Buscandoelmecanismoylavelocidaddereacciónconlaciné3caenzimá3ca

Laciné(caenzimá(casirvepara:

•Determinarlasafinidadesdefijacióndesustratoseinhibidoresdeunaenzima.

•Si conocemos la forma en que varía la velocidad de reacción(además de otra información), se puede elucidar elmecanismocatalí(codelaenzima.

•Conocerelpapeldelaenzimaenunprocesometabólicoglobal.

•Casi siempre, la velocidad de la reacción es proporcional a lacan(dad de enzima presente, por lo que las determinacionesenzimá(cassebasanenestudiosciné(cos.

DeduciendoelmodelodeMichaelis‐Menten

LeonorMichaelis MaudMenten

Análisisdeloscomponentesdeunareacciónenzimá3ca

Seconsideraqueelsustratoestáenexcesoconrespectoalaenzima.

Estadoestacionario.Premisamás

importanteenelmodelode

MichaelisMenten

Lafasetransitoriaoestadopre‐

estacionario,seencuentradentrode

losprimerosmomentosdereacción

EnestaetapalaconcentracióndeESaumenta

Elefectodelaconcentracióndesustratosobrelavelocidaddereacciónseexplicaconlaecuaciónde

Michaelis‐Menten

Enzimasaturada.TodaenformaES

Hipérbolarectangular

KM=Vmax/2

Ejey=Velocidadinicial(Vo).Antesdequeel10%delSseconviertaenP.

Ejex=[S]

(Vo)

Nisiquieraa10KMseob(eneunvalorcerterodeVmáx.

Saturacióndeunaenzimaporsusustrato

Baja[S]50%[S]oKmAlta,saturante[S]oVmax(TodoenES)

Linearizandolagráficahiperbólicacondoblesrecíprocos…

EcuacióndeLineweaver‐Burk

Vo=VelocidadinicialVmáx=Velocidadmáxima[S]=ConcentracióndesustratoKm=ConstantedeMichaelis

GráficadeLineweaver‐Burk

y = m x + b

Ecuaciónde la recta

Significadodelosparámetrosciné3cos

Laconcentracióndesustratoalaquelavelocidaddereaccióneslamitaddelamáxima.

Esunamedidadelaafinidaddelaenzimaporelsustrato.

UnaenzimaconunKMpequeñolograunaeficeinciacatalí(caaltaaunaconcentracióndesustratopequeña.

KMVmáx

KM=Vmax/2

Cuandolaenzimaestácompletamentesaturada

CuandopredominalaformaES

Cuandose(enenALTAS[S],osea[S]>>Km,Vo=Vmáx

Constantecatalí3caonúmeroderecambio.Númerodemoléculasdesustratoquesontransformadasporunamoléculadeenzimaporunidadde(empo.Medidadeeficienciacatalí3ca.

kcat KM

Parámetroquepermitecompararlaseficienciascatalí3casdelasrxs

Constantedeespecificidad

ValoresdeKM,kcatykcat/KMdealgunasenzimasysustratos

Inhibiciónenzimá3ca:Reducciónenlaac3vidadcatalí3cadelaenzima

Inhibición

Irreversible

Reversible

Modificaciónirreversibledelaenzima.UniónCOVALENTEdelinhibidoralosaminoácidosdelaenzima(si(oac(vo).

Unión NO COVALENTE del inhibidor al si(oac(vooaotro si(ode laenzima, limitandoasísucapacidaddecatalizarunareacción.

La ac(vidad enzimá(ca se restaura cuando elinhibidoresremovidodelmedio.

InhibiciónReversible

•COMPETITIVA•NOCOMPETITIVA(MIXTA)•ACOMPETITIVA

Inhibicióncompe33va

Inhibidorcompe33vo.Sustanciaquecompitedirectamenteconunsustratonormalporunsi(odefijaciónenzimá(co.Separecealsustratopuessefijaalsi(oac(voperodifiereenquenoesreac(vo.

Reducela[E]libredisponibleparalafijacióndelsustrato.Noproduc(vo

GráficadeMichaelis‐Mentenenpresenciadeuninhibidorcompe33vo

Donde:

αKm= Km aparente

GráficadeLineweaver‐Burkenpresenciadeuninhibidorcompe33vo

y = m x + b

-1/Km

•LaKmaumentaporelfactorα.SenecesitamayorconcentracióndesustratoparaalcanzarVmax/2

•Unacan(dadaltadesustratopuededesplazaralinhibidor,alcanzandolaVmaxnormal

Km aumentaVmax no cambia

Elmalonatoesuninhibidorcompe33vo

Enzima: Succinato deshidrogenasa (SDH)

Inhibiciónnocompe33vao

mixta

•Elinhibidorseuneaunsi(odis(ntodelsi(oac(vodelaenzima,esindependientedelsustrato.

•PuedeunirsetantoalaenzimaEcomoalcomplejoES.

•Laconformacióndelaenzimacambiayseafectaunpasocatalí(coquedisminuyeoeliminalaac(vidad.

Noproduc(vos

GráficadeMichaelis‐Mentenenpresenciadeuninhibidornocompe33vo

Donde:

GráficadeLineweaver‐Burkenpresenciadeuninhibidornocompe33voomixto

y = m x + b

VmaxdisminuyeKmNOcambia

•Elinhibidornoafectalaunióndelsustrato.LaKmnocambia.•Inac(vaalaenzima,unavezqueseuneaellayformaelcomplejoEI•MientrasmásEIseforme,menosESsetendráydisminuirálaVmax.

Inhibiciónacompe33va(incompe33va,uncompe33ve)

Elinhibidoracompe((voseunedirectamentealcomplejoenzima‐sustratoperonoalaenzimalibre,porloquelaunióndelsustratoesindispensableparalaunióndelinhibidor.

Noproduc(vo

GráficadeMichaelis‐Mentenenpresenciadeuninhibidoracompe33vo

[S]

Vo

+ inhibidor

Control

Vmax /2

Km

Donde:

GráficadeLineweaver‐Burkenpresenciadeuninhibidoracompe33vo(incompe33vo)

y = m x + b

•Enaltas[S],Voesaprox.Vmax/α’.•PorlotantoesteinhibidordisminuyeVmax•LaKmaparentedisminuye.

VmaxdisminuyeKmdisminuye

Ejemplodeinhibidoracompe33vo:Inhibicióndelafosfatasaalcalinaporfenilalanina

•Catalizalaliberacióndefosfatoinorgánicoapar(rdeésteresdefosfato.•Involucradaenladeposicióndehidroxiapa(taencélulasosteoidesdurantelaformacióndehueso.•Esunmarcadorclínico:SuaumentopuedesercausadeenfermedadóseadePaget,hepa((s,etc.

Noolvidesladiferencia!Inhibidorcompe33vovs.nocompe33vo

ResumendelcambiodelosparámetrosdeMichaelis‐Mentenendiferentes3posdeinhibición

Resumendelefectodelosinhibidores