograficas: Pruebas fisico-quimicas de la hemoglobina.

PRUEBAS DE ORIENTACION

Muy sensibles

Carecen de especificidad

Presencia de lasperoxidasas de la sangre

Sangre (enzima) + H2O2=H2O+ O

(+ leucobase= base coloreada)

1. Reacción de Adler

BECIDINA SANGRE

ACIDO ACETICO GLACIAR

AGUA OXIGENADA

Azul intenso

La prueba de Adler tiene como fundamento la oxidacion, basada en a presencia de

peroxidasas (color verde o azul, con bencidina y ácido acético glacial)

2. Reaccion de Van deen

Resina de Guayaco sangre

Alcohol de 95

Agua oxigenada azul intenso

El método de guayacol fue desarrollado por Van Deen en 1864 para detectar sangre oculta.

Boas comenzó a usar este método en 1901 para diagnosticar sangrado gástrico. La reacción

de Van Deen (con tintura de guayaco y agua oxigenada, color azul

REACCION DE KASTLER MEYER

Fenolftaleina

Hidroxido de potasio sangre

Polvo de zinc

Alcohol etilico absoluto

Agua destilada rojo

Agua oxigenada

REACCION DE MEDINGER

Verde malaquita sangre

Acido acetico glacial

Agua destilada

Agua oxigenada

Con verde de malaquita, forma leuco, recuperación del color verde)

REACCION DE LAS CATALASAS

Agua oxigenada con sangre burbujas

Las muestras de saliva no suelen presentar problemas en la analítica de ADN. Suelen llegar al

laboratorio en forma de mancha, sobre filtros de cigarrillo, sellos, chicles o prendas (por

ejemplo la zona coincidente con la boca en un pasamontañas utilizado en un atraco) o bien en

soportes más engorrosos como vasos, botellas o huesos de fruta.

En las muestras de esperma de los casos de agresiones sexuales, el principal problema es que

además de los espermatozoides del agresor se suele encontrar presente otro tipo celular

procedente de la víctima, las células del epitelio vaginal. Por ello, a la hora de analizar estas

muestras nos encontraremos con una mezcla de perfiles genéticos. Es de gran ayuda disponer

de una muestra indubitada de la víctima con el fin de identificar qué alelos pueden proceder

de la víctima en la mezcla evidenciada.

El análisis de ADN a partir de muestras de pelos es más delicado que a partir de los restos

biológicos anteriores. Estas muestras requieren un análisis microscópico previo a la analítica

molecular con el fin de determinar el tipo de análisis que es posible en ellos (estudios de ADN

nuclear o de ADN mitocondrial) además de otras características importantes. Con el análisis

microscópico se determinan, entre otros, los siguientes puntos:

– Si se trata de pelos de origen animal o humano.

– Si se trata de pelos completos (con bulbo) o de fragmentos de pelos (sin bulbo). En el caso de

fragmentos de pelos los estudios a realizar son los de ADN mitocondrial como veremos en el

siguiente apartado.

En el caso de los pelos con bulbo se puede determinar en qué fase vital se encuentra éste. En

los pelos con bulbo telogénico (en fase de caída) se suele realizar análisis de ADN mitocondrial

y en los pelos con raíz anagénica (en fase de crecimiento) se puede realizar un análisis de ADN

nuclear.

– Visualizar el grado de suciedad que presentan los pelos y si aparecen restos de posible

sangre adheridos a los mismos. En el caso de presentar sangre se ha de proceder a la

separación de ambos tipos de restos biológicos para su análisis por separado, pues puede

tratarse de muestras pertenecientes a diferentes personas.

En cuanto a las muestras de uñas diremos que se trata de una muestra muy agradecida pues

suele dar resultados positivos en la mayoría de los casos. Las uñas pueden interesarnos

fundamentalmente por dos motivos:

Como muestra biológica indubitada para la identificación cadavérica (analizando la propia uña)

cuando no es posible una identificación por métodos no genéticos, o como lugar de búsqueda

de restos biológicos si en un hecho delictivo medió lucha.

Las muestras de tejidos también suelen estar relacionadas sobre todo con la identificación de

cadáveres en los que han comenzado los procesos de putrefacción. Los mejores resultados se

obtienen con músculo

Sangre: es un tipo de indicio fácilmente reconocible sobre determinados soportes. Existe una

amplia variedad de tests de diagnóstico previo que ponen de relieve su presencia (luminol,

benzidina, fenolftaleina, o-toloidina, guayacol, verde leucomalaquita...). Los tipos de soporte

más comunes sobre los que se presenta son ropas, armas, uñas, en el lugar de los hechos

(tierra, suelo, piedras, paredes...). El estudio de la morfología de las manchas en la escena del

delito proporciona información a cerca de cómo se produjeron los hechos.

La herramienta de elección es la individualización genética por lo que los laboratorios de

Biología Forense actuales están altamente especializados en Genética Molecular.

RECUPERACIÓN DE LOS VESTIGIOS

I.- EXAMEN CUIDADOSO DEL CUERPO

Toma de muestras de sangre.

RECOGIDAS DE INDICIOS.

Muestras de sangre y/o saliva.

Identificación de indicios biológicos de interés criminal: son el tipo de análisis más solicitado

en el laboratorio de biología forense. Todos los indicios recogidos sobre la víctima, el

sospechoso o el lugar de los hechos deben ser objeto de un minucioso y exhaustivo estudio

que permita localizar, conocer o confirmar la naturaleza de los indicios, que variaran en

función de las características del suceso investigado. Los vestigios biológicos más frecuentes

son los restos de sangre, fluidos seminales, fluidos vaginales, saliva, pelos y restos orgánicos en

uñas.

Estudios complementarios en casos de muerte por sumersión- asfixia: siempre que se

recupera un cadáver del agua o cuando se sospecha que la causa de la muerte puede haber

sido la sumersión, será necesario confirmar los datos macroscópicos obtenidos en la autopsia

mediante estudio anatomopatológico y considerar otros datos tales como la existencia de

hidremia ( hemodilución de la sangre del ventrículo izquierdo respecto de la del derecho) y la

existencia de elementos formes en las vísceras del cadáver que deben compararse, siempre

que sea posible, con las del líquido de sumersión.

Restos de orina: La identificación de la orina se basa en la detección de iones o compuestos

orgánicos que se hallan más concentrados en orina que en otros fluidos fisiológicos, tales

como la urea o creatinina, también presentes en sudor, sangre, saliva, semen pero en menor

concentración. Contiene células epiteliales del tracto urinario, así como leucocitos y eritrocitos,

muy diluidas en la orina, por lo que la esperanza de recuperar ADN a partir de manchas de

orina es muy baja. Además, la flora bacteriana propia de la orina acelera los procesos de

degradación en la muestra.

De forma general y una vez que tenemos seleccionadas las muestras objeto de análisis, todo el

proceso analítico se puede dividir en tres grandes bloques:

EXTRACCIÓN de ADN, AMPLIFICACIÓN (PCR) y DETECCIÓN.

Extracción de ADN

Posiblemente, de los tres bloques citados anteriormente, la extracción constituya el paso más

crítico, ya que cualquier manipulación errónea de la muestra en esta etapa inicial del proceso

puede conducirnos a su descarte, siendo en algunos casos, el único indicio biológico de que se

dispone para resolver un delito.

Cualquier laboratorio forense debe contar con diferentes métodos de extracción que permitan

obtener en cantidad y calidad suficiente ADN de la enorme variabilidad muestral que recibe.

Los métodos de extracción se pueden dividir en tres grupos:

a) Aquel que comprende una digestión, una extracción orgánica y una purificación-

concentración o, como alternativa, una precipitación con etanol. Se utiliza para la mayoría de

las muestras biológicas de interés forense.

b) Aquel que comprende una etapa de digestión seguida de una precipitación con etanol. Se

usa, principalmente, para obtener mucha cantidad de ADN a partir de sangre en buen estado.

c) Aquel que comprende solo una extracción directa mediante membranas especiales o bolas

de sílice o similares. Su uso se limita normalmente a muestras de sangre líquida.

La importancia de las manchas de sangre es conocida por todos, por la frecuencia en el lugar

del hallazgo (1) y la gran cantidad de datos que pueden proporcionar: cómo han sucedido los

hechos, cuál ha sido la cronología de los mismos, cuántas personas han intervenido, qué

objetos se han utilizado, identificación del agresor o agresores, de las víctimas, cuál ha sido la

causa de la muerte.

Las muestras biológicas criminales, entre las que destacan las manchas de sangre, tienen las

siguientes peculiaridades (2), respecto a otro tipo de muestras como son las clínicas:

Son escasas en concentración; puesto que la cantidad de sangre no es la que solicita o desea

el investigador, sino que ésta viene dada por las características del hecho investigado: número

de víctimas, número de autores, tipo de agresión, manipulación posterior, etcétera Están mal

conservadas: las muestras recogidas para estudio criminal por norma han estado expuestas a

circunstancias ambientales o a manipulaciones intencionadas que influyen en el estado de

conservación. Estarán tanto peor conservadas, cuanto más expuestas al ambiente externo

hayan estado o más manipulaciones hayan soportado.

Degradadas: En directa relación con la conservación y más en concreto con las posibles

acciones directas sobre las muestras, se encuentra el hecho de que se deteriore el material

biológico o lo que es lo mismo, que se degrade, de modo que sea mucho más difícil alcanzar

los objetivos planteados en la investigación. En el mejor de los casos, la toma de la muestra se

hará en un periodo que se puede contar en horas, en otros, se hablará de meses, incluso años.

El tiempo constituye por sí solo un factor en contra de la investigación de las muestras

biológicas.

Contaminadas: La exposición del material biológico al ambiente o a acciones externas

determina que puedan contaminarse, es decir, incorporar material biológico o no biológico,

que influya en los resultados.

Y siempre irrepetibles: lo que diferencia fundamentalmente las muestras biológicas judiciales

del resto es que son irrepetibles e irreproducibles, excepto cuando se trata de muestras

indubitadas procedentes de una víctima viva o del agresor, también vivo.

Así pues, los restos biológicos dejan de tener unas condiciones estables y de control cuando

abandonan el organismo del que proceden. Las condiciones a las que se verán expuestos son

peores y se consideran adversas, en especial debido a las condiciones medioambientales,

temperatura y humedad, a la exposición a sustancias químicas o de microorganismos, hongos

y bacterias, etc. que pueden degradar el indicio o bien pueden inhibir los análisis (3)

En el caso de las manchas de sangre, el estudio tradicional de este tipo de incluye los

siguientes diagnósticos: genérico -de orientación y de confirmación-, de especie, individual

(grupos, ADN, sexo) y otros (antigüedad, lugar de procedencia, etcétera). El primero engloba

tanto las pruebas denominadas de orientación como las de confirmación o certeza. Si bien

actualmente en los laboratorios forenses se suele realizar un diagnóstico simultáneo genérico

y específico, mediante el uso de los kits comerciales de detección de hemoglobina humana, no

hay que olvidar que este tipo de indicio se debe buscar en todas las escenas criminales; que

unas veces serán evidentes a simple vista y otras, por su baja concentración o por degradación,

necesitarán de medios de búsqueda y de puesta en evidencia. El descubrimiento de una

mancha en el lugar estudiado no implica que sea de sangre, por lo que resulta fundamental

determinar cuál es su naturaleza (6) y, por tanto, realizar un estudio genérico sobre las

mismas.

Este trabajo sigue la línea de investigación que iniciaron el profesor Verdú y la profesora

Gisbert en 1995 (7), continuada con la tesis doctoral de la profesora Castelló (1) y con la

publicación en 2003 del estudio de la fiabilidad de las pruebas de orientación sobre manchas

contaminadas con distintos productos (6, 8) En realidad no se pretende valorar cómo influye la

contaminación en muestras recientes, sino cómo afecta la degradación que se produce con el

paso del tiempo y con la exposición a factores ambientales (8). Así pues, se trata de comprobar

la utilidad de las pruebas de orientación sobre manchas sometidas a distintas condiciones

ambientales y en distintos soportes, en especial si se afecta la sensibilidad del luminol y si

influye el soporte. También se valora si el empleo de luces puede mejorar la visibilidad de las

manchas latentes.

Material y método

Obtención de la muestra

La sangre se obtuvo por venopunción y no se le añadió ningún conservante.

Las manchas se formaron al depositar una gota de sangre sobre el soporte seleccionado.

Dado que es imposible simular en laboratorio todos los soportes sobre los cuales puede haber una mancha de sangre, pues las escenas delictivas son tan variables como diverso es el planeta y tras valorar todas las posibilidades, se seleccionaron los siguientes materiales, siguiendo un criterio lógico y de frecuencia de presentación en nuestro entorno inmediato:

— Dos superficies impermeables: acero y hierro (placas metálicas de 3 x 3 y 4 x 4 cm)

— Ocho soportes porosos: dos tipos de azulejos, uno más rugoso y otro con una superficie menos porosa; telas de distintos tipos: vaquera, de algodón, sintética blanca y sintética estampada, también tela de rizo (toalla) y, por último papel (pañuelos de celulosa).

Reactivos:

Fenolftaleína (PHENOLPHTHALEIN DISCHAPS™ Sirchie, Cat. No. DCB100)

Leucomalaquita verde (Leuco-Malachite DISCHAPS™ Sirchie, Cat. No. DCB200)

Luminol (Merck)

Carbonato potásico (Panreac)

Perborato de sodio (Panreac)

Agua destilada

Para la preparación del reactivo Luminol se siguieron las instrucciones del laboratorio y los métodos descritos en la bibliografía (9).

Procedimiento para la preparación de la muestra:

Sobre los diferentes soportes se forman manchas de sangre sin diluir, dejando caer una gota con una pipeta Pasteur. En el caso de los soportes impermeables y de los azulejos, se depositó la gota sobre la superficie y se extendió con una espátula con el fin de obtener una fina película y evitar la escasa adherencia debida a la forma de la gota.

En los soportes porosos la sangre formó una mancha, con bordes más o menos difusos y extensión variable según el soporte. Se observó que la tela sintética estampada era poco absorbente, por lo cual la mancha formaba una costra inicial sobre la superficie.

Una vez seca la sangre, las muestras se han sometido a diferentes condiciones ambientales. Es necesario precisar que dependiendo de la naturaleza del soporte, se ha seleccionado las condiciones ambientales, en las que se ha mantenido la muestra. Así, la distribución resultó como sigue:

1. Sumergidas en agua. Se han sumergido todos los soportes excepto los azulejos, puesto que simulan el suelo o revestimiento y, por tanto, no van a estar sumergidos en condiciones reales.

2. Enterrados. Todos los soportes excepto los azulejos, por la misma razón.

3. En el resto de condiciones (aire libre a cubierto, aire libre a descubierto y laboratorio) han estado todos los soportes.

Se depositaron también muestras control de cada tipo de soporte y condición ambiental.

Procedimiento experimental

Los soportes se recogieron después de haber estado expuestos el tiempo predeterminado (5, 10, 15, 20, 25, 40, 50, 70, 80 y 125 días).

Los soportes húmedos se dejaban secar y se guardaban en sobres de papel para el transporte al laboratorio.

El periodo transcurrido desde la recuperación de los soportes y el estudio en el laboratorio no ha sido fijo, sino que ha variado en función de la disponibilidad de tiempo. En realidad, en los laboratorios de investigación, el tiempo que transcurre también varía en función de las condiciones, exigencias, necesidades, etcétera. no sólo del laboratorio sino también la trascendencia judicial.

Pruebas de orientación:

Ya en el laboratorio, el método de estudio ha sido el habitual en el caso de manchas de sangre:

1º Observación directa, con luz blanca con distintos filtros y con luz ultravioleta.

2º Preparación de la muestra previa a la aplicación del reactivo.

Cuando sobre el soporte impermeable aparecía una mancha visible de sangre, se procedía al raspado de la costra en un tubo eppendorf que contenía suero fisiológico. Posteriormente se depositaban tres gotas de la dilución sobre un hisopo y se realizaba la prueba.

Cuando la mancha no era visible, se procedía a la obtención de una «huella» mediante un hisopo hidratado con agua destilada con el cual se limpiaba el soporte; la prueba de orientación elegida se realizaba sobre un fragmento de dicho hisopo.

En el caso de los soportes permeables, éstos se cortaban en varios fragmentos, sobre los cuales se aplicaba el reactivo.

3º Exponer el hisopo o el fragmento al reactivo.

4º Leer el resultado.

Resultados

Como era de esperar, las muestras peor conservadas son las que han estado sumergidas, enterradas y al aire libre descubierto, mientras que las que han permanecido al aire libre cubierto y en el laboratorio se han conservado mucho mejor; la mancha de sangre se ha mantenido visible a simple vista durante el periodo estudiado.

En las tablas 1 a 4, se exponen los resultados obtenidos en función del soporte.

Según el soporte utilizado, se puede decir que:

En el acero el luminol ofrece un resultado positivo hasta los 80 días independientemente

del medio en el que se haya encontrado; para los cuatro meses, sólo se obtienen resultados positivos con el luminol, excepto en las muestras sumergidas.

La leucomalaquita es el reactivo que funciona peor con las muestras antiguas y no sirve para muestras que hayan permanecido en agua.

Las luces no han demostrado ser eficaces en el examen de este soporte.

En el hierro y para muestras sumergidas, los reactivos de orientación utilizados no sirven si se trata de manchas recientes, incluso de diez días. Lo mismo se puede decir de las muestras al aire libre descubierto, expuestas a la lluvia y otros factores atmosféricos; en este caso, es el luminol el que mejores resultados da en muestras de hasta 25 días; no se obtienen resultados

positivos a partir de esta fecha.

Las luces no son útiles a los 5 días si las muestras han estado sumergidas, y a los 25 días si han estado al aire libre descubierto. En los soportes que han estado al aire libre cubierto y en el laboratorio las manchas son visibles a simple vista a los 125 días y los resultados de las pruebas de orientación son positivos.

En el azulejo no poroso, la fenolftaleína es el reactivo que peor funciona en manchas antiguas y deterioradas, expuestas a las condiciones medioambientales.

Con la leucomalaquita se obtienen resultados positivos con muestras deterioradas de hasta 80 días.