UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS

QUÍMICA FARMACÉUTICA

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA MEDIANTE LA EXTRACCIÓN

DE LA FRACCIÓN ACTIVA PRESENTE EN LAS HOJAS DE LA ESPECIE VEGETAL

Moringa oleífera FRENTE A MICROORGANISMOS PATÓGENOS

Proyecto de investigación presentado como requisito previo para la obtención del título de:

Químico Farmacéutico

AUTOR: Dayana Pamela Sarasti Moya

dayana_sarastim@hotmail.com

TUTOR: Borja Espín Dayana Paulina

dpborja@uce.edu.ec

DMQ, MARZO 2018

ii

DEDICATORIA

Este trabajo está dedicado a Dios y a mi

familia que son el pilar fundamental de mi vida.

iii

AGRADECIMIENTOS

A Dios por ser mi guía durante todas las etapas de mi vida.

A mi madre Nancy por su infinito amor y su apoyo incondicional hacia mí, por ser parte

de mis triunfos y fracasos, por siempre darme ánimos para seguir en los momentos

difíciles, gracias mamá por tu esfuerzo y dedicación día a día, todo lo que soy te lo debo

a ti.

A mi padre Carlos, por todo su apoyo y su ejemplo, por sus sabios consejos, que me han

servido para ser una buena persona, gracias por ser parte fundamental de mi formación y

estar presente en cada momento de mi vida. A mi tía Jenny, gracias por ser una amiga

para mí, por tu apoyo y cariño a lo largo de esta travesía.

A mis hermanos Yesy, Paula, Dennis y Martín por todo su cariño, por ser mis mejores

amigos, por siempre estar a mi lado alegrando mis días y dándome ánimos para continuar.

A mis tíos Pablo y Eddy por sus consejos diarios y por estar siempre pendientes de mí.

A mi compañero de vida Carlitos, con quien empezó este sueño y que hoy lo culminamos

juntos, gracias por tu amor, por tu apoyo en este largo camino, por ser parte de vida en

los buenos y malos momentos.

A mi Tutora MSc. Dayana Borja por su apoyo y paciencia durante toda esta investigación,

y por los conocimientos impartidos hacia mí, que hoy me llevan a este gran triunfo.

A mi tribunal, el Dr. Fernando Novillo por su ejemplo como docente, por colaborar

conmigo en esta investigación, por sus consejos y por ser como un amigo para mí y al Dr.

Trosky Yánez por sus consejos para mejorar mi investigación, por su paciencia y tiempo.

A la Dra. Susana López quien me ofreció su ayuda proporcionándome la especie vegetal

para este trabajo investigativo.

A la Dra. Rommy Terán por ser una guía durante el trabajo experimental en Microbiología

y su ayudante de cátedra Paola Obando por colaborar conmigo en esta investigación.

Al Dr. Carlos Calderón quien a lo largo de mi vida universitaria ha estado apoyándome

con sus consejos y pendiente de mí, gracias Doctor por ser mi profesor y un buen amigo

a la vez.

A mis amigas Jessy P. Jessy L. y Rose que han compartido tantos momentos a mi lado,

que han sido incondicionales conmigo, gracias por cada aventura juntas, por su apoyo en

los momentos difíciles.

A mis amigos Richy y Andrés F. a quienes conocí el primer día de universidad y que

hasta hoy se han convertido en personas muy importantes para mí, gracias por su amistad

sincera, por sus consejos y por los momentos vividos.

Finalmente mi más sincero agradecimiento a la Universidad Central del Ecuador,

Facultad de Ciencias Químicas que a través de los conocimientos impartidos por sus

docentes han permitido mi formación profesional.

Dayana.

iv

AUTORIZACIÓN DE LA AUTORÍA INTELECTUAL

Yo, Dayana Pamela Sarasti Moya en calidad de autora del trabajo de investigación:

Evaluación de la actividad antimicrobiana mediante la extracción de la fracción

activa presente en las hojas de la especie vegetal Moringa oleifera frente a

microorganismos patógenos, autorizo a la Universidad Central del Ecuador, a hacer uso

de todos los contenidos que me pertenecen o parte de los que contienen esta obra, con

fines estrictamente académicos o de investigación.

Los derechos que como autora me corresponden con excepción de la presente

autorización, seguirán vigentes a mi favor, de conformidad con lo establecido en los

artículos 5, 6, 8; 19 y demás pertinentes de la Ley de Propiedad Intelectual y su

Reglamento.

También, autorizo a la Universidad Central del Ecuador a realizar la digitalización y

publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de conformidad a lo

dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.

Quito, 09 de Marzo del 2018.

Dayana Pamela Sarasti Moya

C.I. 172492903-7

v

CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TUTOR

Yo, en calidad de tutor del trabajo de investigación titulado: Evaluación de la actividad

antimicrobiana mediante la extracción de la fracción activa presente en las hojas de

la especie vegetal Moringa oleifera frente a microorganismos patógenos, elaborado

por la estudiante Dayana Pamela Sarasti Moya de la Carrera de Química Farmacéutica,

Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador, considero que el

mismo reúne los requisitos y méritos necesarios en el campo metodológico y en el campo

epistemológico, incluido las paginas preliminares, por lo que lo APRUEBO, a fin de que

sea sometido a la evaluación por parte del tribunal calificador que se designe.

Dado en la ciudad de Quito, a día 09 del mes de Marzo del 2018

Dayana Paulina Borja Espín

C.I. 171099384-9

vi

CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TRABAJO FINAL POR EL

TRIBUNAL

El Tribunal constituido por: Dr. Fernando Novillo, Dr. Trosky Yánez y MSc. Dayana

Borja, luego revisar el trabajo de investigación titulado: Evaluación de la actividad

antimicrobiana mediante la extracción de la fracción activa presente en las hojas de

la especie vegetal Moringa oleifera frente a microorganismos patógenos, previo a la

obtención del título (o grado académico) de Química Farmacéutica presentado por la

señorita Dayana Pamela Sarasti Moya APRUEBA el trabajo presentado.

Para constancia de lo actuado firman:

vii

ÍNDICE DE CONTENIDOS

RESUMEN ................................................................................................................................ xv

ABSTRACT ............................................................................................................................. xvi

INTRODUCCIÓN ................................................................................................................. xvii

CAPÍTULO I ............................................................................................................................... 1

EL PROBLEMA ......................................................................................................................... 1

1.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ................................................................ 1

1.2. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA..................................................................... 2

1.3. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN ............................................................... 2

1.3.1. Objetivo general .................................................................................................. 2

1.3.2. Objetivos específicos ......................................................................................... 2

1.4. IMPORTANCIA Y JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN ................... 2

CAPÍTULO II ............................................................................................................................. 5

MARCO TEÓRICO ................................................................................................................... 5

2.1. ANTECEDENTES ..................................................................................................... 5

2.2. FUNDAMENTO TEÓRICO .................................................................................... 6

2.2.1. El árbol de Moringa oleífera: Descripción Morfológica ............................... 6

2.2.2. Taxonomía ........................................................................................................... 7

2.2.3. Distribución ......................................................................................................... 7

2.2.4. Composición química ........................................................................................ 8

2.2.5. Aplicaciones ........................................................................................................ 8

2.2.6. Flavonoides.......................................................................................................... 8

2.2.7. Caracterización de Flavonoides ........................................................................ 9

2.2.8. Procesos de extracción ..................................................................................... 10

2.2.9. Antimicrobianos ................................................................................................ 10

2.2.10. Mecanismos de resistencia bacteriana ........................................................... 10

2.2.11. Microorganismos patógenos ........................................................................... 11

2.2.11.1. Escherichia coli ........................................................................................ 12

2.2.11.2. Pseudomonas aeruginosa ........................................................................ 12

2.2.11.3. Staphylococcus aureus ............................................................................. 13

2.2.11.4. Klebsiella pneumoniae ............................................................................. 14

2.2.12. Métodos de evaluación antimicrobiana ......................................................... 14

2.2.12.1. Métodos de difusión ................................................................................. 15

2.2.12.2. Métodos de dilución ................................................................................. 17

viii

2.2.13. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) ..................................................... 18

2.2.14. Microdilución en placa .................................................................................... 19

2.2.15. Control Positivo ................................................................................................ 19

2.3. FUNDAMENTO LEGAL ....................................................................................... 20

2.4. HIPÓTESIS ............................................................................................................... 21

2.4.1. Hipótesis de trabajo .......................................................................................... 21

2.4.2. Hipótesis nula .................................................................................................... 21

2.5. CONCEPTUALIZACIÓN DE VARIABLES ...................................................... 21

CAPÌTULO III .......................................................................................................................... 23

METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN .................................................................... 23

3.1. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN .................................................................... 23

3.2. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................... 23

3.2.1. Materiales .......................................................................................................... 23

3.2.2. Metodología ....................................................................................................... 25

3.2.2.1. Proceso de Recolección: .......................................................................... 25

3.2.2.2. Tratamiento de la muestra ....................................................................... 25

3.2.2.3. Proceso de Extracción .............................................................................. 25

3.2.2.4. Tamizaje Fitoquímico .............................................................................. 26

3.2.2.5. Cuantificación de flavonoides ................................................................. 27

3.2.2.6. Evaluación de la actividad antimicrobiana ............................................ 28

3.2.2.7. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) ............................................. 30

3.3. DISEÑO EXPERIMENTAL .................................................................................. 31

3.3.1. Diseño Factorial A x B .................................................................................... 31

3.4. TÉCNICA DE PROCESAMIENTO DE DATOS ............................................... 36

3.5. MATRIZ DE OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES ........................... 36

CAPÍTULO IV.......................................................................................................................... 37

ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS ................................................................ 37

4.1. PROCESO DE EXTRACCIÓN ............................................................................. 37

4.1.1. Tamizaje Fitoquímico ...................................................................................... 38

4.2. CUANTIFICACIÓN FLAVONOIDES ................................................................ 39

4.3. ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA POR EL MÉTODO DE LOS POCILLOS

EN AGAR ............................................................................................................................. 41

4.4. MICRODILUCIÓN EN PLACA ........................................................................... 45

4.4.1. Evaluación del porcentaje de Inhibición ....................................................... 53

ix

CAPÍTULO V ........................................................................................................................... 66

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ................................................................... 66

5.1. Conclusiones ............................................................................................................. 66

5.2. Recomendaciones ..................................................................................................... 67

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................................. 68

ANEXOS ................................................................................................................................... 73

x

ÍNDICE DE ANEXOS

Anexo 1. Certificado de Identificación botánica ................................................................. 73

Anexo 2. Hojas frescas y secas de Moringa oleifera ......................................................... 74

Anexo 3. Extracción por el Método Soxhlet ...................................................................... 74

Anexo 4. Marcha Fitoquímica ............................................................................................... 75

Anexo 5. Identificación de flavonoides, reacciones de coloración ................................. 76

Anexo 6. Cromatografía de Flavonoides ............................................................................. 76

Anexo 7. Cepas bacterianas ................................................................................................... 77

Anexo 8. Halos de inhibición formados a partir del extracto total de hojas frescas y secas

en bacteria Escherichia coli .................................................................................................... 77

Anexo 9. Halos de inhibición formados a partir de la fracción activa de hojas frescas y

secas en bacteria Escherichia coli ......................................................................................... 78

Anexo 10. Halos de inhibición formados a partir del extracto total de hojas frescas y

secas en bacteria Klebsiella pneumoniae ............................................................................. 78

Anexo 11. Halos de inhibición formados a partir de la fracción activa de hojas frescas y

secas en bacteria Klebsiella pneumoniae ............................................................................. 78

Anexo 12. Halos de inhibición formados a partir del extracto total de hojas frescas y

secas en bacteria Staphylococcus aureus .............................................................................. 79

Anexo 13. Halos de inhibición formados a partir de la fracción activa de hojas frescas y

secas en bacteria Staphylococcus aureus ............................................................................. 79

Anexo 14. Halos de inhibición formados a partir del extracto total de hojas frescas y

secas en bacteria Pseudomonas aeruginosa......................................................................... 79

Anexo 15. Halos de inhibición formados a partir de la fracción activa de hojas frescas y

secas en bacteria Pseudomonas aeruginosa......................................................................... 80

Anexo 16. Diluciones seriadas en microplaca para Escherichia coli con los diferentes

extractos ..................................................................................................................................... 80

Anexo 17. Diluciones seriadas en microplaca para Pseudomonas aeruginosa con los

diferentes extractos ................................................................................................................... 80

Anexo 18. Diluciones seriadas en microplaca para Staphylococcus aureus con los

diferentes extractos ................................................................................................................... 81

Anexo 19. Diluciones seriadas en microplaca para Klebsiella pneumoniae con los

diferentes extractos ................................................................................................................... 81

Anexo 20. Diagrama de flujo del Proceso de Extracción .................................................. 82

Anexo 21. Diagrama de causa efecto ................................................................................... 83

Anexo 22. Halos de Inhibición CLSI ................................................................................... 84

xi

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Estructuras de la especie vegetal Moringa oleifera ............................................. 7

Figura 2. Distribución de la especie vegetal Moringa oleifera . ......................................... 8

Figura 3. Estructura básica de un flavonoide . ...................................................................... 9

Figura 4. Estructura de la Quercetina ..................................................................................... 9

Figura 5. Escherichia coli al microscopio y en cultivo ...................................................... 12

Figura 6. Pseudomonas aeruginosa al microscopio y en cultivo. .................................... 12

Figura 7. Staphylococcus aureus al microscopio y en cultivo .......................................... 13

Figura 8. Klebsiella pneumoniae al microscopio y en cultivo ......................................... 14

Figura 9. Difusión por cilindro plac. ..................................................................................... 16

Figura 10. Difusión de disco en agar . .................................................................................. 16

Figura 11. Pocillos en agar. .................................................................................................... 17

Figura 12. Método de dilución ............................................................................................. 17

Figura 14. Concentración Mínima Inhibitoria: Dilución en caldo. ................................... 18

Figura 15. Placa para microdilución ..................................................................................... 19

Figura 16. Estructura química de la Ceftriaxona................................................................. 19

Figura 17. Extractor Soxhlet. ................................................................................................. 26

Figura 18. Esquema de cuantificación de flavonoides ....................................................... 28

Figura 19. Esquema de microdilución en placa .................................................................. 31

xii

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Susceptibilidad antimicrobiana del control positivo, Ceftriaxona ..................... 20

Tabla 2. Susceptibilidad antimicrobiana de la Ceftriaxona frente a las diferentes cepas

bacterianas ................................................................................................................................. 20

Tabla 3. Factores y niveles del diseño experimental, Fase III ........................................... 31

Tabla 4. Tratamientos del diseño, Fase III ........................................................................... 32

Tabla 5. Factores y niveles del diseño experimental, Fase IV ........................................... 32

Tabla 6. Tratamientos del diseño, Fase IV ............................................................................ 34

Tabla 7. ANOVA para un diseño factorial AxB ................................................................. 36

Tabla 8. Matriz de Operacionalización de Variables .......................................................... 36

Tabla 9. Porcentaje de rendimiento de extracción .............................................................. 37

Tabla 10. Resultados del Tamizaje Fitoquímico ................................................................. 38

Tabla 11. Datos de Concentración y Absorbancia del estándar Quercetina .................... 39

Tabla 12. Concentración de flavonoides en extractos totales y fracciones activas......... 40

Tabla 13. Halos de inhibición según el tipo de cepa bacteriana con el extracto total .... 41

Tabla 14. Análisis de Varianza para halos de inhibición formados por el Extracto Total

..................................................................................................................................................... 42

Tabla 15. Halos de inhibición según el tipo de cepa bacteriana con la fracción activa . 42

Tabla 16. Análisis de Varianza para halos de inhibición formados por la Fracción activa

..................................................................................................................................................... 43

Tabla 17. Halos de inhibición formados con el control positivo frente a cada cepa

bacteriana ................................................................................................................................... 44

Tabla 18. Resultados de absorbancia para el Extracto Total frente a las diferentes cepas

bacterianas ................................................................................................................................. 45

Tabla 19. Resultados de absorbancia para la Fracción activa frente a las diferentes cepas

bacterianas ................................................................................................................................. 47

Tabla 20. Porcentaje de Inhibición del Extracto Total frente a las diferentes cepas

bacterianas ................................................................................................................................. 53

Tabla 21. Análisis de Varianza para el porcentaje de Inhibición del Extracto total ....... 58

Tabla 22. Porcentaje de Inhibición de la Fracción Activa frente a las diferentes cepas

bacterianas ................................................................................................................................. 59

Tabla 23. Análisis de Varianza para el porcentaje de Inhibición de la Fracción activa . 64

Tabla 24. Concentración Mínima Inhibitoria de las diferentes cepas bacterianas en

relación al tipo de hoja. ............................................................................................................ 64

xiii

ÍNDICE DE GRÁFICAS

Gráfica 1. Porcentaje de Rendimiento de extracción a partir de Hojas Frescas y Secas 38

Gráfica 2. Curva de calibración del Estándar de Quercetina ............................................. 39

Gráfica 3. Concentración de flavonoides distribuidos según el tipo de hoja .................. 40

Gráfica 4. Promedio de los halos de inhibición con el Extracto Total ............................. 41

Gráfica 5. Promedio de los diámetros de los halos de inhibición con la Fracción activa

..................................................................................................................................................... 43

Gráfica 6. Promedio de los diámetros de los halos de inhibición con el control positivo

..................................................................................................................................................... 44

Gráfica 7. Concentración Mínima Inhibitoria del extracto total de hojas frescas y hojas

secas frente a Escherichia coli ................................................................................................ 49

Gráfica 8. Concentración Mínima Inhibitoria de la Fracción activa de hojas frescas y

hojas secas frente a Escherichia coli ...................................................................................... 49

Gráfica 9. Concentración Mínima Inhibitoria del extracto total de hojas frescas y hojas

secas frente a Pseudomonas aeruginosa ............................................................................... 50

Gráfica 10. Concentración Mínima Inhibitoria del extracto total de hojas frescas y hojas

secas frente a Pseudomonas aeruginosa ............................................................................... 50

Gráfica 11. Concentración Mínima Inhibitoria del Extracto total de hojas frescas y hojas

secas frente a Staphylococcus aureus .................................................................................... 51

Gráfica 12. Concentración Mínima Inhibitoria del extracto total de hojas frescas y hojas

secas frente a Staphylococcus aureus .................................................................................... 51

Gráfica 13. Concentración Mínima Inhibitoria del extracto total de hojas frescas y hojas

secas frente a Klebsiella pneumoniae .................................................................................... 52

Gráfica 14. Concentración Mínima Inhibitoria del extracto total de hojas frescas y hojas

secas frente a Klebsiella pneumoniae .................................................................................... 52

Gráfica 15. Porcentaje de Inhibición del Extracto Total frente a Escherichia coli ........ 54

Gráfica 16. Porcentaje de Inhibición del Extracto Total frente a Pseudomonas aeruginosa

..................................................................................................................................................... 55

Gráfica 17. Porcentaje de Inhibición del Extracto Total frente a Staphylococcus aureus

..................................................................................................................................................... 56

Gráfica 18. Porcentaje de Inhibición del Extracto Total frente a Klebsiella pneumoniae

..................................................................................................................................................... 57

Gráfica 19. Porcentaje de Inhibición de la Fracción activa frente a Escherichia coli ... 60

Gráfica 20. Porcentaje de Inhibición dela Fracción activa frente a Pseudomonas

aeruginosa ................................................................................................................................. 61

xiv

Gráfica 21. Porcentaje de Inhibición de la Fracción activa frente a Staphylococcus aureus

..................................................................................................................................................... 62

Gráfica 22. Porcentaje de Inhibición de la Fracción activa frente a Klebsiella pneumoniae

..................................................................................................................................................... 63

xv

TÍTULO: Evaluación de la actividad antimicrobiana mediante la extracción de la

fracción activa presente en las hojas de la especie vegetal Moringa oleífera frente a

microorganismos patógenos.

AUTOR: Dayana Pamela Sarasti Moya

TUTOR: Dayana Paulina Borja Espín

RESUMEN

El interés en la búsqueda de medicamentos a partir de extractos vegetales que tengan

poder antibacteriano, frente a infecciones potencialmente mortales causadas por

microorganismos patógenos, han permitido que el presente trabajo de investigación tenga

como propósito evaluar la actividad antimicrobiana mediante la extracción de la fracción

activa presente en las hojas de la especie vegetal Moringa oleífera frente a los principales

microorganismos patógenos que afectan la salud del ser humano. En este estudio se

obtuvieron extractos etanólicos por el Método de Soxhlet a partir de las hojas frescas y

hojas secas de esta especie vegetal. Se evaluó la actividad antimicrobiana del extracto

total y de la fracción activa mediante el método de los pocillos en agar frente a

microorganismos patógenos, obteniéndose como resultado que el extracto total y la

fracción extraída, exhiben patrones de sensibilidad eficaces frente a enterobacterias

(Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae) debido a que los halos de inhibición obtenidos

son ≥ 23 mm, superando los valores de referencia, un patrón de sensibilidad aceptable

para Staphylococcus aureus ya que los halos de inhibición obtenidos son ≥ 14 mm, por

lo tanto se puede determinar que estas cepas son sensibles a los extractos obtenidos, y una

susceptibilidad antimicrobiana intermedia frente a Pseudomonas aeruginosa ya que el

patrón de sensibilidad es ≥ 21 mm, por lo tanto con los halos de inhibición experimentales

obtenidos se puede deducir que esta cepa no es totalmente sensible a este tipo de extracto

ya que sus valores son menores que los de referencia.

PALABRAS CLAVES: MORINGA OLEIFERA, EXTRACTO TOTAL, FRACCIÓN

ACTIVA, ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA, PRINCIPALES

MICROORGANISMOS PATÓGENOS, SUSCEPTIBILIDAD.

xvi

TITLE: Evaluation of the antimicrobial activity by extracting the active fraction in the

leaves of the Moringa oleifera plant species against pathogenic microorganisms.

AUTHOR: Dayana Pamela Sarasti Moya

TUTOR: Dayana Paulina Borja Espín

ABSTRACT

The interest in the search for drugs that have an antibacterial effect against life-threatening

infections caused by pathogenic microorganisms, which have the present research work,

aims to evaluate the antimicrobial activity by extracting the active fraction present in the

leaves of the plant species Moringa oleifera against the main pathogenic microorganisms

that affect the health of the human being. In this study, ethanolic extracts were obtained

by the Soxhlet Method from the fresh leaves and dry leaves of this plant species. The

antimicrobial activity of the total extract and the active fraction was evaluated by the agar

well method against pathogenic microorganisms, obtaining as a result the total extract

and the fraction extracted, and exhibiting patterns of sensitivity against

enterobacteriaceae (Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae) because the inhibition

haloes obtained are ≥ 23 mm, exceeding the reference values, an acceptable sensitivity

pattern for Staphylococcus aureus since the inhibition haloes obtained are ≥ 14 mm,

therefore, it can be determined these strains are sensitive to obtained extracts, and an

intermediate antimicrobial susceptibility to Pseudomonas aeruginosa since the sensitivity

pattern is ≥ 21 mm, therefore with the experimental inhibition periods it can be deduced

that this strain is not totally sensitive to this type of extract since its values are lower than

those of reference.

KEY WORDS: MORINGA OLEIFERA, TOTAL EXTRACT, ACTIVE FRACTION,

ANTIBACTERIAL ACTIVITY, MAIN PATHOGENIC MICROORGANISMS,

SUSCEPTIBILITY.

xvii

INTRODUCCIÓN

La proliferación de enfermedades causada por microorganismos patógenos es una

preocupación generalizada, que constituye un factor de riesgo para la salud, es por esto

que se buscan fuentes naturales que inhiban el crecimiento bacteriano; descubriendo en

las plantas compuestos bioactivos para tal fin.

Moringa oleifera es una planta con innumerables propiedades nutritivas y

terapéuticas de la cual se puede aprovechar todas sus partes (semillas, raíz, hojas, flores,

vainas y frutos). Varios estudios demuestran las propiedades medicinales de la moringa

como antioxidante, en enfermedades respiratorias, cardiovasculares, gastrointestinales,

endocrinas, en el sistema nervioso central, en el sistema inmunológico y como

antibacteriano (Bonal, 2012).

Esta investigación se ha centrado básicamente en el estudio de la actividad

antimicrobiana que presenta esta especie vegetal frente a los principales microorganismos

patógenos que afectan la salud del ser humano entre los cuales tenemos cepas bacterianas

de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Klebsiella

pneumoniae.

En el capítulo uno de este trabajo de investigación se analiza y se describe

detalladamente el planteamiento y formulación del problema basado principalmente en

como evaluar el efecto antimicrobiano mediante la extracción de la fracción activa

presente en las hojas de la especie vegetal Moringa oleífera frente a microorganismos

patógenos. En este capítulo se describen también los objetivos de esta investigación tanto

de forma general como específica. Finalmente se detalla la importancia y justificación de

realizar esta trabajo, con el fin de que este estudio sirva como un aporte para futuras

investigaciones.

En el capítulo dos se describe el marco teórico de la investigación, se empieza

detallando los antecedentes a este estudio, es decir, los trabajos anteriormente realizados

que sirvieron como base para esta investigación. Posteriormente se describe el

fundamento teórico, donde se analiza y se detalla la descripción morfológica, taxonomía,

distribución, propiedades, composición química y aplicaciones de la especie vegetal

Moringa oleifera, así como los procesos de extracción y los métodos de evaluación

antimicrobiana frente a microorganismos patógenos. Se detalla también la formulación

de la hipótesis describiendo la hipótesis nula como la hipótesis alternativa. Finalmente se

realiza la conceptualización de las variables.

En el capítulo tres se describe la metodología a utilizar durante este trabajo de

investigación donde se detalla el diseño que se va a llevar a cabo en este trabajo

investigativo, los métodos y materiales requeridos, el diseño experimental, la matriz de

operacionalización de las variables y procesamiento de datos.

En el capítulo cuatro se realiza el análisis y discusión de los resultados, bajo los

cuales se determina el mejor porcentaje de extracción entre hojas frescas y hojas secas,

se analiza los metabolitos secundarios presentes en esta especie vegetal, así como la

xviii

concentración de activo en los diferentes extractos obtenidos. Se determina la actividad

antimicrobiana mediante el método de los pocillos en agar, comprobando que tipo de

extracto presenta mejor actividad antimicrobiana comparando con los patrones de

sensibilidad. Finalmente se realiza la concentración mínima inhibitoria por el método de

microdilución en placa de cada extracto frente a las diferentes cepas bacterianas.

En el capítulo cinco se establecen las conclusiones de este trabajo de

investigación de acuerdo a los objetivos planteados y en relación a los resultados

obtenidos. También se describen algunas recomendaciones que servirán para futuras

investigaciones acerca de esta especie vegetal que presenta múltiples propiedades.

1

CAPÍTULO I

EL PROBLEMA

1.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La salud pública enfrenta una crisis global a causa de las resistencias bacterianas.

Esta crisis tiene diversas dimensiones, todas igualmente importantes, sobre el uso

inapropiado de los antibióticos existentes que han acelerado exageradamente su resistencia.

Actualmente la falta de disponibilidad de antibióticos efectivos para las diferentes

poblaciones, ausencia de innovación y desarrollo de nuevos antibióticos han

comprometido la salud de las personas.

La proliferación de enfermedades causada por microorganismos patógenos es una

preocupación generalizada, que constituye un factor de riesgo para la salud, es por esto que

se buscan fuentes naturales que inhiban el crecimiento bacteriano; descubriendo en las

plantas compuestos bioactivos para tal fin (Corzo, 2012).

Desde el descubrimiento de los antibióticos, estos se han convertido en

medicamentos imprescindibles en la práctica médica, tanto para la prevención como para

el tratamiento de infecciones bacterianas en salud humana. En las últimas décadas, debido

principalmente al uso excesivo o inadecuado de los mismos se ha ido observando la

progresiva aparición de bacterias resistentes a la acción de estos fármacos. El desarrollo de

la resistencia a los antibióticos se presenta como uno de los mayores problemas de salud

pública, que es necesario afrontar en el momento actual, especialmente la aparición y

diseminación de bacterias multirresistentes y la escasez de tratamientos alternativos

(Ministerio de Medio Ambiente , 2017).

Según la OMS el uso excesivo e indiscriminado de antibióticos se ha convertido en

una de las principales amenazas para la salud mundial, ya que las bacterias se han vuelto

resistentes haciendo que las infecciones más comunes no puedan ser asistidas y que los

tratamientos actuales dejen de funcionar, de tal manera que las infecciones ocasionadas por

patógenos resistentes a los antibióticos han aumentado la duración de las hospitalizaciones,

los costos médicos y la mortalidad.

La producción farmacéutica en el Ecuador a partir de plantas de uso medicinal es

escasa, además los fitofármacos producidos son de venta libre sin comprobar la calidad de

los mismos constituyendo así un factor de riesgo para quienes consuman estos productos

que generalmente no cumplen con las exigencias establecidas de seguridad y eficacia.

La emergencia de la resistencia bacteriana ha generado nuevos intereses en la

búsqueda de medicamentos con poder antibacteriano, prueba de ello es el aumento en los

últimos años del número de publicaciones, centradas en los productos naturales y actividad

antimicrobiana, como fuentes de moléculas bioactivas frente a microorganismos con alta

capacidad infectiva (Ramírez & Marín, 2009).

2

1.2. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

¿Presentan actividad antimicrobiana los extractos obtenidos a partir de las hojas

frescas y hojas secas de la especie vegetal Moringa oleífera frente a microorganismos

patógenos de: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y

Klebsiella pneumoniae?

1.3. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN

1.3.1. Objetivo general

Determinar la actividad antimicrobiana frente a microorganismos patógenos a partir

de la extracción de la fracción activa de las hojas frescas y secas de la especie

vegetal Moringa oleífera.

1.3.2. Objetivos específicos

Realizar la identificación botánica de la especie vegetal.

Realizar el proceso de extracción a partir de las hojas frescas y secas de la especie

vegetal Moringa oleífera por el método de Soxhlet utilizando como solvente etanol

(70°).

Realizar una marcha fitoquímica de los extractos obtenidos para identificar los

metabolitos presentes en las hojas frescas y secas de la especie vegetal Moringa

oleífera, mediante pruebas de identificación y perfil cromatográfico.

Determinar cuantitativamente el porcentaje de flavonoides presente en los extractos

obtenidos mediante valoración espectrofotométrica utilizando como marcador

Quercetina.

Evaluar la actividad antimicrobiana mediante el método de los pocillos en agar

frente a cepas bacterianas de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,

Staphylococcus aureus y Klebsiella pneumoniae.

Determinar la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) mediante el método de

microdilución en placa frente a cepas bacterianas de Escherichia coli,

Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Klebsiella pneumoniae.

1.4. IMPORTANCIA Y JUSTIFICACIÓN DE LA INVESTIGACIÓN

La frecuencia de infecciones potencialmente mortales causadas por

microorganismos patógenos ha aumentado en todo el mundo y se está convirtiendo en una

importante causa de morbilidad y mortalidad. La creciente prevalencia de cepas

multirresistentes de bacterias y la aparición reciente de cepas con susceptibilidad reducida

a los antibióticos aumentó el espectro de las infecciones bacterianas "intratables" y añade

urgencia a la búsqueda de nuevas estrategias de lucha contra las diferentes infecciones

(Rahman, 2009).

Por un largo tiempo las plantas han sido una fuente importante de productos

naturales para la salud humana. Las propiedades antimicrobianas de las plantas han sido

3

investigadas en varios estudios en todo el mundo y muchos de ellos se han utilizado como

alternativas terapéuticas debido a sus propiedades antibióticas (Rahman, 2009). El uso de

los agentes antimicrobianos en la terapéutica de las enfermedades infecciosas, ha

constituido un acontecimiento sin precedentes, porque la curación y control de las

infecciones ha permitido modificar favorablemente el panorama de la morbilidad y

mortalidad del adulto, en el que estas afecciones ocupaban el primer lugar entre las causas

de muerte (Cordiés & Hamilton, 1998).

Con la finalidad primordial de incentivar y acelerar la investigación de nuevos

antibióticos, la Organización Mundial de la Salud (OMS) publicó en marzo del 2017 su

primera lista de “patógenos prioritarios” resistentes a los antibióticos, que incluye las

bacterias más peligrosas para la salud humana. La OMS divide su lista en tres categorías

por su urgencia en la necesidad de encontrar nuevos antibióticos: prioridad crítica, elevada

o media.

En el grupo de prioridad crítica y elevada se incluyen bacterias multirresistentes

que han adquirido resistencia a un elevado número de antibióticos. Estas son espacialmente

peligrosas para la salud humana y presentan un alto riesgo de contagio en hospitales,

residencias de ancianos y entre pacientes inmunodeficientes. Por lo que en este trabajo de

investigación se incluyen para su estudio las siguientes bacterias de prioridad crítica:

Pseudomonas aeruginosa, enterobacterias como: Klebsiella pneumoniae y Escherichia

coli y de prioridad media: Staphylococcus aureus.

Actualmente se ha generado un problema que deriva del mal uso de los antibióticos,

especialmente del consumo excesivo o inadecuado de los mismos, por lo cual la OMS

sugiere en la práctica médica y a quienes conforman los equipos de salud, que es de gran

importancia incluir la educación y capacitación a los pacientes sobre el uso de antibióticos,

soporte a las decisiones terapéuticas a través del mejoramiento de los servicios de

diagnóstico, implementación de guías de tratamiento, auditar su prescripción, dispensación

y promoción.

A pesar de la existencia de potentes agentes antibióticos y antifúngicos, las cepas

están apareciendo continuamente de forma resistente o multirresistente, imponiendo la

necesidad de una búsqueda intensa y el desarrollo de nuevos fármacos. Por lo tanto, la

búsqueda de nuevas fuentes de antibióticos debe ser un proceso continuo (Rahman, 2009).

Para preservar la eficacia de estos valiosos medicamentos es necesario asegurar su uso

responsable y prudente, aumentando la concienciación y el conocimiento sobre las

resistencias antimicrobianas (Ministerio de Medio Ambiente , 2017).

De acuerdo a la Organización Mundial de Salud, tres cuartos de la población en

países en desarrollo utilizan plantas medicinales como su principal fuente de tratamientos

contra enfermedades (Luqman & Ibrahim , 2014). Muchos de los usos documentados de

las plantas medicinales del Ecuador son vagos y se refieren en su mayoría a síntomas (tos,

fiebre, diarrea, dolor) más no a enfermedades diagnosticadas. Sin embargo, su acción

terapéutica es evidente, por lo que el estudio de la farmacología de los compuestos

4

bioactivos – los compuestos químicos en plantas que tienen actividad biológica en el

cuerpo humano – es necesaria (De la Torre & Navarrete, 2008).

La extracción de los bioactivos presentes en las hojas de la especie vegetal Moringa

oleifera generan un precedente de gran importancia ya que éstos podrían presentarse como

una opción terapéutica frente a diferentes patologías relacionadas con infecciones

producidas por microorganismos patógenos frente a los cuales éstos serán efectivos

mediante su efecto antimicrobiano. Este trabajo servirá además para investigaciones

posteriores de productos naturales obtenidos a partir de la especie vegetal Moringa oleifera

debido a las diferentes actividades farmacológicas que presenta y tomando en cuenta que

actualmente los fitofármacos tienen un valor terapéutico importante para el tratamiento y

prevención de distintas enfermedades, además de que éstos proveen oportunidades

ilimitadas para el hallazgo de nuevos fármacos.

5

CAPÍTULO II

MARCO TEÓRICO

2.1. ANTECEDENTES

“Potenciales aplicaciones de Moringa oleifera. Una revisión crítica” Martín, C. (2013)

En este artículo de investigación se presenta una amplia revisión bibliográfica sobre

las diferentes aplicaciones, usos y propiedades que presenta la especie vegetal Moringa

oleifera. En este estudio se detalla los usos medicinales de esta planta así como la

justificación fitoquímica de los efectos terapéuticos. También se describe sus diferentes

propiedades entre las cuales tenemos: actividad antimicrobiana, antioxidante,

antiinflamatoria, hipoglucemiante, antihipertensiva y su uso frente al cáncer. Se muestra

también sus efectos adversos y aplicaciones a nivel industrial. El análisis crítico de la

bibliografía disponible sobre la utilización de Moringa oleifera revela que, aunque todavía

quedan puntos por aclarar, una parte considerable de los beneficios que se le atribuyen

están confirmados científicamente. Según los autores del presente artículo, esta especie es

un biorrecurso de mucho interés para su explotación (Martín & García , 2013).

“Antibacterial Activity of Leaf Juice and Extracts of Moringa oleifera Lam. against

Some Human Pathogenic Bacteria” Rahman, M. (2009)

En este artículo de investigación se describe la actividad antibacteriana del extracto

de las hojas de Moringa oleifera, in vitro mediante la comparación entre extractos acuosos

y etanólicos los cuales fueron utilizados por el método de disco de difusión en agar y por

concentración mínima inhibitoria contra bacterias patógenas humanas. Ambos extractos

mostraron una potente actividad antimicrobiana frente a bacterias Gram negativas y Gram

positivas por lo que podrían ser utilizados como antibióticos naturales de espectro

extendido, sin embargo cabe recalcar que el extracto etanólico presenta una marcada

diferencia en cuanto al extracto acuoso, ya que el primero no exhibe actividad

antimicrobiana frente a Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes. Los

investigadores determinaron que los bio - componentes que contiene la planta son análogos

al antibiótico tetraciclina lo que le confiere su capacidad antimicrobiana de espectro

extendido (Rahman, 2009).

“Antimicrobial activity of moringa oleifera lam., leaf extract, against selected bacterial

and fungal strains” Devendra, B. (2011)

En este artículo de investigación publicado por la Revista Internacional de Farmacia

y Biociencias, se describe la potente capacidad antimicrobiana que posee la especie vegetal

Moringa oleifera Lam frente a una amplia gama de patógenos bacterianos como:

Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus y Streptococcus

pyogenes e inclusive algunos hongos como Aspergillus niger y Candida albicans. El

estudio demostró que los extractos de las hojas en cloroformo son muchos más eficaces

6

que los extractos en los que se utilizó éter de petróleo. Los investigadores concluyeron que

los extractos de esta especie vegetal tienen excelentes propiedades curativas frente a

patógenos infecciosos sin efectos secundarios en comparación a los antibióticos sintéticos,

sin embargo se necesita más estudios para aislar metabolitos secundarios que podrían

causar interacciones en el organismo humano (Devendra, 2011).

“Phytochemical and antibacterial investigations of moringa (Moringa oleifera) leaf

extract on selected bacterial pathogens” Abubakar, I. (2016)

Este artículo de investigación tuvo como objetivo principal evaluar los beneficios

para la salud que presenta la hoja de Moringa oleifera, utilizando extractos metanólicos y

acuosos en diferentes concentraciones (1:1 y 1:2) para determinar su cribado fitoquímico

y su actividad antimicrobiana aplicando el método de difusión en agar frente a cepas de

Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Streptococcus pneumoniae. El cribado

fitoquímico indicó la presencia de metabolitos secundarios tales como: alcaloides,

flavonoides, antraquinonas, taninos y fenoles. En ambos extractos se mostró actividad

notable contra el crecimiento de las bacterias seleccionadas, pero el extracto metanólico en

mayor proporción que el extracto acuoso. El resultado de este estudio mostró que Moringa

oleifera podría ser un medicamento antibacteriano valioso en el tratamiento de infecciones

causadas por los organismos de ensayo (Abubakar, 2016).

“Antibacterial Efficacy of Moringa oleifera Leaf against Medically Important Clinical

Pathogens” Manikandan, P. (2016).

En este artículo de investigación se describe la actividad antimicrobiana de las hojas

de Moringa oleifera frente a cepas bacterianas de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,

Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus pyogenes, Bacillus sp, Proteus sp, Salmonella sp

y Shigella sp. Utilizando como solventes para el proceso de extracción acetona,

cloroformo, metanol y éter de petróleo en diferentes concentraciones y el método de

difusión de disco en agar para la susceptibilidad microbiana. Se obtuvo como resultado

final que el extracto de las hojas en metanol mostró mayor actividad antimicrobiana frente

a todas las cepas establecidas por lo que se puede concluir que esta planta sería una opción

terapéutica para infecciones causadas por patógenos debido a su alto potencial antibiótico

(Manikandan, 2016).

2.2. FUNDAMENTO TEÓRICO

2.2.1. El árbol de Moringa oleífera: Descripción Morfológica

Moringa oleifera es una especie de muy rápido crecimiento. Alcanza de 7-12 m de

altura y de 20-40 cm de diámetro, con una copa abierta tipo paraguas y fusto recto, la

corteza es blanquecina. Aporta una elevada cantidad de nutrientes al suelo, además de

protegerlo de factores externos como la erosión, la desecación y las altas temperaturas

(Polini, 2011).

7

Las hojas son compuestas de unos 20 cm de largo con hojuelas delgadas oblongas

u ovaladas de 1 a 2 cm. de largo de color verde claro.

Las flores son bisexuales, con pétalos de color crema y estambres amarillos, muy

numerosos y fragantes, son polinizadas por abejas, otros insectos y algunas aves.

Los frutos en cápsulas trilobuladas, dehiscentes, de 20 a 40 cm de longitud.

Contienen de 12 a 25 semillas por fruto. Las semillas son de forma redonda y color castaño

oscuro, con tres alas blanquecinas. Cada árbol puede producir de 15 000 a 25000 semillas

por año. Las vainas maduras permanecen en el árbol por varios meses antes de partirse y

de liberar las semillas, las cuales son dispersadas por el viento, agua y probablemente

animales.

Las semillas son carnosas cubiertas por una cáscara fina de color café. Poseen tres

alas o semillas aladas de 2,5 a 3 mm de largo. Al quitar la cáscara se obtiene el endospermo

que es blanquecino y muy oleaginoso. Cuando se almacenan las semillas por más de dos

meses disminuye su poder germinativo.

La raíz principal mide varios metros y es carnosa en forma de rábano. Es pivotante

y globosa lo que le brinda a la planta cierta resistencia a la sequía en periodos prolongados.

Si se le hacen cortes a la corteza, produce una goma de color rojizo parduzco (Polini, 2011).

2.2.2. Taxonomía

Figura 1. Estructuras de la especie vegetal

Moringa oleifera

Nombre

Científico:

Moringa

oleifera Lam

Reino: Plantae

División: Magnoliophyta

Clase: Magnoliopsida

Orden: Brassicales

Familia: Moringaceae

Género: Moringa

Especie: Moringa oleifera

(Sherwin & Olson, 2012)

2.2.3. Distribución

Moringa oleifera, es un árbol perteneciente a la familia Moringaceae, es nativo de

las estribaciones meridionales del Himalaya. En la actualidad se cultiva prácticamente en

todas las regiones tropicales, subtropicales y semiáridas del mundo. Puede crecer en

condiciones de escasez de agua, pero su cultivo intensivo, con irrigación y fertilización,

aumenta los rendimientos de biomasa hasta superar las 100 toneladas por hectárea (Martín

& García , 2013).

8

Figura 2. Distribución de la especie vegetal Moringa oleifera (Polini, 2011).

2.2.4. Composición química

La corteza de la raíz contiene afomina y espiraquina. Las semillas y la raíz

contienen 4 (a-L-ramnosiloxi) benzilisocianato y pterigospermina. El aceite contiene

ácidos palmitico, esteárico, benoptérico y moríngico (Sherwin & Olson, 2012).

La semilla contiene aceite fijo (21%): ácidos oleico (67.5%), esteárico (10.5%);

bencenoides: (α-L-ramnosil-oxi) fenil-acetonitrilo, 4-hidroxi-fenilacetonitrilo y 4-hidroxi-

fenilacetamida, moringina, niazirina, derivados de bencil-carbamatos; misceláneos:

niazimicina; compuestos sulfurados: bencil-4-rhamnosil-oxi-glucosinolato,

pterigospermina, 4-(α-L-ramnosil-oxi)-bencil isocianato y derivados; esteroles: derivados

de daucosterol (Tramil, 2017).

La hoja contiene bencenoides: derivados de bencil-carbamatos y bencil-

tiocarbamatos; alcaloides: colina, ácido nicotínico; flavonoides: gossipitina, quercetina y

derivados, rutina; compuestos sulfurados: derivados de isotiocianato; misceláneos:

niazicina A, B, niazimina A, B (Tramil, 2017).

2.2.5. Aplicaciones

- Alimentación humana: valor nutritivo, vitamínico y mineral

- Usos medicinales: tos, fiebre, vómitos, etc.

- Prevención del cáncer

- Actividad antiinflamatoria

- Actividad antioxidante

- Actividad antimicrobiana

- Actividad hipoglucemiante y antihipertensiva (Martín & García , 2013).

2.2.6. Flavonoides

El término flavonoides proviene del latín "flavus", que significa "amarillo" y refiere

a una serie de metabolitos secundarios presentes en las plantas. Son pigmentos naturales

responsables de los colores vivos de muchas frutas y verduras y del color otoñal de las

hojas. Comprenden un grupo de compuestos polifenólicos a los que se les atribuye

9

propiedades antioxidantes, antiinflamatorias, antitrombóticas, antimicrobianas,

antialérgicas, antitumorales y antiasmáticas.

Estructuralmente están compuestos de dos anillos aromáticos (A y B) ligados a un

anillo pirano (C), obteniendo un esqueleto de difenilpiranos común en la mayoría de

flavonoides (Escamilla, 2009).

Figura 3. Estructura básica de un flavonoide (Escamilla, 2009).

Quercetina

Es un flavonoide tricíclico que se encuentra glicosilado, específicamente es un flavonol

que en su estructura presenta un grupo carbonilo en posición 4 y un grupo –OH en posición

3 del anillo C. (Escamilla, 2009). Los glicósidos flavonoides son considerados como

importantes productos medicinales para la prevención o el tratamiento de varias

enfermedades.

La Quercetina presenta numerosos efectos beneficiosos para la salud humana, incluyendo

actividad antibacteriana, antitumoral, protección cardiovascular, prevención de las

cataratas, efectos antihipertensivos, etc.

Figura 4. Estructura de la Quercetina

2.2.7. Caracterización de Flavonoides

Reacciones de Coloración

La reacción más usual para la detección de flavonoides en un extracto de p lanta es

la reacción de Shinoda: al extracto alcohólico se añaden pequeñas limaduras de magnesio

y unas cuantas gotas de HCl concentrado, el desarrollo inmediato de coloración es

indicativo de la presencia de: Flavonas: amarillo o rojo, Flavanoles: rojo a magenta,

Flavanonas: rojo, magenta, violeta o azul e Isoflavonas: amarillo que además pueden

estar acompañadas de abundante espuma. (Lock, 1997).

10

Otra reacción utilizada para la identificación de flavonoides es la de Cianidina,

mediante la cual al extracto obtenido se le añade una solución de alcohol etílico 50° y HCl

concentrado en una relación 2:1 (v/v) con limaduras de magnesio, observándose una

resultado positivo con la formación de una coloración anaranjada rojiza que se desarrolla

lentamente (Delporte, 2010).

Cuantificación espectrofotométrica de flavonoides

Este tipo de análisis permite determinar la cantidad de un metabolito específico presente

en un extracto, mediante la comparación con un estándar definido y a una longitud de onda

establecida de acuerdo a la absorción del activo.

2.2.8. Procesos de extracción

Para lograr una concentración adecuada de los principios activos contenidos en las

plantas y que su acción sea más efectiva es necesario realizar diversos procedimientos

mediantes los cuales sean extraídos aquellos con solventes adecuados que se seleccionan

de acuerdo a la solubilidad y la estabilidad que posean las sustancias beneficiosas. Los

métodos de extracción permiten obtener los productos en formas farmacéuticas adecuadas

para su administración oral o externa de acuerdo al lugar de acción que se recomiende . Las

farmacopeas han incluido dentro de sus especificaciones regulaciones con fundamento

científico para garantizar la calidad de estos preparados, los cuales no precisan de un

control tan exacto como los medicamentos oficiales, pero deben observarse algunos

cuidados en cuanto a la conservación y tiempo de almacenamiento (Bravo, 2013).

Los métodos de extracción dependen de la naturaleza química de las sustancias,

presentes en la planta y al propósito de la investigación. Si el trabajo va dirigido al

aislamiento de sustancias para la comprobación de actividad biológica, la extracción del

material vegetal debe hacerse utilizando solventes que se seleccionan de acuerdo a la

solubilidad y la estabilidad que posean las sustancias beneficiosas. Frecuentemente

extracción se realiza con solventes orgánicos de bajo punto de ebullición (alcohol, acetato

de etilo) y de baja reactividad. Algunas veces es conveniente desengrasar el material

vegetal con éter de petróleo (extracto etéreo) o hexano. El alcohol es generalmente más

eficaz para recuperar la mayoría de los metabolitos secundarios. Los extractos son

evaporados bajo presión reducida o liofilizados, en el caso de extracción con agua

(Marcano & Hasegawa, 2002).

2.2.9. Antimicrobianos

Sustancias naturales o sintéticas que se utiliza con fines terapéuticos para el

tratamiento de enfermedades infecciosas causada por bacterias patógenas.

2.2.10. Mecanismos de resistencia bacteriana

Las bacterias, por su alta capacidad de adaptación, pueden desarrollar mecanismos

de resistencia frente a los antibióticos.

Existe una resistencia natural o intrínseca que es propia de cada familia, especie o

grupo bacteriano, donde todas las bacterias de la misma especie son resistentes a algunas

11

familias de antibióticos y eso les permiten tener ventajas competitivas con respecto a otras

cepas y pueden sobrevivir en caso que se emplee ese antibiótico (Vignoli, 2011). La

resistencia adquirida es la realmente importante desde un punto de vista clínico: es debida

a la modificación de la carga genética de la bacteria y puede aparecer por mutación

cromosómica o por mecanismos de transferencia genética (Daza, 2010).

Las bacterias se hacen resistentes a los antibióticos desarrollando mecanismos que

impiden al antibiótico ejercer su acción. Los mecanismos de resistencia de las bacterias son

fundamentalmente tres:

1) Inactivación del antibiótico por enzimas: La bacteria produce enzimas que

inactivan al antibiótico; En este caso la enzima, elaborada por la bacteria, inactiva

a la molécula de la droga volviéndola incapaz de actuar. Hay que tener presente que

este mecanismo es el único capaz de inactivar a la molécula de antimicrobiano

(Daza, 2010).

2) Impermeabilidad de la membrana o pared celular: Las bacterias producen

mutaciones en las porinas de la pared que impiden la entrada de ciertos antibióticos

o alteran los sistemas de transporte. En otras ocasiones pueden provocar la salida

del antibiótico por un mecanismo de expulsión activa, impidiendo que se acumule

en cantidad suficiente para que actúe eficazmente (Daza, 2010).

3) Alteración de su punto diana: impidiendo o dificultando la acción del antibiótico.

Aquí podemos contemplar las alteraciones a nivel del ADN girasa y del ARN de

las enzimas producidas generando una reducción de la afinidad del receptor por la

molécula de antimicrobiano (Daza, 2010).

Una misma bacteria puede desarrollar varios mecanismos de resistencia frente a

uno o muchos antibióticos y del mismo modo un antibiótico puede ser inactivado por

distintos mecanismos de diversas especies bacterianas, todo lo cual complica sobremanera

el estudio de las resistencias de las bacterias a los distintos antimicrobianos.

2.2.11. Microorganismos patógenos

Algunos microorganismos son capaces de penetrar y multiplicarse en otros seres

vivos, a los que perjudican, originando una infección; son los denominados

microorganismos patógenos. Los problemas que causa una infección dependen del tipo de

patógeno, el modo en que se transfiere, dosis o concentración de patógenos, persistencia

de los microorganismos y la resistencia del organismo infectado (Hernández E. , 2016).

Suelen clasificarse en virus, bacterias, hongos y parásitos.

Bacterias: Las bacterias se caracterizan por estar formadas por una única célula sin

núcleo; por esto son denominadas organismos unicelulares procariontes. Estos organismos

se caracterizan también por tener una membrana celular firme, que los rodea y protege. Su

reproducción es asexual, se produce cuando las células generan otras células idénticas y

suele ser una reproducción muy rápida, si las condiciones son favorables (Rodríguez,

2015). Entre las principales bacterias a estudiar tenemos:

12

2.2.11.1. Escherichia coli

Figura 5. Escherichia coli al microscopio y en cultivo (Arnal, 2016)

Se trata de una bacteria patógena que normalmente vive en el intestino del hombre,

no suele causar ningún tipo de problema y es considerado un microorganismo de nuestra

flora bacteriana normal, y que es necesaria para el funcionamiento correcto del proceso

digestivo. Sin embargo, algunas cepas por intercambio de material genético, han adquirido

la capacidad de causar infecciones y provocar diarreas sangrantes (Armora & Gómez,

2012).

Morfología: Escherichia coli es un bacilo Gram negativo, de 1 – 3 μm por 0.5 μm, que se

presenta sólo, en pares, en cortas cadenas o formando grupos.

Metabolismo: anaerobio facultativo de la familia Enterobacteriaceae.

Hábitat: Escherichia coli pertenece a un grupo de bacterias presentes en el intestino del

ser humano y animales, siendo, la gran mayoría, inocuas en ellos. Sin embargo, hay algunas

cepas de Escherichia coli productoras de toxinas, llamadas verotoxinas o toxinas de tipo

shiga que pueden causar cuadros gastrointestinales graves en el ser humano entre ellos

diarrea (Rodríguez & Angeles, 2002).

2.2.11.2. Pseudomonas aeruginosa

Figura 6. Pseudomonas aeruginosa al microscopio y en cultivo (Mahajan, 2011).

13

Es un patógeno que causa infecciones en personas inmunocomprometidas, como

por ejemplo personas con quemaduras de la piel, pacientes que reciben quimioterapia para

el cáncer, pacientes con fibrosis quística, al tipo de infecciones antes mencionadas se le s

llama infecciones de un patógeno oportunista (aprovechar situaciones desfavorables del

paciente para enfermar), también produce muchos casos de infecciones nosocomiales (en

hospitales), como neumonías (González J. , 2015).

Morfología: Son bacilos cortos, en parejas, en cadenas o aislados, Gram negativos,

presentan un tamaño que está entre 0.5 μm y 0.8 μm de espesor por 1.5 μm y 3.8 μm de

largo. No forma esporas.

Hábitat: El género Pseudomonas prácticamente se encuentra distribuido en todas partes,

por ejemplo en agua, suelos, vegetación, gasolina, objetos inanimados, en humanos,

animales, etc.

Metabolismo: Tiene un metabolismo aerobio estricto-oxidativo, no fermenta

carbohidratos, sus requerimientos nutricionales son sencillos prácticamente crece en agua (González J. , 2015).

2.2.11.3. Staphylococcus aureus

Figura 7. Staphylococcus aureus al microscopio y en cultivo (Mulcahy, 2013)

Los Staphylococcus son microorganismos que se asocian con infecciones humanas,

son colonizadores principalmente de superficies cutáneas y mucosas. Staphylococcus

aureus es la principal especie patógena de su género, causa común de infecciones diversas,

tanto de origen comunitario como hospitalario . Estas bacterias pueden vivir en muchas

superficies de la piel sin ocasionar daño alguno, sobre todo alrededor de la nariz, la boca,

los genitales y el ano. Pero, cuando la piel se rompe o perfora por cualquier motivo, los

estafilococos pueden introducirse en la herida y provocar una infección.

El principal reservorio de Staphylococcus aureus es el ser humano, hallándose en

los portadores sanos, especialmente en las fosas nasales, así como en los pacientes

infectados. La colonización puede asentar sobre la mucosa nasal, orofaringe, epidermis

íntegra, úlceras crónicas cutáneas, o en heridas en fase de cicatrización (Camarena, 2011).

14

Morfología: Son cocos Gram positivos, se observa asociación en racimos irregulares

(similar aún racimo de uvas), carecen de flagelos, no producen esporas y rara vez pueden

tener cápsula.

Metabolismo: No son exigentes con sus requerimientos nutricionales , son aerobios

facultativos y crecen favorablemente a temperaturas de 30-37°C, son capaces de crecer en

medios altamente salinos (7.5-10% NaCl)

Hábitat: Flora normal de las narinas (fosas nasales), nasofaringe, región perineal (en mujer

en hombre) y piel. Puede colonizar diversas superficies epiteliales y mucosas (Cruz, 2011).

2.2.11.4. Klebsiella pneumoniae

Figura 8. Klebsiella pneumoniae al microscopio y en cultivo (The Biocote Team, 2015).

Es un tipo de bacteria que forma parte de la flora normal gastrointestinal, sin

embargo su importancia médica radica debido a que es una bacteria oportunista es decir

que frente a pacientes inmunológicamente comprometidos pueden producir enfermedades

nosocomiales como infecciones respiratorias, urinarias, neumonías, etc. Las cepas de K.

pneumoniae tienen el potencial para causar morbilidad y mortalidad, particularmente en

las unidades de cuidados intensivos pediátricos y servicios quirúrgicos (González, 2013)

Morfología: Son bacilos Gram negativos de la familia Enterobacteriaceae, con un tamaño

entre 0.5 μm y 2.0 μm, forma endoesporas y no presenta flagelo, por lo que es inmóvil.

Metabolismo: Son microorganismos facultativos anaerobios, crecen favorablemente a

temperaturas entre 30°C y 37°C. Tienen la enzima de catalasa, ureasa, fermenta

muchos carbohídratos, como la lactosa, por lo tanto son capaces de formar ácidos fuertes

en sus procesos metabólicos.

Hábitat: forma parte de la flora normal gastrointestinal.

2.2.12. Métodos de evaluación antimicrobiana

Diferentes métodos de laboratorio pueden ser usados para determinar in vitro la

susceptibilidad de bacterias ante agentes microbianos, pero estos no son igualmente

15

sensibles o no se basan en los mismos principios, permitiendo que los resultados sean

influenciados por el método seleccionado, los microorganismos usados y el grado de

solubilidad de cada compuesto evaluado (Ramírez & Marín, 2009).

Los métodos para evaluar la actividad antibacteriana están clasificados, en tres

grupos principales: Métodos de difusión, métodos de dilución, bioautografía. En general

se propone usar los métodos de difusión (en papel o en pozo) para estudiar compuestos

polares, y los métodos de dilución para sustancias polares y no polares (Ramírez & Marín,

2009).

Las metodologías aplicadas siempre consideran la estandarización de la

concentración bacteriana a utilizar, con el ánimo de evitar un crecimiento exhaustivo, que

impida el análisis de los resultados o proporcione resultados errados lo cual puede variar

significativamente la respuesta del extracto vegetal o aceite, indicando la necesidad de

utilizar concentraciones mayores de éste para inhibir el crecimiento del microorganismo

(Ramírez & Marín, 2009).

La concentración de bacterias usada para el estudio de susceptibilidad en el

laboratorio ha sido estandarizado en 1,5 x 108 unidades formadoras de colonias (ufc)/mL,

lo cual equivale a un patrón de 0.5 en la escala de Mac Farland. Es recomendable tomar el

inoculo de cultivos en la fase exponencial de crecimiento y siempre tomar 4 o 5 colonias

de un cultivo puro para evitar seleccionar variantes atípicas. Los medios de cultivo más

utilizados en dichas técnicas son el agar Mueller Hinton y agar tripticasa soya, ya que sus

componentes facilitan el crecimiento de diferentes cepas bacterianas y mayor difusión de

las muestras (Ramírez & Marín, 2009).

2.2.12.1. Métodos de difusión

Los métodos de difusión son: método de pocillos en placa, cilindro placa y la

difusión en disco. Estos métodos se fundamentan en la difusión de sustancias en el agar

donde ha sido previamente sembrado un determinado microorganismo. La formación de

un halo alrededor del sitio donde se colocó la sustancia indica que esta tiene actividad

antimicrobiana. El halo debe medirse y compararse contra el de un antibiótico patrón.|

Dependiendo del diámetro de inhibición se puede establecer si el microorganismo es

sensible, moderadamente sensible o resistente al producto analizado (Terán, 2017).

Método de cilindro en placa: Esta técnica es la más utilizada dada su exactitud y

sensibilidad; se fundamenta en la difusión del antibiótico desde un cilindro vertical (o desde

una perforación circular en el agar) a través de una capa de agar solidificada en una placa

de Petri hasta inhibir totalmente el crecimiento del microorganismo añadido en el medio

de cultivo, en un área circular o zona de inhibición entorno al cilindro que contiene una

solución del antibiótico. Las distintas respuestas obtenidas (diámetros de los halos de

inhibición) son proporcionales a las dosis de antibiótico utilizadas.

16

Figura 9. Difusión por cilindro placa (San Martín, 2006).

Método de difusión de disco en agar: está apoyado por datos clínicos y de

laboratorios; y presenta la ventaja que sus resultados son altamente reproducibles. La

técnica está basada en el método originalmente descrito por Bauer et al., (método de Kirby-

Bauer). El fundamento de esta determinación es establecer, en forma cuantitativa, el efecto

de un conjunto de sustancias, ensayados individualmente, sobre las cepas bacterianas que

se aíslan de procesos infecciosos. El método se basa en la relación entre la concentración

de la sustancia necesaria para inhibir una cepa bacteriana y el halo de inhibición de

crecimiento en la superficie de una placa de agar con un medio de cultivo adecuado y

sembrado homogéneamente con la bacteria a ensayar y sobre la cual se ha depositado un

disco de papel filtro de 6 mm de diámetro, o se ha sembrado en pozo impregnado (Ramírez

& Marín, 2009).

Figura 10. Difusión de disco en agar (Labmedica, 2012).

Método de pocillos en placa: esta técnica presenta una relación con el método de

difusión de disco en agar, por su fundamento: a través del agar solidificado en una placa

Petri se siembra homogéneamente la bacteria en estudio con una concentración de en el 1,5

x 108 unidades formadoras de colonias (ufc)/mL, lo cual equivale a un patrón de 0.5 en la

escala de Mac Farland, la variante en este método es que en vez de colocar los discos

impregnados de antibiótico, se realiza un pocillo directamente en el agar utilizando un

sacabocados con una diámetro de 7 mm que permitirá colocar un volumen de 100 μl de la

17

sustancia a ensayar con actividad antibiótica. Una vez incubadas las cajas a las condiciones

establecidas se mide el halo de inhibición producido por antibiótico y se determina su

susceptibilidad o resistencia.

Figura 11. Pocillos en agar.

2.2.12.2. Métodos de dilución

El método de dilución en agar o en caldo como test de susceptibilidad microbiana

es utilizado para determinar la concentración mínima bactericida (MBC) y la concentración

mínima inhibitoria (MIC), estas variables son una herramienta para investigar nuevos

antimicrobianos. En la técnica de dilución en caldo, son utilizados tubos o microplacas

(microdilución) que contienen concentraciones crecientes del extracto vegetal. El

organismo en estudio es inoculado en los diferentes tubos o pozos de las microplacas y la

MIC es determinada después de la incubación (Ramírez & Marín, 2009).

En el método de dilución en agar, las cajas se siembran por profundidad con una

determinada concentración de extracto vegetal, luego se inoculan con el microorganismo

en estudio y se incuban por 24 horas, después de ésta, se examina si el microorganismo

crece o no en cada una de las cajas, la principal desventaja de este método es la cantidad

necesaria de muestra a evaluar (Ramírez & Marín, 2009).

Figura 12. Método de dilución (García Q. , 2014)

18

2.2.13. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)

La determinación de la Concentración Mínima Inhibidora (CMI) es la medida

de la sensibilidad de una bacteria a un antibiótico. Es la mínima cantidad de antimicrobiano

que es capaz de impedir el crecimiento de un microorganismo en unas condiciones

normalizadas. Es el método habitual utilizado en los laboratorios de Microbiología Clínica.

Para llevarlo a cabo es necesario utilizar cepas control (de referencia) con el fin de que los

resultados sean reproducibles y comparables. Este método nos ofrece información sobre la

sensibilidad de las bacterias Sensible (S), Intermedia (I) y Resistente (R) (García J. , 2000).

Sensible: cuando un aislado bacteriano es inhibido in vitro por una concentración

de un antimicrobiano que se asocia a una alta probabilidad con el éxito terapéutico.

Intermedio: cuando un aislado bacteriano es inhibido in vitro por una concentración

de un antimicrobiano que se asocia a un efecto terapéutico incierto.

Resistente: cuando un aislado bacteriano es inhibido in vitro por una concentración

de un antimicrobiano que se asocia a una alta probabilidad con el fracaso

terapéutico (Cantón, 2009).

Existen diferentes técnicas de laboratorio que permiten medir o calcular de forma

rutinaria, y de manera semicuantitativa, las CMI (métodos manuales y métodos

automatizados o semiautomatizados). Los más utilizados son:

a) Difusión en agar: Disco placa

b) Dilución: Medio sólido y Medio líquido (micro/macrodilución)

c) Mecanizados y Automatizados (García J. , 2000).

Figura 13. Concentración Mínima Inhibitoria: Dilución en caldo (Sociedad Española de

Microbiología, 2017).

19

2.2.14. Microdilución en placa

Este método se denomina microdilución porque involucra pequeños volúmenes de

caldo. La prueba se realiza en policubetas de plástico estériles de fondo cónico o redondo,

cada pocillo contiene un volumen aproximado de 300 μL. Para preparar las placas de

microdilución, se hacen diluciones intermedias de los agentes antimicrobianos en caldo o

agua estéril, se utiliza un inóculo de una concentración tal, que duplique la deseada. Cada

policubeta debe incluir un pocillo de control de crecimiento (sin antibiótico), y un control

negativo (caldo sin inocular).

Para evitar la desecación durante la incubación, se debe sellar cada policubeta con

su tapa plástica o película plástica autoadhesiva. El tiempo de incubación para la mayoría

de los microorganismos es de 16 a 20 hs, tanto para la técnica de macro como de

microdilución y la temperatura es 35 ± 2 °C Para mantener una temperatura de incubación

uniforme, se recomienda no apilar más de cuatro policubetas (Institute Clinical and

Laboratory Standars, 2012).

Figura 14. Placa para microdilución (Córdoba, 2013)

2.2.15. Control Positivo

Ceftriaxona es un antibiótico betalactámico que pertenece a las cefalosporinas de

tercera generación. Es un bactericida de amplio espectro y acción prolongada que muestra

una actividad significativa frente a gérmenes gramnegativos y grampositivos serios . Actúa

inhibiendo la síntesis y reparación de la pared celular bacteriana.

Figura 15. Estructura química de la Ceftriaxona

20

Según los nuevos criterios presentados por el CLSI la susceptibilidad

antimicrobiana de la Ceftriaxona frente a microorganismos patógenos viene dada por:

Tabla 1. Susceptibilidad antimicrobiana del control positivo, Ceftriaxona

Antimicrobiano

Criterios de Interpretación

Difusión en disco

[mm]

Concentración mínima

Inhibitoria [μg/ml]

S I R S I R

Cefotaxima ≥ 26 23-25 ≤ 22 ≤ 1 2 ≥ 4

Ceftriaxona ≥ 23 20-22 ≤ 19 ≤ 1 2 ≥ 4

Ceftazidima ≥ 21 18-20 ≤ 17 ≤ 4 8 ≥ 16

Ceftizoxima ≥ 25 22-24 ≤ 21 ≤ 1 2 ≥ 4

S: Sensible; I: Intermedio; R: Resistente

Elaborado por: Sarasti, D.

Tabla 2. Susceptibilidad antimicrobiana de la Ceftriaxona frente a las diferentes cepas

bacterianas

Cepas

bacterianas

CEFTRIAXONA

Difusión en disco

[mm]

Concentración

mínima Inhibitoria

[μg/ml] S I R

Escherichia

coli

≥ 23 20-22 ≤ 19 ≥ 0,125

Pseudomonas

aeruginosa

≥ 21 14-20 ≤ 13 ≥ 16

Staphylococcus

aureus

≥ 14 11-13 ≤ 10 ≥ 4

Klebsiella

pneumoniae

≥ 23 20-22 ≤ 19 ≥ 0,125

Elaborado por: Sarasti, D.

2.3. FUNDAMENTO LEGAL

- Constitución Nacional de la República del Ecuador, Registro oficial N⁰ 449,

2008

Sistema nacional de ciencia, tecnología, innovación y saberes ancestrales

Art. 385.- El sistema nacional de ciencia, tecnología, innovación y saberes ancestrales, en

el marco del respeto al ambiente, la naturaleza, la vida, las culturas y la soberanía, tendrá

como finalidad:

1) Generar, adaptar y difundir conocimientos científicos y tecnológicos.

21

2) Recuperar, fortalecer y potenciar los saberes ancestrales.

3) Desarrollar tecnologías e innovaciones que impulsen la producción nacional,

eleven la eficiencia y productividad, mejoren la calidad de vida y contribuyan a la

realización del buen vivir.

- Ley Orgánica de Salud (Ley No. 2006-67) Capítulo II. De la autoridad sanitaria nacional, sus competencias y responsabilidades

Art. 6.- Es responsabilidad del Ministerio de Salud Pública:

Regular y realizar el control sanitario de la producción, importación, distribución,

almacenamiento, transporte, comercialización, dispensación y expendio de alimentos

procesados, medicamentos y otros productos para uso y consumo humano; así como los

sistemas y procedimientos que garanticen su inocuidad, seguridad y calidad, a través del

Instituto Nacional de Higiene y Medicina Tropical Dr. Leopoldo Izquieta Pérez y otras

dependencias del Ministerio de Salud Pública.

2.4. HIPÓTESIS

2.4.1. Hipótesis de trabajo

Hi: Los extractos obtenidos a partir de las hojas frescas y secas de la especie vegetal

Moringa oleifera presentan efecto antimicrobiano frente a microorganismos patógenos.

2.4.2. Hipótesis nula

Ho: Los extractos obtenidos a partir de las hojas frescas y secas de la especie vegetal

Moringa oleifera no presentan efecto antimicrobiano frente a microorganismos patógenos.

2.5. CONCEPTUALIZACIÓN DE VARIABLES

Etapa 1: Obtención de extractos a partir de las hojas de la especie vegetal Moringa oleifera

Observación: Se utilizó un único método de extracción (Soxhlet) y solvente (Etanol 70°)

Variables Independientes:

A: Tipo de hoja

Variables Dependientes:

A: Concentración de la fracción extraída

Etapa 2: Cuantificación espectrofotométrica de flavonoides

Observación: No presenta un diseño experimental ya que no existen variables

independientes ni dependientes

22

Etapa 3: Evaluación de la actividad antimicrobiana a partir de los extractos obtenidos de

la especie vegetal Moringa oleifera

Variables Independientes:

A: Tipo de extracto

B: Tipo de cepa bacteriana

Variables Dependientes:

A: Efecto antimicrobiano frente a las diferentes cepas bacterianas

B: Diámetro del halo de inhibición

Etapa 4: Evaluación de la Concentración Mínima Inhibitoria a partir de los extractos

obtenidos de la especie vegetal Moringa oleifera

Variables Independientes:

A: Tipo de cepa bacteriana

B: Número de diluciones

Variables Dependientes:

Concentración a la que se inhibe las cepas bacterianas

23

CAPÌTULO III

METODOLOGÍA DE LA INVESTIGACIÓN

3.1. DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN

- Enfoque

El enfoque de este trabajo de investigación corresponde a un enfoque cuantitativo

ya que se base en la recolección de datos para probar la hipótesis con base en una medición

numérica y estadística para establecer patrones de comportamiento y probar teorías

(Hernández R. , 2010). Los datos a recolectar están basados en determinar el porcentaje de

extracción, el porcentaje de la fracción extraída en las hojas de esta especie vegetal

mediante el método espectrofotométrico, comprobar la actividad antimicrobiana mediante

la medición de los halos de inhibición formados a partir de los extractos utilizados y evaluar

la Concentración Mínima Inhibitoria mediantes lecturas de diluciones seriadas.

- Nivel

El nivel de investigación de este proyecto se basa en un nivel descriptivo ya que se

analizará la capacidad antimicrobiana que presentan las hojas de la especie vegetal

Moringa oleifera frente a microorganismos patógenos mediante la caracterización de los

extractos obtenidos para la cuantificación de la fracción activa.

- Tipo de investigación

El tipo de investigación de este trabajo es bibliográfica y experimental.

Bibliográfica porque se sustentará en estudios previos realizados. Experimental ya que se

desarrollará en un lugar donde las variables pueden ser controladas y medidas

(Laboratorio).

3.2. MATERIALES Y MÉTODOS

3.2.1. Materiales

Material Botánico

Hojas de la especie vegetal Moringa oleifera

Material Biológico

Cepas ATCC 25922 de Escherichia coli

Cepas ATCC 27853 de Pseudomonas aeruginosa

Cepas ATCC 25923 de Staphylococcus aureus

Cepas ATCC de Klebsiella pneumoniae

24

Materiales

Frascos ámbar

Vasos de precipitación

Tubos de ensayo

Balones aforados

Matraces Erlenmeyer

Embudo de separación

Embudo

Pipetas aforadas

Pipetas volumétricas

Espátula

Agitadores

Gradilla

Soporte universal

Pera de succión

Papel absorbente

Papel empaque

Papel filtro

Papel aluminio

Film

Placa de porcelana

Micropipetas

Puntas para micropipetas

Cajas Petri

Hisopos

Sacabocados

Asa de inoculación

Asa de digralsky

Reactivos

Alcohol de 70°

Agua destilada

Éter de petróleo

Cloroformo

Acetato de plomo

Ácido acético

Ácido sulfúrico concentrado

Ácido Clorhídrico concentrado

Reactivo de Folin

Amoniaco

Limaduras de magnesio

Hidróxido de potasio

Cloruro de Sodio

Nitrito de Sodio 5%

Cloruro de aluminio 10%

25

Hidróxido de sodio

Estándar de quercetina

Tripteína Soya Agar (TSA)

Mueller Hinton Agar y Caldo

Equipos

Balanza analítica

Rotavapor

Estufa

Molino

Soxhlet

Sistema de filtración al vacío

Espectrofotómetro

Autoclave

Incubadora

Vortex

Lector de Elisa

Cocineta

3.2.2. Metodología

3.2.2.1. Proceso de Recolección:

Las hojas frescas de la especie vegetal Moringa oleifera se recolectaron en los

sembríos de la Finca López ubicada en El Carmen – La Esperanza, provincia de Manabí.

Se determinó que la especie vegetal recolectada corresponde a Moringa oleifera, mediante

la identificación botánica realizada por el Herbario Alfredo Paredes (QAP), Universidad

Central del Ecuador, con su respectivo certificado, como se presenta en el Anex o 1.

Etapa 1

3.2.2.2. Tratamiento de la muestra

Las hojas recolectadas fueron divididas en dos partes, la primera parte se mantuvo

fresca en fundas herméticas selladas, sin oxígeno y en refrigeración, la segunda parte fue

sometida a un proceso de deshidratación en la estufa a una temperatura de 37°C, para

posteriormente ser molidas.

3.2.2.3. Proceso de Extracción

Este procedimiento se llevó a cabo mediante una extracción por Soxhlet, es decir,

sólido - líquido en la cual la muestra sólida (hojas frescas/secas), se coloca en un cartucho

de material poroso (papel filtro) que se sitúa en la cámara del extractor Soxhlet, se colocó

en el balón de fondo plano el disolvente, 250 ml de etanol de 70°, y se sometió a

calentamiento durante un período de 6 horas aproximadamente.

26

Figura 16. Extractor Soxhlet (Jiménez, 2016).

Posteriormente a este proceso los extractos obtenidos de hoja fresca y hoja seca

fueron concentrados en el Rotavapor hasta la cuarta parte de su volumen inicial, para

obtener el extracto puro sin solvente.

Se determinó el porcentaje de rendimiento de la extracción (%R) mediante la

ecuación 1, haciendo referencia al peso inicial del extracto concentrado en la caja Petri y

el peso final después de llevar completamente a sequedad.

%𝑅 =𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜

𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 ∗ 100

Ecuación 1. Porcentaje de rendimiento de extracción

3.2.2.4. Tamizaje Fitoquímico

Se realizó un tamizaje fitoquímico o screening fitoquímico para determinar

cualitativamente los principales metabolitos presentes en las hojas frescas y secas de

Moringa oleifera mediante el fraccionamiento del extracto para aislar los grupos de mayor

interés a través una serie de reacciones de identificación y proceso cromatográficos como

se detalla en el anexo 4.

A partir de los extractos de hoja fresca y hoja seca concentrados se llevaron a cabo

las reacciones de identificación para alcaloides, esteroles, flavonoides, antraquinonas,

taninos y saponinas y cardiotónicos.

27

Identificación de flavonoides

Se tomó 10 ml del extracto concentrado y se colocó en un embudo de separación.

Seguido se adicionó un volumen igual de éter de petróleo y se separó las dos fases. Se

realizó una segunda extracción adicionando la mitad del volumen anteriormente utilizado.

Los extractos etéreos se unieron y se concentraron a presión reducida. La fase acuosa

corresponde a la fracción activa en la misma que se determinó la presencia de flavonoides

mediante las siguientes reacciones:

Reacción de Shinoda: a un 1ml del extracto adicionar unas gotas de ácido

clorhídrico (c) con pequeñas limaduras de magnesio. La reacción será positiva

por la presencia de una coloración rojiza intensa que puede estar acompañada

de espuma.

Reacción de Cianidina: a un 1 ml del extracto añadir una solución de alcohol

clorhídrico (alcohol etílico 50° y ácido clorhídrico (c) en una relación 2:1 v/v)

y pequeñas limaduras de magnesio. La reacción será positiva mediante una

coloración rosa o roja.

Reacción en medio alcalino: a 1ml del extracto adicionar gotas de hidróxido de

potasio (5% en etanol de 95°). La reacción será positiva por la presencia de una

coloración amarillo anaranjado; al añadir unas gotas de cloruro férrico 2%

presentará una coloración azul verdosa.

Etapa 2

3.2.2.5. Cuantificación de flavonoides

Se tomó 25 ml del extracto concentrado de hoja fresca y hoja seca y se colocó en

dos embudos de separación independientemente. Seguido se adicionó un volumen igual de

éter de petróleo en ambos embudos y se separó las dos fases. Se realizó una segunda

extracción adicionando la mitad del volumen anteriormente utilizado, separando las fases.

La fase acuosa se colocó en una caja Petri y se llevó completamente a sequedad en la estufa

a 37°C con flujo constante de aire. El extracto completamente seco se redisolvió con etanol

absoluto a un volumen de 10 ml en un balón aforado.

Para la cuantificación de flavonoides totales se preparó una curva de calibración

utilizando quercetina como estándar.

Se procedió inicialmente a preparar 10 ml de una solución de concentración 2mg/ml

de Quercetina a partir de la cual se realizaron 5 diluciones seriadas a la mitad. De cada

dilución se tomó 1 ml y se añadió: 4 ml de agua destilada + 0,3 ml de nitrito do sodio al

5% (dejar 5 minutos en reposo) + 0,3 ml de cloruro de aluminio al 10% (dejar 6 minutos

en reposo) + 2,0 ml de hidróxido de sodio 1M, finalmente se aforó a 10 ml con agua

destilada y se procedió a leer espectrofotométricamente a una longitud de onda de 546 nm,

obteniendo la concentración de flavonoides expresada en mg quercetina/ml extracto como

28

se representa en la ecuación dos. Este procedimiento se repitió para el extracto total y

fracción de extracto de hoja fresca y hoja seca. Se recomienda que las lecturas se hagan

antes de cumplirse los 30 minutos para evitar la degradación de las muestras. Se determinó

la concentración del activo mediante la ecuación 2.

𝑨 = 𝑚𝐶 + 𝑏

Ecuación 2. Determinación de la concentración de Flavonoides

donde:

A = Absorbancia

m = pendiente de la recta

C = Concentración

b = Ordenada al origen

Figura 17. Esquema de cuantificación de flavonoides

Elaborado por: Sarasti, D.

Etapa 3

3.2.2.6. Evaluación de la actividad antimicrobiana

Preparación de los medios de cultivo

Se empezó preparando los medios de cultivo: Tripteína Soya Agar para crecimiento

bacteriano y Mueller Hinton Agar para la susceptibilidad antimicrobiana.

Tripteína Soya Agar:

- Se disolvió 40 g del medio en 1 litro de agua destilada.

- Se mezcló completamente y se dejó reposar por 5 minutos.

- Se calentó agitando suavemente hasta ebullición por 2 minutos.

29

- Se esterilizó en el autoclave a 121°C durante 20 minutos.

- En una temperatura aproximada de 40°C se repartió el medio en cajas Petri y se

dejó solidificar.

Mueller Hinton Agar:

- Se disolvió 40 g del medio en 1 litro de agua destilada.

- Se mezcló completamente y se dejó reposar por 5 minutos.

- Se calentó agitando suavemente hasta ebullición por 2 minutos.

- Se esterilizó en el autoclave a 121°C durante 20 minutos.

- En una temperatura aproximada de 40°C se repartió el medio en cajas Petri

cumpliendo con los siguientes parámetros antes de su utilización:

Espesor: debe ser de 4mm, es decir, se debe colocar una cantidad de medio

entre 25 a 30 ml en placas de 85-100 mm de diámetro interno. Cuando existe

un espesor mayor a 4 mm, se genera un diámetro de halo de inhibición

menor (falsa resistencia), mientras que un espesor menor a 4mm se genera

un diámetro de halo de inhibición mayor (falsa sensibilidad).

Humedad: El medio debe dejarse a temperatura ambiente unas dos horas

antes de utilizarlo. Si existe agua en la superficie del agar, las placas pueden

colocarse en la incubadora a 35ºC por 30 minutos con la tapa ligeramente

abierta (Terán, 2017).

Cultivo de Cepas ATCC bacterianas

Una vez preparado los medios se procedió a realizar el cultivo de las diferentes

cepas bacterianas en TSA. Se realizó el pase a caja de las diferentes bacterias a partir de

cepas ATCC anteriormente activadas. Se tomó con un asa de inoculación de dos a tres

colonias aisladas y se estrió en el medio solidificado. Se incubó de 18 a 24 horas. Una vez

utilizadas las cepas deben ser guardadas en refrigeración a una temperatura de

aproximadamente 8°C en empaque cerrados.

Preparación del inóculo

A partir de las cepas obtenidas, se tomó varias colonias con un asa y se inoculó

directamente en un tubo con solución salina al 0,85%.

Se ajustó el inóculo a una turbidez 0.5 McFarland que equivale a 1.5 x 108 ufc/ml, leyendo

en el espectrofotómetro a 594 nm para confirmar el valor de la escala McFarland que debe

presentar un valor de absorbancia entre 0,08 - 0,1.

Método de los pocillos en agar

Este proceso se realizó en cajas de Mueller Hinton agar, bajo los parámetros

previamente especificados anteriormente.

Se desinfectó toda el área de trabajo utilizando alcohol antiséptico para que las

condiciones de esterilidad sean las mejores. Se introdujo un hisopo estéril dentro de la

30

suspensión bacteriana (0,5 McFarland) y se rotó varias veces sobre las paredes del tubo

para eliminar el exceso de líquido. Se inoculó sobre el agar por la técnica de hisopado, es

decir, cubriendo todos los espacios de la caja. Se dejó secar por 5 minutos.

Después de la inoculación del microorganismo, se realizaron los pocillos en el agar

utilizando un sacabocados estéril de 7 mm de diámetro, con el asa de inoculación estéril,

se retiró el resto de agar que se encuentra en las perforaciones hasta que queden los pocillos.

Se colocó 100 μl del extracto, del antibiótico patrón y del control negativo dentro de cada

pocillo. Se incubó las cajas a 35-37 °C por 24 horas y con el agar hacia abajo.

3.2.2.7. Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)

Este proceso se realizó utilizando placas para microdilución de 96 pocillos, Mueller

Hinton caldo como medio de cultivo y una suspensión bacteriana en solución salina 0,85%

de una concentración 5x105 ufc/ml (la suspensión puede prepararse a partir de una 0,5

McFarland).

En el pocillo 1 se colocó 100 μl extracto + 100 μl del medio , este pocillo servirá

como blanco. Desde el pocillo 2 al pocillo 10 se colocó 100 μl del medio, en el pocillo 2

se adicionó 100 μl del extracto, a partir del cual se realizarán diluciones seriadas a la mitad

hasta el pocillo 10, posteriormente se procedió a inocular 100 μl de suspensión bacteriana

de concentración 5x105 ufc/ml desde el pocillo 2 al pocillo 10 obteniendo un volumen final

de 200 μl, en el pocillo 11 se colocó el control positivo que corresponde a 100 μl de medio

+ 100 μl se suspensión bacteriana, en el pocillo 12 se colocó el control negativo que

corresponde a 200 μl del medio sin inocular.

Este proceso se realizó por triplicado para cada tipo de extracto y cada bacteria. Se

cubrió la placa con film para evitar que el extracto se evapore y se incubó durante 24 horas.

Finalmente se procedió a leer las absorbancia a 594 nm en el Lector de Elisa, determinando

a que concentración es inhibida la bacteria según el tipo de extracto utilizado. Es importante

que las lecturas se hagan de acuerdo al blanco para evitar las interferencias que pueda

producir la coloración del extracto.

Se determinó el porcentaje de inhibición de acuerdo a cada extracto obtenido y a

cada cepa bacteriana mediante la siguiente ecuación:

% 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 =𝐴𝑏𝑠. 𝐶𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜 − 𝐴𝑏𝑠. 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛

𝐴𝑏𝑠. 𝐶𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜∗ 100

Ecuación 3. Porcentaje de inhibición

La absorción del control positivo corresponde al valor del medio de cultivo con la

bacteria inoculada, a la cual se le debe restar el valor de la absorbancia de cada una de las

concentraciones obtenidas después de las diferentes diluciones.

31

Figura 18. Esquema de microdilución en placa

Elaborado por: Sarasti, D.

3.3. DISEÑO EXPERIMENTAL

3.3.1. Diseño Factorial A x B

Un diseño factorial A x B es un tipo de experimento diseñado que permite estudiar

los efectos que varios factores pueden tener en una respuesta. Al realizar un experimento,

variar los niveles de todos los factores al mismo tiempo en lugar de uno a la vez, permite

estudiar las interacciones entre los factores.

FASE III:

En esta fase se realizó la determinación de la actividad antimicrobiana mediante el

método de los pocillos en agar, midiendo el halo de inhibición formado por cada tipo de

extracto y frente a cada cepa bacteriana.

Tabla 3. Factores y niveles del diseño experimental, Fase III

Factores Niveles Codificación

Tipo de extracto

(A)

Extracto Total de Hoja fresca A1

Extracto Total de Hoja seca A2

Fracción acuosa de extracto Hoja fresca A3

Fracción acuosa de extracto Hoja seca A4

32

Cepa bacteriana

(B)

Escherichia coli B1

Pseudomonas aeruginosa B2

Staphylococcus aureus B3

Klebsiella pneumoniae B4

Tabla 4. Tratamientos del diseño, Fase III

1: primera réplica; 2: segunda réplica; 3: tercera réplica

Elaborado por: Sarasti, D.

En esta fase se aplicó un arreglo factorial AXB, con dos factores y cuatro niveles,

a fin de obtener reproducibilidad en el estudio se realizaron tres réplicas para el

correspondiente factor y nivel con un total de 48 datos.

FASE IV:

En esta fase se determinará la concentración a la cual se inhibe el crecimiento de

las cepas bacterianas según el tipo de extracto utilizado.

Tabla 5. Factores y niveles del diseño experimental, Fase IV

Factores Niveles Codificación

Tipo de Extracto

(A)

Extracto Total de Hoja fresca A1

Extracto Total de Hoja seca A2

Fracción Hoja fresca A3

Fracción Hoja seca A4

Cepa bacteriana

(B)

Escherichia coli B1

Pseudomonas aeruginosa B2

Staphylococcus aureus B3

Klebsiella pneumoniae B4

FA

CT

OR

A

TIP

O D

E E

XT

RA

CT

O

FACTOR B

CEPA BACTERIANA

B1 B2 B3 B4

A1 1 A1 B1 1 A1 B2 1 A1 B3 1 A1 B4

2 A1 B1 2 A1 B2 2 A1 B3 2 A1 B4

3 A1 B1 3 A1 B2 3 A1 B3 3 A1 B4

A2 1 A2 B1 1 A2 B2 1 A2 B3 1 A2 B4

2 A2 B1 2 A2 B2 2 A2 B3 2 A2 B4

3 A2 B1 3 A2 B2 3 A2 B3 3 A2 B4

A3 1 A3 B1 1 A3 B2 1 A3 B3 1 A3 B4

2 A3 B1 2 A3 B2 2 A3 B3 2 A3 B4

3 A3 B1 3 A3 B2 3 A3 B3 3 A3 B4

A4 1 A4 B1 1 A4 B1 1 A4 B1 1 A4 B1

2 A4 B1 2 A4 B1 2 A4 B1 2 A4 B1

3 A4 B1 3 A4 B1 3 A4 B1 3 A4 B1

33

Concentración

(C)

Dilución 1:2 C1

Dilución 1:4 C2

Dilución 1:8 C3

Dilución 1:16 C4

Dilución 1:32 C5

Dilución 1:64 C6

Dilución 1:128 C7

Dilución 1: 256 C8

Dilución 1:512 C9

Elaborado por: Sarasti. D

34

Tabla 6. Tratamientos del diseño, Fase IV

FACTOR A FACTOR B FACTOR C

Cepa

Tipo de

extracto

Diluciones Seriadas

C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9

A1

B1

1 A1 B1 C1 1 A1 B1 C2 1 A1 B1 C3 1 A1 B1 C4 1 A1 B1 C5 1 A1 B1 C6 1 A1 B1 C7 1 A1 B1 C8 1 A1 B1 C9

2 A1 B1 C1 2 A1 B1 C2 2 A1 B1 C3 2 A1 B1 C4 2 A1 B1 C5 2 A1 B1 C6 2 A1 B1 C7 2 A1 B1 C8 2 A1 B1 C9

3 A1 B1 C1 3 A1 B1 C2 3 A1 B1 C3 3 A1 B1 C4 3 A1 B1 C5 3 A1 B1 C6 3 A1 B1 C7 3 A1 B1 C8 3 A1 B1 C9

B2 1 A1 B2 C1 1 A1 B2 C2 1 A1 B2 C3 1 A1 B2 C4 1 A1 B2 C5 1 A1 B2 C6 1 A1 B2 C7 1 A1 B2 C8 1 A1 B2 C9

2 A1 B2 C1 2 A1 B2 C2 2 A1 B2 C3 2 A1 B2 C4 2 A1 B2 C5 2 A1 B2 C6 2 A1 B2 C7 2 A1 B2 C8 2 A1 B2 C9

3 A1 B2 C1 3 A1 B2 C2 3 A1 B2 C3 3 A1 B2 C4 3 A1 B2 C5 3 A1 B2 C6 3 A1 B2 C7 3 A1 B2 C8 3 A1 B2 C9

B3 1 A1 B3 C1 1 A1 B3 C2 1 A1 B3 C3 1 A1 B3 C4 1 A1 B3 C5 1 A1 B3 C6 1 A1 B3 C7 1 A1 B3 C8 1 A1 B3 C9

2 A1 B3 C1 2 A1 B3 C2 2 A1 B3 C3 2 A1 B3 C4 2 A1 B3 C5 2 A1 B3 C6 2 A1 B3 C7 2 A1 B3 C8 2 A1 B3 C9

3 A1 B3 C1 3 A1 B3 C2 3 A1 B3 C3 3 A1 B3 C4 3 A1 B3 C5 3 A1 B3 C6 3 A1 B3 C7 3 A1 B3 C8 3 A1 B3 C9

B4 1 A1 B4 C1 1 A1 B4 C2 1 A1 B4 C3 1 A1 B4 C4 1 A1 B4 C5 1 A1 B4 C6 1 A1 B4 C7 1 A1 B4 C8 1 A1 B4 C9

2 A1 B4 C1 2 A1 B4 C2 2 A1 B4 C3 2 A1 B4 C4 2 A1 B4 C5 2 A1 B4 C6 2 A1 B4 C7 2 A1 B4 C8 2 A1 B4 C9

3 A1 B4 C1 3 A1 B4 C2 3 A1 B4 C3 3 A1 B4 C1 3 A1 B4 C5 3 A1 B4 C6 3 A1 B4 C7 3 A1 B4 C8 3 A1 B4 C9

A2

B1

1 A2 B1 C1 1 A2 B1 C2 1 A2 B1 C3 1 A2 B1 C4 1 A2 B1 C5 1 A2 B1 C6 1 A2 B1 C7 1 A2 B1 C8 1 A2 B1 C9

2 A2 B1 C1 2 A2 B1 C2 2 A2 B1 C3 2 A2 B1 C4 2 A2 B1 C5 2 A2 B1 C6 2 A2 B1 C7 2 A2 B1 C8 2 A2 B1 C9

3 A2 B1 C1 3 A2 B1 C2 3 A2 B1 C3 3 A2 B1 C4 3 A2 B1 C5 3 A2 B1 C6 3 A2 B1 C7 3 A2 B1 C8 3 A2 B1 C9

B2 1 A2 B2 C1 1 A2 B2 C2 1 A2 B2 C3 1 A2 B2 C4 1 A2 B2 C5 1 A2 B2 C6 1 A2 B2 C7 1 A2 B2 C8 1 A2 B2 C9

2 A2 B2 C1 2 A2 B2 C2 2 A2 B2 C3 2 A2 B2 C4 2 A2 B2 C5 2 A2 B2 C6 2 A2 B2 C7 2 A2 B2 C8 2 A2 B2 C9

3 A2 B2 C1 3 A2 B2 C2 3 A2 B2 C3 3 A2 B2 C4 3 A2 B2 C5 3 A2 B2 C6 3 A2 B2 C7 3 A2 B2 C8 3 A2 B2 C9

B3 1 A2 B3 C1 1 A2 B3 C2 1 A2 B3 C3 1 A2 B3 C4 1 A2 B3 C5 1 A2 B3 C6 1 A2 B3 C7 1 A2 B3 C8 1 A2 B3 C9

2 A2 B3 C1 2 A2 B3 C2 2 A2 B3 C3 2 A2 B3 C4 2 A2 B3 C5 2 A2 B3 C6 2 A2 B3 C7 2 A2 B3 C8 2 A2 B3 C9

3 A2 B3 C1 3 A2 B3 C2 3 A2 B3 C3 3 A2 B3 C4 3 A2 B3 C5 3 A2 B3 C6 3 A2 B3 C7 3 A2 B3 C8 3 A2 B3 C9

B4 1 A2 B4 C1 1 A2 B4 C2 1 A2 B4 C3 1 A2 B4 C4 1 A2 B4 C5 1 A2 B4 C6 1 A2 B4 C7 1 A2 B4 C8 1 A2 B4 C9

2 A2 B4 C1 2 A2 B4 C2 2 A2 B4 C3 2 A2 B4 C4 2 A2 B4 C5 2 A2 B4 C6 2 A2 B4 C7 2 A2 B4 C8 2 A2 B4 C9

3 A2 B4 C1 3 A2 B4 C2 3 A2 B4 C3 3 A2 B4 C4 3 A2 B4 C5 3 A2 B4 C6 3 A2 B4 C7 3 A2 B4 C8 3 A2 B4 C9

35

1: primera réplica; 2: segunda réplica; 3: tercera réplica

Elaborado por: Sarasti, D.

A3

B1

1 A3 B1 C1 1 A3 B1 C2 1 A3 B1 C3 1 A3 B1 C4 1 A3 B1 C5 1 A3 B1 C6 1 A3 B1 C7 1 A3 B1 C8 1 A3 B1 C9

2 A3 B1 C1 2 A3 B1 C2 2 A3 B1 C3 2 A3 B1 C4 2 A3 B1 C5 2 A3 B1 C6 2 A3 B1 C7 2 A3 B1 C8 2 A3 B1 C9

3 A3 B1 C1 3 A3 B1 C2 3 A3 B1 C3 3 A3 B1 C4 3 A3 B1 C5 3 A3 B1 C6 3 A3 B1 C7 3 A3 B1 C8 3 A3 B1 C9

B2 1 A3 B2 C1 1 A3 B2 C2 1 A3 B2 C3 1 A3 B2 C4 1 A3 B2 C5 1 A3 B2 C6 1 A3 B2 C7 1 A3 B2 C8 1 A3 B2 C9

2 A3 B2 C1 2 A3 B2 C2 2 A3 B2 C3 2 A3 B2 C4 2 A3 B2 C5 2 A3 B2 C6 2 A3 B2 C7 2 A3 B2 C8 2 A3 B2 C9

3 A3 B2 C1 3 A3 B2 C2 3 A3 B2 C3 3 A3 B2 C4 3 A3 B2 C5 3 A3 B2 C6 3 A3 B2 C7 3 A3 B2 C8 3 A3 B2 C9

B3 1 A3 B3 C1 1 A3 B3 C2 1 A3 B3 C3 1 A3 B3 C4 1 A3 B3 C5 1 A3 B3 C6 1 A3 B3 C7 1 A3 B3 C8 1 A3 B3 C9

2 A3 B3 C1 2 A3 B3 C2 2 A3 B3 C3 2 A3 B3 C4 2 A3 B3 C5 2 A3 B3 C6 2 A3 B3 C7 2 A3 B3 C8 2 A3 B3 C9

3 A3 B3 C1 3 A3 B3 C2 3 A3 B3 C3 3 A3 B3 C4 3 A3 B3 C5 3 A3 B3 C6 3 A3 B3 C7 3 A3 B3 C8 3 A3 B3 C9

B4 1 A3 B4 C1 1 A3 B4 C2 1 A3 B4 C3 1 A3 B4 C4 1 A3 B4 C5 1 A3 B4 C6 1 A3 B4 C7 1 A3 B4 C8 1 A3 B4 C9

2 A3 B4 C1 2 A3 B4 C2 2 A3 B4 C3 2 A3 B4 C4 2 A3 B4 C5 2 A3 B4 C6 2 A3 B4 C7 2 A3 B4 C8 2 A3 B4 C9

3 A3 B4 C1 3 A3 B4 C2 3 A3 B4 C3 3 A3 B4 C4 3 A3 B4 C5 3 A3 B4 C6 3 A3 B4 C7 3 A3 B4 C8 3 A3 B4 C9

A4

B1

1 A4 B1 C1 1 A4 B1 C2 1 A4 B1 C3 1 A4 B1 C4 1 A4 B1 C5 1 A4 B1 C6 1 A4 B1 C7 1 A4 B1 C8 1 A4 B1 C9

2 A4 B1 C1 2 A4 B1 C2 2 A4 B1 C3 2 A4 B1 C4 2 A4 B1 C5 2 A4 B1 C6 2 A4 B1 C7 2 A4 B1 C8 2 A4 B1 C9

3 A4 B1 C1 3 A4 B1 C2 3 A4 B1 C3 3 A4 B1 C4 3 A4 B1 C5 3 A4 B1 C6 3 A4 B1 C7 3 A4 B1 C8 3 A4 B1 C9

B2 1 A4 B2 C1 1 A4 B2 C2 1 A4 B2 C3 1 A4 B2 C4 1 A4 B2 C5 1 A4 B2 C6 1 A4 B2 C7 1 A4 B2 C8 1 A4 B2 C9

2 A4 B2 C1 2 A4 B2 C2 2 A4 B2 C3 2 A4 B2 C4 2 A4 B2 C5 2 A4 B2 C6 2 A4 B2 C7 2 A4 B2 C8 2 A4 B2 C9

3 A4 B2 C1 3 A4 B2 C2 3 A4 B2 C3 3 A4 B2 C4 3 A4 B2 C5 3 A4 B2 C6 3 A4 B2 C7 3 A4 B2 C8 3 A4 B2 C9

B3 1 A4 B3 C1 1 A4 B3 C2 1 A4 B3 C3 1 A4 B3 C4 1 A4 B3 C5 1 A4 B3 C6 1 A4 B3 C7 1 A4 B3 C8 1 A4 B3 C9

2 A4 B3 C1 2 A4 B3 C2 2 A4 B3 C3 2 A4 B3 C4 2 A4 B3 C5 2 A4 B3 C6 2 A4 B3 C7 2 A4 B3 C8 2 A4 B3 C9

3 A4 B3 C1 3 A4 B3 C2 3 A4 B3 C3 3 A4 B3 C4 3 A4 B3 C5 3 A4 B3 C6 3 A4 B3 C7 3 A4 B3 C8 3 A4 B3 C9

B4 1 A4 B4 C1 1 A4 B4 C2 1 A4 B4 C3 1 A4 B4 C4 1 A4 B4 C5 1 A4 B4 C6 1 A4 B4 C7 1 A4 B4 C8 1 A4 B4 C9

2 A4 B4 C1 2 A4 B4 C2 2 A4 B4 C3 2 A4 B4 C4 2 A4 B4 C5 2 A4 B4 C6 2 A4 B4 C7 2 A4 B4 C8 2 A4 B4 C9

3 A4 B4 C1 3 A4 B4 C2 3 A4 B4 C3 3 A4 B4 C4 3 A4 B4 C5 3 A4 B4 C6 3 A4 B4 C7 3 A4 B4 C8 3 A4 B4 C9

36

3.4. TÉCNICA DE PROCESAMIENTO DE DATOS

Para la técnica de procesamiento de datos se utilizará un análisis de varianza

ANOVA para comparar las medias de la variable respuesta en los diferentes niveles de los

factores.

Tabla 7. ANOVA para un diseño factorial AxB

Fuente de

variación

Suma de

cuadrados

Grados de

libertad

Cuadrados

Medios

Estadística

F

Efecto A SSA ɑ-1 CMA=SSA/( ɑ-1) CMA/CME

Efecto B SSB Ƅ-1 CMB=SSB/( Ƅ-1) CMB/CME

Efecto

AB SSAB (ɑ-1)( Ƅ-1) CMAB=SSAB/(ɑ-1)( Ƅ-1) CMAB/CME

Error SSE ɑƄ(n-1) CME=SSE/( ɑƄ(n-1))

Total SST ɑƄn-1

Elaborado por: Sarasti, D.

3.5. MATRIZ DE OPERACIONALIZACIÓN DE VARIABLES

Tabla 8. Matriz de Operacionalización de Variables

Variable Dimensiones Indicadores

Tipo de Hoja

Hoja fresca - Análisis Fitoquímico

- Cuantificación espectrofotométrica

de flavonoides. Hoja Seca

Actividad antimicrobiana

Resistente - Medición de los halos de inhibición

- Determinación de la Concentración

Mínima Inhibitoria

Sensible

Intermedio

Elaborado por: Sarasti, D.

37

CAPÍTULO IV

ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

4.1. PROCESO DE EXTRACCIÓN

El proceso de extracción se realizó con las hojas frescas y hojas secas de la especie

vegetal utilizando un único solvente (Etanol 70°) y por el método de Soxhlet. El porcentaje

de rendimiento de extracción se calculó mediante la ecuación 1.

%𝑅 =𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 𝑑𝑒𝑙 𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑜𝑏𝑡𝑒𝑛𝑖𝑑𝑜

𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 ∗ 100

%𝑅 =6,82 [𝑔]

49,78[𝑔] ∗ 100

%𝑅 = 13,6

Tabla 9. Porcentaje de rendimiento de extracción

Elaborado por: Sarasti, D

En la tabla 9 se muestra el porcentaje de rendimiento de extracción realizado por el

método de Soxhlet tanto para la hoja fresca como para la hoja seca, obteniendo como

resultados 13,6% y 10,7% respectivamente. La diferencia del porcentaje de rendimiento

de extracción entre la hoja fresca y la hoja seca fue del 3% que es un valor mínimo, lo que

determina que este método de extracción permite obtener un rendimiento bueno con los

diferentes tipos de hojas de esta especie vegetal.

EXTRACCIÓN POR EL MÉTODO SOXHLET

Tipo de

Hoja

Peso inicial de

la muestra [g]

Peso final

del extracto

[g]

%R Promedio

%R

Hoja

Fresca

49,78 6,82 13,7

13,6 49,65 6,67 13,4

49,46 6,72 13,6

Hoja

Seca

49,34 5,31 10,7

10,7 49,28 5,27 10,7

49,31 5,23 10,6

38

Elaborado por: Sarasti, D.

4.1.1. Tamizaje Fitoquímico

Tabla 10. Resultados del Tamizaje Fitoquímico

Metabolitos

secundarios

Reacciones Hojas frescas Hojas secas

Fase

acuosa

Fase

orgánica

Fase

acuosa

Fase

orgánica

Alcaloides

Dragendorff +++ + +++ +

Mayer ++ + ++ +

Wagner +++ + ++ ++

Esteroles

Lieberman-Bouchard N/A +++ N/A +++

Zack N/A +++ N/A +++

Flavonoides Shinoda +++ N/A +++ N/A

Cianidina +++ N/A +++ N/A

Medio Alcalino +++ N/A +++ N/A

Antocianos Con Ácido

Clorhídrico

++ N/A ++ N/A

Antraquinonas Bontrager + N/A - N/A

Taninos

Con Cloruro Férrico ++ N/A ++ N/A

Gelatina Salada ++ N/A ++ N/A

Saponinas Con agua ++ N/A ++ N/A

Glúcidos

Cardiotónicos

Baljet N/A + N/A +

Kedde N/A + N/A +

Lieberman-Bouchard N/A ++ N/A ++

Abundante: +++

Moderado: ++

Poco: + No aplica: N/A

Nada: -

Elaborado por: Sarasti, D.

0

2

4

6

8

10

12

14

HOJA FRESCA HOJA SECA

13,6 10,7

Porcentaje de rendimiento de extracción

Gráfica 1. Porcentaje de Rendimiento de extracción a partir de Hojas Frescas y Secas

39

El tamizaje fitoquímico del extracto obtenido a partir de las hojas frescas y secas de

la especie vegetal Moringa oleifera se lo realizó en base al anexo 3. Los resultados

obtenidos de acuerdo a la tabla 9 permiten determinar la presencia de los siguientes

metabolitos secundarios: Alcaloides, Esteroles y Flavonoides en abundante cantidad,

Antocianinas, Taninos, Saponinas y Glúcidos cardiotónicos en cantidad moderada, y

Antraquinonas en poca cantidad.

4.2. CUANTIFICACIÓN FLAVONOIDES

La cuantificación de flavonoides se realizó mediante el método espectrofotométrico

utilizando como marcador, Quercetina obteniendo los siguientes resultados de absorbancia

de acuerdo a cada concentración.

Tabla 11. Datos de Concentración y Absorbancia del estándar Quercetina

Elaborado por: Sarasti, D.

Gráfica 2. Curva de calibración del Estándar de Quercetina

Elaborado por: Sarasti, D.

y = 0,2306x + 0,0059R² = 0,9996

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0,5

0 0,5 1 1,5 2 2,5

Ab

sorb

anci

a

Concentración

Curva de Estándar de Quercetina

Concentración

[mg/ml]

Absorbancia

2 0,469

1 0,231

0,5 0,122

0,25 0,068

0,125 0,034

0,0625 0,019

40

𝐴 = 𝑚𝐶 + 𝑏

0,214 = 0,2306𝐶 + 0,0059

𝐶 =0,214 − 0,0059

0,2306∗ 100

C = 90,24 [mg Quercetina / ml extracto]

Tabla 12. Concentración de flavonoides en extractos totales y fracciones activas

Absorbancia Concentración

Extracto Total Hoja Fresca 0,214 90,24

Fracción activa Hoja Fresca 0,198 83,30

Extracto Total Hoja Seca 0,205 86,34

Fracción activa Hoja seca 0,179 75,06

Elaborado por: Sarasti, D.

En la tabla 11 se muestra la concentración de la fracción extraída de las hojas frescas

y hojas secas. El extracto total presenta mayor concentración de flavonoides en los dos

tipos de hoja; en cuanto a la fracción activa presenta mayor cantidad de flavonoides la hoja

fresca en comparación a la hoja seca. De acuerdo a las concentraciones obtenidas se puede

determinar que en los dos tipos de hoja existe abundante presencia de flavonoides por lo

se podría atribuir la actividad antibacteriana a este metabolito.

Elaborado por: Sarasti, D.

10

20

30

40

50

60

70

80

90

Extracto Total

Hoja Fresca

Fracción

activa Hoja

Fresca

Extracto Total

Hoja Seca

Fracción

activa Hoja

Seca

9083 86

75

Concentración de Flavonoides

[mg St/ml extracto]

Gráfica 3. Concentración de flavonoides distribuidos según el tipo de hoja

41

4.3. ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA POR EL MÉTODO DE LOS POCILLOS

EN AGAR

Tabla 13. Halos de inhibición según el tipo de cepa bacteriana con el extracto total

EXTRACTO

TOTAL

Cepa Bacteriana

Diámetro del Halo [mm] Promedio

Hoja fresca

Escherichia coli 30 29 29 29

Pseudomonas aeruginosa 20 18 18 19

Staphylococcus aureus 26 27 26 26

Klebsiella pneumoniae 28 27 28 28

Hoja Seca

Escherichia coli 28 27 27 27

Pseudomonas aeruginosa 16 17 17 17

Staphylococcus aureus 25 24 24 24

Klebsiella pneumoniae 26 26 27 26

Elaborado por: Sarasti, D.

Relacionando los datos obtenidos en la tabla 14 con los patrones de sensibilidad de

la tabla 2 se puede deducir que la fracción extraída tanto de la hoja fresca como de la hoja

seca del extracto total presentan actividad antimicrobiana eficaz frente a las cepas

bacterianas analizadas a excepción de Pseudomonas aeruginosa que presenta una

sensibilidad intermedia. Así tenemos para las enterobacterias (Escherichia coli y Klebsiella

pneumoniae) un patrón de sensibilidad ≥ 23 mm que como se observan en la tabla los halos

de inhibición experimentales superan al valor de referencia; de igual manera para

Staphylococcus aureus cuyo patrón de sensibilidad es ≥ 14 mm, por lo tanto estas cepas

son sensibles al activo extraído; en lo que refiere a Pseudomonas aeruginosa el patrón de

sensibilidad es ≥ 21 mm, por lo tanto con los halos de inhibición experimentales obtenidos

se puede deducir que esta cepa no es totalmente sensible al metabolito extraído.

Gráfica 4. Promedio de los halos de inhibición con el Extracto Total

Elaborado por: Sarasti, D.

0

5

10

15

20

25

30

E. coli P. aeruginosa S. aureus K. pneumoniae

29

19

262827

17

2426

Promedio de los diámetros de los Halos de inhibición con

el Extracto Total

Hoja Fresca

Hoja Seca

42

Tabla 14. Análisis de Varianza para halos de inhibición formados por el Extracto Total

Fuente Suma de

Cuadrados

Gl Cuadrado

Medio

Razón-F Valor-P

EFECTOS

PRINCIPALES

A:Tipo de Hoja 20,1667 1 20,1667 48,91 0,1235

B:Cepa bacteriana 409,833 3 136,611 331,35 0,0000

RESIDUOS 7,83333 19 0,412281

TOTAL (CORREGIDO) 437,833 23

Elaborado por: Sarasti, D.

Los valores-P prueban la significancia estadística de cada uno de los factores.

Puesto que 1 valor-P es menores que 0,05, este factor tiene un efecto estadísticamente

significativo sobre los Halos de inhibición con un 95,0% de nivel de confianza. Por lo

tanto se establece que las diferentes cepas bacterianas son estadísticamente significativas

sobre la variable respuesta que es el halo de inhibición formado a partir del extracto total y

que el tipo de hoja no es un efecto significativo.

Tabla 15. Halos de inhibición según el tipo de cepa bacteriana con la fracción activa

FRACCIÓN

ACTIVA

Cepa Bacteriana

Diámetro del Halo [mm] Promedio

Hoja fresca

Escherichia coli 27 28 28 28

Pseudomonas aeruginosa 16 17 17 17

Staphylococcus aureus 23 24 24 24

Klebsiella pneumoniae 26 27 27 27

Hoja Seca

Escherichia coli 26 25 25 25

Pseudomonas aeruginosa 15 15 16 15

Staphylococcus aureus 22 22 23 22

Klebsiella pneumoniae 25 24 24 24

Elaborado por: Sarasti, D.

Relacionando los valores de inhibición presentados en tabla 14 con los patrones de

sensibilidad de la tabla 2 se puede deducir que tanto en la extracción de la hoja fresca como

de la hoja seca en la fracción activa existe actividad antimicrobiana eficaz a excepción de

Pseudomonas aeruginosa que presenta una sensibilidad intermedia. Así tenemos para las

enterobacterias (Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae) un patrón de sensibilidad ≥ 23

mm que como se observan en la tabla los halos de inhibición experimentales obtenidos

superan al valor de referencia; de igual manera para Staphylococcus aureus cuyo patrón de

sensibilidad es ≥ 14 mm por lo tanto estas cepas son sensible al activo extraído, en lo que

refiere a Pseudomonas aeruginosa el patrón de sensibilidad es ≥ 21 mm, por lo tanto con

los valores obtenidos de los halos de inhibición se puede deducir que esta cepa no es

totalmente sensible al metabolito extraído.

43

Gráfica 5. Promedio de los diámetros de los halos de inhibición con la Fracción activa

Elaborado por: Sarasti, D.

Tabla 16. Análisis de Varianza para halos de inhibición formados por la Fracción activa

Fuente Suma de

Cuadrados

Gl Cuadrado

Medio

Razón-F Valor-P

EFECTOS

PRINCIPALES

A:Tipo de Hoja 20,1667 1 20,1667 56,07 0,1123

B:Cepa bacteriana 403,5 3 134,5 373,98 0,0000

RESIDUOS 6,83333 19 0,359649

TOTAL (CORREGIDO) 430,5 23

Elaborado por: Sarasti, D.

Los valores-P prueban la significancia estadística de cada uno de los factores.

Puesto que 1 valor-P es menores que 0,05, este factor tiene un efecto estadísticamente

significativo sobre los Halos de inhibición con un 95,0% de nivel de confianza. Por lo

tanto se establece que las diferentes cepas bacterianas son estadísticamente significativas

sobre la variable respuesta que es el halo de inhibición formado a partir de la fracción activa

y que el tipo de hoja no es un efecto significativo.

0

5

10

15

20

25

30

E. coli P. aeruginosa S. aureus K. pneumoniae

28

17

24

2725

15

2224

Promedio de los diámetros de los Halos de

Inbición con la Fracción activa

Hoja Fresca

Hoja Seca

44

Tabla 17. Halos de inhibición formados con el control positivo frente a cada cepa

bacteriana

Control Positivo (Ceftriaxona)

Diámetro [mm]

Promedio

Escherichia

coli

47 46 46 46 47 47 47

Pseudomonas

aeruginosa

33 33 34 33 33 33 33

Staphylococcus

aureus

39 39 39 38 39 39 39

Klebsiella

pneumoniae

45 44 44 44 45 45 45

Elaborado por: Sarasti, D.

De acuerdo a los datos obtenidos en la tabla 16 se puede deducir que las cepas

bacterianas utilizadas exhiben sensibilidad frente al antibiótico de prueba Ceftriaxona ya

que los valores obtenidos de los halos de inhibición superan a los de referencia (Ver tabla

2).

Elaborado por: Sarasti, D.

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Escherichia coli Pseudomonas

aeruginosa

Staphylococcus

aureus

Klebsiella

pneumoniae

47

33

39

45

Promedio de los Halos de Inhibición

formados por la Ceftriaxona

Gráfica 6. Promedio de los diámetros de los halos de inhibición con el control positivo

45

4.4. MICRODILUCIÓN EN PLACA

Este procedimiento se realizó para determinar la Concentración Mínima Inhibitoria de cada extracto obtenido frente a las diferentes cepas

bacterianas.

Tabla 18. Resultados de absorbancia para el Extracto Total frente a las diferentes cepas bacterianas

Tipo de

Extracto

Cepa

bacteriana

B C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C(+) C(-)

EXTRACTO

TOTAL

Escherichia

coli

Hoja

seca

0,342 0,028 0,029 0,027 0,028 0,027 0,029 0,133 0,149 0,161 0,352 0,039

0,345 0,029 0,031 0,025 0,027 0,025 0,028 0,136 0,151 0,163 0,353 0,036

0,343 0,028 0,027 0,028 0,028 0,029 0,029 0,131 0,147 0,160 0,354 0,041

Promedio 0,343 0,028 0,029 0,027 0,028 0,027 0,029 0,133 0,149 0,161 0,353 0,039

Hoja

fresca

0,344 0,037 0,039 0,036 0,035 0,036 0,036 0,139 0,151 0,164 0,354 0,037

0,345 0,039 0,038 0,034 0,032 0,035 0,038 0,141 0,153 0,166 0,355 0,035

0,344 0,035 0,039 0,037 0,037 0,036 0,035 0,137 0,151 0,163 0,355 0,039

Promedio 0,344 0,037 0,039 0,036 0,035 0,036 0,036 0,139 0,152 0,164 0,355 0,037

Pseudomonas

aeruginosa

Hoja

seca

0,342 0,175 0,176 0,174 0,221 0,246 0,263 0,271 0,279 0,294 0,352 0,039

0,344 0,177 0,176 0,171 0,124 0,245 0,261 0,273 0,278 0,292 0,354 0,036

0,341 0,174 0,175 0,176 0,019 0,246 0,265 0,270 0,279 0,295 0,352 0,041

Promedio 0,342 0,175 0,176 0,174 0,121 0,246 0,263 0,271 0,279 0,294 0,353 0,039

Hoja

fresca

0,344 0,179 0,178 0,18 0,231 0,26 0,271 0,282 0,296 0,309 0,354 0,042

0,347 0,181 0,175 0,018 0,234 0,261 0,274 0,285 0,298 0,308 0,357 0,037

0,345 0,178 0,180 0,017 0,229 0,260 0,269 0,280 0,295 0,309 0,356 0,035

Promedio 0,345 0,179 0,178 0,072 0,231 0,260 0,271 0,282 0,296 0,309 0,356 0,038

46

Staphylococcus

aureus

Hoja

fresca

0,341 0,087 0,088 0,086 0,087 0,172 0,201 0,218 0,228 0,236 0,351 0,039

0,344 0,085 0,086 0,086 0,084 0,172 0,198 0,221 0,229 0,238 0,354 0,036

0,345 0,088 0,089 0,085 0,089 0,173 0,203 0,215 0,226 0,235 0,356 0,041

Promedio 0,343 0,087 0,088 0,086 0,087 0,172 0,201 0,218 0,228 0,236 0,354 0,039

Hoja

seca

0,344 0,094 0,095 0,093 0,094 0,181 0,206 0,221 0,233 0,242 0,354 0,044

0,341 0,096 0,095 0,094 0,096 0,184 0,204 0,224 0,234 0,244 0,352 0,042

0,342 0,093 0,096 0,093 0,093 0,179 0,207 0,219 0,232 0,241 0,352 0,041

Promedio 0,342 0,094 0,095 0,093 0,094 0,181 0,206 0,221 0,233 0,242 0,353 0,042

Klebsiella

pneumoniae

Hoja

Fresca

0,341 0,067 0,068 0,066 0,067 0,068 0,147 0,156 0,165 0,173 0,351 0,039

0,344 0,069 0,066 0,066 0,065 0,066 0,149 0,157 0,168 0,176 0,354 0,042

0,342 0,065 0,069 0,067 0,070 0,069 0,145 0,156 0,163 0,171 0,353 0,041

Promedio 0,342 0,067 0,068 0,066 0,067 0,068 0,147 0,156 0,165 0,173 0,353 0,041

Hoja

seca

0,346 0,074 0,073 0,075 0,074 0,073 0,155 0,165 0,174 0,189 0,356 0,044

0,341 0,076 0,075 0,078 0,073 0,072 0,153 0,170 0,175 0,193 0,351 0,042

0,344 0,073 0,072 0,073 0,076 0,075 0,157 0,161 0,173 0,185 0,355 0,045

Promedio 0,344 0,074 0,073 0,075 0,074 0,073 0,155 0,165 0,174 0,189 0,354 0,044

Elaborado por: Sarasti, D.

47

Tabla 19. Resultados de absorbancia para la Fracción activa frente a las diferentes cepas bacterianas

Tipo de

Extracto

Cepa

Bacteriana

B C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C(+) C(-)

FRACCIÓN

ACTIVA

Escherichia

coli

Hoja

fresca

0,341 0,045 0,046 0,045 0,044 0,046 0,149 0,158 0,166 0,174 0,351 0,041

0,347 0,047 0,045 0,041 0,047 0,045 0,146 0,159 0,164 0,176 0,357 0,036

0,345 0,044 0,046 0,047 0,041 0,046 0,151 0,158 0,167 0,173 0,356 0,039

Promedio 0,344 0,045 0,046 0,044 0,044 0,046 0,149 0,158 0,166 0,174 0,355 0,039

Hoja

seca

0,346 0,055 0,056 0,055 0,054 0,055 0,162 0,174 0,183 0,192 0,356 0,044

0,345 0,055 0,058 0,054 0,056 0,056 0,164 0,175 0,186 0,194 0,355 0,047

0,347 0,056 0,055 0,055 0,053 0,054 0,161 0,174 0,181 0,191 0,357 0,032

Promedio 0,346 0,055 0,056 0,055 0,054 0,055 0,162 0,174 0,183 0,192 0,356 0,041

Pseudomonas

aeruginosa

Hoja

fresca

0,345 0,192 0,193 0,195 0,245 0,273 0,288 0,3 0,311 0,319 0,355 0,042

0,344 0,194 0,194 0,193 0,242 0,275 0,287 0,302 0,308 0,317 0,355 0,038

0,342 0,191 0,193 0,196 0,247 0,272 0,288 0,299 0,314 0,321 0,353 0,041

Promedio 0,344 0,192 0,193 0,195 0,245 0,273 0,288 0,300 0,311 0,319 0,354 0,040

Hoja

seca

0,346 0,209 0,206 0,208 0,242 0,257 0,294 0,309 0,319 0,329 0,356 0,044

0,345 0,206 0,208 0,207 0,245 0,257 0,291 0,311 0,321 0,329 0,355 0,039

0,343 0,211 0,205 0,208 0,239 0,258 0,296 0,307 0,318 0,330 0,354 0,041

Promedio 0,345 0,209 0,206 0,208 0,242 0,257 0,294 0,309 0,319 0,329 0,355 0,041

Hoja

fresca

0,344 0,101 0,103 0,102 0,175 0,204 0,217 0,226 0,235 0,246 0,354 0,042

0,343 0,103 0,105 0,104 0,177 0,204 0,221 0,228 0,235 0,247 0,353 0,037

0,346 0,100 0,100 0,100 0,174 0,205 0,214 0,224 0,236 0,244 0,357 0,035

48

Staphylococcus

aureus

Promedio 0,344 0,101 0,103 0,102 0,175 0,204 0,217 0,226 0,235 0,246 0,355 0,038

Hoja

seca

0,344 0,109 0,108 0,109 0,188 0,221 0,234 0,244 0,255 0,266 0,354 0,047

0,347 0,110 0,111 0,108 0,186 0,223 0,237 0,244 0,252 0,263 0,358 0,042

0,345 0,109 0,106 0,109 0,189 0,219 0,231 0,245 0,258 0,268 0,355 0,045

Promedio 0,345 0,109 0,108 0,109 0,188 0,221 0,234 0,244 0,255 0,266 0,356 0,045

Klebsiella

pneumoniae

Hoja

fresca

0,346 0,083 0,084 0,085 0,083 0,154 0,172 0,18 0,189 0,198 0,356 0,042

0,342 0,086 0,085 0,081 0,079 0,155 0,176 0,220 0,192 0,190 0,352 0,039

0,344 0,080 0,083 0,088 0,086 0,153 0,169 0,150 0,185 0,205 0,355 0,035

Promedio 0,344 0,083 0,084 0,085 0,083 0,154 0,172 0,183 0,189 0,198 0,354 0,039

Hoja

seca

0,091 0,093 0,091 0,092 0,159 0,182 0,193 0,201 0,209 0,091 0,355 0,047

0,090 0,090 0,093 0,094 0,161 0,179 0,189 0,205 0,207 0,090 0,353 0,049

0,093 0,096 0,090 0,091 0,157 0,184 0,196 0,197 0,210 0,093 0,351 0,045

Promedio 0,091 0,093 0,091 0,092 0,159 0,182 0,193 0,201 0,209 0,091 0,353 0,047

Elaborado por: Sarasti, D.

49

Gráfica 7. Concentración Mínima Inhibitoria del extracto total de hojas frescas y hojas

secas frente a Escherichia coli

Elaborado por: Sarasti D.

Gráfica 8. Concentración Mínima Inhibitoria de la Fracción activa de hojas frescas y

hojas secas frente a Escherichia coli

Elaborado por: Sarasti D.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Ab

sorb

anci

a

Concentración

CMI de la Fracción Activa de la Hoja Fresca y Hoja

seca frente a Escherichia coli

HOJA FRESCA HOJA SECA

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Ab

sorb

anci

a

Concentración

CMI del Extracto Total de Hoja fresca y Hoja seca

frente a Escherichia coli

HOJA FRESCA HOJA SECA

50

Gráfica 9. Concentración Mínima Inhibitoria del extracto total de hojas frescas y hojas

secas frente a Pseudomonas aeruginosa

Elaborado por: Sarasti D.

Gráfica 10. Concentración Mínima Inhibitoria del extracto total de hojas frescas y hojas

secas frente a Pseudomonas aeruginosa

Elaborado por: Sarasti D.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Ab

sorb

anci

a

Concentración

CMI del Extracto Total de Hojas fresca y hoja seca

frente a Pseudomonas aeruginosa

HOJA FRESCA HOJA SECA

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Ab

sorb

anci

a

Concentración

CMI de la Fracción activa de hoja fresca y hoja seca

frente a Pseudomonas aeruginosa

HOJA FRESCA HOJA SECA

51

Gráfica 11. Concentración Mínima Inhibitoria del Extracto total de hojas frescas y hojas

secas frente a Staphylococcus aureus

Elaborado por: Sarasti D.

Gráfica 12. Concentración Mínima Inhibitoria del extracto total de hojas frescas y hojas

secas frente a Staphylococcus aureus

Elaborado por: Sarasti D.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Ab

sorb

anci

a

Concentración

CMI del Extracto Total de Hoja fresca y Hoja seca

frente a Staphylococcus aureus

HOJA FRESCA HOJA SECA

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Ab

sorb

anci

a

Concentración

CMI de la Fracción activa de la hoja fresca y hoja

seca frente a Staphylococcus aureus

HOJA FRESCA HOJA SECA

52

Gráfica 13. Concentración Mínima Inhibitoria del extracto total de hojas frescas y hojas

secas frente a Klebsiella pneumoniae

Elaborado por: Sarasti D.

Gráfica 14. Concentración Mínima Inhibitoria del extracto total de hojas frescas y hojas

secas frente a Klebsiella pneumoniae

Elaborado por: Sarasti D.

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Ab

sorb

anci

a

Concentración

CMI de la Fracción activa de hoja fresca y hoja seca

frente a Klebsiella pneumoniae

HOJA FRESCA HOJA SECA

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Ab

sorb

anci

a

Concentración

CMI de la Fracción activa de hoja fresca y Hoja

seca frente a Klebsiella pneumoniae

HOJA FRESCA HOJA SECA

53

4.4.1. Evaluación del porcentaje de Inhibición

Este proceso se realizó para determinar la cantidad de bacteria inhibida mediante el metabolito extra. Se calculó en base a la ecuación 3 de

acuerdo a los valores de absorbancia obtenidos.

% 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 =𝐴𝑏𝑠. 𝐶𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜 − 𝐴𝑏𝑠. 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛

𝐴𝑏𝑠. 𝐶𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑝𝑜𝑠𝑖𝑡𝑖𝑣𝑜∗ 100

% 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 =0,353 − 0,028

0,353∗ 100

% 𝑖𝑛ℎ𝑖𝑏𝑖𝑐𝑖ó𝑛 = 92,07

Tabla 20. Porcentaje de Inhibición del Extracto Total frente a las diferentes cepas bacterianas

% de Inhibición

Tipo de

Extracto

Cepa bacteriana C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9

Extracto

Total

Escherichia coli Hoja fresca 92,07 91,78 92,35 92,07 92,35 91,78 62,32 57,79 54,39

Hoja seca 89,58 89,01 89,86 90,14 89,86 89,86 60,85 57,46 53,80

Pseudomonas

aeruginosa

Hoja fresca 50,42 50,14 50,71 37,39 30,31 25,50 23,23 20,96 16,71

Hoja seca 49,44 50,00 49,44 35,11 26,97 23,88 20,79 16,85 13,20

Staphylococcus aureus Hoja fresca 75,42 75,14 75,71 75,42 51,41 43,22 38,42 35,95 33,33

Hoja seca 73,37 73,09 73,65 73,37 48,73 41,64 37,39 33,99 31,44

Klebsiella pneumoniae Hoja fresca 81,02 80,74 81,30 81,02 80,74 58,36 55,81 53,26 50,99

Hoja seca 79,10 79,38 78,81 79,10 79,38 56,21 53,39 50,58 46,61

Elaborado por: Sarasti, D.

54

En la tabla 20 se muestra el porcentaje de inhibición obtenido en cada concentración y frente a las diferentes cepas bacterianas. Escherichia

coli y Klebsiella pneumoniae, fueron las cepas que mayor porcentaje de inhibición presentaron con el extracto total de hoja fresca, con un valor

máximo de 92 y 81 % respectivamente, Staphylococcus aureus presentó un valor máximo de inhibición de 75% , seguido finalmente de

Pseudomonas aeruginosa con el menor porcentaje de inhibición (50%), lo que nos permite determinar que los extractos totales obtenidos presentan

alta actividad antibacteriana frente a las cepas de estudio exceptuando a Pseudomonas aeruginosa.

Gráfica 15. Porcentaje de Inhibición del Extracto Total frente a Escherichia coli

Elaborado por: Sarasti, D.

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

100,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9

92,191,8 92,4 92,1 92,4 91,8

62,357,8

54,4

89,6 89,0 89,9 90,1 89,9 89,9

60,857,5

53,8

% d

e In

hib

ició

n

Concentraciones

% de Inhibición del Extracto Total frente a Escherichia coli

HOJA FRESCA HOJA SECA

55

Gráfica 16. Porcentaje de Inhibición del Extracto Total frente a Pseudomonas aeruginosa

Elaborado por: Sarasti, D.

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9

50,4 50,1 50,7

37,4

30,3

25,523,2

21,0

16,7

49,4 50,0 49,4

35,1

27,0

23,9

20,8

16,9

13,2

% d

e In

hib

ició

n

Concentración

% de Inhibición del Extracto total frente a Pseudomonas aeruginosa

HOJA FRESCA HOJA SECA

56

Gráfica 17. Porcentaje de Inhibición del Extracto Total frente a Staphylococcus aureus

Elaborado por: Sarasti, D.

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9

75,4 75,1 75,7 75,4

51,4

43,2

38,435,6

33,3

73,4 73,1 73,7 73,4

48,7

41,637,4

34,031,4

% d

e In

hib

ició

n

Concentracion

% de Inhibición del Extracto Total frente a Sthapylococcus aureus

HOJA FRESCA HOJA SECA

57

Gráfica 18. Porcentaje de Inhibición del Extracto Total frente a Klebsiella pneumoniae

Elaborado por: Sarasti, D.

En todas las gráficas representadas para porcentaje de inhibición de extracto total se puede determinar que las cepas bacterianas presentan

mayor susceptibilidad frente a los extractos totales de hoja fresca que a los extractos de hoja seca pero con una diferencia que no es mayormente

significativa, de acuerdo a la inhibición obtenida en cada concentración.

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9

81,0 80,7 81,3 81,0 80,7

58,455,8

53,351,0

79,1 79,4 78,8 79,1 79,4

56,253,4

50,846,6

% d

e In

hib

ició

n

Concentración

Porcentaje de Inhibición del Extracto Total frente a Klebsiella pneumoniae

HOJA FRESCA HOJA SECA

58

Tabla 21. Análisis de Varianza para el porcentaje de Inhibición del Extracto total

Fuente Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P

EFECTOS PRINCIPALES

A:Concentración 14737,3 8 1842,17 53,37 0,0000

B:Cepa Bacteriana 21928,4 3 7309,48 211,77 0,0000

C:Tipo de Hoja 75,1742 1 75,1742 2,18 0,1453

RESIDUOS 2036,42 59 34,5156

TOTAL (CORREGIDO) 38777,4 71

Elaborado por: Sarasti, D.

Los valores-P prueban la significancia estadística de cada uno de los factores.

Puesto que 2 valores-P son menores que 0,05, estos factores tienen un efecto

estadísticamente significativo sobre % de Inhibición con un 95,0% de nivel de confianza.

Con los resultados mostrados en la tabla 21 se puede determinar que las diferentes

concentraciones y la cepa bacteriana presentan un efecto significativo sobre el porcentaje

de inhibición obtenido con el extracto total, respecto al tipo de hoja que no presenta efecto

significativo.

59

Tabla 22. Porcentaje de Inhibición de la Fracción Activa frente a las diferentes cepas bacterianas

% de Inhibición

Tipo de

Extracto

Cepa bacteriana C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9

Fracción

Activa

Escherichia coli Hoja fresca 87,32 87,04 87,32 87,61 87,04 58,03 55,49 53,24 50,99

Hoja seca 84,55 84,27 84,55 84,83 84,55 54,49 51,12 48,60 46,07

Pseudomonas

aeruginosa

Hoja fresca 45,76 45,48 44,92 31,83 27,60 18,64 15,25 12,15 9,89

Hoja seca 41,13 41,97 41,41 29,79 22,81 17,18 12,96 10,14 7,32

Staphylococcus aureus Hoja fresca 71,55 70,99 71,27 50,70 42,54 38,87 36,34 33,80 30,70

Hoja seca 69,30 69,58 69,30 47,04 37,75 34,08 31,27 28,17 25,07

Klebsiella pneumoniae Hoja fresca 76,55 76,27 75,95 76,55 56,50 51,41 49,15 46,61 44,07

Hoja seca 74,22 73,65 74,22 73,94 54,96 48,44 45,33 43,06 40,79

Elaborado por: Sarasti, D.

En la tabla 22 se muestra el porcentaje de inhibición obtenido en cada concentración y frente a las diferentes cepas bacterianas. Escherichia

coli y Klebsiella pneumoniae, fueron las cepas que mayor porcentaje de inhibición presentaron con el extracto total de hoja fresca, con un valor

máximo de 87 y 76 % respectivamente, Staphylococcus aureus presentó un valor máximo de inhibición de 71% , seguido finalmente de

Pseudomonas aeruginosa que fue la bacteria que menos porcentaje de inhibición presentó (45%) en relación a las demás cepas, lo que nos permite

determinar que la fracción activa obtenida a partir de los extractos hojas frescas y secas obtenidos presentan alta actividad antibacteriana frente a

las cepas de estudio exceptuando a Pseudomonas aeruginosa.

Comparando los resultados de la tabla 20 y tabla 22 se puede establecer que el extracto total de hoja fresca presenta mayor porcentaje de

inhibición respecto al extracto de hoja seca, pero con una diferencia que no es mayormente significativa. La fracción activa de hoja fresca predomina

sobre el extracto de hoja seca, pero de igual manera con una diferencia que no es significativa.

60

Gráfica 19. Porcentaje de Inhibición de la Fracción activa frente a Escherichia coli

Elaborado por: Sarasti, D.

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

90,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9

87,3 87,0 87,3 87,6 87,0

58,055,5

53,251,0

84,6 84,3 84,6 84,8 84,6

54,551,1

48,646,1

% d

e In

hib

ició

n

Concentración

% de inhibición de la Fracción activa frente a Escherichia coli

HOJA FRESCA HOJA SECA

61

Gráfica 20. Porcentaje de Inhibición dela Fracción activa frente a Pseudomonas aeruginosa

Elaborado por: Sarasti, D.

0,0

5,0

10,0

15,0

20,0

25,0

30,0

35,0

40,0

45,0

50,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9

45,8 45,5 44,9

31,8

27,6

18,6

15,312,1

9,9

41,1 42,0 41,4

29,8

22,9

17,2

13,010,1

7,3

% d

e In

hib

ició

n

Concentración

% de Inhibición de la Fracción activa frente a Pseudomonas

aeruginosa

HOJA FRESCA HOJA SECA

62

Gráfica 21. Porcentaje de Inhibición de la Fracción activa frente a Staphylococcus aureus

Elaborado por: Sarasti, D.

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9

71,5 71,0 71,3

50,7

42,538,9

36,333,8

30,7

69,3 69,6 69,3

47,0

37,734,1

31,328,2

25,1% d

e In

hib

ició

n

Concentración

% de Inhibición de la Fracción activa frente a Staphylococcus aureus

HOJA FRESCA HOJA SECA

63

Gráfica 22. Porcentaje de Inhibición de la Fracción activa frente a Klebsiella pneumoniae

Elaborado por: Sarasti, D.

En todas las gráficas representadas para porcentaje de inhibición de la fracción activa se puede determinar que las cepas bacterianas

presentan mayor susceptibilidad frente a los extractos de hoja fresca que a los de hoja seca, de acuerdo a la inhibición obtenida en cada

concentración., pero con una diferencia que no es mayormente significativa.

0,0

10,0

20,0

30,0

40,0

50,0

60,0

70,0

80,0

1 2 3 4 5 6 7 8 9

76,6 76,3 76,0 76,6

56,5

51,449,2

46,644,1

74,2 73,7 74,2 73,9

55,0

48,445,3

43,140,8

Ab

sorb

anci

a

Concentración

% de Inhibición de la Fracción activa frente a Klebsiella pneumoniae

HOJA FRESCA HOJA SECA

64

Tabla 23. Análisis de Varianza para el porcentaje de Inhibición de la Fracción activa

Elaborado por: Sarasti, D.

Los valores-P prueban la significancia estadística de cada uno de los factores.

Puesto que 2 valores-P son menores que 0,05, estos factores tienen un efecto

estadísticamente significativo sobre % de Inhibición con un 95,0% de nivel de confianza.

Con los resultados mostrados en la tabla 23 se puede determinar que las diferentes

concentraciones y la cepa bacteriana presentan un efecto significativo sobre el porcentaje

de inhibición obtenido con la fracción activa respecto al tipo de hoja que no presenta efecto

significativo.

Tabla 24. Concentración Mínima Inhibitoria de las diferentes cepas bacterianas en

relación al tipo de hoja.

Tipo de

Extracto

Cepa bacteriana Tipo de Hoja CMI experimental

Extracto Total

Escherichia

coli

Hoja fresca 2,82

Hoja seca 2,69

Pseudomonas

aeruginosa

Hoja fresca 11,28

Hoja seca 10,79

Staphylococcus

aureus

Hoja fresca 5.64

Hoja seca 5,39

Klebsiella

pneumoniae

Hoja fresca 1,41

Hoja seca 1,35

Fracción

activa

Escherichia

coli

Hoja fresca 2,60

Hoja seca 2,35

Pseudomonas

aeruginosa

Hoja fresca 10,41

Hoja seca 9,38

Staphylococcus

aureus

Hoja fresca 5,20

Hoja seca 4,69

Klebsiella

pneumoniae

Hoja fresca 1,30

Hoja seca 1,17

Elaborado por: Sarasti, D.

Fuente Suma de

Cuadrados

Gl Cuadrado

Medio

Razón-F Valor-P

EFECTOS

PRINCIPALES

A:Concentración 15819,4 8 1977,43 87,08 0,0000

B:Cepa Bacteriana 19633,6 3 6544,52 288,21 0,0000

C:Tipo de Hoja 152,979 1 152,979 6,74 0,1119

RESIDUOS 1339,73 59 22,7073

TOTAL (CORREGIDO) 36945,7 71

65

De acuerdo a los resultado presentados en la tabla 24 se determinó la CMI para las

diferentes cepas bacterianas, en la misma se muestra que las enterobacterias (Escherichia

coli y Klebsiella pneumoniae) y Staphylococcus aureus tienen una CMI mayor al valor de

referencia de la Ceftriaxona (≥ 0,125 μg/ml y ≥ 4 μg/ml respectivamente) por lo tanto los

extractos obtenidos extracto pueden ser utilizado para tratar este tipo de cepas bacterianas.

En cuanto a Pseudomonas aeruginosa, presenta una CMI menor al valor de referencia del

control positivo (≥ 16 μg/ml), este dato concuerda con los halos y porcentajes de inhibición

obtenidos experimentalmente por lo que se puede deducir que el la fracción extraída de

esta especie vegetal presenta un patrón de sensibilidad intermedio para esta cepa

bacteriana.

66

CAPÍTULO V

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

5.1. Conclusiones

Se hizo la identificación botánica de la planta, determinando que ésta corresponde

a la especie vegetal Moringa oleifera.

Se realizó el proceso de extracción a partir de las hojas frescas y secas de la especie

vegetal Moringa oleífera por el método de Soxhlet utilizando como solvente etanol

(70°), obteniéndose un rendimiento de extracción del 13,6 % para Hoja fresca y

10,7 % para hoja seca.

Se realizó una marcha fitoquímica de los extractos obtenidos en los cuales se

identificó los metabolitos presentes en las hojas frescas y secas de la especie vegetal

Moringa oleífera, mediante pruebas de identificación y perfil cromatográfico, a

través de la cual se determinó la presencia de Alcaloides, Esteroles y Flavonoides

en abundante cantidad, Antocianinas, Taninos, Saponinas y Glúcidos cardiotónicos

en cantidad moderada, y Antraquinonas en poca cantidad.

Se determinó cuantitativamente el porcentaje de la fracción extraída mediante

valoración espectrofotométrica utilizando como marcador Quercetina,

obteniéndose como resultados una concentración de 90,24 mg Quercetina/ ml de

extracto y 86,34 mg Quercetina/ ml de extracto para el extracto total de Hoja fresca

y Hoja seca respectivamente; 83,30 mg de Quercetina/ ml de extracto y 75,06 mg

Quercetina/ ml de extracto para la fracción activa de Hoja fresca y Hoja seca

respectivamente.

Se evaluó la actividad antimicrobiana mediante el método de los pocillos en agar

obteniendo los siguientes halos de inhibición en el extracto total para Escherichia

coli 28 mm, Pseudomonas aeruginosa 18,0 mm, Staphylococcus aureus 25,0 mm

y Klebsiella pneumoniae 27,0 mm, en la fracción activa para Escherichia coli 26,5

mm, Pseudomonas aeruginosa 16,0 mm, Staphylococcus aureus 23,0 mm y

Klebsiella pneumoniae 25,0 mm.

Se determinó la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) mediante el método de

microdilución en placa frente a cepas bacterianas obteniéndose como resultados

para el extracto total una CMI para Escherichia coli 2,73 μg/ml, Pseudomonas

aeruginosa 11,03 μg/ml, Staphylococcus aureus 5,51 μg/ml, y Klebsiella

pneumoniae 2,75 μg/ml. En la fracción activa se obtuvo una CMI para Escherichia

coli 1,23 μg/ml, Pseudomonas aeruginosa 9,89 μg/ml, Staphylococcus aureus 4,95

μg/ml, y Klebsiella pneumoniae 2,47 μg/ml.

Se determinó el porcentaje de inhibición para cada cepa bacteriana respecto a las

diferentes concentraciones, obteniéndose como resultado que el extracto total

presenta mayor porcentaje en comparación a la fracción activa. Los máximos

67

valores de inhibición para el extracto total frente a para Escherichia coli fue de 90,8

%, para Pseudomonas aeruginosa 49,9 %, para Staphylococcus aureus 74,4 % y

para Klebsiella pneumoniae 80,1 % En la fracción activa se obtuvo un porcentaje

de inhibición para Escherichia coli de 85,9 %, para Pseudomonas aeruginosa 43,4

%, para Staphylococcus aureus de 70,4 % y para Klebsiella pneumoniae de 75,4

%.

Se determinó la actividad antimicrobiana del extracto total y de la fracción activa

de las hojas frescas y secas de la especie vegetal Moringa oleífera frente a

microorganismos patógenos, obteniéndose como resultados que la fracción extraída

exhibe patrones de sensibilidad eficaces frente a enterobacterias (Escherichia coli

y Klebsiella pneumoniae), un patrón de sensibilidad aceptable para Staphylococcus

aureus y para Pseudomonas aeruginosa. una susceptibilidad antimicrobiana

intermedia.

5.2. Recomendaciones

Realizar estudios científicos comparativos sobre cada una de las propiedades que

se le atribuye a esta especie vegetal, para comprobar su valor terapéutico.

Obtener extractos a base de diferentes solventes para evaluar la concentración de

los metabolitos presentes en esta especie vegetal.

Se recomienda separar y aislar completamente el activo que le atribuye la actividad

antimicrobiana a esta especie vegetal con el fin de obtener altas concentraciones,

para asociar su acción antibiótica al desarrollo de nuevas moléculas que sirvan

como modelo químico para el diseño y síntesis de nuevas drogas para tratar

infecciones ocasionadas por patógenos.

Hacer estudios de toxicidad de esta especie vegetal y sus diferentes extractos, para

evaluar el riesgo que pueda ocasionar sobre la salud humana frente a exposiciones

agudas o crónicas y para analizar el perfil de seguridad de esta planta.

Se recomienda continuar con este estudio para la elaboración de formas

farmacéuticas a partir del extracto de esta especie vegetal para el tratamiento de

infecciones producidas por las cepas bacterianas mencionadas en este trabajo de

investigación como respuesta a la problemática de salud pública que existe en la

actualidad en cuanto a resistencia microbiana ya que el activo correspondería a un

antibiótico natural.

68

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Abubakar, I. (Mayo de 2016). Academic Journal. Journal of Microbiology and

Antimicrobials. Obtenido de Phytochemical and antibacterial investigations of

moringa (Moringa oleifera) leaf extract on selected bacterial pathogens:

http://www.academicjournals.org/journal/JMA/article-full-text-

pdf/45083DB59795

Armora, E., & Gómez, I. (03 de Abril de 2012). ABC.es. Recuperado el 21 de Agosto de

2017, de Escherichia coli: http://www.abc.es/20110531/sociedad/abci-escherichia-

coli-pepinos-201105301450.html

Arnal, A. (12 de Julio de 2016). Segundo Médico. Obtenido de Escherichia coli:

http://www.segundomedico.com/urocultivo-positivo-que-significa/

Atieno, W. (18 de Enero de 2011). African Journal of Microbiology. Obtenido de

Antibacterial activity of Moringa oleifera and Moringa stenopetala methanol and

n-hexane seed extracts on bacteria implicated in water borne diseases:

file:///C:/Users/Usuario/Downloads/Antibacterial_Moringa_Oleifera.pdf

Avello , M., & Cisternas , I. (Octubre de 2010). Scielo. Obtenido de Revista médica de

Chile: http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0034-

98872010001100014

Bhat, R. (Agosto de 2015). Research Gate. Obtenido de Método de pocillos en agar:

https://www.researchgate.net/figure/280920441_The-methylene-blue-agar-

method-to-screen-Pseudomonas-isolates-for-rhamnolipid

Bonal, R. (Octubre de 2012). Scielo. Obtenido de Moringa oleifera:

http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1029-

30192012001000014

Bravo, L. (2013). Farmacognosia-Plantas medicinales. Obtenido de Métodos de

extracción: https://www.plantas-medicinal-

farmacognosia.com/temas/m%C3%A9todos-de-extracci%C3%B3n/

BritaniaLab. (Noviembre de 2015). BritaniaLab.com . Recuperado el 21 de Agosto de

2017, de http://www.britanialab.com/productos/B02102%20REV%2001-

TRIPTEINA%20SOYA%20AGAR.pdf

Camarena, J. (Julio de 2011). SEIMC. Obtenido de INFECCIÓN POR Staphylococcus

aureus:

https://www.seimc.org/contenidos/ccs/revisionestematicas/bacteriologia/sarm.pdf

Cantón, R. (Diciembre de 2009). Lectura interpretada del antibiograma: una necesidad

clínica. Obtenido de ELSEVIER: http://www.elsevier.es/es-revista-enfermedades-

infecciosas-microbiologia-clinica-28-articulo-lectura-interpretada-del-

antibiograma-una-S0213005X1000087X

Cea, R. (2013). DICA. Obtenido de Fitofármacos:

http://www.dbbe.fcen.uba.ar/contenido/objetos/Cea2013.pdf

69

Cordiés, L., & Hamilton, M. (1998). Principios generales de la terapéutica antimicrobiana.

BVS Cuba, 13-27.

Córdoba, S. (Junio de 2013). DocPlayer. Obtenido de Microdilución en placa:

http://docplayer.es/21805428-Pruebas-de-sensibilidad-in-vitro-en-levaduras-y-

hongos-miceliales-susana-cordoba.html

Corzo, D. (Septiembre de 2012). Scielo. Obtenido de Evaluación de la actividad

antimicrobiana del extracto etanólico:

http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1870-

01952012000300009

Cruz, A. (03 de Agosto de 2011). Staphylococcus aureus . Recuperado el 21 de Agosto de

2017, de Microbitos Blog: http://microbitosblog.com/2011/08/03/staphylococcus-

aureus-epidermidis-saprophyticus/

Daza, R. (Mayo de 2010). Información Terapéutica del Sistema Nacional de Salud.

Obtenido de Resistencia bacteriana a antimicrobianos:

http://www.mspsi.es/fr/biblioPublic/publicaciones/docs/bacterias.pdf

De la Torre, L., & Navarrete, H. (2008). Enciclopedia de las Plantas Útiles del Ecuador.

Obtenido de http://www.puce.edu.ec/portal/wr-resource/blobs/1/PUB-QCA-

PUCE-2008-Enciclopedia.pdf

Delporte, C. (Junio de 2010). Farmacognosia, flavonoides. Obtenido de Departamento de

Química Farmacológica y Toxicológica:

file:///C:/Users/Usuario/Downloads/GU_A_TP_FARMACOGNOSIA_2010%20(

3).pdf

Devendra, B. (Septiembre de 2011). International Journal of Pharma and Bio Sciences .

Obtenido de Antimicrobial activity of Moringa oleifera lam, leaf extract, agains t

selected bacterial and fungal strains. :

https://pdfs.semanticscholar.org/8d2d/76c97abab8afa2dc55b16c7836b2efae0059.

pdf?_ga=2.190569891.989336266.1504629517-1206906889.1504629517

Escamilla, C. (Marzo de 2009). Journal UNAM. Obtenido de Flavonoides:

http://www.ejournal.unam.mx/rfm/no52-2/RFM052000207.pdf

García, J. (Octubre de 2000). Procedimientos de Microbiología. Obtenido de Pruebas de

sensibilidad bacteriana:

http://campus.usal.es/~micromed/Practicas_odontologia/unidades/labv/LabMicro/

Antibiograma.html

García, Q. (30 de Octubre de 2014). Microbiología blogspot . Obtenido de Dilución

Bacteriana: http://microbiologia3bequipo5.blogspot.com/2014/10/dilucion-

bacteriana.html

González. (Junio de 2013). Scielo. Obtenido de Caracterización de cepas de Klebsiella

pneumoniae: https://scielo.conicyt.cl/pdf/rci/v30n4/art04.pdf

González, J. (20 de Marzo de 2015). Pseudomonas aeruginosa. Recuperado el 21 de

Agosto de 2017, de Microbitos blog:

70

http://microbitosblog.com/2015/04/28/pseudomonas-aeruginosa-p-putida-p-

fluorescens-morfologia-medios-de-cultivo-enfermedades-y-mas/

Grzelak, E. (Abril de 2016). ResearchGate. Obtenido de Bioautography:

https://www.researchgate.net/publication/295841181_Bioautography_with_TLC-

MSNMR_for_Rapid_Discovery_of_Anti-

tuberculosis_Lead_Compounds_from_Natural_Sources

Hernández, E. (Septiembre de 2016). Microorganismos patógenos. Obtenido de

http://microorg1.blogspot.com/2016/09/microorganismospotagenos.html

Hernández, R. (2010). Métodología de la Investigación. En Paradigma cuantitativo (pág.

4). Mc Graw Hill.

Institute Clinical and Laboratory Standars. (Enero de 2012). Microdilución en placa.

Obtenido de http://antimicrobianos.com.ar/ATB/wp-content/uploads/2012/11/04-

DETERMINACION-DE-LA-SENSIBILIDAD-METODO-DE-DILUCION-

2012.pdf

Jiménez. (mayo de 2016). Extracción Soxhlet. Obtenido de

http://soxhletproint.blogspot.com/2016/05/partes-principales.html

Labmedica. (08 de Octubre de 2012). Journal of Clinical Microbiology & Infectious

Diseases. Obtenido de Difusión de disco en agar:

https://www.labmedica.es/microbiologia/articles/294742841/sustituyen-agar-

nutritivo-por-sangre-en-los-antibiogramas.html

Lock, O. (1997). Flavonoides. En Colorantes Naturales (pág. 77). Perú: Fondo Editorial.

Obtenido de

https://books.google.com.ec/books?id=LjmH_3qjaEIC&pg=PA77&lpg=PA77&d

q=la+reaccion+mas+usual+para+la+deteccion+de+flavonoides+de+planta+es+la

+reaccion+de+shinoda&source=bl&ots=mKuWgoj5tv&sig=VOeMCTvu9QXjIr7

0qFZ2qxRzPC4&hl=es-419&sa=X&ved=0ahUKEwiVxOXDg4jZA

Luqman, S., & Ibrahim , S. (Junio de 2014). Evidence based complementary and

alternative medicine . Obtenido de Efficacy of Herbal Drugs in Human Diseases

and Disorders.

Mahajan, G. (Marzo de 2011). Alchetron. Obtenido de Pseudomonas aeruginosa:

https://alchetron.com/Pseudomonas-aeruginosa-4112001-W

Manikandan, P. (Septiembre de 2016). International Journal of Current Microbiology and

Applied Sciences. Obtenido de Antibacterial Efficacy of Moringa oleifera Leaf

against Medically Important Clinical Pathogens: https://www.ijcmas.com/5-4-

2016/P.%20Manikandan,%20et%20al.pdf

Marcano, D., & Hasegawa, M. (2002). Fitoquímica Orgánica. Caracas: Torino.

Martín, C., & García , A. (Junio de 2013). Scielo. Obtenido de Potenciales aplicaciones de

Moringa oleifera. Una revisión crítica:

http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0864-

03942013000200001

71

Martz, E. (Junio de 2013). Blog Minitb. Obtenido de Tipos de Anova :

http://support.minitab.com/es-mx/minitab/17/topic-library/modeling-

statistics/anova/basics/what-is-anova/

Ministerio de Medio Ambiente . (Junio de 2017). Gobierno de España. Obtenido de

Vigilancia de zoonosis y resistencia antibacteriana:

http://www.mapama.gob.es/es/ganaderia/temas/sanidad-animal-higiene-

ganadera/sanidad-animal/zoonosis-resistencias-

antimicrobianas/resistencias_antimicrobianas.aspx

Minitab. (Marzo de 2017). Support Minitab 18. Obtenido de Diseño Factorial:

https://support.minitab.com/es-mx/minitab/18/help-and-how-to/modeling-

statistics/doe/supporting-topics/factorial-and-screening-designs/factorial-and-

fractional-factorial-designs/

Mulcahy, M. (04 de Marzo de 2013). Biología.com. Obtenido de Staphylococcus aureus :

http://www.bioblogia.com/2013/03/descubren-por-que-el-staphylococcus-aureus-

coloniza-preferentemente-la-nariz/

Pardo, J. (Mayo de 2002). Centre de patents. Obtenido de Patentabilidad de los extractos

vegetales:

http://www.ub.edu/centredepatents/pdf/doc_dilluns_CP/pardo_patentesextractospl

antas.pdf

Paredes, F. (Marzo de 2004). ÁMBITO FARMACÉUTICO. Obtenido de Concentración

Mínima Inhibitoria: file:///C:/Users/Usuario/Downloads/13059414_S300_es.pdf

Polini, G. (Julio de 2011). Cooperación Internacional . Obtenido de La Moringa oleífera:

http://www.desaprender.org/fileSendAction/fcType/5/fcOid/44744069514297778

8/fodoid/447440695142977787/Moringa%20Oleifera

Rahman, M. (2009). Antibacterial Activity of Leaf Juice and Extracts of Moringa oleifera

Lam. against Some Human Pathogenic Bacteria. 219-226.

Ramírez, L., & Marín, D. (Agosto de 2009). METODOLOGIAS PARA EVALUAR IN

VITRO LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE COMPUESTOS DE

ORIGEN VEGETAL . Scientia et Technica , 263-266.

Rodríguez. (Diciembre de 2015). Lifeder. Obtenido de Bacterias:

https://www.lifeder.com/clasificacion-bacterias/

Rodríguez, G., & Angeles, M. (2002). Principales características y diagnóstico de los

grupos patógenos de Escherichia coli. Recuperado el 21 de Agosto de 2017, de

Instituto Nacional de Salud Pública: http://www.adiveter.com/ftp_public/E.coli.pdf

San Martín, B. (Junio de 2006). Método del cilindro placa. Obtenido de

http://web.uchile.cl/vignette/avancesveterinaria/CDA/avan_vet_completa/0,1424,

SCID%253D12729%2526ISID%253D480,00.html

Sherwin, & Olson. (Junio de 2012). Taxonomía Moringa oleifera. Obtenido de EcuRed:

https://www.ecured.cu/Moringa_oleifera

72

Sociedad Española de Microbiología. (Abril de 2017). SEM. Obtenido de Concentración

Mínima Inhibitoria:

https://twitter.com/SEMicrobiologia/status/850078913275584518

Support Minitab. (2016). ANOVA. Obtenido de http://support.minitab.com/es-

mx/minitab/17/topic-library/modeling-statistics/anova/basics/what-is-anova/

Terán, R. (Septiembre de 2017). MANUAL DE LABORATORIO DE

MICROBIOLOGÍA. Quito, Pichincha, Ecuador .

The Biocote Team. (Agosto de 2015). Biocote. Obtenido de Klebsiella pneumoniae:

https://www.biocote.com/blog/5-facts-about-klebsiella-pneumoniae/

Tramil. (Septiembre de 2017). Tramil . Obtenido de Programa de investigación aplicada a

la medicina popular del Caribe: http://www.tramil.net/es/plant/moringa-

pterygosperma

Vignoli, R. (Marzo de 2011). Principales mecanismos de resistencia bacteriana. .

Obtenido de

http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/Principalesmecanismosderesistenciaantibiot

ica.pdf

73

ANEXOS

Anexo 1. Certificado de Identificación botánica

74

HOJAS FRESCAS

HOJAS SECAS

Anexo 2. Hojas frescas y secas de Moringa oleifera

Anexo 3. Extracción por el Método Soxhlet

75

Anexo 4. Marcha Fitoquímica

76

Reacción de Shinoda

Reacción de Cianidina

Reacción en medio alcalino

Anexo 5. Identificación de flavonoides, reacciones de coloración

Anexo 6. Cromatografía de Flavonoides

77

Escherichia coli

Staphylococcus aureus

Pseudomonas aeruginosa

Klebsiella pneumoniae

Anexo 7. Cepas bacterianas

Anexo 8. Halos de inhibición formados a partir del extracto total de hojas frescas y secas

en bacteria Escherichia coli

78

Anexo 9. Halos de inhibición formados a partir de la fracción activa de hojas frescas y

secas en bacteria Escherichia coli

Anexo 10. Halos de inhibición formados a partir del extracto total de hojas frescas y

secas en bacteria Klebsiella pneumoniae

Anexo 11. Halos de inhibición formados a partir de la fracción activa de hojas frescas y

secas en bacteria Klebsiella pneumoniae

79

Anexo 12. Halos de inhibición formados a partir del extracto total de hojas frescas y

secas en bacteria Staphylococcus aureus

Anexo 13. Halos de inhibición formados a partir de la fracción activa de hojas frescas y

secas en bacteria Staphylococcus aureus

Anexo 14. Halos de inhibición formados a partir del extracto total de hojas frescas y

secas en bacteria Pseudomonas aeruginosa

80

Anexo 15. Halos de inhibición formados a partir de la fracción activa de hojas frescas y

secas en bacteria Pseudomonas aeruginosa

Anexo 16. Diluciones seriadas en microplaca para Escherichia coli con los diferentes

extractos

Anexo 17. Diluciones seriadas en microplaca para Pseudomonas aeruginosa con los

diferentes extractos

81

Anexo 18. Diluciones seriadas en microplaca para Staphylococcus aureus con los

diferentes extractos

Anexo 19. Diluciones seriadas en microplaca para Klebsiella pneumoniae con los

diferentes extractos

82

Especificaciones

E1: Hojas frescas / Hojas secas

E2: Etanol 70°

Proceso de Extracción

Pesar ≈ 50 g de Hojas

de Moringa

Colocar En el capuchón

Armar Equipo de

Soxhlet

Extraer Durante 6

horas

Recolectar El extracto

obtenido

Concentrar

Hasta eliminar

solvente

Determinar Rendimiento

Fin

E1

E2

Anexo 20. Diagrama de flujo del Proceso de Extracción

83

Causas:

Efectos:

Anexo 21. Diagrama de causa efecto

Resistencia

antimicrobiana

Mal uso de

antibióticos Automedicación

Bacterias

multirresistentes

Falla

terapéutica

Menor eficacia en

los tratamientos

Infecciones

complicadas

Mayor costo en

los tratamientos

Aumento de la

mortalidad

Venta libre de

antibióticos

Poca investigación

de antibióticos

naturales

Dependencia de uso de

antibióticos sintéticos

Desarrollo de nuevos mecanismos de

resistencia bacteriana

84

Anexo 22. Halos de Inhibición CLSI