UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE SAN LUIS

POTOSÍ

COORDINACIÓN ACADÉMICA REGIÓN

ALTIPLANO OESTE

TESIS PARA OBTENER EL GRADO DE

INGENIERA AGROINDUSTRIAL

Determinación de etanol y metanol en cervezas artesanales por

cromatografía líquida (HPLC)

PRESENTA:

TERESA DE JESÚS RODRÍGUEZ CARDONA

DIRECTOR DE TESIS:

Dr. JUAN ANTONIO RENDÓN HUERTA

CO-DIRECTOR DE TESIS:

Dr. CÉSAR IVÁN GODÍNEZ HERNÁNDEZ

DICIEMBRE 2019

Dedicatoria

Este logro es dedicado a mis padres por ser un pilar fundamental en toda mi vida, por su

amor, trabajo y sacrificio durante estos años que me han permitido llegar a cumplir un sueño

más, por creer y depositar su confianza en mí.

A mi madre Teresa Cardona, principalmente por darme la vida y por haberme apoyado en

todo momento, por sus consejos, paciencia, sus valores, la motivación constante que me ha

permitido ser una persona de bien, pero más que nada por su amor incondicional.

A mi padre Manuel Rodríguez, agradezco el cariño la compresión y paciencia. Por los

ejemplos de perseverancia y constancia que lo caracterizan y que me ha infundado siempre,

por trabajar día a día, por el valor mostrado para salir adelante y principalmente por apoyarme

siempre.

A mis hermanos Aldo, Cindy, Manuel, Saraí y Dionel por ser parte importante de mi vida,

que me han ayudado, motivado a hacer mejor persona, aconsejado y apoyado en el largo

camino de la vida en toda la extensión de la palabra, a mis sobrinos que siempre están ahí

llenándome de alegría y a mi mejor compañero Mario la ayuda que me brindo ha sido

sumamente importante, estuvo a mi lado inclusive en los momentos y situaciones más

tormentosas, siempre ayudándome, fue muy motivador y esperanzador, me ayudo hasta

donde le era posible, incluso más que eso.

Siempre me he sentido maravillada por la linda familia que tengo, se han preocupado de mí

desde el momento en que llegué a este mundo, me han formado para saber cómo luchar y

salir victorioso ante las diversas adversidades de la vida. Muchos años después, sus

enseñanzas no cesan, y aquí estoy, con un nuevo logro exitosamente conseguido.

Quiero agradecerles por todo, no me alcanzan las palabras para expresar el orgullo y lo bien

que me siento por tener una familia tan asombrosa.

Agradecimientos

Principalmente quiero agradecer a la Universidad Autónoma de San Luis Potosí Campus

Salinas, por haberme abierto las puertas para continuar con mi formación profesional, por

tener como prioridad fomentar la educación de calidad en los jóvenes y formar parte de ella.

Agradezco al Dr. Juan Antonio Rendón Huerta por su gran apoyo y motivación para

culminación de mis estudios profesionales, por la paciencia, dedicación y palabras de aliento,

infinitas gracias por ser la persona que me asesoro para la elaboración de esta tesis.

Agradezco al Dr. Cesar Iván Godínez, por sus aportaciones en el trascurso de esta

investigación y su disponibilidad de ayudarme con el equipo ya que sin su contribución no

hubiera sido posible esta investigación.

ÍNDICE

RESUMEN ............................................................................................................................. 1

INTRODUCCIÓN .................................................................................................................. 2

ANTECEDENTES ................................................................................................................. 4

HISTORIA DE LA CERVEZA ............................................................................................. 4

DEFINICIÓN DE CERVEZA................................................................................................ 5

TENDENCIAS DE PRODUCCIÓN Y CONSUMO DE CERVEZA ................................... 6

CONSUMO PER CÁPITA DE CERVEZA ........................................................................... 8

TIPOS DE CERVEZA ........................................................................................................... 9

ESTILOS DE CERVEZA ARTESANAL (ALE) ................................................................ 10

AMERICAN PALE ALE ..................................................................................................... 10

BLONDE .............................................................................................................................. 10

STOUT ................................................................................................................................. 11

PROPIEDADES DEL CONSUMO MODERADO DE CERVEZA ................................... 11

PROCESO DE ELABORACIÓN DE CERVEZA .............................................................. 12

INGREDIENTES DE LA CERVEZA ................................................................................. 15

TIPOS DE MALTAS ........................................................................................................... 15

LEVADURAS (SACCHAROMYCES SPP) ....................................................................... 18

LÚPULOS ............................................................................................................................ 20

AGUA ................................................................................................................................... 21

ADJUNTOS ......................................................................................................................... 22

FERMENTACIÓN ............................................................................................................... 23

ALCOHOLES ...................................................................................................................... 24

TIPOS DE ALCOHOLES .................................................................................................... 25

ALCOHOLES DE FUSEL ................................................................................................... 26

IDENTIFICACIÓN DE ALCOHOLES ............................................................................... 27

DEFECTOS EN LA CERVEZA .......................................................................................... 28

AROMAS Y SABORES EXTRAÑOS EN LA CERVEZA TERMINADA ....................... 28

CROMATOGRAFÍA ........................................................................................................... 29

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) ............................... 29

OBJETIVO GENERAL ....................................................................................................... 30

OBJETIVOS ESPECIFICOS ............................................................................................... 30

HIPÓTESIS .......................................................................................................................... 31

JUSTIFICACIÓN ................................................................................................................. 31

MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................. 31

DISEÑO EXPERIMENTAL ................................................................................................ 31

ELABORACIÓN DE CERVEZAS ARTESANALES ........................................................ 31

CUANTIFICACIÓN DE ETANOL Y METANOL POR HPLC ........................................ 33

ANÁLISIS ESTADÍSTICO ................................................................................................. 34

RESULTADOS .................................................................................................................... 35

DISCUSIÓN ......................................................................................................................... 43

CONCLUSIONES ................................................................................................................ 46

LITERATURA CITADA ..................................................................................................... 47

1

RESUMEN

La cerveza es una bebida fermentada elaborada principalmente a partir de la cebada malteada

(semillas germinadas y secadas artificialmente), que es macera para liberar los azúcares

fermentables vía enzimática en una solución, la cual es aromatizada y amargada con flores

de lúpulo y fermentada con levaduras del género Saccharomyces. El objetivo de este trabajo

fue analizar los tipos de alcoholes que se generan en la fermentación de distintos estilos de

cerveza artesanal (de elaboración propia y comerciales) por cromatografía líquida (HPLC).

Se elaboraron lotes de tres estilos de cervezas artesanales en laboratorio, Blonde, Pale Ale y

Stout en lotes de 15 L. El proceso de elaboración de las cervezas se realiza con una segunda

fermentación en botella con sacarosa al 6 gr/L para su gasificación natural. El proceso de

cada tratamiento fue el mismo, lo único que cambió, fueron las proporciones y cantidades de

malta utilizadas, la cantidad y el tipo de lúpulos usados. Una vez elaboradas las cervezas

artesanales, se calculó el grado alcohólico de cada tratamiento por el método de

cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC). Lo resultados del análisis indican que

los estilos Pale y Stout presentaron un mayor contenido de etanol en contraste con la cerveza

Blonde. Además, el lote 1 de las tres cervezas fue el que presentó menor contenido etanólico.

Los tres estilos elaborados en la Universidad presentaron un contenido ligeramente mayor al

de las cervezas comerciales. No se encontraron diferencias en el contenido de etanol entre

cervezas filtradas o no filtradas. Por otro lado, no se detectaron niveles de metanol ni otros

alcoholes pesados que sobrepasen la NOM-199-SCFI-2017.

2

INTRODUCCIÓN

La elaboración y consumo de cerveza es muy antiguo y su descubrimiento se le atribuye a

los egipcios en Mesopotamia (Hornsey, 2003). Uno de los grandes cambios del proceso de

elaboración de cerveza fue la incorporación del lúpulo a finales del siglo XIX por los

alemanes, con la finalidad de contrarrestar el sabor dulce de la malta, ya que los únicos

ingredientes que se ocupaban eran la cebada, agua y los microorganismos del ambiente

(Cabras et al., 2016). Los principales países productores de cerveza artesanal son Australia,

Bélgica, Alemania, Estados Unidos y Nueva Zelanda, ya que ellos representan un 65% de la

producción (Deloitte, 2017). El consumo mundial de cerveza en 2017 fue de 186.72 millones

de kilolitros. El consumo de cerveza por país, señala a China (21.5%) como el país de mayor

consumo por 15º año consecutivo, seguido de Estados Unidos (12.8 %), Brasil (6.7 %),

México (4.6 %) y Alemania (4.4 %), es decir estos cinco países consumen el 50 % de la

cerveza que se produjo en el mundo en 2017. La cerveza es una bebida fermentada elaborada

principalmente a partir de la cebada malteada (semillas germinadas y secadas

artificialmente), que es macera para liberar los azúcares fermentables vía enzimática en una

solución, la cual es aromatizada y amargada con flores de lúpulo y fermentada con levaduras

del género Saccharomyces (The Beer Times, 2018). Los principales ingredientes para la

producción de cerveza son cebada, lúpulo, agua y levadura, en la fermentación alcohólica

varias de las sucesiones utilizan diferentes adjuntos que son compuestos aromáticos. El sabor

final de la cerveza depende principalmente del proceso y la composición del mosto en la cepa

de la levadura (Carvalho et al., 2009).

Generalmente una cerveza comercial su grado alcohólico es perfectamente conocido porque

es producto de un proceso completamente estandarizado. En cambio, en la producción de

3

cerveza artesanal, la determinación del grado alcohólico es meramente inferencial mediante

el cambio de densidades del mosto al inicio y al final de la fermentación. Sin embargo, es

necesario conocer a partir de una formulación y un proceso estandarizado de elaboración de

cerveza artesanal los niveles de alcohol que puede alcanzar bajo ciertas condiciones.

Para la cuantificación de alcohol en baja concentración en una solución o producto como la

cerveza, la técnica analítica más utilizada es la cromatografía de líquidos de alta resolución

(HPLC, por sus siglas en ingles). Básicamente es una técnica analítica de separación, la cual

tiene como principio la adsorción selectiva debida a la polaridad o al tamaño, y la capacidad

que tienen las moléculas de eluir a través de una fase móvil sobre una fase estacionaria. De

tal manera, que después de la separación y con la ayuda de un estándar externo (de 99% de

pureza) se puede realizar la cuantificación del compuesto de interés (alcohol y metanol) de

una muestra interpolando dentro de una curva de calibración de diferentes concentraciones

previamente analizada.

4

ANTECEDENTES

Historia de la cerveza

Las bebidas fermentadas son tan antiguas como la domesticación de especies y el desarrollo

de la agricultura, pues surgen con la recolección de frutos azucarados, semillas y raíces

amiláceas, que a su vez les extrajeron los jugos y fermentaron de manera espontánea, gracias

a la microbiota nativa del ambiente (Aguirre, 2012). La elaboración y consumo de cerveza

data de más de 8000 mil años y su descubrimiento se le atribuye a los egipcios (Hornsey,

2003). Hace miles de años en Mesopotamia, nadie entendía que la fermentación natural de

jugos se debía a levaduras presentes en el suelo y en las plantas, por lo cual se pensaba que

era un fenómeno divino (White y Zainasheft, 2010). El proceso de elaboración de cerveza ha

tenido pocos cambios (Bamforth, 2017), y por mucho tiempo se desarrolló de manera

empírica, pues el descubrimiento de los microorganismos responsables de la fermentación

alcohólica fue posterior (mediados del siglo XIX). Uno de los grandes cambios del proceso

de elaboración de cerveza fue la incorporación del lúpulo a finales del siglo XIX por los

alemanes, esto con la finalidad de contrarrestar el sabor dulce de la malta, ya que los únicos

ingredientes que se ocupaban eran la cebada, agua y los microorganismos del ambiente

(Cabras et al., 2016) lo que hacía que fueran fermentaciones más lentas e incompletas. La

producción industrial de cerveza en diferentes países implicó un desarrollo biotecnológico

importante, y el escalamiento del proceso en volúmenes descomunales a principios y

mediados del siglo XX, a tal grado que en la actualidad es considerada la bebida fermentada

más consumida en el mundo. En Alemania, a principios del siglo pasado, descubrimientos

arqueológicos evidenciaron la existencia de jarras que contenían residuos de cerveza hecha

con granos de cebada hace más de 16 siglos, este descubrimiento revela la existencia del

5

conocimiento del proceso de elaboración de bebidas alcohólicas (Grossman y Lemberck,

1983). La producción de cerveza en pequeña escala o nivel doméstico, fue lo que determinó

que la cerveza que se producía en condiciones precarias de equipo, recipientes, maquinaría y

aditamentos especiales para replicar el proceso antiguo, se le diera el concepto de cerveza

“artesanal”. Las pequeñas cervecerías siempre han existido en países de gran tradición

cervecera como Alemania. Sin embargo, a mediados de los años noventa del siglo pasado,

surge la primera cerveza mexicana artesanal inspiradas en las cervezas estadounidenses

(Deloitte, 2017). La producción de estas cervezas artesanales, han tenido un desarrollo y un

auge impresionante en México gracias al acceso de la información por internet y el interés

particular de los jóvenes por elaborar su propia cerveza y comercializarla en nivel local y

nacional.

Definición de cerveza

La cerveza es la bebida fermentada elaborada principalmente a partir de la cebada malteada

(semillas germinadas y secadas artificialmente), que se macera para liberar los azúcares

fermentables vía enzimática en una solución, la cual es aromatizada y amargada con flores

de lúpulo y fermentada con levaduras del género Saccharomyces (The Beer Times, 2018).

Los azúcares simples o fermentables que se obtienen de la maceración de la cebada malteada

son derivados de la hidrólisis enzimática del almidón, principalmente glucosa, maltosa y

maltotriosa. Sin embargo, no todo el almidón es convertido en azúcares fermentables, una

parte de este almidón queda en solución en forma de cadenas dobles de glucanos. Estos

glucanos solubles aportan calorías a esta bebida alcohólica, más que los azúcares

fermentables remantes al final de la fermentación. El contenido de alcohol que llega a

6

alcanzar una cerveza es variable y dependerá de las proporciones y cantidades de cebada y

otros granos utilizados, pero oscila entre 5 - 8 % de alcohol.

Tendencias de producción y consumo de cerveza

Para poder consultar datos específicos del consumo y producción de cerveza en México se

consultaron las estadísticas más recientes en nivel mundial (2017) que la Kirin Holdings

Company con sede en Japón, ha publicado desde 1975. Dichas estadísticas se obtienen a

través de encuestas realizadas a diversas asociaciones de cerveceros de 170 países.

Los principales países productores de cerveza artesanal son Australia, Bélgica, Alemania,

Estados Unidos y Nueva Zelanda, ya que ellos representan un 65% de la producción

(Deloitte, 2017).

El consumo mundial de cerveza en 2017 fue de 186.72 millones de kilolitros. El consumo de

cerveza por país, señala a China (21.5%) como el país de mayor consumo por 15º año

consecutivo, seguido de Estados Unidos (12.8 %), Brasil (6.7 %), México (4.6 %) y Alemania

(4.4 %), es decir estos cinco países consumen el 50 % de la cerveza que se produjo en el

mundo en 2017.

El mercado global de cerveza por regiones en el mismo año, se distribuye de la siguiente

manera: Asia con 33.7 %, Europa 26 % Centro y sur América 17.2 %, Norte América 13.9

%, África 7.3 %, Oceanía 1.2 % y otros 0.6 %. La cerveza artesanal ha tenido un crecimiento

muy favorable en los últimos años, como se muestra en el Cuadro 1, ya que cada vez hay

más productores que elevan su nivel de profesionalismo.

7

Cuadro 1. Crecimiento y ventas de cerveza artesanal en el mundo (Fuente: Alonso 2017).

Año Crecimiento % Ventas en Hectolitros.

2011 - 10,594

2012 43 15,179

2013 68 25,509

2014 77 45,200

2015 43 64,561

2016 62 104, 446

2017 59 166, 069

La cerveza mexicana tiene aparición en más de 180 países a nivel mundial, los principales

destinos son Estados Unidos, Australia, Chile, Canadá, Reino Unido y Brasil. Por lo que la

producción de cerveza, México ocupa el cuarto lugar por debajo de China, Estados Unidos y

Brasil, pero prevaleciendo a Alemania y Rusia (Alonso 2017).

Una encuesta realizada por el corporativo Deloitte (2017) señala que en México los

consumidores de productos con alcohol, el 53% de los encuestados prefieren cerveza

industrial, seguida por la cerveza artesanal con un 14%. Sin embargo, la cerveza artesanal va

creciendo su demanda.

La producción de cerveza por países en 2017 (186.2 millones de kilolitros) en el mundo,

China encabeza el ranking con 20.8 %, Estados unidos 11.4 %, Brasil 7.3 %, México 5.8 %

y Alemania 4.9 %. Los países que más consumen cerveza son los mismos países que

producen la mayor parte de su cerveza a excepción de China y E.E. U.U., México, Brasil y

Alemania son autosuficientes y exportan una pequeña parte a países con déficit de cerveza.

La tendencia del consumo de cerveza a través del tiempo generalmente es positiva, sin

8

embargo, los pequeños retrocesos que se logran ver en las estadísticas de ciertos países con

respecto a otros años, es quizás debido al desarrollo y consolidación de las cervecerías

artesanales, que muchas veces no se contabiliza en estas estadísticas.

Consumo per cápita de cerveza

El consumo per capita de cerveza (litros de cerveza por persona al año) más alto en 2017 fue

Republica Checa, seguido de Austria, Alemania, Polonia, Rumania, Irlanda y España, en 19°

lugar E.E. U.U. y en 25° lugar México (Figura 1).

Figura 1. Consumo per cápita de cerveza (litros por persona por año) por país en 2017.

Fuente: Kirin Holdings Company, 2017.

Rosovsky et al. (2013) mencionan que el consumo per cápita en 1989 fue de 4.7 litros de

etanol para la población mayor de 15 años (3 litros para la población total). En comparación

con otros países incluyendo a los de Latinoamérica, el consumo en México es bajo. La ingesta

de bebidas con etanol en México está representada principalmente por la cerveza (alrededor

del 70%), seguida de los destilados (casi el 30%) y, en forma menor, por los vinos

(aproximadamente 1%). Entre los años 2005-2010, España tenía las estadísticas de mayor

consumidor de cerveza con bajo contenido de alcohol, entre el 4.0 % y 5.0 % (Branyik et al.,

2011). Panda et al. (2015) indican que las bebidas alcohólicas más aceptadas a nivel mundial

9

son el vino y la cerveza, y las bebidas espirituosas como el whisky, el vodka, la ginebra y el

ron. La bebida alcohólica más vendida globalmente es la cerveza, y es la tercera bebida más

consumida después del agua y té.

Tipos de cerveza

Oliver (2012) hace mención que las cervezas se dividen en dos grandes categorías de familias

de cervezas tipo Ale y Lager que a continuación se describen algunas de sus características:

Las del tipo Ale comprende una amplia clase de cervezas aromáticas hechas con malta

de cereales generalmente más amarga que otras cervezas y elaborada con la levadura

de fermentación superior Saccharomyces cerevisiae, es una fermentación rápida de 2

a 7 días y a temperaturas altas de 15° C – 24° C (60° F – 78° F) (Grossman y

Lemberck 1983).

Cervezas tipo Lager, es una bebida brillante de cuerpo ligero, espumosa y

efervescente, elaborada con mezclas de maltas de diferentes cereales, tales como

sémola de maíz o maíz molido, por otro lado, utiliza una levadura de fermentación

inferior Saccharomyces pastorianus (En honor a Luis Pasteur), considerada como una

fermentación lenta de 5 a 10 días a temperaturas bajas de 7° C a 13° C (45° F – 55°

F) (Grossman y Lemberck 1983).

Las cervezas con bajo contenido de alcohol se especializaron por compuestos procedentes de

la malta. Adjuntas por pirazinas y furanos, y mezclados volátiles como linalool, β-humuleno

y α-terpineol derivados del aceite esencial de lúpulo. El Benzaldehído, el acetilpirrol, el

furfural y el 2-furanmetanol fueron características de las cervezas sin alcohol (Riu-Aumatell

et al., 2014).

10

Estilos de cerveza artesanal (Ale)

American Pale Ale

Uno de los primeros estilos americanizados, elaborados por las nuevas cervecerías en la

década de 1980, surgió cuando se utilizaron ingredientes estadounidenses para emular la pale

ale británica. La cerveza resultante mostro sabores cítricos y de lúpulo americanos con esto

fue encendiendo su amplia popularidad en el estilo de cerveza American Pale ale o también

conocida como americana pálida (Garrett, 2012). Las cepas de levadura de cerveza americana

producen menos ésteres que las levaduras de cerveza inglesa, por lo tanto, las cervezas

americanas tienen un sabor afrutado, también tienen más del carácter del lúpulo en sabor y

aroma amargos. El contenido de alcohol varia de tan bajo como 4.5% a tan alto como 6.2%

(Palmer, 2017).

Blonde

Las cervezas rubias o también conocidas como cerveza dorada son muy similares a las

cervezas pálidas, excepto que los lúpulos se han marcado para crear una cerveza que se pueda

beber como una cerveza ligera, puesto que es a menudo la cerveza más accesible para un

nuevo bebedor de cerveza artesanal (Palmer, 2017). La amargura para las cervezas rubias es

de 15-25 IBU en comparación con 25-25 IBU para las cervezas pálidas. El color suele ser un

dorado brillante y son generalmente muy suaves y las cualidades del éster se mantiene al

mínimo, el contenido de alcohol de 4.5% a 5.5%. Algunos cerveceros dicen que prepararlos

requiere habilidad, porque cualquier falla será notable (Garrett, 2012).

11

Stout

Las stouts evolucionaron del robusto portero que era un estilo muy popular en Londres en el

siglo XIX, aunque el termino robusto surgió por primera vez en Inglaterra en la década de

1700 para describir la versión con el alto contenido alcohólico y con sabor más audaz de

cualquier estilo de cerveza. Son una categoría de estilos de cerveza fermentada en caliente

que se distingue por su color, así como su carácter tostado que a menudo se percibe como a

chocolate oscuro o café (Garrett, 2012). La cerveza stout es posiblemente uno de los estilos

más populares entre los cerveceros caseros, varían mucho en sabor, grado de tostado y

cuerpo. La característica definitoria de una cerveza negra es el uso de maltas altamente

tostadas o cebada tostada sin maltear. Hay stout secos con una amargura de 25-45 IBU, su

color es de un marron oscuro a negro (Palmer, 2017).

Propiedades del consumo moderado de cerveza

El consumo de cerveza se ha asociado a contrarrestar un gran número de enfermedades, sin

embargo, aún no hay evidencias contundentes para su comprobación, únicamente se ha

asociado y comprobado que el consumo moderado puede reducir la incidencia de

enfermedades cardiovasculares, debido a sus efectos vasodilatadores, mejoradores del perfil

lipídico a causa en parte al contenido alcohólico bajo, pero en gran parte a los compuestos

no alcohólicos, principalmente compuestos fenólicos, los cuales se derivan del tostado de la

malta y del lúpulo añadido en su elaboración. Así, se ha reconocido que el consumo

moderado de cerveza (28 mL de alcohol, equivalente a dos cervezas de 355 mL al día) puede

reducir la incidencia de enfermedades cardiovasculares (de Gaetano et al., 2016), debido a

sus efectos vasodilatadores, mejoradores del perfil lipídico, atenuantes de la oxidación de las

lipoproteínas de baja densidad, antiinflamatorios y reguladores de los procesos de apoptosis

12

en el endotelio vascular. Capece et al., (2018) mencionan que el incremento de la ingesta de

antioxidantes en la dieta puede ser suministrada por medio de bebidas ampliamente

consumidas, tales como el vino, el café y la cerveza.

Proceso de elaboración de cerveza

El proceso de elaboración de cerveza es el mismo o similar tanto a nivel industrial como de

manera artesanal, comienza con el malteado de los granos, consiste en colocar el grano con

agua fría para estimular la germinación del grano por 24 horas y posteriormente secarlo,

algunos cambios con el uso de abrasión y ácido gilberelico para estimular y homogenizar la

germinación, sin embargo, actualmente no se aplica universalmente (Bamforth, 2017). Las

bacterias ácido lácticas se usan popularmente en las fermentaciones de los alimentos para

mejorar las propiedades sensoriales aromáticas y texturales. La aplicación de estas bacterias

a los granos en el proceso de malteado ayuda a prevenir que los microbios del ambiente se

adhieran a las maltas para la elaboración de la cerveza, resultando en la producción de una

cerveza de mayor calidad (Rouse y Sinderen, 2008). Una vez germinada la cebada es secada

y tostada dependiendo del tipo de cerveza que se quiera y es secada en hornos para su

estabilización y almacenamiento. Posteriormente, la cebada malteada se tritura con un

molino sin llegar a moler completamente, hasta reducir el tamaño de partícula de una cuarta

parte de la cebada malteada. Después se realiza una maceración que consiste en colocar la

cebada malteada malta en agua purificada a 65 – 68° C dependiendo del estilo de cerveza,

por un tiempo de 60 min, el líquido obtenido se llama mosto y es separado por un proceso

de filtración del grano o bagazo de cebada, el siguiente paso consiste en realizar una

pasteurización del mosto, como primer paso se realiza un hervido a 85° C, una vez que

comienza a hervir el mosto se agrega el lúpulo y se deja a hervor durante 60 min, transcurrido

13

este tiempo, se realiza un choque térmico con agua a 0° C con la ayuda de un intercambiador

de calor (Serpentin, placas, etc) y se baja la temperatura del mosto, este se coloca en un

fermentador al que se le agrega la levadura y se deja fermentar por 10 días a 19° C. Para que

ocurra la fermentación en necesaria la interacción de un microorganismo y un sustrato

orgánico susceptible a fermentarse (azucares fermentables). En el proceso de fermentación

de la cerveza el sustrato son los azúcares de la cebada malteada y macerada y el

microorganismo es la levadura, y como consecuencia sus principales subproductos son

dióxido de carbono y alcohol etílico (Vieira, 1996).

Actualmente, las cervecerías artesanales tienen más preferencia por sus estrategias

innovadoras, ya que producen cerveza de temporada con diferentes sabores y niveles de

alcohol, por ejemplo, en invierno se prefiere cervezas de malta caramelizada que es más

fuerte que la de verano ya que esta posee sabor a cítricos y es más ligera (Stewart, 2017)

La elaboración de la cerveza se divide en dos procesos principales, que corresponde a la

conversión del almidón de un cereal en azúcares fermentables por acción de las enzimas que

se encuentran en la malta y la posterior fermentación alcohólica de los mismos por la acción

de la levadura, pues en las siguientes imágenes podemos observar dos formas de elaboración

de cerveza, en la Figura 2, se presentan los pasos de un proceso industrial con puntos de

control establecidos y automatizados, y en la Figura 3 se muestra el proceso de elaboración

de cerveza artesanal.

14

Figura 2. Diagrama de proceso industrial de elaboración de cerveza (imagen tomada de

Lynch et al., 2016).

Molienda Agua Dosificación del lúpulo

Silo de malta Maceración Hervidor Mezclador

Levadura Enfriador

de mosto

Fermentación Maduración Limpiador

de botellas

Limpieza de barriles

Llenado

Llenado

Filtro de cerveza

PROCESO DE

ELABORACIÓN

15

Figura 3. Diagrama de elaboración de cerveza tipo artesanal (Fuente:www.haztucheve.com).

Ingredientes de la cerveza

Los principales ingredientes para la producción de cerveza son cebada, lúpulo, agua y

levadura. En la fermentación alcohólica varias de las sucesiones se utilizan diferentes

adjuntos que son compuestos aromáticos que confieren cualidades organolépticas al

producto. El sabor final de la cerveza depende principalmente del proceso y la composición

del mosto en la cepa de la levadura (Carvalho et al., 2009).

Tipos de Malta

Lewis y Bamforth (2006) hacen referencia que la cebada debe de ser una variedad baja en

proteínas (11% a 13%) para evitar turbidez por la precipitación de las mismas durante la

maceración, y bastante baja en humedad (12%-14%) ya que esta se cosecha en otoño, para

maltearla durante todo el año, esta debe ser movida y limpiada de forma regular y mantener

una temperatura de 13°C y una humedad menor al 13%.

16

Pilsner: Esta es la malta más suave de todas, y le da

a la cerveza un sabor que oscila entre lo dulce y

granulado.

Pale: Se parece mucho a la pilsner, pero la

diferencia radica en el tiempo de horneado, lo que

le da a la cerveza un sabor muy cercano al pan.

Típicamente se usa en la cerveza tipo ale.

Vienna: Es todavía más oscura que la Pale, y se

utiliza para hacer cerveza amber, tales como la Bock

o la Oktoberfest.

Munich: Es el doble de oscura que la vienna, y a

pesar de que no lo parece por su tonalidad ámbar, se

utiliza en cervezas con un sabor un poco más pesado

que la pilsner, pale o vienna. Muchos cerveceros

utilizan esta malta por su sabor acaramelado con

pequeños acentos de tostado y nueces.

Acarameladas: Son utilizadas bastante, tanto para

cervezas ligeras como la pale ale, y un poco más

fuertes como la dark ale, pero las cervezas que se

caracterizan por utilizar esta malta son la ale

inglesa, stout, y porter.

17

Chocolate: Para un sabor mucho más pesado y

fuerte, esta malta es la que más utilizan los

cerveceros, ya que su leve amargura le da un sabor

que se asemeja bastante al cacao. Muchas stout y

porter utilizan este tipo de malta.

Roasted Barley: Este tipo de malta se utiliza en la

stout, ya que le da un sabor profundo y tostado a la

cerveza. La stout irlandes, tal como la Guiness, son

las que utilizan este tipo de malta.

Trigo: Se utiliza mucho por sus proteínas, ya que

éstas ayudan a que la cerveza obtenga sabores

inusuales, como por ejemplo el sabor a plátano o a

clavo y presenten turbidez.

Centeno: Se da en lugares con condiciones

climáticas desfavorables, por eso, su uso en la

cerveza se da en lugares fríos, como Rusia o

Finlandia. De hecho, la cerveza tradicional de estos

dos países es hecha a base de este tipo de malta.

18

Avena: Se utiliza para realzar la textura de la

cerveza, ya que ayuda a crear una profunda

experiencia en el paladar que oscila entre lo

cremoso y sedoso. La cerveza stout y la pale ale son

las que más la utilizan.

Malta negra: Al igual que un café expresso, el

sabor de esta malta es amargo, e inclusive quemado,

pero justo por eso se utiliza en cervezas para

paladares más especializados. Por lo general se

utiliza para añadir profundidad y complejidad a la

cerveza, ya que ayuda a balancear los sabores dulces

propios de cualquier cerveza

Figura 4. Tipos de maltas (imágenes tomadas de Cerveceros de México, 2017).

Levadura Saccharomyces spp

De acuerdo con Kurtzaman et al. (2011) la levadura es microorganismo unicelular eucariota

y perteneciente al reino fungi, se considera un microorganismos económicamente importante

(figura 5). Ya que tiene un amplio uso en la industria como; 1) productores de etanol (bebidas

embriagantes, farmacéutica, solvente, esterilizante), 2) productores de biomasa y bióxido de

carbono (panificación), 3) productores de extractos (membranas celulares, mánanos,

glucanos, vitaminas, etc).

19

Figura 5. Estructura típica de una célula de levadura (imagen tomada de Stewart, 2017)

El nombre del género (Saccharomyces) es una palabra que proviene del griego “Sákcharon”

que significa azucar y “mykes” significa hongo. Este género comprende unas 10 especies, en

los que se encuentran S. cerevisae, S. paradoxus, S. mikatae, S. Kudriavzevii, S. arborícola,

S. eubayanus, S. uvarium, así como, híbridos desarrollados por la industria S. pastorianus y

S. bayanus (Stewart, 2017).

La importancia de la levadura en las bebidas fermentadas es producir el alcohol (White y

Zainasheff, 2010), la ecuación general [1] que describe la conversión de azúcar a etanol es:

Núcleo

Retículo

endoplamático

Mitocondria Globulo

de grasa

Vesículas

Brote

Cables

de actina

Aparato de

Golgi

Pared celular

Membrana

celular

endoplamático

Vacuola

20

Glucosa + 2 ADP + 2 grupos fosfato → 2 etanol + 2 CO2 + 2 ATP [1]

Y por cada gramo de azúcares en solución se produce 0.51 g de alcohol y el resto de CO2 y

otros compuestos minoritarios o congéneres.

Lúpulos

Palmer (2017) menciona que el lúpulo es una la planta tipo enredadera, que puede trepar

sobre cualquier soporte disponible hasta una altura de 9.0 metros o más, es nativa de las zonas

templadas de América del norte, Europa y Asia, el lúpulo florece en verano y los frutos se

obtienen entre finales de agosto y primeros de septiembre (figura 6). El lúpulo (Humulus

lupulus) es una planta estróbilo porque despliegan hojas reproductivas masculinas y

femeninas (las femeninas producen el fruto). Las hojas del lúpulo son parecidas a las de la

vid (uva) mientras que los conos (frutos) se asemejan a una piña en forma, pero es de color

verde claro y delgadas (Anderson et al., 2019). El lúpulo se utiliza en la producción de

cerveza debido a que le confiere un sabor amargo y aroma agradable, que son las

características más distinguibles de la bebida. La vida útil de la planta es de 10 a 15 años para

después sustituirla por otra. Las hojas externas del lúpulo se encuentran unas glándulas de

lupulina amarillas que contienen los aceites esenciales y las resinas que los cerveceros

aprecian por sus cualidades de amargor y aroma. El amargor se logra al isomerizar los ácidos

a los isoácidos más solubles durante la ebullición del mosto, mientras que el aroma de la

cerveza proviene de una mezcla de compuestos volátiles derivados de los aceites esenciales

del lúpulo (Anderson et al., 2019) Los aceites y resinas inhiben el crecimiento bacteriano, y

esta propiedad conservante natural es una de las razones por las que el lúpulo se utilizó por

primera vez en la cerveza.

21

Figura 6. Ilustración de la planta del lúpulo a) plantíos de lúpulo a gran escala, b)

inflorescencias de lúpulo conocidos como piñas y c) lúpulo peletizado.

Agua

La pureza del agua es posiblemente el parámetro más importante en la cerveza, pues esta

representa aproximadamente el 90% de la cerveza y tiene algunos parámetros que pueden

afectar el sabor, incluido el pH, la alcalinidad, las concentraciones de iones metálicos, los

microbios y la presencia de subproductos de desinfección. Algunas recomendaciones para su

uso en la industria cervecera es que debe estar limpia, hervida previamente para eliminar la

dureza temporal, la alcalinidad debe ser inferior a 50 mg/L y debe contener de 50-100 mg de

calcio/L (Palmer y Kaminski, 2013)

Anderson et al., (2019) indican que el pH del agua potable es de alrededor de 7.5, las cervezas

tienen un pH en que oscila entre 3.0 a 6.0 y las cervezas agrias pueden tener un pH tan bajo

como 3.3. La alcalinidad del agua afecta directamente el pH del mosto y el de la cerveza.

Palmer y Kaminski (2013) mencionan que el agua contiene muchos minerales y compuestos

naturales, así como contaminantes artificiales. Los altos niveles de magnesio causan un sabor

agrio y amargo desagradable en la cerveza. El sodio puede hacer que el carácter de la malta

a

b

c

22

sea más dulce a bajas concentraciones, pero también puede interactuar con el cloruro para

dar un sabor salado. El cloruro proporciona una calidad, más completa y más dulce a la

cerveza y también se usa para reducir la alcalinidad. Una cantidad moderada de sulfato

aumenta el "tiempo de permanencia" del amargor y acentúa el sabor del lúpulo, además de

aumentar la sequedad de algunas cervezas.

Adjuntos

Los adjuntos pueden ser macerados porque contienen almidón para convertirlos en azúcares

fermentables, como puede ser el maíz o el arroz, y los adjuntos que no necesitan ser

macerados y se añaden directamente a la olla de hervido pueden ser otro tipo de azúcares

como melazas y jarabes. Lewis y Bamforth (2006) indican que los adjuntos son utilizados

principalmente para que la cerveza sea más sabrosa y menos suave y ayude a diluir la

contribución de la malta al mosto. Algunos cerveceros de Alemania bajo los términos de

Reinheitsgebot pueden usar colorantes un ejemplo es la cerveza farbebier hecha con malta

tostada y filtrada con carbón activado para eliminar el carácter quemado, puesto que hay una

gama de extractos de maltas tostadas en las que los componentes de color y sabor sean

fraccionados y se puedan usar para introducir color sin sabores a las maltas y viceversa

(Lewis y Bamforth, 2006). Aquilani et al., (2015) señalan que los productores enfatizan el

sabor típico y distintivo de sus cervezas, debido a la adicción de frutas hierbas y especias que

puedan transformar la cerveza ordinaria en cerveza especial, junto con otros aromatizantes y

sustratos fermentables. Las primeras cervezas no utilizaban lúpulo, solo agregaban aditivos

para darle un sabor diferente, hoy en día es un ingrediente que contiene glándulas de lupulina

que produce el amargor de la cerveza (Mosher y Thantham, 2017). En la elaboración de la

cerveza el uso de cultivos iniciadores tiene como objetivo aumentar la eficiencia de la

23

fermentación, desarrollar nuevas cervezas y mejorar la complejidad sensorial de la cerveza

que se produce (Capece et al., 2018).

Fermentación

La levadura de cerveza puede ser tolerante a los distintos niveles de etanol ya que no

requieren función genética. Dahabieh et al. (2009) hacen referencia a que la cepa de S.

cerevisiae reduce la formación de carbamato de etilo, un carcinógeno que se produce durante

la fermentación de la cerveza.

Los tipos y la concentración de compuestos fenólicos y nitrogenados presentes en la cerveza

pueden variar según el estilo de cerveza, y están directamente influenciados por la

composición de las materias primas utilizadas en la producción de esta. Dichas materias

primas presentan características diferentes según las peculiaridades genéticas de la planta y

las condiciones ambientales durante el cultivo (Cheiran et al., 2019). Además, el proceso de

elaboración también influye en estos componentes.

La hidrólisis del almidón se puede lograr mediante dos procesos:

El primero de ellos se lleva a cabo por la maceración de algunos cereales malteados,

principalmente cebada u otros cereales. La segunda hidrolisis se realiza por la acción de

enzimas amilasas aisladas de bacterias y hongos para obtener los azúcares que después serán

fermentados con levaduras del género Saccharomyces (Stewart, 2017). Una vez hidrolizado

el almidón en azúcares más simples (maltosa y glucosa), entran a la ruta de la glucolisis

(figura 7) anaerobia para la producción de etanol.

24

Sulfato

Azúcares (C6H12O6) Aminoácidos

Piruvato Cetoácido

Acetil-CoA Etanol

Acil-CoA graso Alcoholes fusel

Lípidos

Figura 7. Principales rutas metabólicas durante la fermentación por las cuales la levadura

sintetiza alcoholes de fusel, ésteres, compuestos de azufre, VDK, acetaldehído y etanol

La fermentación alcohólica implica el rompimiento del piruvato a acetaldehído y CO2 y la

posterior reducción del acetaldehído a etanol por el alcohol deshidrogenasa (Mathews et al.,

2013).

Alcoholes

Los alcoholes son derivados de hidrocarburos saturados o insaturados en los cuales un átomo

de H se ha sustituido por un grupo hidroxilo (-OH). El cual está unido a un átomo de carbono

H2S + SO2

Acetaldehído Ácidos

orgánicos

Ácidos

grasos

Ésteres

Dicetonas

vecinales

25

alifático (Whitten et al., 2015). Garrett (2012) menciona que los alcoholes son precursores

de ésteres aún más potentes de sabor, derivados por reacciones catalizadas por enzimas en

levaduras a través del acoplamiento de los alcoholes con ácidos. Los alcoholes superiores

que se producen en la cerveza y en muchas bebidas espirituosas son n-propanol, isobutanol,

2-metl-1-butanol y 3-metil-1-butanol. Stewart (2017) señala que a medida que la biosíntesis

de alcohol superior es complicada, ya que pueden producirse como subproductos del

metabolismo de aminoácidos o mediante piruvato producidos a partir del metabolismo de

carbohidratos. Las cervezas ale tienden a contener mayores niveles de alcoholes fusel, un

ejemplo, los niveles de propanol son característicamente cuatro veces más altos en cervezas

ale que en cervezas lager y las elevaciones de isobutanol son tres veces más altos en cerveza

ale que en cervezas lager (Garrett, 2012)

Tipos de alcoholes

El etanol que también recibe el nombre de alcohol etílico o alcohol de grano, se obtiene por

la fermentación de azúcares. El metanol o alcohol de madera, se obtiene por la destilación de

madera y hoy en día se produce por monóxido de carbono e hidrógeno (Whitten et al., 2015).

(Etanol: CH3CH2OH, Metanol: CH3OH)

Las cervezas son exquisitas en compuestos alcohólicos de semejantes orígenes, mencionando

hexanol, heptanol y decanol y se derivan de diferentes vías de degradación. Mientras que el

α-terpineol citronelol, geraniol y el vinilfenol provienen del aceite esencial de lúpulo. Los

elementales alcoholes y ésteres podrían perderse por procedimientos físicos o por métodos

biológicos (Riu-Aumatell et al., 2014).

El piruvato tiene numerosos destinos alternativos en los microorganismos anaerobios, las

bacterias del ácido láctico reducen el piruvato a lactato en un solo paso. En cambio, las

26

levaduras convierten el piruvato en etanol en una ruta de dos pasos (Figura 8). La ecuación

[1] se divide en dos partes principales: glucosa a piruvato (glucolisis), luego el piruvato a

etanol. La primera es la descomposición de una molécula de glucosa en dos moléculas de

piruvato (White y Zainasheft, 2010) y la segunda fase (fermentación alcohólica) comienza

con la descarboxilacion no oxidativa del piruvato a acetaldehído catalizada por la piruvato

descarboxilasa (Mathews et al., 2013)

Figura 8. Reacción bioquímica de la generación de etanol a partir de piruvato.

Alcoholes de fusel

Garrett (2012) describe que este tipo de alcoholes son subproductos de la fermentación de

etanol, químicamente hablando presentan más de dos átomos de carbono en la molécula y

con puntos de ebullición más altos que el etanol, están presentes en concentraciones más altas

en cervezas más robustas y alcohólicas como los vinos de cebada y las cervezas tipo stout

imperiales, esto por las altas concentraciones de etanol y fermentaciones más extenuantes.

La levadura comienza a formar alcoholes fusel a partir de piruvato y acetil CoA durante la

síntesis de aminoácidos o de la absorción de aminoácidos, la formación de alcoholes fusel

implica la reoxidación de NADH a NAD+ en el paso final y algunos científicos creen que la

levadura produce alcoholes fusel para que NAD+ vuelva a estar disponible para la glucolisis

(White y Zainasheft, 2010) las condiciones de fermentación que promueven el crecimiento

27

celular, tales como la temperatura, la aireación y el nitrógeno dan como resultado niveles

mucho más altos de alcoholes fusel.

Identificación de alcoholes

El metanol (CH3OH) es el alcohol más sencillo, la ingestión de una cantidad tan pequeña

como 30 ml puede provocar ceguera permanente o la muerte. En la producción de metanol

interviene una reacción del monóxido de carbono con hidrógeno. El etanol CH3CH2OH, tiene

un punto de ebullición de 78ºC, se produce en la fermentación de granos al igual que el

metanol y otros alcoholes de bajo peso molecular (Burns, 2001).

El alcohol etílico (etanol) es el que se obtiene en la fermentación, especialmente de materias

primas que contienen azúcar o almidones sacarificables. El alcohol etílico se clasifica según

su contenido de congenéricos como se muestra en el cuadro 2.

Cuadro 2. Clasificación de las bebidas alcohólicas de acuerdo a su contenido de etanol.

Alcohol etílico mg/100ml

Espíritu neutro 8

De calidad 17

Común 75

La elaboración de bebidas alcohólicas se regula por la NOM-199-SCFI-2017, que no permite

la utilización o mezclas de alcoholes de otros orígenes a los derivados de materias primas

(Cuadro 3).

28

Cuadro 3. Especificaciones de la NOM-199 a bebidas Ale y cerveza

Especificaciones

Limites

Mínimos Máximos

Contenido de alcohol 2 % Alc. Vol. 20 % Alc. Vol.

Metanol (alcohol anhidro) - 300 mg/100ml

Acidez total (ácido láctico) - 10 g/l

(Fuente: Diario Oficial de la Federación, 2017)

Defectos en la cerveza

Aromas y sabores extraños en la cerveza terminada

Acetaldehído: generalmente la presencia de acetaldehído en la cerveza nos indica que la

fermentación de la cerveza fue estresada o incompleta. Los aromas pueden ser a calabaza

cortada o una habitación recién pintada, y los sabores pueden ser a sidra, así como a manzana

verde inmadura.

Alcohólico: un sabor alcohólico es un sabor fuerte, a veces picante que puede ser suave y

agradable pero también puede ser caliente y molesto.

Diacetil: es un sabor a mantequilla o caramelo, es una diacetona vecinal que se produce en

la fermentación por una reacción química de precursores de la levadura tales como amino

ácidos y α-acetolactato (Mosher y Trantham, 2017).

Carnoso: los sabores a carne o caldo generalmente son causados por la autolisis de la

levadura, en la cual las células mueren y derraman sus organelos sobre la cerveza. La autolisis

es causada por el hambre de la levadura y es más probable que ocurra con paquetes de

levadura viejos, condiciones de fermentación pobres o fermentaciones prolongadas (Palmer,

2017).

29

Carácter afrutado y alcoholes fusel: la razón más común de altos niveles de alcoholes, ésteres

y α-cetoácidos, puede deberse a un control insuficiente de temperatura, así como producir 2-

butanol, 3-metil-2-butanol, y 2-pentanol a partir de valina e isoleucina (dos aminoácidos) por

el rápido crecimiento de la levadura (Mosher y Trantham, 2017).

Fenoles: algunas cepas de levadura de cerveza producen compuestos fenólicos aromáticos a

través de una reacción de descarboxilacion de ácidos fenólicos que comúnmente se encuentra

en la malta y produce unos sabores extraños, al tener estos aromas y sabores se debe de

examinar los procesos de saneamiento y limpieza (White y Zainasheft, 2010)

Cromatografía

El término cromatografía procede de la palabra griega chroma- que significa color y -

graphein que significa escribir. El primer uso registrado fue del científico ruso Mikhail Tsvet

quien trituro carbonato de calcio y agrego plata verde homogeneizada en un tubo, y seguido

de un solvente orgánico. Así pudo observar bandas de colores separadas conforme el solvente

pasaba a través del tubo (Dhandapani, 2017)

Cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)

Miranda y Martin (2018) indican que la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, por

sus siglas en inglés) es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla. Es

un tipo de cromatografía en columna en el que, por acción de una bomba, se hace pasar una

mezcla de compuestos o analitos en un sistema disolvente comúnmente conocido como fase

móvil (figura 9). La fase móvil pasa a través de una columna cromatográfica, que contiene

la fase estacionaria a un flujo especifico. La separación de los compuestos ocurre con base

en la interacción de éstos con la fase móvil y la fase estacionaria (Dhandapani, 2017).

30

Figura 9. Representación de un equipo HPLC modelo 1260 infinity II Prime de la marca

Agilent (imagen tomada de https://www.agilent.com/en/products/liquid-

chromatography/infinitylab-analytical-lc-solutions/1260-infinity-ii-lc-systems/1260-

infinity-ii-prime-lc-system#zoom1405084609839)

OBJETIVO GENERAL

Estudiar los alcoholes como etanol y metanol que se generan en la fermentación de distintos

estilos de cerveza artesanal (de elaboración propia y comerciales) por cromatografía líquida

de alta resolución (HPLC).

OBJETIVOS ESPECIFICOS

1. Analizar el grado de alcohol presente en tres estilos de cerveza artesanal (Blonde,

Pale Ale y Stout).

2. Identificar y comparar el predominio de etanol y metanol que se generan durante la

fermentación de la cerveza artesanal (de elaboración propia versus comercial) por el

método de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).

31

HIPÓTESIS

La formación de metanol en la fermentación de cerveza artesanal (tipo Blonde ale, Pale ale

y Stout) se produce en igual cantidad que el etanol tanto en cervezas de elaboración propia

como en cervezas comerciales.

JUSTIFICACIÓN

La producción de alcoholes durante la fermentación de cerveza pueden ser varios tipos

(metanol, etanol), sin embargo, no hay suficiente información de la presencia y dominio de

cierto tipo de alcoholes en las cervezas artesanales, que pudieran ser dañinos para la salud de

los consumidores y que además cumplan con la norma de grado alcohólico de bebidas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Diseño experimental

El diseño experimental fue completamente al azar de tratamientos, donde cada

tratamiento será el tipo de cerveza, Blonde, Pale-Ale y Stout, cada tratamiento se realizó por

triplicado en distintos tiempos. La unidad experimental fue una cubeta de 15 L utilizada como

fermentador. Una vez envasada la cerveza en botellas, se seleccionó al azar tres botellas de

cada tratamiento y de cada replica como submuestra para su análisis de etanol y metanol por

cromatografía de líquidos, como variables dependientes.

Elaboración de cervezas artesanales

Se elaboraron en el laboratorio de Procesos Agrícolas de la Coordinación Académica

Región Altiplano Oeste de la Universidad Autónoma de San Luis Potosí, tres lotes de 15

litros de tres estilos de cervezas artesanales del tipo ale, Blonde, Pale y Stout. Todo el proceso

se realizó bajo condiciones controladas de asepsia e higiene en los materiales, recipientes y

32

mangueras lavados y/o sanitizados con alcohol al 70 %. El proceso de cada tratamiento fue

el mismo, lo único que varío, fueron las proporciones y cantidades de malta utilizadas con

otros granos, la cantidad y el tipo de lúpulos usados. Las formulaciones de las diferentes

mezclas de maltas, tipos de lúpulos y levaduras se describen en el Cuadro 4:

Cuadro 4. Formulaciones y materiales para la elaboración de lote de 15 litros de cervezas

artesanales estilos Blonde, Pale y Stout

Estilos

Ingredientes Blonde (T1) Pale-Ale (T2) Stout (T3)

Malta (kg) 4.10 Base

0.15 Caramelo

4.40 Base

0.30 Munich

0.20 Trigo

0.30 Victory

4.00 Base

0.40 Chocolate

0.25 Caramelo 120ºL

0.20 Negra

Levadura (g) 11.5 Safale US-05 11.00 Safale US-05 11.00 Safale S-04

Lúpulo (g) 28.00 *Willamette 14.00 *Columbus 32.00 *East Kent Golding

Otros lúpulos 7.00**Cascade

7.00**Centennial

14.00 ***Cascade

14.00***Centennial

Agregación de lúpulos: * 60 min en hervor, ** últimos 10 minutos del hervor, *** transcurridos los

60 min de hervor

Se realizó una maceración del grano a 67° C con agua purificada en hieleras de 50 L de

capacidad, para lo cual se calentó agua de garrafón (20 litros) a 78° C, 15 litros de agua

caliente se colocaron en la hielera en contacto con el grano y se dejaron reposar o macerar

por 60 min. Los otros 5 litros restantes se colocaron en otra hielera limpia y se utilizaron para

hacer lavados al bagazo. Posteriormente, se filtró la fase líquida (mosto) del bagazo de cebada

(fase sólida) y se realizó una pasteurización del mosto, como primer paso de este proceso el

mosto se colocó en una olla de acero inoxidable de 20 L y se hirvió a 80° C, una vez que el

mosto comenzó a hervir se agregó el lúpulo y se dejó a hervor durante 60 min, transcurrido

este tiempo se realizó un choque térmico con la ayuda de un intercambiador de calor tipo

33

serpentín de cobre de 7 m de largo y de 3/8 de diámetro, este se colocó adentro de la olla y

se le hizo circular agua a 0° C hasta que la temperatura del mosto descendiera a 35° C.

Después, se pasó el mosto pasteurizado a fermentadores tipo cubeta de plástico grado

alimentario, previamente sanitizados con alcohol al 70%, se les añadió la levadura y se

taparon y se sellaron con airlock (trampa de alcohol). La fermentación se llevó a cabo en un

cuarto oscuro a 19° C por 15 días. Pasado este tiempo, se realizó una segunda fermentación

en botella para su gasificación natural, se preparó una solución de sacarosa (6.0 g/L por litro

de cerveza) y se diluyo en 300 ml de agua purificada, esta se esterilizó, se agregó al

fermentador y se dejó reposar por 30 min. El lavado de botellas y corcholatas se realizó con

una solución de agua y jabón líquido grado alimentario (Starsan) 1.6 mL de jabón/1 L de

agua purificada. Una vez envasada la cerveza se mantuvo en un cuarto oscuro a 19° C por 15

días.

Una vez elaboradas las cervezas artesanales, se estimó el grado alcohólico de cada

tratamiento y cada repetición por densimetría, así como su cuantificación por cromatografía

de líquidos de alta resolución. Los datos de las variables dependientes se presentan con los

valores medios de las repeticiones de cada tratamiento y su desviación estándar.

Cuantificación de etanol y metanol por HPLC

La identificación y cuantificación de etanol y metanol se realizó utilizando el método de

Ewen (2011) por medio de un estándar externo con un cromatógrafo de líquidos de alta

resolución (Serie Agilent 1100, EE. UU.), con un detector de índice de refracción y una

columna Hi-Plex (Animex HPX 87-C, EE. UU.), y un lup de inyección de 20 µl, se utilizaron

etanol y metanol grado HPLC (J.T. Baker, EE. UU.) como estándares. Para su cuantificación,

se construyó una curva de calibración para cada estándar de acuerdo al contenido esperado

34

en las muestras. Como fase móvil se utilizó agua grado HPLC a 5 mM de H2SO4, la cual se

utilizó para la preparación de las muestras por dilución. Cada submuestra de cerveza se

sometió a un baño de sonicación (Branson 1510, EE. UU.) previamente de tomar el volumen

para su análisis, para eliminar el CO2, se hizo una dilución de 1:10 de muestra y fase móvil,

y las muestras se filtraron en membranas de poros de 0,45 µm (Millipore, EE. UU.) antes de

inyectar al HPLC. El compartimento de la columna como el detector de índice de refracción

se operó a una temperatura de 55 °C y con un flujo de 0.6 ml/ min. El tiempo de corrida de

las muestras fue de 26 minutos. Además, se realizó una comparación con cervezas artesanales

de los mismos estilos ya existentes en el mercado.

Análisis estadístico

Los resultados del contenido de alcohol entre lotes de cada estilo de cerveza (Blonde ale,

American pale ale y Stout, triplicado y n = 3.) elaboradas en nuestro laboratorio (propias), se

analizaron por medio de un diseño completamente al azar y con un análisis de varianza,

donde el único factor para cada estilo de cerveza fue el número de lote (3 lotes). Además, se

realizó un análisis estadístico por medio de un diseño de bloques al azar y un análisis de

varianza, donde los bloques resultaron ser los estilos de cerveza y los tratamientos fueron los

lotes, finalmente se hizo una prueba de medias de Tukey con una significancia de p<0.05.

Por otro lado, se compararon los contenidos de porcentaje de alcohol de las cervezas propias

y se compararon contra cuatro marcas comerciales de cervezas artesanales, para esto, se

realizó un diseño de bloques completamente al azar y un análisis de varianza con contrastes

ortogonales, donde los bloques resultaron ser los estilos de cerveza y los contrastes fueron

“cervezas propias vs marcas comerciales”, “cervezas con levadura filtrada vs no filtrada”,

35

finalmente, se hizo una prueba de medias de Tukey con una significancia de p<0.05 con el

software estadístico RStudio (2017).

RESULTADOS

Lo resultados del análisis de alcoholes presentes en las cervezas elaboradas y adquiridas de

marcas comerciales, se hicieron por el método de cromatografía HPLC, en el cual se logró

identificar solamente picos de etanol en un tiempo de retención de 22.44 min, tal como se

muestra en la Figura 10, por otro lado, aun cuando se corrieron estándares de metanol (tiempo

de retención de 18.39 min), este no se detectó en ninguna de las muestras.

Figura 10. Ejemplo de un cromatograma de las muestras de cerveza analizadas en HPLC

Cuantificación de etanol

Los valores del porcentaje del volumen de alcohol en cada uno de los estilos de cerveza

(Blonde, American pale ale (APA) y Stout) se muestran en la figura 11, 12 y 13,

respectivamente. De acuerdo con el análisis estadístico para el estilo de cerveza blonde ale

(figura 11), se observó que si hay diferencias significativas entre lotes (p<0.0001), los valores

más altos de contenido de alcohol se presentaron en los lotes número 2 y 3 siendo ambos

estadísticamente iguales entre ellos y con una media de 6.19 y 5.99, respectivamente. Por

Etan

ol

36

otro lado, el lote número uno fue el que presentó menor contenido de etanol (3.25 % vol.

etanol).

Figura 11. Comparación de contenido de alcohol en tres lotes de cerveza propia estilo

Blonde ale, elaboradas en la Universidad. Columnas con literales distintas son

estadísticamente diferentes (α<0.05). Barras de error están representadas por Desviación

Estándar.

El análisis estadístico para el estilo de cerveza APA, que se muestra en la figura 12, dicho

análisis indica que no hay diferencias significativas entre los lotes (p= 0.0660), el contenido

de alcohol de los tres lotes fue estadísticamente igual entre ellos con una media de 5.28, 7.24

y 6.53, para los lotes 1, 2 y 3 respectivamente.

b

a a

37

Figura 12. Comparación de contenido de alcohol en tres lotes de cerveza propia estilo

American Pale Ale, elaboradas en la Universidad. Columnas con literales distintas son

estadísticamente diferentes (α<0.05). Barras de error están representadas por Desviación

Estándar.

Los resultados del análisis estadístico para el estilo de cerveza Stout, se muestra en la figura

13, no se encontraron diferencias significativas entre los lotes (p = 0.3103) ya que los valores

de contenido de alcohol en los lotes 1, 2 y 3 resultaron estadísticamente iguales entre ellos

con una media de 5.84, 6.83 y 6.40 % vol. de etanol, respectivamente.

a

a

a

38

Figura 13. Comparación de contenido de alcohol en tres lotes de cerveza propia estilo

Stout, elaboradas en la Universidad. Columnas con literales distintas son estadísticamente

diferentes (α<0.05). Barras de error están representadas por Desviación Estándar.

De acuerdo al análisis estadístico del diseño por bloques al azar, indica que los resultados

mostraron diferencias significativas debido al bloque (estilos de cerveza, p<0.002) y los

tratamientos (lotes p<0.0001). Para los bloques las cervezas Stout y APA como se muestra

en la figura 14, fueron estadísticamente iguales con valores de % de vol. de alcohol igual a

6.36 y 6.35, respectivamente, siendo el estilo Blonde el que menor porcentaje de volumen de

alcohol presentó (5.14). Para los tratamientos, los lotes con valores más altos en contenido

de alcohol fue el lote 2 y 3 con una media de 6.75 y 6.30, respectivamente, quedando el lote

1 con el menor porcentaje de volumen de alcohol ya que mostro 4.79, como se observa en la

Figura 15.

a

a

a

39

Figura 14. Comparación del contenido de % de vol. de alcohol entre los tres estilos de

cerveza (Blonde, Pale Ale y Stout) por cada lote. Columnas con distinta literal, son

diferentes estadísticamente (p<0.05). Barras de error están representadas por el Error

Estándar de la Media.

0

1

2

3

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Blonde Ale Pale Ale Stout

Con

tenid

o d

e al

coho

l, %

vo

l

Bloques por estilo de cerveza

b

a a

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Lote 1 Lote 2 Lote 3

Conte

nid

o d

e al

cohol,

% v

ol

a a

b

40

Figura 15. Contenido de % de vol. de alcohol de cada estilo de cerveza (Blonde, Pale Ale y

Stout) por lote 1, 2 y 3. Columnas con distinta literal, son diferentes estadísticamente

(p<0.05). Barras de error están representadas por el Error Estándar de la Media.

De acuerdo al análisis de bloques al azar, se detectaron diferencias significativas del

contenido de etanol entre tratamientos (p=0.0554), el mayor contraste de volumen de alcohol

se logró entre la cerveza elaborada (Testigo) y la comercial # 4 (Figura 16). Además, con el

factor de bloque (estilos) también se detectaron diferencias estadísticas (p<0.01), donde las

cervezas Pale y Stout mostraron mayor contenido de etanol en contraste con la Blonde

(Figura 16).

Figura 16. Comparación del contenido de % de vol de alcohol en cada uno de los estilos de

cerveza, así como en todas las cervezas propias como las ya comerciales. Barras sólidas

0

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Tes

tig

o B

lon

de

Com

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al 1

Co

mer

cial

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Co

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cial

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cial

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Co

mer

cial

1

Co

mer

cial

2

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4

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Co

mer

cial

1

Co

mer

cial

2

Co

mer

cial

3

Conte

nid

o d

e al

cohol,

% v

ol

Tratamientos

Blonde ale Pale ale Stout

41

corresponden a cervezas sin filtrar y con asientos de levadura, barras con textura

corresponden a cervezas filtradas.

Los resultados del análisis de varianza indicaron que si se detectaron diferencias

significativas (p<0.01) entre los tres tipos de cerveza (bloques), los estilos pale ale y stout

fueron los presentaron el mayor contenido alcohólico (5.64% volumen, en los dos) siendo

ambos iguales estadísticamente hablando, el estilo de Blonde fue el exhibió menor % de vol.

de alcohol (4.89) (Figura 17).

Figura 17. Comparación del contenido de % de volumen de alcohol entre los tres estilos

(Blonde, Pale ale y Stout) en cada estilo se agruparon la cerveza elaborada en la

universidad, así como la de marcas comerciales. Columnas con distinta literal, son

diferentes estadísticamente (p<0.05). Barras de error están representadas por el Error

Estándar de la Media

El análisis de contraste ortogonal de los tratamientos (los diferentes tipos de marcas de

cervezas) mostró que si hubo diferencias significativas entre los tratamientos (p < 0.05) donde

0

1

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10

Blonde Pale Ale Stout

Conte

nid

o d

e al

cohol,

% v

ol

Bloqueo por estilo de cerveza

b

a a

(p < 0.01)

42

se observó que valores de contenido de alcohol en el tratamiento de la cerveza propia

(UASLP) contiene mayor contenido etanólico en contraste con los otros tratamientos de

marcas comerciales, los tratamientos (comercial #1, comercial #2 y comercial #3) son

estadísticamente iguales, la mayor diferencia estadística se presentó entre el tratamiento de

cerveza propia y la cerveza comercial # 4 (Figura 18).

Figura 18. Comparación del contenido de % de vol. de alcohol de la cerveza artesanal

elaborada en la universidad contra cervezas artesanal comerciales. Columnas con distinta

literal, son diferentes estadísticamente (p<0.05). Barras de error están representadas por el

Error Estándar de la Media

El análisis de contraste ortogonal para ver diferencias del contenido alcohólico entre cervezas

que filtran o no la levadura en cerveza para la gasificación de CO2, el cual muestra en la

figura 19, dicho análisis señala que no hay diferencias significativas si se filtra o no la

0

1

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10

UASLP Comercial 1 Comercial 2 Comercial 3 Comercial 4

Conte

nid

o d

e al

cohol,

% v

ol

Tratamientos

aab ab ab

b

(p < 0.05)

43

levadura (p = 0.0834), el contenido de alcohol de cervezas filtradas o no fue estadísticamente

igual.

Figura 19. Comparación del contenido de % de vol. de alcohol de la cerveza artesanal con

la levadura filtrada y sin filtrar. Barras de error están representadas por Error Estándar de la

Media.

DISCUSIÓN

El objetivo de este estudio fue identificar los tipos y predominio de alcoholes presentes en la

cerveza artesanal, en los estilos blonde, pale ale y stout, al ser una cerveza artesanal no

pasteurizada y sin filtrar (es decir con sedimento de levadura), la cerveza artesanal por su

proceso pudiera llegar a contaminarse y desviar la fermentación en otros subproductos y

desarrollar alcoholes con efectos negativos sobre la salud (Capece et al., 2018), y al no haber

suficiente información sobre los tipos de alcoholes que se generan durante la fermentación

0

1

2

3

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10

Sin Filtrar Filtrada

Conte

nid

o d

e al

coh

ol,

% v

ol

Levadura en cerveza

(p = 0.0834)

44

en cervezas artesanales en México, de ahí la importancia del desarrollo del presente proyecto,

pues además ello, la cerveza es la tercer bebida más popular en todo el mundo después del té

y el café, y es la bebida alcohólica más consumida en el mundo (Rodhouse y Carbanero,

2017).

En un trabajo realizado por Giovenzana et al. (2014) midieron el contenido de alcohol de

cervezas tipo ales y lager por espectrofotometría, y sus resultados concuerdan con los

obtenidos en nuestro trabajo, donde el contenido de etanol varía entre 4.9 y 7.1 % vol de

alcohol.

La identificación y cuantificación de etanol en bebidas alcohólicas no es exclusiva de la

cromatografía de gases, en cromatografía de líquidos recientemente se ha desarrollado

columnas más específicas como la Hiplex- H, que es una columna muy versátil para el

análisis muestras de fermentación, además de medir algunos alcoholes también puede separar

mono y disacáridos, además de algunos ácidos orgánicos.

Por ello el rango del contenido del alcohol encontrados en las muestras de cerveza por HPLC

fue similar al que reporta Rossi et al., (2014) al analizar el contenido de etanol de cervezas

de distintos países, sin embargo, la ventaja que tiene la cromatografía de gases de la del

HPLC es que además del etanol que se encuentra como producto principal de la fermentación,

se puede identificar más de 50 compuestos minoritarios o congéneres de la cerveza.

Zhao et al. (2010) analizaron 34 marcas comerciales internacionales de cerveza y los valores

de contenido alcohólico (entre 3.0 y 8.0 % v/v) también son consistentes con nuestros valores,

además señalan, que variaciones de etanol entre cervezas, se debe principalmente a la

formulación y a las cantidades de malta utilizada así como su calidad.

45

Es importante reconocer que el proceso de elaboración de cerveza se basa en una

fermentación completa de los azúcares (es decir, que se agotan completamente y se

transforman en etanol), por el tiempo que tarda en fermentar y porque la precepción de la

cerveza no es ni ligeramente dulce. Por ello el grado alcohólico es dependiente de la cantidad

de malta que la formulación nos diga, a mayor cantidad de malta, mayor es el grado

alcohólico que esperaremos al final de la fermentación. Eso se refleja con el grado alcohólico

que obtuvimos en el tipo de cerveza Blonde con 4.25 kg de malta, fue la que menor grado

alcohólico tuvo. En cambio, la Pale ale y la Stout con 5.2 y 4.85 kg de malta respectivamente,

fueron superiores que la Blonde, así la formulación es crítica para estimar el grado alcohólico

que puede llegar a alcanzar nuestra cerveza.

Es decir si Coehlo et al. (2019) mencionan que fermentar cerveza en barriles de madera por

largos periodos (3 meses), incrementa la producción de etanol (11% v/v) y otros compuestos

volátiles de mayor peso molecular 3-metil-1-butanol, 2-metil-1-butanol y 2- feniletanol,

quiere decir que para alcanzar ese nivel de alcohol al menos los grados Brix del mosto era

superior a 20° Brix, es decir, casi el doble de lo que se espera de una cerveza normal en el

doble de tiempo, por lo tanto el desarrollo de fermentaciones lentas puede deberse a varias

circunstancias entre ellas insuficiencia de levadura, pero también a un concentración alta de

azúcares del mosto al inicio de la fermentación alcohólica.

Las sustancias con actividad antioxidante presentes en la cerveza provienen esencialmente

de las materias primas empleadas en su elaboración, estando ya presentes en aquellas u

obteniéndose por modificación y transformación de sus constituyentes. Entre estas sustancias

destacan los polifenoles, que provienen esencialmente de la cáscara de la cebada malteada y

del lúpulo. Entre los compuestos que se encuentran en menor proporción en la cerveza, se

46

pueden destacar los compuestos fenólicos y nitrogenados. Vanderhaegen et al. (2006)

señalan que los compuestos fenólicos pueden influir en las características sensoriales de la

cerveza al agregar un sabor amargo y astringente a la bebida, estos compuestos tienen una

capacidad antioxidante y pueden estar relacionados con la estabilidad oxidativa de la cerveza,

aunque la principal fuente de amargor se debe al lúpulo.

El contenido de alcohol de las cervezas sin filtrar (con sedimento de levadura) y las filtradas

no hubo diferencias significativas, ya que las levaduras en es atapa de la fermentación muchas

de las levaduras están muertas y solo las pocas que quedas suspendidas en la cerveza son las

que llevan a cabo la segunda fermentación. Al contrario, si se agrega más sacarosa del rango

normal para fermentar suele presentarse gushing debido una mayor producción de CO2.

CONCLUSIONES

La cerveza artesanal se elabora siguiendo puntos de control de sanitización y limpieza, los

sabores son el resultado de la mezcla de agua, malta, lúpulo y levadura. Su producción es

limitada debido a los costos altos, sin embargo, sus sabor, amargor, aspecto y grado

alcohólico son distintos a las marcas comerciales industriales.

El mayor contenido alcohólico detectado en todas las cervezas analizadas fue de etanol. El

lote uno en las tres cervezas elaboradas fue el que presentó menor contenido etanólico. Los

estilos Pale y Stout, fueron los que mayor contenido de etanol presentaron en contraste con

el estilo Blonde y se relaciona con la cantidad de malta utilizada. Tanto las cervezas propias

como las comerciales presentan un contenido de etanol no mayor a 7.0 % de vol, es decir que

todos cumplen con la Norma Oficial Mexicana. La cerveza elaborada presenta mayor

47

volumen de alcohol, en comparación con marcas de cerveza artesanal comercial, quizás sea

debido a la cantidad de azúcar utilizada para realizar la segunda fermentación en botella para

gasificar de manera natural, esto le aporta un extra de alcohol a la cerveza de la primera

fermentación. Las cervezas sin filtrar (Con asientos de levadura) no presentan mayor

volumen de etanol en contraste con las cervezas filtradas. Con esta técnica no se detectó

producción de metanol, ni de otros alcoholes pesados.

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