Inmovilizacin

Enzimtica

Actividad Enzimtica1. Resumen

Las enzimas son el medio por el cual los organismos canalizan el flujo de energa y materia. En la actualidad, como resultado de la acumulacin de datos procedentes de la dinmica de las protenas (estudios de movimiento conformacional) y del anlisis del hacinamiento macro molecular, la investigacin de enzimas est experimentando cambios revolucionarios. (URL)

Evaluar la cintica enzimtica de la invertasa durante el desarrollo de la reaccin qumica y su relacin con el tiempo, permite comprender el efecto de los factores que la pueden modificar la velocidad de reaccin. Principalmente para esta prctica, se evaluara el efecto de concentracin, a temperatura constante 37C, tras la aplicacin del GOD PAP, si se extraen volumen de muestras dentro de un determinado tiempo y se llevan a refrigeracin, la actividad disminuye debido a que el enzima, como cualquier otra protena, sufre procesos de desnaturalizacin y, por lo tanto, de inactivacin.

Pasado el periodo de incubacin se toman 1 ml en celdas de cuarzo determinndose la absorbancia a 510nm de la mezcla problema utilizando como blanco la mezcla de ensayo del blanco de sustrato. A partir de los valores de absorbancia y tiempo de incubacin se pueden determinar los valores de actividad enzimtica.2. Introduccin

Las enzimas son molculas de naturaleza proteica que actan como catalizadores en todas las reacciones del metabolismo. Las enzimas dems de ser consideradas como catalizadores, son capaces de reconocer sobre que sustancia van a actuar y tambin son capaces de provocar una transformacin (Sapag, M., et al)La invertasa es una enzima que convierte la sacarosa en glucosa y fructosa, esta enzima es procedente de cepas especiales de levadura. La invertasa es una B-fructofuranosidasa: el pH ptimo de inversin es de 4,5 y presenta una mxima actividad a una temperatura entre 50-60C. El azcar invertido, por el alto contenido de fructosa libre, es ms soluble en agua, presenta un poder edulcorante ms elevado (es ms dulce) que una disolucin de sacarosa de igual concentracin y una viscosidad mayor.Los mtodos de ensayo enzimtico son mtodos que miden las actividades enzimticas, mediante el cual se puede medir indirectamente la cantidad de enzima activa presente. Especficamente la actividad enzimtica expresa la cantidad de sustrato convertido o la cantidad de productos producidos, por unidad de tiempo, teniendo en cuenta el volumen de reaccin (Herrera, C., et al., 2003)

En los ensayosespectrofotomtricos puede seguirse el curso de una reaccin observando cmo cambia laluzabsorbida por la solucin en la que se est dando la reaccin. Para poder utilizar un ensayo de este tipo debe haber entre los sustratos o los productos alguno que absorba luz a unalongitud de ondadeterminada, y que sea la nica molcula de la mezcla de reaccin que lo hace a la misma; de esta forma, se puede observar el aumento o la disminucin de laabsorbanciaa dicha longitud de onda. 3. Mtodos y materiales utilizados

El mtodo utilizado fue anlisis cuantitativo por espectrofotometra, en donde se determina la actividad enzimtica aprovechando la absorcin de radiacin electromagntica en la zona del ultravioleta y visible del espectro de la muestra a analizar y se emplean para su ejecucin, los siguientes materiales: Agitadores de vidrio.

Agua destilada.

Balanza analtica.

Bao de termostato.

Beakers.

Celdas para espectrofotmetro. Cinta para rotular.

Erlenmeyers.

Esferas de la Enzima invertasa inmovilizada en alginato de calcio. Esferas de la Levadura inmovilizada en alginato de calcio. Esptula.

Espectrofotmetro.

Kit GOD PAP (Reactivo para la determinacin fotomtrica de glucosa)

Micropipeta.

Pipetas.

Plancha de calentamiento

Reloj.

Sacarosa

Toallas absorbentes.

Tubos de ensayo.

Vidrio de Reloj.La experimentacin se realiza con invertasa inmovilizada en alginato de calcio y levadura inmovilizada en alginato de calcio. A continuacin se describe cronolgicamente cada uno de los pasos realizados:Actividad enzimtica Invertasa Colocar en un Erlenmeyer 20mL de solucin de sacarosa al 30%.

Pesar 1 gramo de esferas de invertasa inmovilizada en alginato de calcio y agregarlas al Erlenmeyer.

Llevar el Erlenmeyer al bao termostadado graduado a 45C

Con ayuda de una pipeta tomar 2mL de la solucin del beaker en el tiempo 0min, y colocarlos en un tubo de ensayo en el refrigerador. Con ayuda de una pipeta tomar 2mL de la solucin del beaker en el tiempo 1min, y colocarlos en un tubo de ensayo debidamente marcado, colocar el tubo de ensayo en el refrigerador. Repetir este proceso para los tiempos 3min, 6min, 10min y 20 min. Al finalizar los 20 minutos y tener los 6 tubos de ensayo, retirarlos del refrigerador.

Tomar 100L del tubo de ensayo tiempo 0 y depositarlos en otro tubo de ensayo, agregarle 1mL de reactivo GOD PAP.

Colocar el tubo en el bao de agua termostato a 37C por 10 min.

Repetir este proceso para las muestras tiempo 1min, 3min, 6min, 10min y 20 min.

Leer las absorbancias de cada tubo a 510nm.

Actividad enzimtica Levadura Colocar en un Erlenmeyer 80mL de solucin de sacarosa al 30%.

Pesar 10 gramos de esferas de levadura inmovilizada en alginato de calcio y agregarlas al Beaker.

Llevar el Erlenmeyer al bao termostatado graduado a 37C por 2 horas.

Transcurrido el tiempo observar las burbujas generadas.

Grupo de Imgenes N. 01 Resumen del Procedimiento.4. Resultados

Imagen N. 01. Hidrolisis de la sacarosa.Actividad enzimtica invertasaTiempo (min)Absorbancia

Blanco0

0 min0,034

1 min0,308

3 min0,547

6 min0,601

10 min0,701

20 min0,867

Tabla N. 01 Absorbancia a tiempos determinados.Actividad LevaduraTranscurridas las 2 horas de reaccin se observa la aparicin de unas pocas y pequeas burbujas.La composicin del reactivo enzimtico es la siguiente:

Buffer fosfato pH 7.075mM

Glucosa oxidasa (Aspergillus Nger)15000U/I

Peroxidasa2000 U/I

4-Aminoantipirina0.5 mM

Acido p-Hidroxibenzoico10mM

Azida sdica0.1 g/dL

Estabilizantes y preservantes no reactivosc.s.

Tabla N. 02 Composicin del GOD PAP

Grafica N. 01. Seguimiento a la Produccin de glucosa.Para cuantificar la glucosa producida en cada punto se emplea la relacin proporcionada por el docente que dice que 0,1mg/mL de glucosa presentan un dato de absorbancia de 0,322, teniendo en cuenta esta relacin se haya la concentracin de glucosa para cada punto.

AbsorbanciaConcentracin glucosa

(mg/mL)

0.0340,010

0.3080,095

0.5470,169

0.6010,186

0.7010,217

0.8670,269

Tabla N. 03 Concentracin de glucosa.

Grafica N. 02. Concentracin de glucosa vs absorbancia5. Discusin de los resultadosEn esta prctica se determin la actividad enzimtica de la invertasa, mediante el seguimiento a la reaccin de hidrolisis de la sacarosa. Inicialmente se puso a reaccionar la invertasa inmovilizada en una matriz de alginato de calcio, en una solucin de sacarosa a 45C, temperatura que es propicia para que la invertasa pueda catalizar la reaccin y la sacarosa se hidrolice y produzca glucosa y fructosa.

La reaccin observada en la Imagen N. 01 Esta reaccin fue frenada por choque trmico en diferentes momentos (Tiempo 0min, 1min, 3min, 6min, 10min y 20 min), posteriormente se emple el kid reactivo GOD PAP para lograr cuantificar por mtodos espectrofotomtricos la cantidad de glucosa producida en la reaccin de hidrolisis de sacarosa.Este kid reactivo GOD PAP se basa en que la glucosa reacciona con el reactivo enzimtico que contiene una mezcla de las enzimas Glucosa Oxidasa (GOD) y Peroxidasa (POD). En la primera etapa la Glucosa es oxidada a Ac. Glucnico por la accin de la enzima GOD, liberndose como producto H2O2, el cual en una reaccin mediada por la enzima POD, reacciona con el Ac. p-Hidroxibenzoico y 4- Aminoantipirina producindose un compuesto coloreado con un mximo de absorcin a 505 nm., en cantidad proporcional a la cantidad de Glucosa presente en la muestra (Grupo Mexlab).

Con los resultados obtenidos se realiza la grfica 1 que representa el seguimiento de la reaccin de hidrolisis de sacarosa mediante la produccin de glucosa. de estos resultados es posible obtener la grfica 2.

En la grfica 1 se observa el aumento en la absorbancia en los diferentes tiempos demuestra que la enzima invertasa est ejerciendo su funcin como catalizador de la hidrolisis de la sacarosa con la produccin de glucosa y fructosa, y a mayor cantidad de glucosa producida la absorbancia y por consiguiente la concentracin de glucosa en la muestra ser mayor.

Adicionalmente se observa que la grfica obtenida es de tipo exponencial, en donde en la primera fase la actividad de la enzima crece rpidamente, luego se observa una tendencia estacionaria, en donde la actividad enzimtica disminuye levemente.Los resultados muestran que la inmovilizacin de la enzima invertasa en alginato de calcio, no frena la actividad enzimtica de la misma, sin embargo no es posible establecer si el proceso de inmovilizacin afecta o no la actividad enzimtica, es decir si la disminuye, ya que para esto sera necesario determinar la actividad enzimtica de esta enzima sin inmovilizar y compararla con la actividad de la enzima inmovilizada.Sin embargo en otras investigaciones (Segura, E., et al) en las cuales realizaron la comparacin de la actividad enzimtica de la invertasa sin inmovilizar, comparada con la invertasa inmovilizada, reportan que la enzima inmovilizada es ms estable, ya que mantiene su actividad hasta por ms de dos meses almacenada a -4C, despus de este periodo de tiempo empieza a disminuir drsticamente la actividad de la invertasa. Adicionalmente reportan que al ser la invertasa inmovilizada resiste condiciones de pH y temperatura ms altos que la invertasa en su forma libre.6. ConclusionesEn el presente artculo se evidencian de manera clara la actividad enzimtica de enzimas y levaduras en una matriz de alginato de calcio, mediante el seguimiento a la reaccin de hidrolisis de la sacarosa, demostrando la relacin de la concentracin contra la absorbancia.

Tomando como base la experimentacin realizada, clculos, resultados, discusin y anlisis, y al ser comparados con la teora existente en varias fuentes, se determina que:

-La metodologa utilizada de anlisis cuantitativo por espectrofotometra para determinar la actividad enzimtica de la invertasa fue acertado ya que permiti observar y cuantificar de manera clara y sencilla el transcurso de la reaccin.

-La cuantificacin de glucosa por espectrofotometra se realiz a una longitud de onda de 510nm.

-El uso del kid reactivo GOD PAP fue efectivo, rpido y muy til en la determinacin fotomtrica de glucosa en las muestras analizar.

-La inmovilizacin de la enzima invertasa en alginato de calcio, no frena la actividad enzimtica de la misma, sin embargo a travs de los resultados obtenidos no es posible establecer si el proceso de inmovilizacin afecta de alguna forma la actividad enzimtica de la invertasa.7. Referencias(i) Manual del laboratorio

Florez, Y., (2014). Gua componente prctico: 211619 Biotecnologa Alimentaria. Bogot: UNAD.

(iii) Sitios webs Herrera, C., Bolaos, N., Lutz, G. Qumica de alimentos. Manual de laboratorio. Editorial de la Universidad de Costa Rica. 2003. Recuperado de https://books.google.com.co/books?id=8VpJ8foyDiIC&pg=PA46&dq=invertasa&hl=es-419&sa=X&ei=b-xbVY3oEIjCggSc1oA4&ved=0CCgQ6AEwAw#v=onepage&q=invertasa&f=false Grupo Mexlab. Glucosa (GOD PAP) Reactivo lquido para la determinacin fotomtrica de glucosa o suero en plasma y otros fluidos biolgicos. Recuperado de http://www.grupomexlab.com/quimica/pdf/8001504.pdf Segura, E., Mendoza, D., Valdes, M., Llina, A. Evaluacion de la actividad de invertasa libre e inmovilizada en cera de Candelilla. Universidad Autonoma de Coahuila. 2010. Recuperado de http://www.smbb.com.mx/congresos%20smbb/queretaro11/TRABAJOS/trabajos/I/carteles/CI-16.pdf3