DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE ...
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1 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE Cellulosimicrobium funkei Y Pseudomonas aeruginosa FRENTE A CELULOSA Y ESTIRENO MORENO-DIAZ, W. J AUTOR FRANCO-ANAYA, P. A. DIRECTORA DEL PROYECTO. Bact. Esp. ASEGURAMIENTO DE LA CALIDAD MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS MSc. ADMINISTRACIÓN TIRADO-BALLESTAS, I. P CODIRECTORA. Bact. Esp. MICROBIOLOGÍA CLÍNICA, MSc. CIENCIAS AMBIENTALES. PhD (c). TOXICOLOGÍA AMBIENTAL GRUPO DE INVESTIGACION MICROBIOLOGIA Y AMBIENTE UNIVERSIDAD DE SAN BUENAVENTURA FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD PROGRAMA DE BACTERIOLOGIA CARTAGENA DE INDIAS D. T Y C 2018
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DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE Cellulosimicrobium funkei
Y Pseudomonas aeruginosa FRENTE A CELULOSA Y ESTIRENO
MORENO-DIAZ, W. J
AUTOR
FRANCO-ANAYA, P. A.
DIRECTORA DEL PROYECTO. Bact. Esp. ASEGURAMIENTO DE LA
CALIDAD MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS MSc. ADMINISTRACIÓN
TIRADO-BALLESTAS, I. P
CODIRECTORA. Bact. Esp. MICROBIOLOGÍA CLÍNICA, MSc. CIENCIAS
AMBIENTALES. PhD (c). TOXICOLOGÍA AMBIENTAL
GRUPO DE INVESTIGACION MICROBIOLOGIA Y AMBIENTE
UNIVERSIDAD DE SAN BUENAVENTURA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
PROGRAMA DE BACTERIOLOGIA
CARTAGENA DE INDIAS D. T Y C
2018
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AGRADECIMIENTOS
A la Infinita Misericordia de Dios, que permitió cada acto para construir este sueño, y
suscito en el corazón de todas las personas que con un alma llena de caridad
ayudaron a cumplirlo.
A mi familia, compañía inigualable de mi madre Adriana Díaz, apoyo en la distancia de
mi padre, Wilson Moreno, la dulce intercesión de mi abuelita Enith Hernández (q.e.p.d),
a la motivación y apoyo que me regaló mi abuelito Héctor Díaz, a los buenos deseos
de mi prima Brenda Díaz.
A mi profesora y gran amiga, la Doctora Irina Tirado Ballestas, por creer en mí desde el
principio – aún más que yo misma, por enseñarme, impulsarme y apoyarme en seguir
mis sueños por más complicados que sean, por exhortarme en que vale la pena ser
diferente.
A mi mejor amiga Luisa Vergara, por sostenerme con su oración, ayudar mi alma y aún
sin entenderme se motivaba a estar ahí, estando en todo este proceso interesada en
mí. A quienes, con su oración, permitieron que no dejara de creer en las promesas de
Dios y seguir en esta lucha, en especial a la familia Vergara Cordoba, Kevin Buelvas,
Diana Acosta, Jhoan López, Rafael Buelvas, Cristian Giraldo, Lilian Ortiz y demás
hermanitos del movimiento Lazos de Amor Mariano.
A mi mejor amigo de la carrera José Mario Montiel, por ser mi ángel en la redacción de
la propuesta, en auxiliarme, apoyarme en mis crisis, por presentarme a la familia
Marriaga Martínez, en especial la señora “chichi” y el Señor Omar. A quienes
estuvieron en los momentos más difíciles, Ruth Gonzales, Daniel García, Nicolle
Arrieta, Anayerlis Roa, los hermanos Karen y Álvaro Herrera Deavila.
A todos quienes durante la ejecución me guiaron con tanta caridad, en especial a
Fredys Sánchez Hoyos, por ser mi ángel, pues con su ternura me ayudó en este
complicado proceso, me sostuvo y acompañó en los momentos de gran dificultad,
además de impulsarme a seguir adelante, centrando mis sueños y con sabiduría
buscar las vías para cumplirlos. A la enorme acogida que tuvo Audreis Gonzales, pues
siempre fue una amiga que me suscitaba sonrisas y brindaba todo de sí para
ayudarme. Al apoyo e interés de, Katerin Fuentes, Diana Barraza, Maideleine Lozano,
Adolfo Olmos por estar en mis momentos difíciles y dulces alegrías.
Al Grupo de Química Ambiental y computacional y Grupo de Investigación Química de
Medicamentos de la Universidad de Cartagena, por acrecentar mi amor y experiencia
por la investigación.
A todas esas personitas que fueron el rostro de Amor de Dios en las pequeñas y
sencillas cosas que me permitieron llegar hasta aquí.
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCION ................................................................................................. 10
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA................................................................. 12
3. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................. 15
4. OBJETIVOS ........................................................................................................ 18
4.1. OBJETIVO GENERAL ....................................................................... 18
4.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS .............................................................. 18
5. MARCO REFERENCIAL ..................................................................................... 19
5.1. MARCO CONCEPTUAL .................................................................... 19
5.2. MARCO TEÓRICO ............................................................................ 20
5.2.1. Antecedentes ......................................................................... 20
5.2.2. Contexto Teórico .................................................................... 21
5.3. MARCO LEGAL ................................................................................. 36
5.4. CONSIDERACIONES ETICAS .......................................................... 36
6. ACERCAMIENTO METODOLOGICO .................................................................... 38
6.1. TIPO DE ESTUDIO ............................................................................ 38
6.2. POBLACIÓN ...................................................................................... 38
6.3. ETAPAS ............................................................................................. 38
Objetivo Específico 1. ................................................................................ 38
Objetivo Específico 2. ................................................................................ 40
6.4. OPERACIONALIZACION DE VARIABLES ........................................ 44
7. RESULTADOS .................................................................................................... 45
7.1 Objetivo especifico 1. ......................................................................... 45
7.1.1 Caracterización de cepas de estudio. ....................................... 45
7.2 objetivo especifico 2: .......................................................................... 46
7.2.1 Obtención de los sustratos y verificación de la calidad a utilizar
para los experimentos. .............................................................................. 46
7.2.2 Verificación del aumento de la biomasa bajo condiciones
óptimas de crecimiento bacteriano ............................................................ 46
7.2.3 Ensayo de degradación de celulosa .......................................... 47
7.2.4 Ensayo de degradación de estireno .......................................... 51
8. DISCUSIÓN ........................................................................................................ 58
4
9. CONCLUSIONES ................................................................................................ 64
10. LIMITACIONES .............................................................................................. 65
11. RECOMENDACIONES ................................................................................... 65
12. ADMNISTRACIÓN DEL PROYECTO ............................................................. 66
12.1. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES ................................................ 66
12.2 PRESUPUESTO GENERAL .............................................................. 67
13. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ............................................................... 71
14. ANEXOS .............................................................................................................. 81
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Porcentaje de compuestos químicos del papel…………..…………...22
Tabla 2. Tipos de tinta y sus principales usos………………..…………...….......23
Tabla 3. Taxonomía de C. funkei…………………………………..………..…......30
Tabla 4. Características Bioquímicas y de resistencia del C. funkei……..…....32
Tabla 5. Taxonomía Y Clasificación molecular del género Pseudomonas spp...34
Tabla 7. Perfil caracterización morfológica para las cepas en estudio…….…..45
Tabla 8. Curva de Calibración de Estireno mediante espectrofotometría UV....46
Tabla 9. Promedio de DO Biomasa de C. funkei………………………………….48
Tabla 10. Promedio de DO Biomasa de C. funkei/ P.aeruginosa……………….49
Tabla 11 Concentraciones de patrón de glucosa para curva de calibración……50
Tabla 12. Resultados ensayo de degradación de celulosa……………………....50
Tabla 13. Promedio de Crecimiento en Estireno por horas…………………….52
Tabla 14. Concentración de Estireno por horas en P. aeruginosa…………….53
Tabla 15. Concentración de Estireno por horas en C. funkei………………….55
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LISTA DE FIGURAS
Fig. 1. Esquematización sobre la composición de la pared celular vegetal….....21
Fig. 2. Mecanismo de degradación de celulosa………………………..……........28
Fig. 3. Oxidación de la cadena lateral del estireno……………………………....27
Fig. 4. Curva de Calibración de Estireno mediante espectrofotometría UV…….46
Fig. 5. Verificación del aumento de la Biomasa en Caldo LB……………………47
Fig. 6. Crecimiento de C. funkei frente a celulosa en diferentes variaciones de
pH……………………………………………………………………………………...48
Fig.7. Crecimiento de inoculo mixto frente a celulosa en diferentes variaciones
de pH…….…………………………………………………………………………….49
Fig. 8. Curva de Calibración para identificación de azucares reductores……..50
Fig. 9. Concentración de glucosa en montajes…………………………..……….51
Fig. 10. Crecimiento en estireno……………………………………………….…..52
Fig. 11. Porcentajes de Degradación de estireno por P. aeruginosa……………53
Fig. 12. Degradación de estireno por P. aeruginosa conforme al tiempo……...54
Fig. 13. Porcentajes de Degradación de estireno por C. funkei………..………55
Fig. 14. Degradación de estireno por C. funkei conforme al tiempo…………....55
Fig. 15. Porcentajes de Degradación de estireno en inoculo mixto…………….56
Fig.16. Degradación de estireno por C. funkei y P. aeruginosa conforme al
tiempo………………………………………………………………….……..……….56
Fig. 17. Porcentaje de Hidrolisis de Celulosa……………………………………..59
RESUMEN
El papel es uno de los productos más utilizados por el ser humano, esta necesidad ha
causado que al terminar su vida útil tenga una disposición final inadecuada,
convirtiéndose en uno de los principales componentes de los botaderos. Como solución
a esto se ha propuesto el reciclaje, que a pesar de ser una medida remediadora, su
volumen final, ocasiona desequilibrios ambientales debido al uso de sustancias
químicas que son peligrosas no sola al entorno, sino al ser humano. Para ello se
propone el uso de sustancias naturales que permiten esto de manera más eficiente,
para reemplazar los tensoactivos y aditivos sintéticos utilizados en la industria del
reciclaje del papel. La biotecnología destaca las enzimas provenientes de
microorganismos con capacidad de degradar compuestos complejos y persistentes,
principalmente el estireno y la celulosa contenidos en estos residuos. Por ende, este
trabajo tiene como objetivo determinar la actividad enzimática de Cellulosimicrobium
funkei y Pseudomonas aeruginosa frente a celulosa y estireno comunes en el papel de
desecho, estos microorganismos han reportado importante actividad degradadora de
diferentes xenobióticos, principalmente petroquimicos y papel. Fueron realizados
ensayos experimentales de degradación, que mediante la exposición a concentraciones
conocidas del analito, permitieron transformar estas macromoléculas en compuestos
más sencillos e inocuos, de ellos, se obtuvo una hidrolisis máxima de celulosa de 181,2
% y reducción de estireno en un 55,70 %, datos obtenidos del cultivo mixto, con base
en esto se concluye que dichos microorganismos poseen la capacidad de degradar
estos productos de desecho preponderantes en el papel.
Palabras clave: Ensayo enzimático, Biodegradación, Celulosa, Estireno, (MeSH).
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GLOSARIO
ANALITO: aquella sustancia (molécula o compuesto) que es sometida a los ensayos
experimentales, y posteriormente análisis cuantitativo de las mismas.
BIOACUMULACION: proceso por el cual de manera consecutiva y magnificada se da
la acumulación de xenobióticos en los diferentes organismos de las diversas cadenas
tróficas, incluyendo dentro de estas a los seres humanos.
BIOTECNOLOGIA: disciplina donde se utilizan organismos vivos, y con ellos sus
procesos biológicos, para la resolución de problemáticas comunitarias, mediante la
acción de diversas áreas de manera interdisciplinaria.
BLANQUEAMIENTO: mecanismo mediante el cual, se procede a eliminar los
compuestos naturales o químicos que le aportan coloración a la fibra de papel y que
restan calidad al producto terminado.
DEGRADACION: proceso químico mediante el cual se descompone moléculas
complejas a otras más sencillas e inocuas.
DESTINTADO: proceso generalmente químico que se lleva a cabo para eliminar los
residuos de tintas adheridos a la fibra de papel luego de su vida útil.
ENZIMAS: moléculas, generalmente proteínas, que ayudan a catalizar los procesos
químicos, es decir potencian las reacciones de tal manera que mejora su velocidad y
liberación de energía.
ENSAYO: prueba de laboratorio en la cual, de manera experimental, se lleva a cabo la
comprobación de una hipótesis.
HIDROCARBUROS: compuestos químicos ricos en carbonos e hidrógenos, que,
dependiendo de su complejidad y los enlaces presentes, tienen la capacidad de formar
sustancias molecularmente estables y de difícil degradación e inactivación en el medio.
INOCUO: sustancia, producto que no presenta un peligro potencial, ni a corto, ni a largo
plazo para el individuo, ni la comunidad.
LODOS: aguas residuales resultantes del proceso de reciclaje tradicional del papel, se
caracterizan por su alto contenido de compuestos químicos (especialmente
hidrocarburos) potencialmente peligrosos para el medio ambiente y la comunidad.
METABOLISMO: conjunto de reacciones químicas de catabolismo y anabolismo
(creación y degradación, respectivamente) que se dan dentro de un ser vivo para la
manutención de su homeostasis (equilibrio) vital.
MONOMERO: molécula de menos tamaño y complejidad que constituye conjuntos de
macromoléculas (polímeros).
PASTA: sustancia que se presenta cuando el papel virgen o utilizado ha sido tratado e
hidratado, y que se caracteriza por su consistencia inestable y maleable. Es una fase
intermedia en los procesos de fabricación y reciclado del papel.
POLIMEROS: sustancias de alto peso molecular, que se caracterizan por su gran
complejidad estructural, formadas mayoritariamente por monómeros.
SUSTRATO: compuesto químico que va a ser sometido a transformación enzimática.
TINTA: sustancia pigmentada que se utiliza con la finalidad de recrear imágenes y
textos sobre el papel, que se impregna en las fibras del mismo.
XENOBIOTICO: compuestos químicos producidos humanamente, que, siendo externos
a los procesos biológicos normales, presentan un peligro potencial para los organismos
y su entorno.
XEROGRAFIA: tipo de tinta que mediante el uso de tóner, impregna los pigmentos en
el papel mediante una luz láser, que adhiriere estructuralmente los rastros de la tinta a
la fibra.
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1. INTRODUCCION
La industria del papel no es sólo un punto importante en la economía de los países que
generan este material, sino también en el desarrollo educativo, administrativo, comercial
y gubernamental a nivel global. Este material ha sido ampliamente utilizado, desde la
fabricación de billetes, hasta la generación de recibos en transacciones bancarias o
compra de bienes y servicios, pasando por la producción de materiales impresos de alto
impacto como revistas, cuadernos, libros, entre otros. La producción mundial de papel
llega hasta aproximadamente 400 millones de toneladas en 2012 (1). La cantidad de
material vegetal destinado a esta producción es bastante alta y se han utilizado árboles
provenientes tanto de bosques de coníferas como de bosques secos tropicales,
impactando de forma negativa en diferentes ecosistemas. Este hecho ha generado la
necesidad de alternativas que disminuyan el uso desmesurado de estos recursos. Se
estima una pérdida anual de 15 mil millones de árboles de 12 metros de altura para la
fabricación de papel, por lo que los problemas relacionados con pérdida de
biodiversidad, ecosistemas completos y alteraciones en diversos niveles de la cadena
trófica son evidentes (2, 3, 4). Es por esto que se han planteado diversas soluciones
para mitigar el impacto ambiental de la industria del papel. Entre estas, resalta el
reciclaje del material desechado. Sin embargo, en el proceso de reciclaje, destintado o
blanqueo de las fibras, tradicionalmente, es realizado con productos químicos que son
nocivos tanto para el medio ambiente como para las personas que los manipulan y
realizan este proceso (5).
Para disminuir el uso de las sustancias químicas en el momento del blanqueamiento del
papel en la producción o reciclaje del mismo se han investigado alternativas que
además, ayuden a obtener una materia prima de mayor calidad. La biotecnología ha
brindado algunas alternativas para la reducción de estos contaminantes, entre las
cuales destaca la utilización de enzimas degradadoras de los componentes del papel y
la tinta, y la conversión de estos compuestos en subproductos menos persistentes en el
medio ambiente, reduciendo de forma significativa su potencial contaminante (5).
En este sentido, se ha demostrado la gran capacidad degradadora que poseen ciertas
enzimas en el destintado y degradación del papel, entre estas resaltan: celulasas,
hemicelulasas, xilanasas, amilasas, lipasas y lacasas (6).Estudios realizados por
Llenque Diaz y col. (6) demuestran que muchas enzimas celulíticas pueden ser
11
obtenidas a partir de diferentes microorganismos, como bacterias y hongos. Entre los
microorganismos más importantes y utilizados se encuentran los hongos filamentosos
del género Trichoderma spp. y Aspergillus spp, considerados productores de celulasas,
y bacterias con capacidad degradativa de polímeros como Cellulosimicrobium spp. y
Clostridium cellulolyticum, puesto que poseen un complejo enzimático conocido como
celulosoma, capaz de degradar de forma eficiente dicho material (7-10).En cuanto a la
remoción de la tinta del papel, este proceso resulta ser mucho más complejo por la
composición de la misma. En un estudio realizado por Mooney y O’Connor (11) se
demostró la existencia de microorganismos con capacidad de crecer en presencia de
estireno, molécula monomérica, base estructural del principal componente de las tintas,
además de utilizar dicha molécula como fuente única de alimentación, demostrando con
ello la capacidad de metabolizar y por ende, degradar al polímero, entre ellas,
Xanthobacter, P. fluorescens y Corynebacterium sp.
Por otra parte, son escasos los estudios que permitan conocer si existen en el país
microorganismos con capacidad degradativa de sustancias poliméricas y
estructuralmente complejas como la celulosa y componentes mayoritarios de la tinta
como el poliestireno, por lo tanto, se crea la necesidad de desarrollar ensayos que
permitan dar inicio al uso de microorganismos para la degradación de dichas moléculas.
De esta forma, se dará un aporte significativo a los procesos biotecnológicos que tienen
como base la tecnología verde, permitiendo tener a la mano herramientas amigables
con el medio ambiente y posibilite continuar con procesos químicos complejos como la
mitigación de emisiones a la atmósfera de sustancias nocivas utilizadas en el reciclaje
del papel.
El presente trabajo tuvo como objetivo determinar la actividad enzimática de
Cellulosimicrobium funkei y Pseudomonas aeruginosa frente a celulosa y estireno. Estas
dos sustancias son dianas concretas en el proceso de desintegración del papel y
blanqueamiento del mismo, respectivamente. En adición, las sustancias utilizadas en el
proceso de degradación de las mismas son altamente nocivas por su naturaleza
oxidante, recalcitrante y persistente. Al comprobar la posible actividad degradativa de
moléculas de estireno y desdoblamiento eficiente de celulosa utilizando
microorganismos autóctonos de la región caribe colombiana, se dará inicio al posible
uso de las mismas en el proceso de reciclaje de papel en el país, aportando además
información pertinente sobre la utilización de enzimas bacterianas en el proceso de
recuperación del material vegetal, aumentando con ello el valor comercial de dichos
productos.
12
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
En la actualidad, la generación de residuos sólidos es un problema global, relacionado
directamente con la mala disposición final de los mismos, muestra de ello se aprecia en
el reporte del Banco Mundial en su estudio “What a waste”, publicado en el 2012, donde
se reporta una producción de 1.3 billones de toneladas de desecho, y tiene expectativa
de quedar una producción de 2.2 billones para el año 2025 (12).
A nivel de América Latina, han sido realizadas diversas comparaciones entre la
disposición final de residuos sólidos en las ciudades capitales que permiten discernir
sobre lo que se espera a nivel de generación de residuos a nivel internacional,
encontrando que México, cuya capital, Ciudad de México, se ubica en primer lugar, con
una producción total de 12000 Ton/día, lo cual resulta coherente con su alta densidad
poblacional (8720916 Hab), seguido de países como Perú (Lima) y Chile (Santiago de
Chile), con producciones de 8938.5 Ton/día y 7100 Ton/día, respectivamente.
Colombia no es ajena a este contexto, generando un promedio de 26.6 Ton/día de
residuos sólidos, los cuales en el último informe de “La disposición final de residuos
sólidos” para el año 2015, examina e identifica que los principales lugares en el país que
encabezando en producción de desechos, Bogotá, seguido por el departamento de
Antioquia, y aunque Bolívar, ocupa el tercer lugar, es el departamento con mayor índice
de Toneladas por día, se encuentra con una cantidad total de 1248.84 Ton/día (13,14).
En el contexto local, la ciudad de Cartagena de Indias fue analizada respecto al tema a
través del informe Residuos Sólidos y Espacio Público en Cartagena, resaltando al papel
como residuo, tanto para estratos medios como altos (4-5), los cuales generan hasta
56.4 Kg/día, y los estratos bajos (1-2) generan hasta 70.5 Kg (15). Muestra de que, los
desechos de la industria del papel, priman como componentes de las basuras del
entorno.
En cuanto a la generación de residuos de la industria papelera, es un hecho comprobado
que los líderes en la generación de este tipo de desecho son los sitios de impresión
masiva de documentos. Entre ellos encabezan: la academia (instituciones educativas),
oficinas y administrativos. Es un hecho importante que la tecnología de sistemas y
cómputo, ha permitido que a través de los medios virtuales se lleven a cabo la mayoría
de actividades, pero, como se evidencia en el informe de Cartagena como Vamos (15),
sigue estando en aumento la cantidad de desechos físicos entre los que principalmente
destaca el papel. Este material tiene muy poca vida útil, por lo que los residuos
generados son alarmantes. Sólo en Estados Unidos, ha habido un aumento del 25%
anual en el uso de papel, lo que permite extrapolarizar un amento a nivel mundial (5).
13
De acuerdo con esto, se ha dado como alternativa el reciclaje del papel. Del total
generado, aproximadamente el 60% del mismo es destinado a este fin (16). Dicho
porcentaje se ha acrecentado en los últimos años, y lo evidencian estudios tanto
internacionales como nacionales, como el realizado por Saez y Col. (13), quienes
exponen que Colombia es el país con mayor tasa de reciclaje de papel y cartón a nivel
de Latinoamérica, donde, se dan 57 Toneladas recicladas por 100 producidas. Al
contexto nacional, la Alcaldía Mayor de Bogotá, en su documento “Guía para la gestión
y el manejo integral de residuos. Industria de Litografía e impresión” afirma que en la
ciudad de Bogotá el reutilizamiento y reciclaje son los principales sitios donde terminan
los desechos de estas áreas (17).
Dentro del proceso de reciclaje se utilizan diversas técnicas para el destintado del
producto de desecho, especialmente la tinta de origen xerográfico es decir aquellas
tintas laser que son utilizadas en impresiones masivas (oficinas) y en fotocopiadoras
(18). Estas poseen mayor complejidad de remoción debido a su complejidad, puesto
que son tintas hechas a bases de sustancias poliméricas, que en conjunto a los aditivos
agregados derivan a las vertientes mediante lodos, que se hacen potencialmente
tóxicos, ya que tienen la capacidad de bioacumularse e incluso biomagnificarse(19).
Toda esta problemática ambiental se confirma con resultados de investigaciones como
lo expone Suzuki y col. (20) en la cual fueron detectados hidrocarburos aromáticos
policíclicos (HAPs) en efluentes de las industrias de reciclaje del papel, reportando
presencia de tres isómeros del naftaleno en sedimentos en seco: monoisobutilnaftaleno,
diisobutilnaftaleno y triisobutilnalfatleno en concentraciones de < 0.86 – 8.6, < 1.1 - 4400
y < 0-83 -500 ng/g, respectivamente (20). Este tipo de químicos resultan derivados del
componente mayoritario de la tinta xerográfica (Tóner), conocido como poliéster, el cual
se encuentra en un 75-95% (21), dicha sustancia está compuesta de monómeros de
estireno, que impactan de forma crítica la salud humana y medioambiental (22), puesto
que la exposición a los mismos en las concentraciones antes reportadas provocan
intoxicaciones agudas, manifestadas como alteraciones comportamentales tales como
psicosis aguda, trastornos de la conciencia, encefalopatía convulsiva, coma, trastornos
cerebelosos (ataxia, rigidez, neuropatía periférica motora, sensorial o mixta, por daño
de los axones neuronales). Asimismo, la exposición crónica al estireno se relaciona con
daño a nivel del ADN, siendo mutagénico tipo 1. Este tipo de exposición tiene mayor
incidencia en los trabajadores que se exponen directamente a este xenobiótico,
desencadenando el aumento de patologías como linfomas, leucemias y cáncer de
14
hígado y pulmón. La toxicidad reproductiva se expresa en el incremento de abortos
espontáneos y defectos del tubo neural de hijos de trabajadores (22).
Lo antes descrito genera entonces la siguiente pregunta de investigación: ¿Son
capaces las cepas de Cellulosimicrobium funkei y Pseudomonas aeruginosa
aisladas de suelos de la costa caribe colombiano de degradar celulosa y estireno
de forma eficiente?
15
3. JUSTIFICACIÓN
El gobierno de Colombia en el plan decenal de salud pública, plantea iniciativas sobre
el cuidado de la salud en un entorno ambiental óptimo, con la menor cantidad posible
de contaminantes. Para lograr esta iniciativa, son requeridas estrategias encaminadas
a la reutilización, reciclaje y buena disposición final de los desechos sólidos y similares
(23).
Tanto los organismos gubernamentales como las entidades de vigilancia y control
ambiental, presentan en sus documentos oficiales, mecanismos que permiten la
disminución en la mala disposición de desechos bien sea industriales como domésticos,
el cual se ve reflejado en las normativas que rigen cada una de estas entidades,
ministerio de salud y protección en el decreto 351 del 30 de febrero de 2014, el
ministerio de ambiente, vivienda y desarrollo territorial en el decreto 4741 del 31 de
diciembre de 2005 (24,25).
Entre los residuos sólidos generados de forma industrial, resaltan los relacionados con
la industria de reciclaje tradicional del papel. Dentro de los desechos de estas empresas,
se encuentran diferentes compuestos cuyo componente principal es cloro, resaltando el
dióxido de cloro (ClO2), hipoclorito sódico (NaOCl), y cloro (Cl2), las cuales son
sustancias usadas con mayor frecuencia en el blanqueamiento del papel (1). Estos
compuestos se relacionan tanto con la degradación de celulosa, como con la eliminación
de las tintas presentes en el papel usado. Es importante iniciar procesos más amigables
con el medio ambiente, en el cual se utilice lo menos posible, o incluso se eliminen los
compuestos capaces de degradar celulosa y estireno. Los procesos biotecnológicos que
tratan de mejorar el reciclaje del papel se basan principalmente en el uso de proteínas
microbiológicas como las enzimas, que pueden ser utilizadas como sustrato que genere
igual o mayor eficiencia en el proceso de reciclaje del papel al compararse con los
químicos usados en la actualidad. En adición, el proceso tiene variables controladas en
reactores biológicos que garantizarían la inocuidad del proceso, logrando con ello
objetivos trazados mundialmente como son las tecnologías verdes, las cuales son
fundamentales y recomendadas en tratados ambientales como el Kyoto, entre otros
(26).
En Colombia se está partiendo de normativas tales como el Acuerdo 71 de 2010
Concejo de Bogotá D.C, que a nivel distrital impulsa el proceso de aprovechamiento de
los residuos, ya que existen normas que buscan llevar a una adecuada gestión de los
16
residuos sólidos, pero no se enfocan en una adecuada y productiva utilización, a nivel
institucional, el Ministerio de Interior ha propuesto iniciativas como el plan de gestión
ambiental y el programa cero papel, hechos que se han visto reflejad en sus primeros
pasos en reportes como el Informe Nacional de Aprovechamiento publicado por la
Superintendencia de Servicios Públicos Domiciliarios, donde mencionan el papel como
el desecho más aprovechado (27-29). Por otro lado, el gobierno nacional también
expone que es necesario regular la cantidad de sustancias generadoras de olores
ofensivos, donde va a entrar el estireno y diferentes compuestos involucrados en la
industria de tinta y papel (30,31).
El posible uso de microorganismos en el proceso de reciclaje de papel además de ser
una alternativa amigable con el medio ambiente y eficiente por la producción enzimática
a gran escala, genera biomasa de forma exponencial si se mantienen las variables
fisicoquímicas óptimas para las cepas, lo cual garantiza la auto sostenibilidad del
proceso, la disponibilidad constante del catalizador biológico requerido para la
transformación del papel usado. Este punto cumple con los parámetros de desarrollo
sostenible, el cual es una meta que se quiere lograr en todos los procesos industriales
en la actualidad, por ejemplo Torrez Martínez y col. (32) con biorreactores de bipartición,
donde se han usado bacterias lácticas y realizando pruebas con E. coli o con
biorreactores usando consorcios microbianos para degradar hidrocarburos (33).
Continuando con la relevancia ambiental, en el contexto local se aprecia que Cartagena
de Indias no cuenta con empresas de reciclaje de papel, por lo que la gran cantidad de
desechos de esta naturaleza que se generan en la ciudad son enviados directamente al
relleno sanitario. Esto conlleva al uso innecesario del relleno con elementos totalmente
reciclables, aumentando los costos de mantenimiento y recolección de los desechos
sólidos urbanos. El tonelaje de desechos diarios podría disminuir de manera
considerable si se hace una buena separación en la fuente y se someten los papeles
desechados al proceso de reciclaje.
Además del impacto positivo que este proyecto presenta en materia ambiental, cabe
resaltar que el mismo es una propuesta emprendedora e innovadora, puesto que
brindaría el conocimiento teórico suficiente para dar valor agregado a la industria
recicladora con los aportes de la ciencia (34), esto va brindar a que el presente trabajo
tenga un alto grado de pertinencia, puesto que posiciona la biotecnología que inicia
desde la fases de laboratorio con un análisis experimental de la dinámica metabólica
17
bacteriana en fines de ser potencializado el conocimiento al área industrial con su
posible uso a gran escala.
Por otro lado, éste estudio sigue los lineamientos y filosofía de la Universidad San
Buenaventura seccional Cartagena, puesto que con la misma, se fomentará a los
estudiantes a buscar posibles soluciones a las problemáticas ambientales que nos
afectan directamente a todos. El beneficio de la comunidad y el medio ambiental
(incluyéndo flora y fauna) es parte de la filosofía franciscana de nuestra institución. En
adición, el Proyecto Educativo Bonaventuriano (PEB) nos enseña que la universidad
debe “Formar líderes capaces de afrontar los retos que surgen del fenómeno de la
globalización en sus distintas manifestaciones”, lo cual es demostrado con este tipo de
trabajos de investigación. Además, va de la mano con el grupo de investigación GIMA,
a su línea de investigación de biotecnología y procesos tecnológicos, puesto que se
busca una alternativa biotecnológica por medio del uso de microorganismos con
capacidad enzimática de degradar compuestos de difícil tratamiento en la degradación
del papel.
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4. OBJETIVOS
4.1. OBJETIVO GENERAL
Determinar la actividad enzimática de Cellulosimicrobium funkei y Pseudomonas
aeruginosa frente a celulosa y estireno.
4.2. OBJETIVOS ESPECIFICOS
Caracterizar morfológica, bioquímica y molecularmente las cepas
Cellulosimicrobium funkei y Pseudomonas aeruginosa provenientes del Banco de
Bacterias del Grupo de Química Ambiental y Computacional de la Universidad de
Cartagena.
Evaluar la capacidad degradativa de estireno y celulosa por parte de las cepas
Cellulosimicrobium funkei y Pseudomonas aeruginosa.
19
5. MARCO REFERENCIAL
5.1. MARCO CONCEPTUAL
Para la realización de este trabajo, es necesario tener en cuenta ciertos conceptos con
el fin de llevar a cabo un proceso de comprensión y análisis de lo expuesto, no solo
como referente teórico, sino también lo concerniente a ensayos experimentales y sus
posteriores resultados.
DEGRADACIÓN DE ANALITO: se puede hablar como degradación al conjunto de
transformaciones que afectan a un compuesto en su composición original y que
implican una alteración en sus propiedades y prestaciones iniciales (35), en este
contexto, transformación a compuestos más sencillos de los sustratos escogidos
(celulosa y estireno).
CELULOSA: este es el biopolímero más abundante en el medio ambiente, el cual
proviene principalmente de las plantas, específicamente en la corteza (madera) de los
árboles. Desde el punto de vista químico, está conformado por una estructura lineal,
que posee aproximadamente de 2000 a 14000 unidades de β-(1,4) glucosa, unidos
mediante puentes de hidrogeno. Al ser tan frecuente y de fácil obtención, es principal
materia prima para usos industriales, especialmente en la industria papelera (36,37).
ESTIRENO: también conocido como vinil benceno, es un monómero de hidrocarburo
obtenido a partir de etileno y el benceno, físicamente se observa como un líquido
incoloro, normalmente, cuyo olor varía del grado de concentración que se tenga. Se
usa industrialmente como componente del poliéster o poliestireno, el cual se utiliza
desde la producción de plásticos, hasta ser el componente mayoritario de la tinta
xerográfica (22, 38,39).
METABOLISMO ENZIMÁTICO: el metabolismo hace referencia a un conjunto de
reacciones químicas que se producen en las células para su supervivencia Entre ellas,
se dan procesos en los que intervienen las enzimas, que se conocen como catabolismo
y anabolismo, el primero de ellos enfocado a la creación de sustancias, y el segundo
hace referencia, a las reacciones degradativas, donde, el organismo va a utilizar
fuentes complejas para la obtención de nutrientes (40).
20
ENZIMAS DEGRADADORAS DE CELULOSA: este grupo de enzimas, se encuentran
las definidas como enzimas celulíticas, las celulasas, son un complejo de enzimas que
llevan a cabo el proceso de degradación de la celulosa a monosacáridos (5,41).
ENZIMAS DEGRADADORAS DE ESTIRENO: hace referencia a las enzimas
encargadas de degradar el estireno, principalmente a las oxigenasas, entre ellas
destacan las mono, di y lipooxigenasas, que tienen la capacidad de convertir el
monómero en compuesto más amigables con el medio ambiente (42).
5.2. MARCO TEÓRICO
5.2.1. Antecedentes
Para el presente trabajo, se tuvieron en cuenta varias investigaciones previas, las
cuales se han utilizado como guía para definir puntos clave para este proyecto, tales
como estado del arte para la metodología, los sustratos y la población a utilizar.
En los reportes internacionales, se toma como documentos de referencia, a nivel de
actividad celulolitica lo expuesto por Dhara ID, Bragradish DI, en la India y que lleva
como título “Biodeinking of old newspaper pulp using a cellulase-free xylanase
preparation of Aspergillus niger DX-23” (43), respecto a la actividad enzimática frente
a estireno, se apoya en lo expuesto por Mi So Park y col. titulado “Degradation of
styrene by a isolate Pseudomonas putida SN1” (44)
A nivel nacional, se tienen varios artículos de investigación, el primero de ellos titulado
“Caracterización de actinobacterias raras, degradadoras de lignocelulosa:
Demostración de actividad lacasas en dos aislado de Tsukamurella y
Cellulosimicrobium sp” publicado en julio de 2012 por Escudero E y col. (45), en este,
se va a conocer la capacidad celulítica de estas actinobacterias. Otras investigaciones
importantes, y bases de la metodología fueron los artículos titulados “Producción de
celulasas a partir del hongo Trichoderma sp y su aprovechamiento de la fibra prensada
de palma como medio de cultivo”, por Ramirez y Urrego (46) y “Seleccion de bacterias
con capacidad degradadora de hidrocarburos aisladas a partir de sedimentos del
caribe colombiano”, por Narvaez-Florez y col. (42).
Por último, como antecedente local, se toma una tesis publicada en 2002 por Pastrana-
Pacheco M, Zapateiro-Barrios G, titulada como “Destintado de la pulpa de papel
reciclaje de oficina y/o fotocopiadora a través de los procesos alcalino, neutro y
21
enzimático en la Universidad de San Buenaventura Cartagena” (47), con respecto a
esta tesis, es relevante reconocer, que previamente en la institución, se han llevado a
cabo trabajos de grado con los mismos fines, además que han tenido en cuenta los
mismos sustratos, he inclusive, el mismo mecanismo enzimático, con la sustancial
diferencia, que, las enzimas de este trabajo serán obtenidas a partir del metabolismo
de los microorganismos bacterianos.
En resumen, estas investigaciones han sido de gran ayuda, ya que al igual que el
presente trabajo, son ensayos experimentales, conjuntamente, en los artículos que se
utilizaron como antecedentes; internacional y nacional se trabajaron con población
microbiana similar, y que se va a utilizar en esta investigación, con la diferencia que se
usan métodos de medición de resultados distintos. El antecedente local lo tomamos
como referencia por la utilización de variables enzimáticas, y en diferencia de esta
investigación, utilizaron también variables químicas.
Algunos antecedentes, como el internacional y local, a pesar de ser del 2005 y 2002
respectivamente, se toman como investigaciones previas, por su gran valor teórico,
además que al realizar profundización en el tema, no se encontraron investigaciones
más recientes y con el mismo grado de pertinencia sobre este.
5.2.2. Contexto Teórico
Para llevar a cabo un proceso de investigación, es necesario dotarse de todos los
conocimientos concernientes al estado del arte del tema a tratar, encausar una
investigación profunda del tema principal, que para la investigación es el papel, cuyos
componentes son la celulosa y el estireno, se tienen en cuenta cualquier otro factor
que pueda intervenir en ella, por ende para el presente trabajo se ha realizado una
inmersión en temas tales como el reciclaje, porque a partir de allí es donde ha surgido
el uso de enzimas microbiológicas, como agentes importantes en la degradación de
estos compuestos.
5.2.2.1. Papel y tinta
El papel es uno de los productos industriales de mayor uso en la actualidad, que se ha
tomado todos los sectores de la población, y no solo abarca el área de la impresión y
escritura, también hace parte de los productos de embalaje, cartones e higiénicos. A
pesar de que el papel destinado a la impresión, denominado “papel de publicación”,
tiende a ser el segundo en producción industrial, destronado por el papel para el
22
recubrimiento del cartón, el papel de publicación es el que ejerce mayor impacto
ambiental, especialmente en la parte de la impresión, es decir, aquel momento de su
ciclo de vida donde se da el mayor uso por parte del usuario (49)
El papel, es proveniente de la corteza de los árboles, específicamente de la pulpa de
la madera, la cual es obtenida de árboles como eucalipto y pino, principalmente,
también hay otra variedad, siendo igualmente fuentes vegetales como el algodón, paja,
bagazo de caña e inclusive bambú. Estos componentes le van a brindar, luego de su
proceso de manufactura, una pasta de alta calidad, resistencia, con una capacidad de
absorción y fijar, aditivos y tintas sobre las mismas (1, 37,50 ,51).
A nivel molecular, por ende, va a ser rica en elementos complejos, que van a
componer la pared vegetal (Fig. 1), entre los cuales se van a encontrar polisacáridos,
como celulosa y hemicelulosa, y lignina, un polímero aromático. A estos dos últimos,
se les atribuye el soporte celular para la celulosa, que no solo está en mayor
concentración, sino que es de mayor complejidad degradativa en comparación a ellos.
También cabe resaltar que la lignina, es la responsable de la coloración café resultante
en el tratamiento de la fibra, al momento de la fabricación del papel, lo que según el
deseo del consumidor, se erradicara por el uso de químico o mediante enzimas (5).
Fig. 1 Esquematización sobre la composición de la pared celular vegetal. Tomado de
Carreño y col (37)
23
Se tiene que hacer la salvedad, que no únicamente la fibra del papel está hecha a base
de carbohidratos y lignina, se va a encontrar en ella también otros compuestos. El
primero grupo de ellos, en cantidades mínimas denominados extraíbles, son
principalmente de naturaleza lipídica, donde se puede encontrar alcanos, alcoholes
grasos, ácidos grasos, ácidos resínicos, esteroles, otros terpenoides, esteroles
conjugados (como ésteres y glucósidos), triglicéridos, ceras, fenoles, aceites
esenciales, oleorresinas, alcaloides y pigmentos colorantes. Un segundo grupo, en
concentraciones trazas, son los minerales y compuestos inorgánicos. En la tabla 1 se
puede apreciar sus porcentajes, según la materia prima utilizada.
Tabla 1. Porcentaje de compuestos químicos del papel. Adaptado de Teschke y
Demers (1)
Maderas
blandas
Maderas
duras
Paja Bambú Algodón
Carbohidratos
Alfa-celulosa 38-46 38-49 28-42 26-43 80-85
Hemicelulosa 23-31 20-40 23-38 15-26 n.d
Lignina 22-34 16-30 12-21 20-32 n.d.
Extraíbles 1-5 2-8 1-2 0.2-5 n.d.
Minerales y
otros
compuestos
inorgánicos
0.1 -7 0.1-11 3-20 1-10 0.8-2
Por su mayor biodisponibilidad, entre los diversos compuestos químicos que de la fibra
de madera que se pueden utilizar, se tiene en cuenta la celulosa, la cuales es un
biopolímero sumamente abundante en la naturaleza, se obtiene en primera instancia
de fuentes vegetales, principalmente madera de coníferas, o arboles sencillos como
bambú, lino y cáñamo, por otro lado se extrae también de cereales como trigo, el
centeno y el arroz; cañas, como el bagazo; e inclusive de otras partes de la planta, bien
sea corteza, semillas o tallos del algodón, el abacá y el henequén o sisa (1). Al ser
componente fundamental de plantas, podemos encontrarlo en los detritos de los
suelos, donde es usado como fuente de alimento de los microorganismos presentes
en ellos. Por otro lado, Sanz (52) reporta que hay bacterias con capacidad de sintetizar
celulosa, la cual, es mucho más pura, puesto que, no viene acompañada de
hemicelulosa, lignina, ni pectina.
24
Está compuesto por 300-15.000 unidades de D-glucosa, unidas linealmente mediante
enlaces ß-1-4 glucosídicos y estabilizadas mediante puentes de hidrogeno, lo que le
otorga a esta molécula una gran resistencia a la fermentación, pero que las enzimas
microbianas han tenido gran auge en estos procesos degradativos (6,53).
Antes de finalizar su ciclo de su vida, el papel no se mantiene inerte, al llegar al proceso
de impresión, genera su más grande transformación, por la adición de tintas, que son
utilizadas en elaboración de diversos productos, que van desde artículos publicitarios
(flayers, tarjetas de presentación, entre otros), documentos (administrativos,
académicos, legales), todo ello que va a marcar el uso del ser humano sobre el papel.
Las tintas son fundamentalmente una mezcla de pigmentos (quien aporta el color),
barnices, ceras, solventes y aditivos. Actualmente, se utilizan derivados del petróleo,
diferentes pigmentos, también, sustancias conocidas como aglutinantes, que permiten
la adhesión de los pigmentos al papel, y barnices, que permiten la movilización y
retención del pigmento (54).
Se entra al tema entonces, de las distintas tintas utilizadas comercialmente,
especificadas en la siguiente tabla.
Tabla 2. Tipos de tinta y sus principales usos. (3)
Para determinar el impacto que generara la tinta adherida a los diferentes tipos de
papel, según sea su finalidad, debe tener en cuenta aspectos como composición
química, entre ella los tipos de aceites, solventes, procesos de curación (necesidad de
energía lumínica para su grabado en el papel) y los residuos de la tinta (53), porque
estas características van a hacer que no únicamente sea en unión con el papel que la
tinta genere polémica, desde su mismo proceso de producción, hasta el
almacenamiento son de sumo cuidado tanto para el ser humano que la manipule como
el ambiente al cual llegue a tener contacto.
Tinta Utilidad
De aceite Papel periódico
Xerográfica Impresión laser
Tintas offset Litografía
Flexográfica Impresión de periódicos
25
Iniciando con los aceites, se tiene por ejemplo, las tintas offset, las cuales son ricas
en aceites bien sea puros o mezclados con destilados petrolíferos (aceites minerales)
y vegetales, el primero de ellos, es de alta peligrosidad ya que se bioacumula en el
medio ambiente, puesto que se lixivia en las aguas subterráneas y llegando en un lapso
de tiempo a tener contacto con el ser humano. En lo que respecta a los aceites
vegetales, por su misma naturaleza son inocuos al medio ambiento, pues
principalmente son de cereales como soja o linaza, pero que tendrán como desventaja
de manera más tardía en comparación con las tintas acompañadas de hidrocarburos
(55).
En lo que respecta a la base de la tinta, se habla de la tinta en base solvente (alcohol)
que acompaña a los compuestos orgánicos volátiles (por su sigla COV) los cuales
tienen un alto impacto negativo, no solo a nivel de salud, donde genera alteraciones
multisistemicas, sino también, contaminación atmosférica, ya que actúan como
precursores de ozono troposférico. Las tinas en base acuosa, reducen la cantidad
COV, pero generan en contrapeso, mayor cantidad de aguas residuales (55).
Por su uso cotidiano, se tiene que la impresión láser es la más ampliamente preferida
(18), desde la pequeña tienda con fotocopiadora hasta la más sofisticada oficina, el
inconveniente con este tipo de tinta, es que su remoción en procesos como el reciclaje,
es compleja, puesto que, estas se funden con la fibra, lo que dificulta su eliminación,
que mediante métodos químicos degradan el poliéster, un polímero que luego de ser
separado, se convierte en moléculas de diversos hidrocarburos aromáticos policíclicos,
que son altamente volátiles, y generan gran cantidad de compuestos orgánicos, entre
ellos, el monómero de estireno. Por ende, en los papeles de desecho, es decir aquellos
que han terminado su ciclo productivo, va a haber abundancia de moléculas propias
del papel, como la celulosa, y residuales de la tinta como el estireno. Este último, ha
sido descrito como una de las moléculas que se encuentran de forma mayoritaria en
las tintas convencionales. Se le conoce con diferentes nombres vinilbenceno,
feniletieno, cinameno, y etilbenceno, cuyo nombre denota la estructura química de esta
molécula, la más sencilla de los alquinilbencenos, se caracteriza por ser un líquido
aceitoso, incoloro, con un olor dulce (cuando se encuentra en estado puro) o un fuerte
olor desagradable (al estireno industrial, que posee aldehídos), parcialmente insoluble
en agua.
El origen del estireno puede ser antropogénico o ambiental, este último dándose
gracias a la descomposición de material vegetal, en el cual se da la descarboxilación
26
del ácido cinámico, en procesos de extracción de aceites esenciales, de árboles como
pinos, eucaliptos y plantas aromáticas, de igual manera como la industria papelera
utiliza este tipo de coníferas, es un subproducto de estos procesos de creación del
papel (11,40,56), además de ser producto metabólico de algunas plantas, bacterias y
hongos. Se utiliza principalmente en la producción de polímeros tales como
poliestireno, y copolímeros de estireno-butadieno, que son utilizados en diversos
productos como plásticos, neumáticos, tintas, a partir de los procesos de creación de
estos productos, se encuentra la entrada del estireno antropogénico al medio, pues
para su disposición final a nivel industrial se da el vertimiento de aguas, la evaporación
o la pirólisis (57). Tiene un tiempo promedio de degradación ambiental en aire, oscila
entre 1-2 días, a pocas profundidades (en suelo o agua) se evapora rápidamente, de
lo contrario es degradado por microorganismos (58).
La cinética del estireno en el cuerpo se inicia con la absorción, la cual principalmente
se da por vía respiratoria, por ser extremadamente volátil, aunque también se puede
dar mediante vía cutánea y oral, finalmente llega a tejido adiposo donde está en
promedio 2-5 días, luego de ello es metabolizado por el organismo, por las citocromo
P450, donde finalmente el feniletanodiol sale por vía renal, con metabolitos como ácido
mandélico y el fenilglioxílico (58,59).
La exposición crónica a estireno, la cual no es determinada mediante análisis clínico
de diagnóstico en laboratorio, puesto que en su metabolismo corporal no se dentifican
con metabolitos específicos de este xenobiótico, ha sido analizada en trabajadores,
captado mediante inhalación, en el medio común en el humo del cigarrillo, e inclusive
se ha expresado que, las fotocopiadoras emanan estireno durante su uso, ha
determinado que provoca, alteraciones neurológicas, entre la cuales destaca
alteraciones de la visión de color, cansancio, sensación de embriaguez, reacciones
lentas, problemas de concentración y del equilibrio; pruebas en animales, demuestran
perdida de la audición, alteraciones en aprendizajes y daño en espermatozoide; por
otro lado, instituciones como el Programa Nacional de Toxicología (NTP, en inglés) del
Departamento de Salud y Servicios Humanos (DHHS, en inglés), y La Agencia
Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC), han determinado que es estireno
es posiblemente cancerígeno (58).
27
Al final de su vida productiva, el papel tiene como principal destino los botaderos, que
van a ser parte de la creciente contaminación, en solución a ello, se propuso el
reciclaje, el cual brinda una aparente solución a la gran generación de residuos
producidos.
El proceso de reciclaje tradicional del papel, explicado por Teschke y Demers (1) se da
inicialmente por un tratamiento de agua y NaOH, posteriormente se realizar
sedimentación y centrifugación, después se extraen sustancias como resinas y colas
mediante lavados por corriente de aire usando los lodos de la pasta, con la adición
de sustancias floculantes, de este proceso se producen espumas con alto contenido
de sustancias químicas, las cuales se retiran del material, consecutivamente, se
procede a destintar la pulpa mediante nuevos lavados donde se adicionan químicos,
como detergentes tensoactivos, para erradicar impurezas, ya en el blanqueo, se
utilizan compuestos químicos similares al del abrillantado de la pasta, estos con la
suficiente agresividad que disminuyen su calidad. Ya con la nueva pulpa, se realiza de
nuevo la creación de fibras de papel, de manera similar a la materia prima virgen.
Hay que tener en cuenta, que las tintas han ido cambiando conforme al tiempo y que
el reciclaje se hace mucho más complejo debido a la naturaleza química de estos
productos, por lo tanto se deben conocer los distintos residuos de tinta (55). El primero
de ellos, son las tintas de exceso, las cuales son aquellas que no han sido empleadas
en la impresión y que por ende no se han visto en unión ni con otras tintas, ni otros
elementos como solventes o el papel, su último fin no suele ser el reciclado, sino la
reutilización. Las tintas combinadas por otro lado, son aquellas que intervienen en el
uso productivo del papel, donde no solo con solventes y el papel, sino con diferentes
tintas (con diferentes pigmentos de color), con este tipo, es idóneo el reciclaje, el cual
se basa en la filtración, reacondicionamiento y remezclado.
Pero estos procesos han traído consigo muchos inconvenientes, puesto que los
desechos resultantes de estos procesos tales como los lodos y residuos sólidos tienen
un alto potencial contaminante. En respuesta a esta problemática, la biotecnología ha
querido aportar soluciones a este problema mediante el uso de enzimas para el
destintado (5).
5.2.2.2. Enzimas degradadoras
Autores como Rojas (61) mencionan que las enzimas son polímeros biológicos que
catalizan las reacciones químicas vitales, empero, gracias a su potencial catalíco,
28
abarcan otras áreas de la ciencia, llegando a las aplicaciones biotecnológicas, entre
las que destacan en áreas como alimentos, medicina de manera independiente y de la
mano de la industria (producción de fármacos y antibióticos), ambiente, estas dos
últimas áreas por el amplio uso de contaminantes, han urgido por el uso de enzimas
que degraden aquellos compuestos peligroso para el medio y la población, y aquellas
enzimas encargadas de estos roles, son las enzimas degradadoras. En una afán de
implementar una producción más limpia (P+L), es decir, enfocar sus procesos,
productos y servicios, hacia una adecuada sostenibilidad ambiental, las empresas se
han visto en la necesidad de encontrar soluciones biotecnológicas, todo ello inicio, ya
específicamente en la industria papelera, cuando en la década de los 80 salió a la luz
pública las contrariedades en el uso del Cloro como agente blanqueante, a partir de
allí se inició una búsqueda exhaustiva de soluciones entre las que destaco el uso de
enzimas para la creación de nuevos productos (5,61).
Hay complejos enzimáticos encargados de degradar cada molécula que se encuentra
en mayor concentración en la fibra del papel entre ellas encontramos las celulasas,
hemicelulasas, lacasas (encargadas de degradar la lignina), xilanasas, amilasas,
lipasas, pectinasas, donde cabe destacar la labor de las lacasas y xilanasas, por su
gran capacidad de blanquear el papel, degradando complejos de ligno-celulosa.
5.2.2.2.1 Enzimas degradadoras de celulosa
Hace referencia al complejo de enzimas denominadas celulasas, se le llaman
glicosilhidrolasas, las cuales se encargan de hidrolizar estructuras complejas de
glucosa, principalmente celulosa. Comprenden a tres enzimas principalmente: endo-ß-
1,4-glucanasas, exo-ß-1,4-glucanasas y ß-glucosidasa. El mecanismo de degradación
de la celulosa, explicado en la Figura 2, se ejecuta mediante varias hidrolisis que se
dan de la siguiente manera: las endoß-1,4-glucanasas, se encargaran de romper
regiones de cadenas dispuestas en desorden (denominadas amorfas), al romper los
enlaces internos de este, disminuyen la longitud de la cadena y paralelamente los
grupos reductores libres se incrementa, posterior a esto las exo-ß-1,4-glucanasas, van
a remover de los extremos libres no reductores, unidades tanto de glucosa, como de
celobiosa, provocando así un crecimiento de los azucares reductores, pero sin alterar
el tamaño del polímero, para finalizar el proceso, la ß-glucosidasa hidroliza la celobiosa
libre, dejando como único compuesto la glucosa (5,41).
29
Fig. 2 Mecanismo de degradación de celulosa (61,62).
Para analizar la actividad enzimática se pueden tomar dos vías, medición individual de
enzimas o actividad total del complejo, en los casos de las celulasas individuales se
mide mediante métodos semicuantitativos (tales como viscosidad y extremos
reductores), para la medición de la hidrolisis del complejo, se utilizan métodos
cuantitativos, usando colorimetría, tales como DNS o Nelson Somogy (41).
A nivel industrial, son diversas áreas que la utilizan las células para el mejoramiento
de los productos y los procesos, además de significar una reducción de costos, entre
ellas encontramos los textiles, alimentos, detergentes, agro, entre otras (5,41).
5.2.2.2.1. Enzimas degradadoras de estireno
Para el metabolismo bien sea corporal o microbiano del estireno, se utiliza varias
enzimas denominadas oxigenasas, pertenecientes al grupo de las oxidoreductasas,
por lo tanto la degradación de este hidrocarburo se va a basar en reacciones oxido-
reducción.
En los microorganismos, Kennelly y Rodwell (60) menciona que se dan dos vías, las
cuales son dependientes de las condiciones de oxígeno en la cual se presenten, por
ende encontramos entonces, metabolismo anaeróbico y aeróbico.
En la ruta anaeróbica, hay ausencia de enzimas y en ella se presenta la conversión
de estireno hasta ácido fenilacetico, usando la vía 2-feniletanol y fenilacetaldehido,
30
llegado a ese compuesto, se transforma en benzoato, a partir del cual puede coger dos
vías, quedar en un anillo de benceno o llegar hasta pentanoato (60).
En la ruta aeróbica, se degrada el estireno usando principalmente enzimas y se puede
dar mediante dos vías: degradación del anillo aromático o la oxidación de la cadena
lateral. En la primera de ellas, para atacar el anillo, se utilizan enzimas como catecol
2,3-dioxigenasa, semialdehído hidrolasa, hidratasa, y aldolasa, para degradar el anillo
y llevarlo hasta acetaldehído y piruvato, esto se ha reportado principalmente en
microorganismo como Rhodococcus rhodochrous (60).
La oxidación de la cadena lateral, expresada en la Fig 3, es la via más comúnmente
utilizada por los microorganismos y en ella, se toma como sustrato el vinil (etil), para
ello interviene la estireno monooxigenasa, la cual usando como coenzima al FADH2,
oxida al estireno a epoxiestireno (óxido de estireno), cabe resaltar que para cumplir
con los requerimientos energéticos se necesita de FAD reductasa, para resustituir la
coenzima a partir del de la oxidación del NADH, luego de esto ya dependiendo del
microorganismo, puede tomar dos vías, una de ellas es isomerizar el epoxiestireno a
fenilacetaldehido catalizada por la epoxiestireno isomerasa o la conversión de
epoxiestireno en 2-feniletanol, estas vías son especificas a ciertos microorganismos,
la primera se ha descrito en bacterias como E. coli y Pseudomonas sp, la segunda via
a ha sido reportada en Xanthobacter sp, Corynebacterium sp puede presentar las dos
vías (9,60).
Fig. 3. Oxidación de la cadena lateral del estireno (59).
31
5.2.2.3. Microorganismos con capacidad degradadora
La contaminación es una problemática que afecta la población, en respuesta a ello se
ha buscado alternativas biológicas que permitan disminuir el impacto económico y
ambiental, una de ellas es la biodegradación, mejor conocida como biorremediación,
donde los microorganismos son los encargados de hacer inocuos esos xenobióticos
peligrosos para el ser humano (65). Para los microorganismos, que principalmente se
encuentran en los sitios más afectados, estos contaminantes significan su fuente de
nutrición, para lo cual su metabolismo va a facilitar la degradación de estos compuestos
(66).
5.2.2.3.1. Cellulosimicrobium funkei
El Cellulosimicrobium funkei es un bacilo grampositivo, no esporulado, saprofito,
oportunista, una actinobacteria, de la familia Promicromonosporaceae, cuya taxonomía
esta especificada en la Tabla 3. Anteriormente se conocía como Oerskovia turbata que
mediante biología molecular (secuencia de genes 16S ARNr) fue cambiado a C. funkei,
dicho nombre fue atribuido en honor al microbiólogo Guido Funke, quien reconoció el
pigmento amarillo en una corinebacteria (67,68)
Se cultiva en medio tripticasa de soya a 35°C, produciendo colonias color amarillo, con
hifas vegetativas que se introducen en el agar. Se encuentran otras especies del
genero Cellulosimicrobium, a nivel clínico y frecuencia en el ambiente, entre las que
destacan C. cellulans y C. terreus, las cuales se diferencian bioquímicamente como lo
muestra la Tabla 4. (70,71)
Tab. 3 Taxonomía del C. funkei. Adaptado Global Biodiversity Information Facility (68) .
Reino Bacteria
Filo Actinobacteria
Clase Actinobacteria
Orden Micrococcales
Familia Promicromonosporaceae
Genero Cellulosimicrobium
Especie C. funkei
32
Tab. 4 Características fenotípicas de C. cellulans, C. funkei y C. terreus Adaptado de
Kim y col. (71)
Características C. cellulans
ATCC 12830 C. funkei W6122 C. terreus DS64
Peptidoglicano L-Lis-D-Ser-D-
Asp Nd L-Lis-L-Thr-P-Asp
Azúcar
Mayoritaria en
pared celular
Ramanosa Galactosa Galactosa
Reducción de
Nitrato + V(-) +
Actividad Hidrolitica
Gelatin + + -
Beta
Galactosidasa + + -
Beta-Glucosidasa - V -
N-Acetil-B-
glucosamina + + -
Producción
Melobiosa + V(-) .
L-arabinosa - - Nd
Resistencia a
Ampicilina + ´+ Nd
Movilidad V + Nd
Con respecto a las variaciones que por sub-cepas puedan presentar los
microorganismos, se agrupa la tradicional “batería” de pruebas bioquímicas y un
antibiograma que expresa resistencia a ciprofloxacino (MIC > 64 ug/ml) y amikasina
(MIC >4ug/ml), y sensibilidad a imipenem (MIC >16 ug/ml), algunas cepas son
resistentes a trimetropin-sulfametaxona (MIC >4-76 ug/ml, otros aspectos relevantes
se presentan en la siguiente figura (68).
33
Tab 5. Características Bioquímicas y de resistencia del C. funkei Adaptado de GBIF
(68).
Característica Cellulosimicrobium funkei sp. Nov
W6122 W2796 W4083 W6123
Fermentación
L-arabinosa + + - +
Celobiosa + + + +
Glicerol + + - +
Inulina - - - -
Manosa + + - +
Melecitosa - - - -
Melobiosa - + - -
Rafinosa - - - -
L-Ramanosa - - - -
D-Sorbitol - - - -
Crecimiento a
35°C + + + +
Pigmento HIA Amarillo Amarillo Amarillo Amarillo
Hidrolisis
Adenina + + + +
Caseína + + + +
Hipoxantina + + + +
Xantina + + + +
Movilidad ++ + + +
Producción de
ureasa + + + +
Reducción de
nitrato - + + +
Licuefacción de
gelatina + + + +
Resistencia
Amikacina
(MIC>64 ug/ml) + + + +
Ciprofloxacina
(MIC>4ug/ml) + + + +
34
Trimetropin
Sulfametaxona
(MIC>4-76 ug/ml)
+ + + +
Se ha evidenciado en la literatura, que los actinomicetos son de naturaleza oportunista,
por ende, el C. funkei, sigue este patrón, no se considera virulenta, puesto que son
los reportes de enfermedad e inclusive mínimos los referentes a fallecimientos, estos
cuadros son principalmente de endocarditis y peritonitis, los dos primeros de la
afectación cardiaca fueron diagnosticados en adultos mayores, uno de ellos con
enfermedad de base (Enfermedad de Crohn) y el segundo con presencia de catéter,
para el caso de peritonitis, también siguió el mismo, curso un anciano con una
condición de base (hipertensión) (61,71).
Por su habitad, la continua exposición al medio ambiente, aquel rico en sustratos
vegetales, es decir el humus de los suelos, ha fomentado la investigación de
actinobacterias con capacidad enzimática, la cual ha sido evidenciada con complejos
enzimáticos de lacasas, hemicelulasas y celulasas, creando estructuras degradativas
que se conocen como celulosomas, esta va a ser típica no solo de las actinobacterias,
sino también de las corinebacteria (7-9, 41, 72).
5.2.2.3.2. Pseudomonas aeruginosa
Son bacilos gramnegativos, que presentan movilidad, y supervivencia en presencia de
oxígeno, con ciertas cepas donde hay presencia de pigmento y fluorescencia, son
saprofitas, algunas especies son patógenas, una de ellas, perteneciente a las más
patógenas del mundo, es la Pseudomonas aeruginosa, que controversialmente hace
parte (escasa) de la flora de piel. Este género pertenece al grupo de los bacilos
gramnegativos cuya fuente de energía es el citrato, puesto que no fermentan
carbohidratos (73).
Su taxonomía tradicional mencionada NCBI (73) cita pertenece al a familia
Pseudomonaceae, y demás taxones explicados en la Tabla 5, empero, la biología
molecular basada en la homología de rRNA/DNA, incluye otros microorganismos, que
se encuentran expuestos en la Tabla 6 (72).
Tabla 5. Taxonomía y Clasificación molecular del género Pseudomonas spp.
Adaptación de NCBI, Brooks y col (72,73)
35
Reino Bacteria
Filo Proteobacteria
Clase Gammaproteobacteria
Orden Pseudomonasdales
Familia Pseudomonasdaceae
Genero Pseudomonas
CLASIFICACION MOLECULAR
I
Grupo fluorescente
Pseudomonas aeuriginosa
Pseudomona florescens
Pseudomonas pautida
Grupo no fluorescente
Pseudomonas stutzeri
Pseudomonas mendocina
II
Burkholderia pseudomallei
Burkholderia mallei
Burkholderia cepacia
Burkholderia picketii
III Especies de Camamonas
Especies de Acidovorax
IV Especies de Brevundimonas
V Stenotrophomonas maltophilia
En los concerniente a características macroscópicas, son colonias redondas y lisas,
que varían de color según su pigmento: pioverdina (verde alga), piocianina (azul no
fluorescente), piorrubina (rojo oscuro) o piomelanina (negro). Especies como P.
aeruginosa, presentan colonias mucoides, ya que tienen excesiva producción de
alginatos (exopolisacáridos).
Para su diagnóstico se realizan pruebas bioquímicas donde se identifica un perfil de
oxidasa positiva, algunas cepas metabolizan glucosa, crecimiento a 42°C
aproximadamente. Sus factores de virulencia, se basan en la adhesión mediante
fimbrias, exopolisacáridos (para formación de biofilms), toxinas (exotoxina),
hemolisinas (fosfolipasa C termolábil y un glucolípido termoestable) y una gran arsenal
enzimático, que en clínica resaltan elastasas, proteasas. En base a sus factores de
36
virulencia, podemos encontrarlos en cuadros de endocarditis asociadas a catéter,
bacteriemias, fibrosis quística o infecciones leves como la “otitis del nadador” o
afectaciones en piel y mucosas (73).
Como bien se ha mencionado en los factores de virulencia, la maquinaria enzimática
de las Pseudomonas tienen la capacidad de degradar compuestos de diferentes
complejidades, especialmente hidrocarburos, puesto es la más aislada en ambientes
ricos esos contaminantes, por lo que es ampliamente usada para fines de
biorremediación.
5.3. MARCO LEGAL
En Colombia, la investigación está regulada con por una institución conocida como
Colciencias, la cual mediante la ley 1286 de 2009, dota a dicha institución de carácter
de departamento administrativo, con el fin de fortalecer los procesos de ciencia,
tecnología e innovación (CTI). A partir de ello, se va a fomentar la investigación no solo
con fines académicos, sino con proyecciones a la comunidad en aspectos tecnológicos
y empresariales, por lo que el Sistema Nacional de Ciencia, Tecnología e Innovación,
fomentara investigaciones de carácter biotecnológico, ya que esta le otorga un valor
agregado a las industrias, que se desea que tengan una base tecnológica,
fundamentada con los conocimientos de la academia y la ciencia (74).
A partir de estas disposiciones legales, se fundamenta el documento CONPES 3697,
vigilara el uso de la riqueza natural, la biodiversidad con fines biotecnológicos y en
largo plazo, y como principal finalidad, de industrias biotecnologías, no solo en la
regulación en el uso recursos biológicos y adjuntos a estos, sino también la promoción
y el establecimiento de políticas para el financiamiento de las mismas (75).
Se relaciona también el documento CONPES 3527, desde el punto de vista, la
promoción que hace a la investigación biotecnológica con la finalidad de crear
industrias y no únicamente con producto comercializables, sino también, que brinden
aportes a la economía con un alto impacto ambiental, enfocadas en la sostenibilidad,
con ello desean aumentar el potencial competitivo en el país a nivel empresarial (76).
5.4. CONSIDERACIONES ETICAS
De acuerdo con las normas establecidas en la resolución 008430 del Octubre 4 de
1993 y en cumplimiento con los aspectos mencionados en los artículos 66 y 71 de la
37
presente resolución, la utilización de los microorganismos con los que se pretende
llevar a cabo esta investigación no implica riesgo ni para el investigador ni para el sujeto
de estudio si se siguen las normas de bioseguridad necesarias (77).
En cuanto al riesgo químico que implica trabajar con el monómero estireno, se deben
tomar las siguientes precauciones en el laboratorio según la dirección nacional de
laboratorios (78)
38
6. ACERCAMIENTO METODOLOGICO
6.1. TIPO DE ESTUDIO
El presente estudio es experimental, ya que dentro de los ensayos que se han llevado
a cabo, se manipulan de manera controlada las variables con la finalidad de analizar
críticamente las variaciones expuestas.
6.2. POBLACIÓN
Se tomó como población las cepas de Pseudomonas aeruginosa y Cellulosimicrobium
funkei provenientes del Banco de Bacterias del Grupo de Química Ambiental y
Computacional de la Universidad de Cartagena.
6.3. ETAPAS
El desarrollo de los objetivos del presente proyecto se llevó a cabo por medio de etapas,
las cuales serán descritas a continuación para cada uno de dichos objetivos.
Objetivo Específico 1.
“Caracterizar morfológica, bioquímica y molecularmente las cepas
Cellulosimicrobium funkei y Pseudomonas aeruginosa provenientes del Banco de
Bacterias del Grupo de Química Ambiental y Computacional de la Universidad de
Cartagena”
Para alcanzar este objetivo, se realizó por medio de 3 etapas descritas a continuación.
Etapa 1. Confirmación de la pureza, viabilidad y comportamiento de las cepas a
evaluar. Caracterización Morfológica.
Para esta etapa se realizó la reconstitución de los microorganismos provenientes del
banco de bacterias, autóctonas de suelos colombianos altamente impactados en la zona
caribe colombiana, por parte del grupo de Química Ambiental y Computacional de la
Universidad de Cartagena, con la finalidad de realizar la caracterización morfológica y
bioquímica.
Del cultivo puro, extraído del freezer a -70°C, se sometio a atemperamiento gradual,
para finalmente ser repicado a medios de cultivo con medio Luria Bertan (LB), cultivo y
caldo, mediante una siembra masiva, pretendiendo con ello que el microorganismo se
39
extienda de manera homogénea a toda la placa, transcurridos 5 días de incubación a
35°+/-2°C, se realizó la Tinción de Gram, con el propósito de verificar de manera rápida
la presencia de ambos microorganismos en los respectivos medios, a partir de estos
medios se hizo una siembra por agotamiento, con el objetivo de tener las bacterias
aisladas, para poder extraer las colonias con cantidad homogéneas de microorganismos
para la posterior verificación de actividad bioquímica, e idónea identificación del
microorganismo (79).
Etapa 2. Evaluación del comportamiento bioquímico de las cepas.
Una vez los microorganismos se encontraron estandarizados y listos para siembra, se
realizó la evaluación del comportamiento bioquímico que permitió en primera instancia,
definir y verificar la taxonomía de las cepas en estudio, a través de siembra en medios
indicadores de actividad metabólica de las bacterias, a través de los kit BBL Crystal ID
® BD: BD BBL Crystal Gram-positive ID kit y BD BBL Crystal enteric/nonfermenter ID
kit, inoulados con C. funkei y P. aeruginosa¸ respectivmente, llevados a incubación a
37°+/-2°C, con lectura final mediante panel e identificación de código de perfil. Cada
una de las cepas en estudio fue evaluada por triplicado, y el montaje fue realizado al
menos dos veces, para de esta manera, garantizar la reproducibilidad de los resultados
(79).
Con los datos obtenidos en esta etapa, fue posible tener conocimiento sobre el
comportamiento metabólico de las bacterias en estudio, y luego de la obtención de los
resultados relacionados con degradación de estireno y celulosa, serán relacionados
unos con otros para determinar a grandes rasgos, posibles rutas bioquímicas que
permitan o trunquen la capacidad degradativa de las bacterias estudiadas.
Etapa 3. Caracterización molecular de las cepas.
Dentro grupo de Química Ambiental y Computacional de la Universidad de Cartagena,
se realizó la genotipificación de las cepas llevando a cabo una Reacción en Cadena de
la Polimerasa (PCR) mediante la amplificación del gen ribosomal 16S, material extraído
y verificado mediante espectrofotómetro NadoDrop, utilizando cebadores específicos al
microorganismo, se realizaron 30 ciclos a temperaturas de desnaturalización (94°C),
amplificación (55°C) y amplificación (72°C), seguido de la secuenciación de un
fragmento de 1465 pb. Con los datos obtenidos, se comparó la información con la base
de datos del National Center For Biotechnology Information (NCBI) y Ribosomal
Database Project (RDP).
40
Cabe resaltar que se llevó a cabo el control de cada una de las variables fisicoquímicas
a tener en cuenta en cada uno de los equipos utilizados, incluyendo pH y temperatura
de neveras, freezer, incubadoras, shakers, entre otros.
Objetivo Específico 2.
“Evaluar la capacidad degradativa de estireno y celulosa por parte de las cepas
Cellulosimicrobium funkei y Pseudomonas aeruginosa”
El presente objetivo se alcanzó a través de 5 etapas presentadas a continuación.
Etapa 1. Obtención de los sustratos y verificación de la calidad a utilizar para los
experimentos.
Con la finalidad de asegurar la especificidad enzimática se llevaron a cabo los ensayos
de degradación con estándares analíticos de celulosa y estireno, para lo cual se
utilizaron carboximetilcelulosa (CMC) y estireno de las casas comerciales Alfa Aesar y
Sigma-Aldrich, respectivamente.
Para la manipulación de la celulosa se realizaron alícuotas en tubos tipo Falcon de
manera directa, para mayor practicidad en la manipulación. Debido a que se llevara a
cabo la cuantificación del producto final, se verifica la calidad del sustrato con el
certificado de análisis adjunto con el producto.
En el caso del estireno, debido a su presentación, se llevó a cabo la reconstitución,
mediante inyección continua de solvente (Medio Mineral (80) + DMSO 10%), iniciando
en bajas cantidades (5 ml aproximadamente), con ello se procede a disminuir la
concentración inicial para su extracción, asegurando de realizar los adecuados lavados
para obtener todo el hidrocarburo contenido, luego de ello se llevó a balón aforado, con
tapon de caucho asegurado con parafina y sellado con parafilm, además de recubrirlo
con papel aluminio para tenerlo así protegido de luz, a un volumen final de 100 ml, en
el cual se tiene una concentración total de 2450 ppm, a partir de esta solución madre
se realizaron alícuotas a frascos ámbar sellados, en diferentes volúmenes para su
facilidad en la manipulación y almacenamiento. Con la finalidad de poder establecer
mas rigurosamente la medición de la concentración de estireno presente en la muestra,
se preparó la curva de calibración de este sustrato, verificada en espectrofotómetro con
longitud de onda UV a 270 nm (81), con variación de concentraciones desde 25 ppm
41
hasta 1000 ppm con la finalidad de asegurar una adecuada linealidad, finalmente se
estableció la curva con las siguientes concentraciones 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200,
300 y 500 ppm.
Etapa 2. Verificación del aumento de la biomasa bajo condiciones óptimas de
crecimiento bacteriano.
De acuerdo con Jaramillo y col. (82), fue necesario realizar el seguimiento de la
capacidad de duplicación de las bacterias en estudio. La medición de la fase de
crecimiento se ha realizado a través de la medición de la densidad óptica en el tiempo
cero (0) de la incubación y en el tiempo final de incubación a 35 °C±2 con agitación
constante (48 horas) a través de un espectrofotómetro a 600 nm.
Etapa 3. Ensayo de degradación de celulosa.
Preparación del montaje. Se preparó el Caldo M9 según lo descrito por Jaramillo y col.
(82), una cantidad de 250 ml (pH 7.0 ± 0.5) con la adición de 200 ppm de celulosa. De
esta solución madre (a pH neutro) se realizaron 4 alícuota en sus respectivos frascos
para llevar a cabo las variaciones de pH establecidas (5, 8 y 10 ± 0.5), realizando el
ajuste con Hidróxido de Sodio 10N y Ácido clorhídrico. Se preparó simultáneamente
según cada variación de pH, controles con 200 ppm de glucosa.
Luego de establecidos los pH, se esterilizaron en autoclave a 121°C durante 15 minutos
con el tiempo equiparable en secado, tanto al medio, como al material (vidriería, puntas
de pipeta, algodón) necesario para llevar a cabo el montaje. A partir de cada variación,
se organizaron tubos de ensayos, teniendo para cada pH, tres tubos con sus respectivas
replicas, a los cuales se les adicionó 5 ml de medio, tapados con torundas de algodón.
Ensayo. Se llevan a cabo 2 montajes, con dos inóculos diferente, el primero para
Cellulosimicrobium funkei, el segundo para un pool de las dos cepas (C. funkei y
Pseudomonas aeruginosa). De cada microorganismo se adicionó 50 μl de solución, con
densidad 0.5 en la escala Mc Farland. Luego de la inoculación, se mantienen los
montajes en incubación a 35 °C ±2 con agitación constante hasta la hora 312.
Teniendo en cuenta el tiempo de crecimiento del microorganismo, se estableció a partir
de la hora 72, verificación del crecimiento mediante el aumento de la densidad óptica
(DO) mediante espectrofotometría a 600nm, para ello se utilizó microplacas de 96
42
pozos. De manera paralela a la medición, se llevó a cabo el control con el medio sin
inocular.
Verificación de la actividad enzimática. Para llevar a cabo la verificación de azucares
reductores, los cuales son el resultado de la degradación de celulosa, se utilizó el
reactivo 3, 5-dinitrosalicílico, conocido como DNS, se siguió lo descrito por Ávila Núñez
y col (83) para su preparación y se comprueba su linealidad mediante la curva de
calibración en lo descrito por Moralez Vazques (84) todo el material utilizado se refrigeró
protegido de la luz.
Para realizar la cuantificación, a la hora final (312 horas) se tomó 1ml de la respectiva
muestra, se le agregó 0.5 ml de DNS, luego de homogenizar, se sometió a una
temperatura de 90 +/- 5°C durante 5 minutos en baño serológico, transcurrido el tiempo
se enfrentó a agua en bajas temperaturas (4+/- 5°C), con la finalidad de frenar la
reacción, luego de aclimatarse, se completó el volumen a 5 ml con Agua MiliQ., por
último, se llevó a vortex durante 15 segundos promedio, acorde al tamaño del tubo.
Finalmente se lleva a cabo la lectura en espectrofotómetro a una longitud de onda de
540 nm.
Etapa 4. Ensayo de degradación de estireno.
Preparación del montaje. Se preparó una solución de estireno a una concentración de
1000 ppm en balón aforado de 100 ml, con las condiciones anterioremente mecionadas.
A partir de esta solución, se extrajo el estireno para lograr en cada variación de pH (5,
7, 8 y 10 ± 0.5) una concentración de 200ppm. Se llevaron a frascos estériles con tapón
de caucho, igualmente asegurados, 5 ml del medio, tomando 3 frascos por pH, con sus
respectivas replicas, es decir, en la misma proporción a lo realizado en el ensayo de
degradación de celulosa.
Ensayo. Se realizaron 3 montajes, cada uno para un inoculo especifico, el primero para
Cellulosimicrobium funkei, el segundo para Pseudomonas aeruginosa un pool de las
dos cepas (C. funkei y P. aeruginosa). Se estableció como control, medio sin inóculo.
De cada microorganismo se adiciona 100 μl de solución con densidad 0.5 en la escala
Mc Farland, de igual manera al ensayo de celulosa, se mantienen los montajes en
incubación a 35 °C ±2 con agitación constante hasta la hora 312.
43
Se lleva a cabo la verificación del aumento de la biomasa de manera simultánea a la
verificación de la concentración de estireno, mediante espectrofotómetro a una longitud
de onda de 600nm. Al igual que en el ensayo de celulosa, se llevó a cabo el control con
el medio sin inocular.
Verificación de la actividad enzimática. Se procede a verificar conforme el paso del
tiempo, en tres lecturas a la hora 0, 192 y 312, la alteración en la concentración de
estireno presente en la muestra, esto mediante espectrofotómetro a longitud de onda
rango UV a 270 nm.
Etapa 5. Organización y análisis de resultados.
Se llevó a un análisis mediante estadística descriptiva, puesto que, con la finalidad de
garantizar la reproducibilidad de los resultados, dentro de cada ensayo, con cada uno
de los inóculos, se realizaron a cada variación de pH, una muestra por triplicado y cada
uno de estos, con un duplicado del mismo. Por ende, para llevar a cabo la organización
de la información obtenida, fue necesario realizar la tabulación en tablas, para facilitar
de este modo la obtención de promedios, donde unificados los resultados se determinó
la desviación estándar de cada variación, tanto para crecimiento, como para
degradación. Por otro lado, cabe resaltar que dentro de cada ensayo, se llevó a cabo,
controles, según la naturaleza del ensayo, biológico y químico, para degradación de
celulosa y estireno, respectivamente, lo que permitió realizar el control interno de los
resultados obtenidos.
Por otro lado, se tuvo la necesidad de expresar los resultados del presente trabajo en
cantidades porcentuales para ambos sustratos, porcentaje de sacarificación (85) y de
reducción de estireno para facilitar de este modo el cotejo con resultados de otros
ensayos de degradación y poder expresar de manera equiparable la actividad
enzimática obtenida.
44
6.4. OPERACIONALIZACION DE VARIABLES
TIPO
MACRO
VARIABLE
VARIABLE
DEFINICION
NATURALE
ZA
NIVEL
DE
MED/ON
CRITERIO
DE
CLASIF/CION
D E P E N D I E N T E
Degradación del sustrato
pH El logaritmo negativo de la
concentración de ion hidrógeno, que incide en
acidez o alcalinidad de una muestra
Cuanti/va Razon Valor de pH
Inoculo (puro o mixto)
Concentración de
microorganismos adicionada a la
muestra
Cuanti/va Razón Especie en caldo a 0.5 Escala Mac
Farland
Degradación de celulosa
Descomposición de un
polisacárido (Celulosa) a
monosacáridos más sencillos.
Cuanti/va Razón Porcentaje de Hidrolisis (%
sacarificación)
Degradación de estireno
Descomposición de una molécula de hidrocarburo
(Estireno) a compuestos
inocuos.
Cuanti/va Razón Porcentaje de reducción de
estireno.
I N D E P E N D I E N T E
Metabolismo Microbiano
Biomasa Microbiana
Poblacion microbiana
residente en la muestra que ha sido capaz de
metabolizar los sustratos
presentes en el medio
Cuanti/va Razón DO crecimiento Bacteriano
Enzimas catalíticas
Enzimas celulíticas
Molécula que permite la
degradación de celulosa a
compuestos más sencillos.
Cuanti/va Razón Concentración de glucosa
(ppm)
Enzimas degradadoras
de estireno
Descomposición de una molécula de hidrocarburo
(Estireno) a compuesto
inocuos.
Cuanti/va Razón Concentración de estireno
(ppm)
45
7. RESULTADOS
7.1 OBJETIVO ESPECIFICO 1.
7.1.1 Caracterización de cepas de estudio.
El comportamiento metabólico de los microorganismos se ve influenciado por diversos
factores, en especial aquellos que afectan las condiciones óptimas de su maquinaria
enzimática como lo son la temperatura, pH y humedad principalmente, por ello, se
procedió a verificar su correcto crecimiento para simultáneamente realizar una
adecuada identificación. Para ello, luego de estabilizadas las cepas se llevó cabo las
características morfológicas de las cepas en estudio, C. funkei y P. aeruginosa, cuyas
perfiles de caracterización están expuestos en la Tabla 7.
Tabla 7. Perfil caracterización morfológica para las cepas en estudio.
Prueba Cellulosimicrobium
funkei Pseudomonas
aeruginosa
Tinción de Gram
Respuesta al Gram Bacilos grampositivos generalmente largos.
Bacilos gramnegativos.
Presencia esporas No esporulado Cultivo (Agar LB, Merk®)
Característica de la colonia
Colonias blancas, planas, con borde irregular de
aspecto cremoso.
Colonias verdes, planas, mucoides con borde
irregular Tiempo de crecimiento
(Cultivo) 72 horas 18 horas
Condiciones de Crecimiento
35+/- 2°C Aerobios facultativos
Respecto a la caracterización bioquímica se encontró homología del 98% con la batería
bioquímica BBL Crystal para C. funkei y P. aeruginosa. A nivel molecular, se obtuvo
homología del 99% para las cepas anteriormente mencionadas, de acuerdo con los
resultados obtenidos en BLAST luego de comparar las secuencias del gen de estudio
con las reportadas en dicha base de datos
46
7.2 OBJETIVO ESPECIFICO 2.
7.2.1 Obtención de los sustratos y verificación de la calidad a utilizar para
los experimentos.
Para llevar a cabo la validación de la técnica de identificación de la concentración de
estireno presente en la muestra, se realizó la curva de calibración en espectófometro
con rango UV, exactamente, con una longitud de onda de 270 nm, con base en la
concentración de trabajo (1000 ppm), se obtuvo la curva de calibración con un límite de
linealidad hasta 500 ppm, y una mínima concentración detectable de 25 ppm mediante
espectrofotometría UV a 270 nm (Figura 4, Tabla 8).
Tabla 8. Curva de Calibración de Estireno mediante espectrofotometría UV
Fig. 4. Curva de Calibración de Estireno mediante espectrofotometría UV
En lo referente a la Carboximetilcelulosa, su certificado de análisis se encuentra adjunto
en los anexos.
7.2.2 Verificación del aumento de la biomasa bajo condiciones óptimas
de crecimiento bacteriano
Luego de la reconstitución, se llevó a cabo el seguimiento de la biomasa microbiana, el
cual evidenció una fase de adaptación de cercana a las 48 horas para C. funkei, por
otro lado, para P. aeruginosa se evidencia un acelerado inicio de la fase exponencial, lo
que da a entender su rápida adaptación al medio, tal comportamiento se ve reflejado en
la Figura 5.
47
Fig. 5. Verificación del aumento de la Biomasa en Caldo LB.
7.2.3 Ensayo de degradación de celulosa
7.2.3.1 Crecimiento
Se realizó el seguimiento al aumento en la población microbiana por medio de la
densidad óptica, partiendo desde la hora 0, con mediciones a las horas 48, 144 y 312.
Crecimiento en C. funkei
Se aprecia de manera general un crecimiento marcadamente exponencial en las
diferentes variaciones de pH, hallando una mayor biomasa en pH 8, y menor población
para pH 5, a pesar de ello sigue siendo masivo el crecimiento microbiano de manera
general frente a la celulosa a comparación del presentado a nivel general en el control,
expresando de este modo mayor adaptación a la fuente de carbono disuelta en el medio
(Tabla 9, Figura 6).
Crecimiento en Inoculo Mixto
Para el ensayo con el inoculo mixto (Tabla 10, Figura 7), se reflejan diferentes
comportamientos que son similares a los presentados por el control. En pH 5, por
ejemplo, se aprecia escaso crecimiento, mayor tendencia decreciente, contrario a lo
ocurrido en pH 7, donde luego de un descenso, se de crecimiento exponencial continuo,
con el pH 8 se analiza una continua fase estacionaria, por ultimo para pH 10 se repite
el patrón de comportamiento de pH5. En este ensayo, se aprecia cierto grado de
dificultad en la adaptación al sustrato, lo que pone de manifiesto cierto grado de
confrontación por parte de las cepas presentes para catabolizar la celulosa, pero que
48
alrededor de la hora 150, la posible simbiosis entre las bacterias potencia su crecimiento
en los medios neutro y levemente alcalino (pH 8).
Tabla 9. Promedio de DO Biomasa de C, funkei
Fig. 6. Crecimiento de C. funkei frente a celulosa en diferentes variaciones de pH: A.
pH 5, B. pH 7, C. pH 8, D. pH 10.
A B
C D
49
Tabla 10. Promedio de DO Biomasa de C. funkei/ P.aeruginosa
Fig. 7. Crecimiento de inoculo mixto frente a celulosa en diferentes variaciones de pH:
A. pH 5, B. pH 7, C. pH 8, D. pH 10.
7.2.3.2 Verificación de la actividad enzimática
Luego de 312 horas de incubación, se realizó la cuantificación de azucares reductores
presentes en el medio, con la finalidad de asegurar el control de una adecuada
medición, se establece la curva de calibración (Tabla 11, Figura 8) estableciendo la
A B
C D
50
linealidad dentro del siguiente rango, con una concentración mínima de 100 ppm y una
máxima de 800 ppm.
Tabla 11. Concentraciones de patrón de glucosa para curva de calibración.
Fig. 8. Curva de Calibración para identificación de azucares reductores.
Se calcularon las concentraciones gracias a ecuación de la recta en la curva de
calibración (Tabla 12). En las gráficas de concentración de los montajes (Figura 9) en
el realizado con C. funkei, se evidenció que los pH donde mayor cantidad de glucosa se
obtuvo fue en los medios alcalinos, en primera instancia pH 8, seguido de pH 10, para
los pH menores (5 y 7), similares. En el montaje del inoculo mixto, se generó una
relación inversa entre la cantidad de glucosa y el pH del medio.
Tabla 12. Resultados ensayo de degradación de celulosa
(-) Muestra insuficiente
Curva de Glucosa
Concentración Abs.
100 0.045
200 0.129
400 0.233
600 0.305
800 0.391
51
Fig. 9. Concentración de glucosa en montajes. A. C. funkei B. Inoculo mixto.
7.2.4 Ensayo de degradación de estireno
7.2.4.1 Crecimiento
Frente a estireno como única fuente de carbono en el medio, se apreció que la respuesta
microbiana es de manera general escasa, puesto que desciende la biomasa y en
promedio alrededor de la hora 200, toma un comportamiento estacionario (Tabla 13,
Figura 10).
Para P. aeruginosa (Figura 10A) en los pH 5,7 y 8, se dió marcada disminución, con un
posterior aumento, aunque este se presente de manera escasa, en el caso de pH 10 es
un decrecimiento constante.
En el caso de C. funkei (Figura 10B) en los pH 5 y 10, se da una tendencia similar a la
presentada de manera general por la
P. aeruginosa, pH 8 es similar en comportamiento a pH 10 del bacilo gramnegativo, la
diferencia significativa se aprecia en pH 7 donde presenta crecimiento exponencial y
acelerada disminución posterior.
Para el inoculo mixto (Figura 10C) de manera relevante se potenciado el crecimiento
en pH 8, respecto a los demás pH se repite el mismo patrón de crecimiento a las cepas
individuales.
52
Tabla 13. Promedio de Crecimiento en Estireno por horas.
Fig. 10. Crecimiento en estireno A. P. aeruginosa, B. C. funkei, C. Inoculo mixto.
A
C.
B.
53
7.2.4.2 Verificación de la actividad enzimática
De manera paralela, conforme se realizaban los controles de la biomasa, se llevaban a
cabo el seguimiento de la concentración de estireno presente en los montajes,
enfrentados al comportamiento que expresara el control asignado a cada variación de
pH en cada montaje.
En el montaje la P. aeruginosa, se presentó de manera general disminución en la
concentración, lo que se vio relacionado con los diferentes pH de crecimiento de manera
proporcional, tal como se expone en la Figura 12, donde se expresan los porcentajes
de reducción de la concentración para las horas 192 y 312. Existe una diferencia
significativa para el pH 8, donde se presenta hasta la hora 192 disminución en la
concentración en un 40.04%, pero tomó un comportamiento estable, (Tabla 14, Figura
12), se aprecia la alteración de la concentración conforme al tiempo transcurrido frente
a los controles.
Fig. 12. Porcentajes de Degradación de estireno por P. aeruginosa
Tabla 14. Concentracion de Estireno por horas en P. aeruginosa
54
Fig. 12. Degradación de estireno por P. aeruginosa conforme al tiempo. Según variación
de pH: A. pH 5, B. pH 7, C. pH 8, D. pH 10.
Para el montaje con C. funkei, se apreció una tendencia de mayor degradación en los
pH alcalinos, tal como se aprecia en la Figura 13, donde se verifica la escasa actividad
para pH neutro, y en pH 5 el comportamiento atípico de reducción y posterior aumento
de la concentración que se dio en P. aeruginosa a pH 8. Teniendo en cuenta el grado
de reducción respecto al tiempo, en pH 7 y 10 se observa una disminución más
prolongada a comparación de pH 8, donde a partir de la hora 192 se aprecia disminución
significativa. Tal como se mencionó anteriormente, en pH 5 se da disminución
progresiva hasta la hora 192, posterior a ello toma un leve incremento (Tabla 15, Figura
14).
55
Fig. 13. Porcentajes de Degradación de estireno por C. funkei.
Tabla 15. Concentracion de Estireno por horas en C. funkei.
Fig. 14. Degradación de estireno por C. funkei conforme al tiempo. Según variación de
pH: A. pH 5, B. pH 7, C. pH 8, D. pH 10.
56
En el inoculo mixto, respecto al porcentaje de degradación (Figura 15), en comparación
con los ensayos realizados, se evidenció en pH 7 la mayor reducción de estireno, con
un 55,70% de disminución de la concentración inicial, también se obtuvo un porcentaje
significativo para pH 8 con un 36,83%, en lo referente a los pH 5 y 10, se dio una
reducción regresiva para el primero, y menor para el segundo respecto a la hora 312.
El comportamiento obtenido durante el tiempo (Tabla 16,Figura 16) de manera común
entre las variaciones de pH, se apreció que aproximadamente en la hora 160 se
potencia la degradación, salvo para pH 7, donde se mantuvo estable hasta la hora 192
donde luego disminuyó marcadamente hasta la lectura de la hora 312.
Fig. 15. Porcentajes de Degradación de estireno en inoculo mixto.
Tabla 16. . Concentracion de Estireno por horas en C. funkei/ P. aeruginosa.
57
Fig. 15. Degradación de estireno por C. funkei y P. aeruginosa conforme al tiempo.
Según variación de pH: A. pH 5, B. pH 7, C. pH 8, D. pH 10.
58
8. DISCUSIÓN
El uso de microrganismos para la degradación de desechos, ha sido una manera de
remediar el alto grado de contaminación que esta simboliza, sin embargo, su capacidad
enzimática no se ha reducido a residuos orgánicos (86), en especial las bacterias, han
adecuado su metabolismo para la degradación de diferentes xenobióticos, tales como
pesticidas, metales pesados e hidrocarburos (82, 87, 88). Dentro de sus residuos, el
papel de desperdicio, sus desechos conllevan al aumento preponderante de materia
orgánica (celulosa) y de del riesgo químico por parte de los restos de tinta, que son
persistentes aun en las industrias de reciclaje (89).
Con base en ello, se parte del análisis de la capacidad degradativa de celulosa, el cual
es el compuesto de mayor porcentaje en los desechos de la industria papelera. Se toma
como punto de partida para el primer inoculo, del género Cellulosimicrobium, al cual
se le ha atribuido gran maquinaria enzimática reductora de compuestos lignocelulósicos,
como se ve en lo expuesto por Kim y col. (90), donde obtienen un porcentaje de
hidrolisis optima (45.2%) de CMC en medio acido (pH 5) en la cepa C. funkei HY-13, lo
que difiere en lo obtenido en los ensayos realizados, donde se presenta un porcentaje
de 79.10% en un medio a un pH 8, es decir ligeramente alcalino (Figura 9), en el
mencionado trabajo, a pesar de utilizar como única fuente de carbono el mismo sustrato
(carboximetilcelulosa, CMC) Kim y col. (90) somete la enzima aislada y purifica a un
rango tanto de temperaturas como de pH, puesto que ellos se centran en la actividad
específica, tal como suele ser el objeto de estudio en las investigaciones de análisis
enzimático, a diferencia de este ensayo, donde se realiza el seguimiento de la actividad
de la enzima en el microorganismo vivo (evidenciado en las variaciones de biomasa),
factor por el cual se puede explicar la diferencia en degradación con relación al pH, ya
que el C. funkei presenta un rango amplio de pH optimo, fluctuando desde 6.5 hasta 7.5
(91), lo que permite asimilar mayor flexibilidad en las condiciones óptimas de la enzima
presentada por ese microorganismo, adicional al hecho que en el pH donde mayor
hidrolisis se presentó una relación directa a la mayor biomasa obtenida.
Como explicación a lo anteriormente mencionado, y basándose en expuesto por
Salcedo y col, 2011, donde mencionan que el uso de CMC verifica principalmente la
enzima β-1-4 – endoglucanasa, de igual manera al presente proyecto, podría dar razón
a la diferencia en condiciones óptimas de degradación respecto a lo expresado por Kim
y col. (90) que el C. funkei presenta una maquinaria enzimática con ciertas variaciones
59
a la de los microorganismos con celulosomas (92), que le permite degradar dichas
sustancias poliméricas en diversas condiciones, en apoyo a lo anteriormente
presentado, se encuentra que existen otras cepas bacterianas, como Bacillus subtilis
SU40, que también presentan optima descomposición de la celulosa en medios
alcalinos y bajo medios con alta concentración de iones y surfactantes (93).
Fig. 17. Porcentaje de Hidrolisis de Celulosa
Pues bien, la actividad enzimática puede ser potenciada por el uso de otras especies
que presenten alta maquinaria enzimática, y ello se aprecia en el ensayo de crecimiento
conjunto, llevado a cabo con un inoculo mixto de C. funkei y P. aeruginosa, donde se ha
encontrado respecto a esta última que del género Pseudomonas se reportan especies
con capacidad celulolíticas, que tienen poca incidencia a nivel clínico, tal como P.
nitroreducens y P. putida, estas especies, aunque no expresan cantidades exorbitantes
de enzimas celulolíticas, se han encontrado ampliamente asociadas a organismos de
la macrofauna edáfica, en especial a lombrices de tierra y escarabajos (93,94). Durante
el ensayo realizado, se tomó una especie con mayor frecuencia aislada, no solo
ambientalmente, P. aeruginosa, que en sinergia con el conocido celulolítico, C. funkei,
presentaron una respuesta positiva, encontrando una concentración de glucosa de
402,64 ppm, mayor a la presentada por C. funkei de manera independiente, por otro
lado, y en coherencia a lo reportado para la actividad de β-1-4 – endo glucanasa, dicha
degradación se presentó en medios ácidos (85, 95).
60
Retornando a la composición de los compuestos de los desechos papeleros, luego de
la gran cantidad de papel, se encuentra la composición de sus tintas, que como se h
citado anteriormente, las tintas de mayor uso, poseen alta cantidad de poliestireno, que
luego de tratamiento a la fibra se disuelve a compuestos sencillos, donde tiene lugar el
estireno entre los demás hidrocaburos derivados
En lo que respecta al crecimiento a nivel general dentro del ensayo de degradación de
estireno, es decir la variación de la biomasa, se evidencia en estos tres ensayos una
larga fase de adaptación, donde inclusive se evidencia cierto grado de disminución en
la biomasa, posterior a la hora 196, se genera un patrón de crecimiento según su pH,
en el medio ácido y neutro , se encuentra caracterizado, un crecimiento típico, en fase
acelerada y exponencial desde la hora 200 hasta la 312, para los pH alcalino, se aprecia
un leve crecimiento estacionario con rápida tendencia a la muerte, siendo el inoculo
mixto el ensayo con mayor disminución de su biomasa, este comportamiento se ve
amparado por lo expuesto por Hazrati y col (80), donde exponen que el estireno
presenta un lento consumo, en dicho estudio, 80 mg/L fueron consumidos después de
27 horas, lo que permite deducir que para la concentración utilizada en este estudio, el
tiempo de consumo inicial sea más amplio y se refleje en la escasa multiplicación
bacteriana durante las primeras horas, por otro lado, también evidencian en su ensayo
de crecimiento frente a diferentes concentraciones de estireno y etilbenceno, que en
altas concentraciones, se presenta inhibición bacteriana (96, 80), lo que puede explicar
el descenso en cierta parte de la biomasa de los ensayos.
En lo referente la degradación enzimática del estireno, se encuentran microrganismos
que lideran los procesos de remediación de este compuesto, bacterias de las clases
Proteobacteria y Actinobacteria, en primer lugar, el género Pseudomonas spp, seguido
de la actinobacteria Rhodococcus spp, lo que va en coherencia a la elección de dos
microorganismo de estas clases, P. aeruginosa (proteobacteria) y C. funkei
(actinobacteria), y un inoculo mixto de los mismos.
En el caso de la degradación de estireno por P. aeruginosa¸ se conoce por la literatura
que el género Pseudomonas presenta una alta capacidad de reducir el estireno, tal
como se aprecia en el presente estudio, un porcentaje de degradación alrededor del
50% en comparación con estudios donde se degrada en casi un 100% como se
evidencia en publicaciones pioneras y base de estudios posteriores sobre la
61
degradación de estireno como la realizada por Park y col. (44), y de investigación en
compuestos clave para la producción del estireno, como el etilbenceno por
Parameswarappa y col (97), dichos estudios de igual manera al presente, basan su
metodología de en la alteración de la concentración en un medio líquido, con las
diferencias en sus concentraciones, se difiere con el presente artículo va a explicar los
disímiles en los porcentajes de degradación, radica en la especie de elección, Park y
col. (44), realiza el ensayo con P. putida y Parameswarappa y col (97). con P.
fluorecens, lo que va a da a entender que dichas especies de manera individual
expresan mayor cantidad de enzimas reducir estireno, posiblemente estireno
monooxigenasa (SMO) y estireno 2,3-dioxigenasa (98, 99). Por otro lado, en estudios
más recientes llevados a cabo por bacterias del mismo género, se evidencia que en
biofiltros con adiciones de estireno bajo presión en gas, también se lleva a cabo un
porcentaje de remoción oscilante entre 55%-97% según sus condiciones (100).
Teniendo en cuenta las condiciones de la enzima bacteriana, tanto Park y col (44) como
Parameswarappa y col (97), exponen que la SMO expresada por la P. putida SN1 y P.
fluorescens CS2, respectivamente, presentan un pH óptimo de 7, condición que
comparte la cepa utilizada para el presente estudio, pero, P. aeruginosa presento un
mayor porcentaje de degradación (45,46%) en pH 10, lo que podría suponer, que la
enzima SMO no sería la única responsable de la reducción de estireno presente en la
muestra, ya que se aprecia que las dioxigenasas presentan un rango de pH oscilante
entre 6-8 (101), por lo cual el estireno podría ser reducido por la vía de oxidación de
cadena lateral o un ataque directo al anillo bencénico, es decir por utilizando la vía de
los alquil-catecoles (99, 102).
Por otro lado, también se sometió a C. funkei de manera independiente al ensayo de
degradación de estireno, este género de microorganismo propio del suelo, para el año
2010, según lo descrito por Kampfer (103), se inició el análisis con este genero,
planteado con poca actividad para metabolizar hidrocarburos, en contraste a ello, en
años posteriores se ha expuesto en diferentes reportes su capacidad de degradación
de degradar crudo, PAHs y plásticos, especialmente en polietileno (104-107), dentro de
las especies aisladas con dicha maquinaria enzimática se encuentra C. cellulans y C.
funkei, esta última especie fue utilizada durante el presente ensayo, y presentó frente
al estireno un porcentaje máximo de degradación de 38,71% en medio altamente
alcalino (pH 10), además de presentar un porcentaje similar para la hora 192 de 31,54%
del medio acido (pH 5), de igual manera a P. aeruginosa se plantean dos posibles rutas
62
de degradación del estireno, para medio alcalino la vía de los alquil-catecoles y para
medio acido, la vía de las monooxigenasas, siendo esta última menos exitosa puesto
que para la hora 312 se da un leve aumento, lo que simboliza la posible poca expresión
de la SMO en C. funkei.
Respecto al ensayo de con el inoculo mixto de P. aeruginosa y C. funkei, se obtuvo en
el crecimiento sinérgico de dichos microorganismos el mayor porcentaje de degradación
de todo el ensayo, un total para la hora final (312 hs) de 55,70% a un pH neutro, lo que
da a entender que posiblemente la riqueza enzimática de Pseudomonas induzca y
potencie las enzimas presentes en C. funkei.
Por otra parte, tal como se apreció en ambos en los ensayos de degradación, el hecho
de utilizar de manera conjunta dos cepas reconocidas por capacidad enzimática,
evidenciamos como estas presentan el mayor porcentaje de consumo del sustrato
utilizado, y esto se podría explicar a la posible interacción ocurrida por dichos
microorganimos mediante el Quorum Sensing, la cual es una interacción interspecie
ocurrida mediante señales moleculares que permiten a la bacteria regular sus procesos
fisiológicos, de acuerdo a la densidad microbiana circundante y las condiciones del
medio, permitiendo de esta manera la inducción (o bien inhibición) de moléculas, que le
permitan adaptarse a las diversas situaciones que lo circunden, de esta manera permite
la formación de biofilms, metabolitos segundarios, exopolisacáridos, quimiotaxis,
motilidad, transferencia horizontal de genes y la expresión de genes claves en
procesos de catabolismo (108, 109), dentro de los géneros bacterianos con mayor
capacidad de expresión de moléculas de quorum sensing se encuentra la P. aeruginosa,
por ello, podría ser posible que dicho microorganismo liderara la señalización celular
que potenciara la producción de enzimas tanto celulolíticas (para celulosa) como
oxidoreductasas (para estireno).
Cabe resaltar que los presentes ensayos son realizados en comparación con las
diversas condiciones en las cuales es sometido el papel para su reciclaje, apuntando
principalmente al proceso de destintado, que presenta diferentes condiciones,
principalmente en las variaciones de pH, presentándose en medios ácidos, neutros,
álcali-reducidos -alrededor de pH 8- y alcalino (89). A pesar de ser una herramienta
altamente eficiente parta el proceso de destintado, las enzimas industriales utilizadas se
enfocan principalmente en la remoción de la tinta de la fibra de papel, siendo el auge de
las enzimas lignoceluloliticas, ya que las enzimas microbianas ejercen de manera eficaz
63
la remoción de tinta, especialmente de la tinta proveniente de Tóner (110). Teniendo en
cuenta dichos aspectos, es necesario conocer que el destintado en medio alcalino ha
sido el medio más efectivo de remoción de la tinta de las fibras, comportamiento que se
ve reflejado en el ensayo realizado frente a estireno para las cepas independientes, pero
llevando a cabo una acción sinérgica, se aprecia la eficiencia de reducción en el medio
neutro, para la descomposición de la celulosa, se ha preferido el uso de celulasas
acidas, hecho que de igual manera se aprecia en el presente estudio donde el
porcentaje de sacarificación redondea el 200%.
64
9. CONCLUSIONES
Es de gran importancia llevar a cabo el seguimiento al comportamiento microbiano
frente a diferentes compuestos, ya que estos microorganismos poseen una versatilidad
metabólica bastante amplia que les permite adecuarse en sus diferentes medios de
supervivencia, no solo a nivel clínico, generando diversas vías de evasión a los
tratamientos, sino a las condiciones adversas que pueden enfrentar en su habitad
natural, este ha sido el blanco de estudio en las diversas ramas de la biotecnología.
Con base en ello, de este proyecto se puede confirmar que esta capacidad de
adaptación si es expresada por estos microorganismos, más específicamente aquellos
presentes en los suelos de la región caribe colombiana, y que apuntando a miras de
ambientes altamente contaminados con diversos xenobióticos se verifica que estos
poseen no solo la capacidad de tolerancia, sino que también aportan la estabilización
e inclusive reducción significativa de la concentración de dichos contaminantes, puesto
que cuentan con las enzimas capacitadas para catabolizar estas moléculas. Se
encontró que de manera independiente, en diferentes variaciones de pH, Pseudomonas
aeruginosa está adaptada frente a degradación de hidrocarburos, estireno
específicamente, al igual que Cellulosimicrobium funkei frente a altas concentraciones
de materia orgánica rica en celulosa, pues bien, gracias a la simbiosis llevada a cabo,
se logró potencializar dicha capacidad enzimática, pues dentro de los ensayos
realizados, el que se llevó a cabo con el inoculo mixto presento el más alto porcentaje
de hidrolisis de celulosa, en su totalidad y reducción de estireno, mayor al 50% de la
concentración inicial, en un tiempo aproximado a 15 días.
Por otro lado, conociendo ya las óptimas condiciones de actividad enzimática frente a
ambos sustratos, utilizando un medio rico en sales y con presencia de ciertos iones, a
similitud de las condiciones industriales, se concluyó que en condiciones de pH neutro
se podría llevar a cabo una óptima reducción de ambos compuestos de manera conjunta
utilizando los microorganismos de estudio. En caso tal, se quisiese llevar a cabo una
reducción de sustratos de manera independiente, lo ideal sería entonces, en medio
alcalino, frente a celulosa pH óptimo de 5 y a estireno un pH óptimo de 7, aunque es
posible para el caso de este sustrato variar de pH con inoculo puro de P. aeruginosa
hasta un pH de 10. Dichos datos permiten de manera amplia reflejar diversas vías de
reciclaje que son llevadas a cabo y de manera más sostenible lograr la reducción del
papel de desecho que es rico en estos compuestos.
65
10. LIMITACIONES
Durante el presente proyecto se enfrentaron las siguientes limitaciones:
Limitaciones temporales, respecto a los tiempos de obtención de los sustratos,
que las casas comerciales a nivel nacional se vieron en la necesidad de realizar
la importación de dichos productos, tramites que suelen ser altamente inexactos
en las fechas de entrega y por ende, tardanza en la ejecución de los ensayos.
Limitación metodológica, se vio en la necesidad de reestablecer partes de ciertas
procesos debido a la poca disposición de ciertos equipos especializados.
Limitación teórica, ya que la bibliografía de ciertos ensayos no se encuentra
plenamente actualizada y dichas metodologías difieren puntualmente respecto
al presente proyecto.
11. RECOMENDACIONES
Se recomienda seguir profundizando las investigaciones en el área de biotecnología,
frente a diferentes xenobióticos, apuntando especialmente a aquellos que por su
naturaleza química pueden bioacumularse y biomagnificarse ya que van a representar
un potencial peligro no solo al ambiente sino a la población que tenga contacto con las
matrices donde se sitúen o sus afluentes.
66
12. ADMNISTRACIÓN DEL PROYECTO
12.1. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
FECHAS ACTIVIDAD
2016 2017 2018
Julio -
noviembre
Febrero -
Abril
Mayo -
Agosto
Septiembre
- Diciembre
Enero -
Marzo
Abril –
Mayo
Junio - Julio Agosto -
Septiembre
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
Revisión bibliográfica
Desarrollo de la propuesta
Desarrollo del proyecto
Recepción de reactivos y preparación de las cepas
Ensayo
Tabulación de datos
Análisis e interpretación
de los resultados
Presentación del informe
final y Sustentación
67
12.2 PRESUPUESTO GENERAL
En pesos $ colombianos
Ítem presupuestario Valor Total
Recurso Humano 2.800.000
Equipos 28.166.100
Reactivos y elementos de laboratorio 8.261.700
Material de Oficina 178.000
Gastos de Transporte 800.000
Imprevistos 250.000
Total 40.445.800
12.1.1. Recursos humanos:
Investigador/Experto/
Auxiliar
Formación
Académica
Función
dentro del
Proyecto
Dedicación
Horas/Sema
na
Valor
Piedad Astrid Franco
Anaya
Bacterióloga
Magister
Director 4 2.800.000
Irina Patricia Tirado
Ballestas
Bacterióloga
MSc. PhD (c)
Co- director 8 Aporte U. de
Cartagena
Wendy Johanna Moreno
Díaz
Estudiante Investigador 8 0
Total 2.800.000
12.1.2. Equipos:
Equipo Utilidad Valor
Cabina de Flujo
Laminas
Manipulación
Microorganismos
6.200.000
Microscopio óptico Lectura de tinciones 645.000
Nevera Preservación de muestras 775.000
Autoclave Esterilizar 625.000
Espectofotometro Lectura Concentraciones 17.490.000
Baño serológico Preparación de Muestra
para DNS 950.000
Balanza Peso de medios y reactivos 958.500
pHmetro Medición pH Medios 427.600
Micropipeta 1000 ul Preparación de ensayo 50.000
Micropipeta 100 ul Preparación de ensayo 45.000
Total 28.166.100
Apoyo en especie por la Universidad de Cartagena.
12.2.3 Reactivos y elementos de laboratorio:
Producto Utilidad Cantidad
(Und)
Valor
Unitario
Valor Total
68
Medio LB Cultivar Bacterias 1 800.000 800.000
Caldo LB Inocular Bacterias 1 250.000 250.000
Glicerol Almacenamiento
Bacterias
1 350.000 350.000
Colorantes Tinción de
Gram
Verificación
Morfología
Bacteriana
1 kit 914.000 914.000
Solución Salina Lectura Gram 1 3.000 3.000
Kit BBL Crystal Identificacion
Bacteriana
2 400.00 800.000
Estándar Analítico
Estireno
Ensayo de
Degradación
1 397.000 397.000
Carboximetilcelulosa Ensayo de
Degradación
1 524.000 524.000
Reactivo DNS Medición de
Glucosa
1 63.600 63.600
Tartrato de Sodio Medición de
Glucosa
500 g 184.000 184.000
Glucosa Anhidra Medición de
Glucosa
250 g 100.000 100.000
Ácido Sulfúrico Limpieza 1 L 124.000 124.000
Dicromato de Potasio Limpieza 500 g 473.000 473.000
Hipoclorito Limpieza 2.5 L 260.000 260.000
Dimetilsulfoxido Dilución Estireno 1 L 362.000 362.000
Fosfato dipotásico Medio salino 250 g 83.000 83.000
Sulfato de Manganeso Medio salino 1 kg 832.000 832.000
Cloruro Férrico Medio salino 500 g 354.000 354.000
Hidróxido de Sodio Ajuste pH
Medición Glucosa
1 67.900 67.900
Ácido clorhídrico Ajuste pH 1 53.700 53.700
Agua MiliQ Preparación Medios
y Soluciones
1 89.700 89.700
Caja de Petri (vidrio) Cultivar Bacterias 20 3.000 60.000
Tubo de Vidrio 5 ml Ensayo
degradación
Celulosa
60 1500 90.000
Enrlenmeyer de 600 ml Preparación de
Medios
2 11.000 22.000
Portaobjetos Lectura de gram 1 15.000 15.000
69
Frasco tapa azul 50 ml Preparación de
Medios
12 17.100 205.000
Frasco tapa Azul 200 ml Preparación de
Medios
4 20.000 80.000
Frasco Serológico 35 ml Ensayo
degradación
Estireno
72 400 28.800
Frasco serológico ámbar
10 ml
Ensayo
degradación
Estireno
10 500 5.000
Pipeta 10 ml Preparación de
Medios y
Soluciones
1 7.500 7.500
Pipeta 5 ml Preparación de
Medios y
Soluciones
4 6.500 26.500
Puntas Micropipeta
1000 ul
Ensayo
Degradación de
Celulosa
1 Bolsa 140.000 140.000
Puntas Micropipeta 100
ul
Ensayo
Degradación de
Celulosa
1 Bolsa 62.000 62.000
Microplaca 96 pozos Verificación
Densidad Óptica
Biomasa
1 caja 138.500 138.500
Tubo Falcon 50 ml Almacenamiento
Reactivos
12 3.000 36.000
Tubo Eppendorf Almacenamiento
Bacterias
24 4.000 96.000
Jeringa 10 ml Ensayo
degradación
Estireno
5 600 3.000
Jeringa 5 ml Ensayo
degradación
Estireno
10 500 5.000
Jeringa 3 ml Ensayo
degradación
Estireno
60 500 30.000
Jeringa Insulina 100
unid.
Ensayo
degradación
Estireno
5 600 3.500
Guantes Protección 2 500 40.000
Gorros Protección 2 600 15.000
Tapabocas Protección 1 10.000 10.000
70
Algodón Esterilizacion 1 2.000 4.000
Cinta de enmascarar Esterilizacion 5 3.000 15.000
Papel craff Limpieza-
Esterilizacion
3 10.000 30.000
Papel absorbente Limpieza 3 3.000 9.000
Total 8.261.700
12.2.4 Material de oficina:
Producto Utilidad Cantidad Valor Unitario Valor Total
Tinta de impresión
negra
Impresión 1 35.000 35.000
Tinta de impresión
color
Impresión 1 60.000 60.000
Lapiceros Tomar apuntes 5 1.000 5.000
Marcador para virio Marcar material
de vidrio
10 3.000 30.000
Borrador Borrar 1 3.500 3.500
Carpetas Archivar los
trabajos
2 4.000 8.000
Engrapadora Grapar las hojas 1 6.500 6.500
Calculadora Calcular los datos 1 30.000 30.000
Total 178.000
12.2.5 Gastos de transporte:
Transporte Tipo Valor
Transporte
Interno 800.000
Total 800.000
71
13. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. Teschke K, Demers P. Capítulo 72. Industria del papel y la pasta de papel.
En: Enciclopedia de la OIT. Instituto Nacional de Salud e Higiene en el
trabajo. 2012. 1-21. Documento web disponible en
http://www.insht.es/InshtWeb/Contenidos/Documentacion/TextosOnline/Enci
clopediaOIT/tomo3/72.pdf
2. ASPAPEL. Memoria de Sostenibilidad. Asociacion Española de Fabricantes
de Pasta PyC, editor. España; 2017.
3. ASPAPEL. Economia circular del papel. Asociacion Española de Fabricantes
de Pasta PyC, editor. España; 2015. Madrid. Disponible en:
http://www.aspapel.es/sites/default/files/publicaciones/doc_348.pdf
4. Leon Nieto M, Fuentes Medina E. Diseño de un proceso para la fabricación
de papel reciclado ecológico a escala laboratorio usando peróxido de
hidrógeno [Internet]. Cartagena: Universidad de Cartagena; 2012.
Documento webdisponible: en:
http://190.242.62.234:8080/jspui/bitstream/11227/112/1/TESIS%20DE%20G
RADO.pdf
5. Santamaria AM, Alzate HH, Quintana GC, Velasquez JA. Biotecnologia en el
reciclaje del Papel. En Zanuttini MA, editor. Reciclado Celulosico.; 2012.
6. Llenque Díaz A, Muñoz Ríos, Espejo Vargas E, Moreno Ruiz. Producción de
celulasas por Aspergillus niger a partir de bagazo de caña de azúcar en
biorreactor aireado. Ciencia y Tecnología. 2015; 4: p. 39-49.
7. Yuan Y, Hu Y, Zhang H, Leng J, Li F, Zhao X, et al. Characterization of a
recombinant multifunctional glycoside hydrolase family 3 b-xylosidase/ alfa-
1arabinofuronasidase/ b-glucosidase from Cellolosimicrobium cellulans sp.
Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2016 September; 65.
8. Young D, ham SJ, Kim HJ, Lee MH, Cho HY, Shin DH, et al. Novel modular
endo-b-. 1,4 xylanase with transglycosylation activity from Cellulosimicrobium
sp. strain HY-13 that is homologus to inverting GH family 6 enzymes.
Bioresource Technology. 2012 marzo; 25(32).
9. Desvuax D. The cellulosome of Clostridium cellulolyticum. Enzyme and .
Microbiological Technology. 2005; 37(4): p. 373-385.
10. Bhat MK, Bhat S. Cellulose degrading enzymes and their potential industrial
. applications. 1997.
11. Mooney A, Ward P, O’Connor K. Microbial degradation of styrene:
biochemistry, molecular genetics, and perspectives for biotechnological
applications. Applied Microbiology and Biotechnology. 2006; 72(1).
72
12. Hoornweg D, Bhada-Tata P. What a waste. Review. Washington, DC: Urban
Development & Local Government Unit. The World Bank; 2012. Report No.:
15.
13. Saez A, Urdaneta G, Joheni A. Manejo de residuos solidos en America Latina
y el Caribe. Omnia. 2014 septiembre-diciembre; 20(3).
14. Duque P, Carrillo J, Villalba V, Ramos C, Ojeda A, Velazques H, et al.
Disposicion Final de Residuos Solidos. Informe Nacional. Superintendencia
de Servicios . Públicos Domiciliarios; 2015. Report No.: 7.
15. Cartagena como Vamos. Cartagena como Vamos. [Online]; 2016. Available
from: http://www.cartagenacomovamos.org/nuevo/wp-
content/uploads/2014/08/Presentacio%CC%81n-RS-y-EP.pdf
16. Garnica-Daza C. Alternativos de gestión de lodos papeleros. Repositorio
Universidad Javeriana. 2013.
17. Pedraza G, Villamil F, Bolaños H, Otaalora Z, Rodriguez D, Granados J, et
al. Guia para la gestion y el manejo integral de Residuos de Industria de
Impresion y . Litografia Torres G, editor. Bogota: 2010.
18. Ramirez R, Avila LG, Gallardo MG. Estudio sobre el impacto de contratacion
y uso de cartuchos de impresion y toner no originales en instituciones
públicas.. CONACYT, editor. Mexico: INFOTEC; 2015.
19. Martínez–Prado A, Pérez–López ME, Pinto–Espinoza J, Gurrola–Nevárez
BA, Osorio–Rodríguez AL. Biorremediación de suelo contaminado con
hidrocarburos empleando lodos residuales como fuente alterna de nutrientes.
Rev. Int. Contam. Ambient vol.27 no.3 México ago. 201.
20. Suzuki M, Matsumura C, Nakaro T, Imaishi H. Investigation of environmental
contaminationof mono-isopropylnaphthalene, di-isopropylnaphthaleneand tri.
isopropylnaphthalene in Hyogo in Japan. Environmental Science and
Pollution Research. 2012 Noviembre; 19(o): p. 3959–3968.
21. Hewlett-Packard. [Online]; 2003. Available from:
http://h22235.www2.hp.com/hpinfo/globalcitizenship/environment/productdat
a/pdf/lj_ c3105a_es_spa_v4.pdf.
22. Porras-Jimenez BM. Determinación cuantitativa de estireno y sus efectos en
la salud de los trabajadores de la industria de carroceros del canton ambato.
Tesis. . Repositorio Universidad Tecnica de Ambato; 2014 Julio.
23. Colombia. Ministerio de Salud y Proteccion Social. Plan Decenal de Salud
Publica 2012-2021: La Salud en Colombia la construyes tú. Informe
Institucional. Bogotá: Ministerio; 2012.
73
24. Colombia. Ministerio de Salud y proteccion social. Decreto 4741 2005.
Bogota: Ministerio; 2014 Febrero 19.
25. Colombia. Ministerio de Ambiente, Vivienda y desarrollo territorial. Decreto
4741 2005. Bogota: Ministerio; 2005 Diciembrre 31.
26. Naciones Unidas. Programa de las Naciones Unidas para el medio ambiente.
[Online].; 2010. Available from: .
http://www.unep.org/yearbook/2010/PDF/UNEP_ES_2010_low.pdf.
27. Colombia. Alcaldía Mayor de Bogotá D.C. Secretaría Jurídica Distrital.
Proyecto de Acuerdo 71 de 2010. Bogotá. Concejo de Bogotá. Disponible en:
http://www.alcaldiabogota.gov.co/sisjur/normas/Norma1.jsp?i=38899
28. Colombia. Ministerio de Interior. Plan de Gestion Ambiental. Bogota. El
Ministerio; 2013. Disponible en:
http://www.mininterior.gov.co/sites/default/files/plan_de_gestion_ambiental_
2013_0.pdf
29. Colombia. Ministerio de Vivienda, Ciudad y Territorio Informe Cero Papel.
Documento Buenas Practicas. El Ministerio; 2013. Disponible en:
http://www.minvivienda.gov.co/Documents/Buenas%20practicas%20CERO
PAPEL%20Sector.pdf
30. Colombia. Departamento Nacional de Planeación. Informe Nacional de
Aprovechamiento. Superintendencia de Servicios Públicos Domiciliarios;
2016. Disponible en:
http://www.andi.com.co/Uploads/22.%20Informa%20de%20Aprovechamient
o%20187302.pdf
31. Isagen. El control de olores en procesos industriales. Disponible en:
https://www.isagen.com.co/SitioWeb/delegate/documentos/publicaciones-
tecnicas/2016/boletin-agosto.pdf
32. Torrez Martinez D, Orozco Soto M, Flores Juarez JL, Prado Barragan LA,
Gutierrez Rojas M, Aguilera Vazquez L, et al. Tolerancia de E.coli a
diferentes tipos de liquidos . ionicos para su aplicacion en biorreactor de
particion. In XII Congreso Nacional de Biotecnologia y Bioingenieria; 2007;
33. Medina Moreno SA, Huerta Ochoa S, Lucho Constantino CA, Aguilera
Vazquez L, Jimenez Gonzales A. Modelado de la biodegradación en
bioreactores de lodos de hidrocarburos totales del petróleo intemperizados
en suelos y sedimentos. Revista Mexicana de Ingenieria Quimica. . [Online].;
2009. Available from: http://www.scielo.org.mx/pdf/rmiq/v8n3/v8n3a2.pdf
34. Gonzales C, Villa JM, Velasco R. Biotecnologia: Desde el punto de vista de
los negocios. Facultad de ciencias agropecuarias. 2007 Marzo; 5(1).
74
35. San Andres M, Chércoles R, De la roja J, Gomez M. Factores responsables
de la degradación química de los polímeros. Efectos provocados por la
radiación lumínica .sobre algunos materiales utilizados en conservación:
primeros resultados. In “técnicas de documentación, Conservación y
restauración del Patrimonio. Madrid: Universidad Complutense de Madrid;
2010.
36. Babot E. Utilizacion de enzimas en la industria de pasta y papel Sevilla:
Universidad 1 de Sevilla; 2010.
37. Carreño L, Caicedo L, Martinez C. Técnicas de fermentación y aplicaciones
de la 2 celulosa bacteriana: una revisión. Ingeniería y Ciencia. 2012
Septiembre; 8(16).
38. Billmeyer F. Ciencia de los polímeros. 1st ed. Barcelona: Reverte; 1975.
39. New Jersey Departament of Health. [Online].; 2012. Available from:
http://nj.gov/health/eoh/rtkweb/documents/fs/1748sp.pdf.
40. Varela G, Grotiuz G. Fisiología y metabolismo bacteriano. In Republica
DByVUdl. Temas de Bacteriologia y virologia medica. 3rd ed. Montevideo:
Oficina del Libro; 2008.
41. Cortez B. Aislamiento de microorganismos productores de celulasas alcalinas
en 6 aguas termales y suelos de bosques de Contamana Iquitos: Universidad
Nacional de . la amazonia peruana; 2015.
42. Narvaez-Florez S, Gomez ML, Martinez MM. Seleccion de bacterias con
capacidad degradadora de hidrocarburos aisladas a partir de sedimentos del
caribe colombiano. Boletin del Instituto de Investigaciones Marinas y
Costeras. INVEMAR. 2008; 37(1).
43. Dhara ID, Bragradish DI. Biodeinking of old newspaper pulp using a cellulase-
free xylanase preparation of Aspergillus niger DX-23. Biocatalysis and
Agricultural . Biotechnology. 2016; 5.
44. Park MS, et al. Degradation of Styrene by a New Isolate Pseudomonasss
putida SN1. Korean J. Chem. Eng. 2005 March; 22(3).
45. Escudero E, Serna O, Hernandez J. Caracterización de actinobacterias raras,
degradadora de lignocelulosa: Demostracion de actividad lacada en dos
aoisaldos . de Tsukamurella y Cellulosimicrobium sp. Rev. Colomb. Biotecno.
2012 Diciembre; 14(2).
46. Ramirez OL, Urrego FA. Produccion de celulasas a partir del hongo
Trichoderma sp y su aprovechamiento de la fibra prensada de palma como
medio de cultivo. Boletin Alimentica. 2004; 1.
75
47. Pastra-Pacheco M, Zapateiro-Barrios G. Destintado de la pulpa de papel
reciclaje de oficina y/o fotocopiadora a través de los procesos alcalino, neutro
y enzimático en la Universidad de San Buenaventura Cartagena Cartagena:
San Buenaventura; 2002.
48. Junta de Andalucia. Ciclo de Vida del Papel. In Territorio CdMAyOd, editor.
Manueal de Ecoedicion. Sevilla: PEFC; 2013. p. 11.
49. RICOH. Guia acerca del papel. Instrucciones de uso. ; 2013.
50. ASPAPEL. Memoria de Sostenibilidad Asociacion Española de Fabricantes
de Pasta PyC, editor. España; 2015.
51. Guinea M. Diseño de planta piloto para producción de Celulosa Bacteriana
Barcelona: Escuela Tecnica Superior de Ingenieria Industrial de Barcelona;
2016.
52. Sanz A. Escuela de ingenierias industiales. Universidad de Valladolid.
[Online]. Available from: https://www.eii.uva.es/organica/qoi/tema-03.php.
53. El Tinter, Leitat, Simpple. Manual de la buenas ecoedicion Tinter E, editor.
Barcelona: Greenings Book; 2013.
54. Junta de Andalucia, Ideas, Bakeaz. Manual sobre Ecoedicion Sevilla: Vertigo.
Estudio de diseño; 2013.
55. Morleth J. Analisis microbiologico y molecular de un consorcio y una cepa
bacteriana presente en la biodegradacion de los btex Nuevo Leon, Mexico:
Universidad . Autonoma de Nuevo Leon; 2009.
56. Rodriguez-Vasquez R, Roldan-Carrillo T, Vasquez-Torres H, Cardoso-
Martines J, Torres-Dominguez A. Remocion de estireno por Phanerochaete
chrysosporium en . cultivo liquido. Interciencia. 2001 Diciembre; 26(12).
57. Agencia para sustancias toxicas y el registro de enfermedades. Centers for
Disease Control and Prevention. [Online].; 2016. Available from: .
https://www.atsdr.cdc.gov/es/phs/es_phs53.html.
58. Caballero A. Temas de Higiene de los alimentos. 1st ed. La Habana: Ciencias
Medicas; 2008.
59. Del Peso M. Estudio de la regulacion de la expresion de genes catabolas en
Pseudomonas sp Y2 Madrid: Universidad Complutense de Madrid; 2008.
60. Kennelly P, Rodwell V. Enzimas: Mecanismo de accion. In Harper.
Bioquimica Ilustrada. Mexico: Mc Graw Hill; 2012. p. 712.
61. Rojas W. Siete Pasos para implementar la Producción más Limpia en su
organizacion. Exito empresarial. 2011;(138).
76
62. Vilches L. Determinacion de la actividad de exoglucanasas de cepas fungicas
nativas de la provincia de Huylas y Huaraz Lima, Peru: Universidad Nacional
Mayor . de San Marcos; 2002.
63. Marchal R, Rebeller M, Fayolle F, Pourquie J, Vandecasteele J. Acetone
butanol fermentation of hydrolysates obtained by enzymatic hydrolysis of
agricultural . lignocellulosic residues. Elsevier applied science publishers.
1985 March.
64. Villegas S. Aislamiento de microorganismos degradadores de 2,4,6-
Trinitotolueno (TNT) a partir de ambientes contaminados con explosivos
Bogota: Universidad . Javeriana; 2009.
65. Marin L. Determinacion de contaminantes organofosforados en leche de
ganado bovino y suelo de cultivos provenientes del municipio de San
Fernando del Viento, Cordoba, y obtencion de cepas bacterianas nativas del
suelo con capacidad degradativa Cartagena: Universidad de Cartagena;
2014.
66. Castellanos B, et a. Primer caso de infección peritoneal por Oerskovia turbata
(Cellulosimicrobium funkei). Nefrologia. 2011; 31(2).
67. Brown J, et al. Characterization of clinical isolates previously identified as
Oerskovia turbata: proposal of Cellulosimicrobium funkei sp. nov. and
emended description of . the genus Cellulosimicrobium. nternational Journal
of Systematic and Evolutionary Microbiology. 2006; 56.
68. Global Biodiversity Information Facility. NCBI Taxonomy. [Online].; 2016.
Available 3 from: http://www.gbif.org/species/102561056
69. Whitman W, et al. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. 2nd ed.
Georgia: Springer Science & Business Media; 2012.
70. Petkar H, et al. Cellulosimicrobium funkei: First Report of Infection in a
Nonimmunocompromised Patient and Useful Phenotypic Tests for
Differentiation from Cellulosimicrobium cellulans and Cellulosimicrobium
terreum. Journal of microbiology. Marzo 2011; 55(4).
71. Kim D, et al. Genetic and functional characterization of an
extracellularmodular GH 6 endo-b-1,4-glucanase from an earthworm
symbiont, Cellulosimicrobium funkei HY. 13. Antonie van Leeuwenhoek. 2015
Octubre; 109.
72. Brooks G, Carrol K, Butel J, Morse S, Mietzner T. Pseudomonas,
Acinetobacter y bacterias gramnegativas infrecuentes. In De Leon J, editor.
Microbiologia Medica. . 25th ed. Mexico: Mc Grwa Hill; 2010. p. 883.
77
73. National Center for Biotechnology Information. NCBI. [Online].; 2016.
Available from:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?mode=Info&id
=287&lvl=3&keep=1&srchmode=1&unlock&lin=s&log_op=lineage_toggle
74. Colombia. Congreso de la Republica. Ley 1286 de 2009. Bogota: Congreso;
2009.
75. Colombia. Consejo Nacional de Política Económica y Social. Documento
CONPES 0 3697. Bogota: CONPES, Departamento Nacional de Planeacion;
2011.
76. Colombia. Consejo Nacional de Política Económica y Social. Documento
CONPES 1 3527. Bogota: CONPES, Departamento Nacional de Planeacion;
2008.
77. Koneman E, et al. Diagnóstico microbiólogico Texto y Atlas en color.
Argentina. Ed. Panamericana. 6 ed. 2008.
78. Trabajo indsehee. Fichas Internacionales de Seguridad Química. [Online].;
2006. Available from: .
http://www.insht.es/InshtWeb/Contenidos/Documentacion/FichasTecnicas/FI
SQ/Fich eros/0a100/nspn0073.pdf
79. Seo TK, Park IH, Piao MY, Lee, CH, Ha, JK. Characterization of cellulolytic
and xylanolytic enzymes of Bacillus licheniformis JK7 isolated from the rumen
of a Native Korean Goat. Asian-Australas J. Anim. 2013; 26(1):50-58.
80. Hazrati H., Shayegan J, Seyedi SM. Biodegradation kinetics and interactions
of styrene and ethylbenzene as single and dual substrates for a mixed
bacterial culture. Journal of Environmental Health Science & Engineering,
2015; 3(72): 1-12. Doi: 10.1186/s40201-015-0230-y
81. Gaigalas AK, Wang L, Choquette S. Measurement of Scattering and
Absorption Cross Sections of Microspheres for Wavelengths between 240 nm
and 800 nm. J Res Natl Inst Stand Technol. 2013 Jan 10; 118:1-14. Doi:
10.6028/jres.118.001
82. Jaramillo B, Tobón A, Ballestas I. Organophosphorus pesticides degrading
bacteria present in contaminated soils. Revista Ciencias Técnicas
Agropecuarias 2016; 25
83. Ávila Núñez R, Rivas Pérez B, Hernández Motzezak R,Chirinos, M.
Contenido de azúcares totales, reductores y no reductores en Agave cocui
Trelease. Multiciencias, 2012, 12 (2): 129-135.
78
84. Moralez Vazques O. Etanol lignocelulósico, a partir de cascarilla de café, por
medio de hidrólisis quimica-enzimática y fermentación (tesis de maestría).
Universidad veracruzana. México; 2015.
85. Salcedo Mendoza J, Galán López J, Pardo Flórez L. M. Hidrólisis enzimática
de residuos de la cosecha de caña de azúcar. Rev. colomb. Biotecnol., 2012;
14 (1): 171-181. ISSN impreso 0123-3475. ISSN electrónico 1909-8758.
Disponible en:
https://revistas.unal.edu.co/index.php/biotecnologia/article/view/32797/3836
1
86. Tirado-Muñoz, O., Tirado-Ballestas, I., Castro, I., Morales-Aleans, M.,
Orozco-Ugarriza, M., Barreto-Maya, A. Degradación de materia orgánica por
cepas bacterianas en la ciénaga de las Quintas. CienciActual, 2014; 4: 5-13.
Disponible en:
http://revistas.usb.edu.co/index.php/Cienciactual/article/view/2140/1861
87. Thatoi, H., Das, S., Mishra, J., Prasad Rath, B., Das, N Bacterial chromate
reductase, a potential enzyme for bioremediation of hexavalent chromium: A
review. Journal of Environmental Management, 2014; 146: 383-399.
http://dx.doi.org/10.1016/j.jenvman.2014.07.014
88. Martino, C., Lopez, N., Raiger Lustman, L. Isolation and characterization of
benzene, toluene and xylene degrading Pseudomonas sp. selected as
candidates for bioremediation. International Biodeterioration &
Biodegradation, 2012; 67: 15-20. Doi: 10.1016/j.ibiod.2011.11.004.
89. Alzate, A., Alzate H Métodos utilizados en el destintado de papel de
desperdicio – aproximación al estado del arte. Revista de Investigaciones
Aplicadas, 2012; 6(1): 9-25.
90. Kim, D., Lee. M., Cho, H., Lee, J., Lee, M. et al Genetic and functional
characterization of an extracellular modular GH6 endo-b-1,4-glucanase from
an earthworm symbiont, Cellulosimicrobium funkei HY-13. Antonie van
Leeuwenhoek, 2016, 109; 1–12. Doi: 10.1007/s10482-015-0604-2.
91. Jung-Hoon, Y., So-Jung, K., Schumann, P., Tae-Kwang, O.
Cellulosimicrobium terreum sp. nov., isolated from soil. International Journal
of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2007; 57: 2493–2497. Doi:
10.1099/ijs.0.64889-0.
92. Wang. W, Yu, Y., Dou, T., Wang, J., Sun, C. Species of family
Promicromonosporaceae and family Cellulomonadeceae that produce
cellulosome-like multiprotein complexes. Biotechnol Lett, 2017; 4(2): 335-
341. https://doi.org/10.1007/s10529-017-2469-0
79
93. Asha, B., Sakthivel, N. Production, purification and characterization of a new
cellulose from Bacillus subtilis that exhibit halophilic, alkalophilic and solvent-
tolerant properties. Ann Microbiol, 2014; 64(4): 1839-1848. Doi:
10.1007/s13213-014-0835-x.
94. Huang, S., Ping Sheng, P., Zhang, H. Isolation and Identification of Cellulolytic
Bacteria from the Gut of Holotrichia parallela Larvae (Coleoptera:
Scarabaeidae). Int. J. Mol. Sci. 2012; 13: 2563-2577. Doi:
10.3390/ijms13032563
95. Pinheiro, G.L., Correa, R., Cunha, R., Cardoso, A.M., Chaia, C. et al. Isolation
of aerobic cultivable cellulolytic bacteria from different regions of the
gastrointestinal tract of giant land snail Achatina fulica. Front Microbiol, 2015;
20(6): 860. Doi: 10.3389/fmicb.2015.00860.
96. Montoya, S., Sánchez, O., Levin, L. Evaluación de actividades
endoglucanasa, exoglucanasa, lacasa y lignina peroxidasa en diez hongos
de pudrición blanca. Biotecnología en el Sector Agropecuario y
Agroindustrial, 2014; 12(2): 115-124. Disponible en:
http://www.scielo.org.co/pdf/bsaa/v12n2/v12n2a13.pdf
97. Parameswarappa, S., Karigar, C. & Nagenahalli, M. Degradation of
ethylbenzene by free and immobilized Pseudomonas fluorescens-CS2.
Biodegradation 2008; 19: 137-144. Doi: https://doi.org/10.1007/s10532-007-
9121-y
98. Gąszczak, A., Bartelmus, G., & Greń, I. Kinetics of styrene biodegradation by
Pseudomonas sp. E-93486. Applied Microbiology and Biotechnology, 2012;
93(2): 565–573. Doi: http://doi.org/10.1007/s00253-011-3518-6
99. Tischler, D Pathways for the Degradation of Styrene. En SpringerBriefs in
Microbiology (Ed) Microbial Styrene Degradation. 2015: 7-22. Alemania.
ISBN 978-3-319-24860-8 ISBN 978-3-319-24862-2 (eBook). Doi:
10.1007/978-3-319-24862-2
100. Portune, K. J., Pérez, M. C., Álvarez-Hornos, F. J., & Gabaldón, C.
Investigating bacterial populations in styrene-degrading biofilters by 16S
rDNA tag pyrosequencing. Applied Microbiology and Biotechnology, 2015; 99:
3–18. Doi: http://doi.org/10.1007/s00253-014-5868-3
101. Olukunle, O. F., Babajide, O., & Boboye, B. Effects of Temperature and pH
on the Activities of Catechol 2,3-dioxygenase Obtained from Crude Oil
Contaminated Soil in Ilaje, Ondo State, Nigeria. The Open Microbiology
Journal 2015; (9): 84–90. Doi: http://doi.org/10.2174/1874285801509010084
80
102. Nogales J., García J.L., Díaz E. Degradation of Aromatic Compounds in
Pseudomonas: A Systems Biology View. En Rojo F. (eds) Aerobic Utilization
of Hydrocarbons, Oils and Lipids. Handbook of Hydrocarbon and Lipid
Microbiology.. Springer, Cham. Online ISBN 978-3-319-39782-5. 2017. Doi:
https://doi.org/10.1007/978 -3-319-39782-5_32-1
103. Kämpfer P. Actinobacteria. In: Timmis K.N. (eds) Handbook of Hydrocarbon
and Lipid Microbiology. Springer, Berlin, Heidelberg. 2010. Doi:
https://doi.org/10.1007/978-3-540-77587-4_133
104. Shaieb, F.M., Elghazawani, A.H., Ahmed, I. Studies on crude oil degrading
Bacteria isolated from Libyan desert. Int.J.Curr.Microbiol.App.Sci, 2015; 4(2):
920-927. Disponible en: https://www.ijcmas.com/vol-4-
2/Farag%20M.%20Shaieb,%20et%20al.pdf
105. Qin W, y col. Anaerobic biodegradation of benzo(a)pyrene by a novel
Cellulosimicrobium cellulans CWS2 isolate from PAH-contaminated soil. Braz
J Microbiol. 2017. http://dx.doi.org/10.1016/j.bjm.2017.04.014
106. Nakei, M. D. Isolation and identification of plastics-degrading microorganisms
from soils of morogoro, Tanzania (Tesis de Maestría). Sokoine university of
agriculture. Tanzania. 2015. Disponible en:
http://41.73.194.142:8080/xmlui/bitstream/handle/123456789/1013/MONICA
%20DANIEL%20NAKEI.pdf?sequence=1&isAllowed=y
107. Muhonja, C.N., Makonde, H., Magoma, G., Imbuga, M. Biodegradability of
polyethylene by bacteria and fungi from Dandora dumpsite Nairobi-Kenya.
PLoS One, 2018; 13(7): 2-17. Doi: 10.1371/journal.pone.0198446.
108. Gianfreda, L. Enzymes of Significance to the Restoration of Polluted Systems:
Traditional and Advanced Approaches. Revista de la ciencia del suelo y
nutrición vegetal, 2008; 8(especial): 12-22. https://dx.doi.org/10.4067/S0718-
27912008000400004
109. Mangwani N., Kumari, S., Das, S. Bacterial biofilms and quorum sensing:
fidelity in bioremediation technology. Biotechnology and Genetic Engineering
Reviews. 2016: 1-31. http://dx.doi.org/10.1080/02648725.2016.1196554
110. Bajpai, P. Deinking with Enzymes. In Pulp and Paper Consultants (eds)
Recycling and Deinking of Recovered Paper. Patiala, India. 2014.
https://doi.org/10.1016/B978-0-12-416998-2.00008-8
81
14. ANEXOS
![Enzimatica [PLM]](https://static.fdocumento.com/doc/165x107/5571f22b49795947648c476e/enzimatica-plm.jpg)
