Manual de Enzimatica

UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE TECÁMAC

DIVISIÓN DE BIOTECNOLOGÍA

ELABORO:

M. EN D. JESÚS ALARCÓN BONILLA

Q.B.P. BEATRIZ ORTEGA ESCAMILLA

I.B.Q. MÓNICA ARACELI CAMACHO GONZÁLEZ

ÍNDICE

PRACTICA No. 1 HIDRÓLISIS ÁCIDA Y ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN 2

PRACTICA No. 2 CINÉTICA ENZIMÁTICA 4

PRACTICA No. 3 DETERMINACIÓN DE Vmax Y Km Y EVALUACION DEL TIPO DE INHIBICIÓN 8

PRACTICA No. 4 PRODUCCIÓN DE AMILASAS Y CELULASAS MICROBIANAS 13

PRACTICA No. 5 OBTENCIÓN DE AMILASAS VEGETALES 15

PRACTICA No. 6 OBTENCIÓN DE LACTATO DESHIDROGENASA Y SUS COFACTORES A PARTIR DE TEJIDO ANIMAL 17

PRACTICA NO. 7 INMOVILIZACIÓN DE UNA PROTEASA VEGETAL EN RESINAS DE INTERCAMBIO IONICO Y DE ADSORCIÓN 20

ENE - ABR 2013

INTRODUCCIÓN

OBJETIVO (S)

Recordar los conceptos de hidrólisis

Identificar la estructura del almidón

Reconocer por reacciones de identificación, los compuestos resultantes de la hidrólisis ácida y enzimática del almidón.

MARCO TEÓRICO. Fundamento de reacciones

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPO

Solución del enzima: Se prepara colectando 1 ml de saliva (previo enjuague de la boca con agua destilada) y diluyéndolo hasta 10 ml con agua destilada

50 ml Solución de almidón al 2%

1 frasco HCl concentrado

1 frasco Lugol

50 ml Solución de glucosa al 2%

50 ml Solución de maltosa al 2%

1 frasco Reactivo de Benedict o Reactivo de Fehling

1 pza Vaso de precipitados de 50 ml

3 pza Vidrios de reloj

1 pza Parrilla eléctrica (o mechero/tripie/malla de asbesto)

1 pza Baño maría a 37°C

1 pza Agitador de vidrio

6 pza Pipetas Pasteur

6 pza Pipetas de vidrio de 1 ml

2 pza Pipetas de vidrio de 5 ml

2 pza Pipeta de vidrio de 10 ml

1 pza Termómetro

METODOLOGÍA

Hidrólisis Ácida

1. Agregar 20 ml de almidón al 2% en un vaso de precipitados.2. Agregar 1 ml de HCl concentrado.3. Agitar con una varilla de vidrio y llevar a un baño de Maria hirviendo, el vaso de

precipitados debe permanecer en el baño durante cada determinación.4. Anotar el tiempo de inicio de la hidrólisis,

2

PRÁCTICA No. 1

HIDRÓLISIS ÁCIDA Y ENZIMÁTICA DEL ALMIDÓN

5. Cada 5 minutos hacer una reacción con lugol en una placa de porcelana (vidrio de reloj en fondo blanco).

6. Hacer la reacción hasta que ya no haya cambio de coloración (la reacción da el mismo color del lugol). Anotar el tiempo de la hidrólisis.

7. Tomar 0,5 ml de este hidrolizado y colocarlo en un tubo de ensaye rotulado como (“ácida”)

Hidrólisis Enzimática

1. En un tubo de ensayo 16x100 medir 4 ml de almidón al 2%2. Colocar dicho tubo en un baño maría a 37ºC por 5 minutos.3. Agregar 2 ml de la solución de la enzima.4. Agitar la mezcla por golpeteo y anotar el tiempo de inicio de la hidrólisis5. Cada 5 minutos hacer la reacción con lugol hasta completar 15 minutos. 6. A los 15 minutos sin sacar el tubo de ensayo del baño maría tomar 0,5 ml del hidrolizado

y colocarlo en un tubo de ensaye etiquetado como (15´).7. Continuar haciendo la reacción con Lugol cada 5 minutos hasta los 30 minutos.8. Completados los 30 minutos, retirar el tubo del baño maría y tomar 0,5 ml de este

hidrolizado y colocarlo en un tubo de ensaye etiquetado como (30´).9. Previamente preparar tubos de ensaye con 0,5 ml de las siguientes soluciones:

Sol. Almidón al 2 % ----------------------- 0,5 mlGlucosa al 2% ------------------------------ 0,5 mlMaltosa al 2% ------------------------------- 0,5 ml

10. Para conocer el grado de hidrólisis, realizar la reacción de Benedict, adicionando a cada tubo, incluidos los hidrolizados ácido y enzimático (15´y 30´); 2,5 ml del Reactivo de Benedict. En caso de realizar la reacción de Fehling adicionar a cada tubo respectivamente, 1 ml de la solución de Fehling A y 1 ml de la solución de Fehling B.

11. Colocar todos los tubos al mismo tiempo en un baño maría de agua hirviendo por 5 minutos, retirar los tubos y observar.

RESULTADOS Y ANÁLISIS

1. Registrar en el siguiente cuadro el resultado de la reacción de hidrólisis

Reactivo Reacción de Benedict(+/–)

Grado de hidrólisis

Almidón al 2%Glucosa al 2%Maltosa al 2%Hidrolizado ácidoHidrolizado enzimático (15´)Hidrolizado enzimático (30´)

CUESTIONARIO

1. Describir los tipos de especificidad que presentan las enzimas2. En base a la utilización o no de un cofactor en la forma activa de la enzima, ¿Cómo se

clasifican las enzimas?3. ¿Cuántos tipos de cofactores existen? 4. ¿Cuál es la función de las coenzimas?5. ¿Cuál es la enzima empleada en la práctica? Escriba su nombre común, su nombre

sistemático y su número de clasificación internacional (cuatro digitos)

CONCLUSIONES Y REFERENCIAS

3

INTRODUCCION.

OBJETIVO (S)

Evaluar el efecto del pH y la temperatura sobre la transformación de un sustrato en una reacción mediada por una enzima.

Evaluar el efecto del a concentración de la enzima y de la concentración del sustrato sobre la velocidad de reacción mediada por una enzima.

MARCO TEÓRICO

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.

20 ml Solución del enzima: Se prepara colectando 1 ml de saliva (previo enjuague de la boca con agua destilada) y diluyéndolo hasta 20 ml con agua destilada.

20 ml Disolución de almidón al 0,5 %.

100 ml Solución de Lugol

20 ml Disoluciones tampón de pH 5.0; 6.8 y 8.0.

12 pza Tubos de ensayo,

1 pza placa de porcelana con excavaduras. (vidrio de reloj fondo blanco)

3 pza vasos de precipitados de 50 ml

2 pza Baño maría a 40 y 50 ºC o baños termostatado,

1 pza Cronómetro.

5 pza Goteros

2 pza Pipetas de 2 ml

1pza Termómetro

METODOLOGÍA

Estudio de la influencia de la [E].1. Tome 4 tubos de ensayo y añada a cada uno 2 ml de disolución de almidón al 0,5 %.2. Añada a cada tubo 0.1; 0.2; 0.3 y 0.4 ml de disolución del enzima respectivamente, y

complete hasta un volumen de 0,5 ml con agua. Añada primero el agua y luego la disolución del enzima, pues de lo contrario la reacción comenzará a verificarse y usted no tendrá en cuenta el tiempo transcurrido. Inmediatamente después de adicionar la solución del enzima al último tubo ponga en marcha el cronómetro y comience a medir el tiempo del experimento.

4

PRÁCTICA No. 2

CINÉTICA ENZIMÁTICA

3. En cada intervalo de 1 minuto ensaye en la placa con excavadura la reacción de la solución experimental con el Lugol: para ello sólo tiene que extraer con el gotero pequeñas cantidades de cada tubo de ensayo en reacción a una excavadura de la placa y luego adicionar una gota del reactivo de Lugol. Observe y anote el color para cada tiempo y cada tubo ensayados. En cada toma de muestra con el gotero, enjuague el mismo en agua destilada contenida en un vaso de precipitados.

4. Determine por el procedimiento anterior el tiempo que tarda cada uno de los tubos en no dar reacción alguna con el reactivo de Lugol, la mezcla de las dos gotas debe quedarse del color original del Lugol. Si desea puede adicionar en una excavadura unas gotas de agua y Lugol para tenerlo como solución de control.

5. Con los datos obtenidos construya la siguiente tabla:TUBO 1 2 3 4

Volumen de la enzima (ml)

Tiempo total de reacción (min)

Velocidad de reacción (1/min)

6. Con estos datos construya un gráfico de [E] en el eje ordenado contra velocidad de reacción (1/t) en el eje de abscisas.

Estudio de la influencia del pH.

1. En 3 tubos de ensayo vierta respectivamente 2 ml de las soluciones tampones de pH 5.0; 6.8 y 8.0.

2. Añada a cada tubo 2 ml de la solución del almidón al 0,5% y 2 ml de la solución del enzima. Incube a 40ºC y ensaye la reacción con el Lugol según se indica en el trabajo experimental del estudio de la influencia de la [E].

3. Con los datos obtenidos extraiga las conclusiones sobre el rango de pH en el cual el enzima muestra su actividad óptima.

Estudio de la influencia de [S].

1. Tome 4 tubos de ensayo y añada a cada uno 0.5; 1.0; 1.5 y 2.0 ml de solución de almidón. Complete el volumen de cada tubo hasta 2,0 ml con agua destilada.

2. Adicione a cada tubo 0,5 ml de disolución del enzima Alfa amilasa e incúbelos a 40 ºC.3. A intervalos de 1 minuto ensaye la presencia de almidón mediante la reacción con Lugol

de forma similar a como se describe en el trabajo experimental del estudio de la influencia de la [E].

4. Con los datos obtenidos construya la siguiente tabla:

5. Con los datos de la tabla construya un gráfico de velocidad de reacción (volumen / tiempo) en el eje ordenado contra volumen de sustrato en el eje de abscisas (que representa concentración de sustrato creciente en nuestro experimento).

TUBO 1 2 3 4

Volumen de sustrato (ml)

Tiempo total de reacción (min)

Velocidad de reacción (volumen/min)

5

Estudio de la influencia de la temperatura.

1. En 5 tubos de ensayo añada 5 ml de disolución de almidón al 0,5% y 1 ml de solución de enzima.

2. Ponga a hervir uno de los tubos durante 5 min y reponga el volumen de agua perdida por evaporación. Incúbelo a 40 ºC y ensaye de la forma estudiada la presencia de almidón en él a diferentes intervalos de tiempo.

3. Incube un segundo tubo a 40 ºC y un tercero a 50 ºC, y ensaye en ellos la reacción con Lugol a intervalos de 1 minuto. Anote el tiempo que se demora en desaparecer la coloración azul.

4. Un cuarto tubo incúbelo en un baño de hielo y ensaye también la reacción con Lugol.5. El último tubo déjelo a temperatura ambiente del laboratorio y ensaye con el Lugol hasta la

desaparición de la reacción positiva en intervalos de 1 minuto.

6. Con los datos obtenidos en el ensayo complete la siguiente tabla, y extraiga sus conclusiones:

Color observado a diferentes tiempos (min)

TUBOS 5 10 15 20 25 30

1

2

3

4

5

RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS

1. Describa qué características estructurales del almidón permiten su identificación mediante las disoluciones de yodo, y el efecto de la amilasa salival sobre los enlaces del almidón.

2. Anexe la tabla y el gráfico de velocidad de reacción contra [E], tomando como concentración del enzima el volumen de la solución utilizado en cada tubo. ¿Por qué se puede tomar como velocidad de reacción el inverso del tiempo?

3. Plantee las conclusiones a que puede arribar de los resultados de éste experimento.4. Describa lo observado al realizar el estudio de la influencia del pH en la velocidad de

reacción del enzima alfa-Amilasa. ¿A qué conclusión llega acerca del pH óptimo de este enzima?

5. ¿Qué efecto tendría la utilización del medio con pH muy ácido o muy básico en la realización de este ensayo?

6. Anexe la tabla y el gráfico elaborados según las indicaciones del trabajo práctico, tomando como valor de [S] el del volumen del mismo medido en cada tubo. ¿Por qué en este caso para calcular la velocidad de la reacción es necesario dividir el volumen de sustrato entre el tiempo?

7. Analice el gráfico y plantee las conclusiones a que puede llegaren este caso.8. Anexe la tabla resumen de los resultados del experimento del efecto de la temperatura

según las indicaciones del trabajo práctico.9. Explique qué le sucede al enzima del tubo que se hierve antes de incubarlo a 40 ºC10. Plantee las conclusiones a que pudo arribar en este ensayo. ¿Por qué no se debe emplear

el término de temperatura óptima?

6

CUESTIONARIO:

1. ¿Cuáles son las características estructurales del almidón?2. ¿Qué tipo de enzima es la alfa-Amilasa salival?3. ¿Cuáles son los productos que origina la acción de este enzima sobre el almidón?4. Explique cómo influyen en la velocidad de las reacciones enzimáticas una variación en la

concentración del enzima presente, en la concentración del sustrato, el pH y la temperatura.

CONCLUSIONES

REFERENCIAS

7

INTRODUCCIÓN.

OBJETIVO: El alumno realizará los cálculos necesarios para la determinación del tipo de inhibición, Vmax y Km de diferentes series de datos, en base a la cinética enzimática obtenida.

MARCO TEÓRICO.Ecuación química de la reacción catalizada de cada ejemplo. Tipo de enzima que cataliza

la reacción y vía biosintética que incluye a cada reacción.

MATERIALES Y EQUIPO.

Computadora (Excel) Listas de datos de velocidades y concentraciones de sustratos.

METODOLOGÍA

1. Entrar al programa Excel en la PC2. Introducir los datos y las fórmulas necesarias para llevar a cabo los cálculos

correspondientes.3. Obtener las gráficas necesarias.4. Interpretar los datos obtenidos y determinar lo que se pide.

DATOS

Ejercicio 1: Utilizando los siguientes datos y haciendo uso del modelo de Lineweaver-Burk y el modelo de Eadie-Hofstee, determina el valor de Vmáx y la Km por cada método y compara los

resultados.

TIEMPOVELOCIDAD(μmoles/min)

[SUSTRATO](mM)

1 18,8 32 23,6 113 29,8 184 30,5 195 35,5 216 40,5 357 45,5 418 50,5 459 55,5 6810 60,5 78

8

PRÁCTICA No. 3

DETERMINACION DE Vmax Y Km Y EVALUACION DEL TIPO DE

INHIBICION

Ejercicio 2: La sintetasa de citrato mitocondrial del cerebro de rata es inhibida por el fenil-piruvato. La actividad de la enzima se midió a tres concentraciones diferentes de acetil-CoA en presencia de cinco concetraciones diferentes de fenil-piruvato. Las velocidades iniciales de la reacción se expresan en nmoles de acetil-CoA incorporados/min·mg de proteína mitocondrial y aparecen expuestos en la siguiente tabla:

Fenil piruvato(mM)

Acetil-CoA

6,2 μM 9,3 μM 12,4 μM

VELOCIDAD(nmoles/min·mg)

0,00 247,04 276,30 300,000,77 210,00 250,00 289,661,54 181,03 233,33 280,003,10 142,37 200,00 270,976,20 101,20 157,30 247,06

Determine:

a) Parámetros cinéticos sin inhibidor b) Tipo de inhibiciónc) El valor de Ki

Ejercicio 3: Cuando se produce un infarto al miocardio, un enzima es secretado al torrente sanguíneo. En el caso de una distrofia muscular una isoenzima que cataliza la misma reacción, es secretada al torrente sanguíneo y se puede diferenciar fácilmente por tener un distinto valor de Km, (Km de la isoenzima de músculo esquelético = 2X10–5 M). Un ensayo en una muestra de sangre de un paciente que legó al hospital inconsciente dio los resultados que se indican a continuación:

VELOCIDAD INICIAL

SUSTRATO(M)

ENZIMA DEL MIOCARDIO(μmoles/mg·min)

ENZIMA DEL PACIENTE(μmoles/ml suero·min)

5,00 x 10–5 2,86 437,00 x 10–5 3,78 571,00 x 10–4 5,00 751,50 x 10–4 6,67 1002,00 x 10–4 8,00 1203,00 x 10–4 10,00 150

Determine:

a) Km de la enzima el miocardiob) Km de la enzima del pacientec) ¿Se trata de un infarto al miocardio o de una distrofia

muscular?

9

Ejercicio 4: Los eritrocitos embrionarios contienen una enzima que cataliza la reacción S P Los eritrocitos adultos también poseen la actividad de dicha enzima para catalizar la reacción S P. Algunos datos cinéticos se muestran en la tabla siguiente:

[S](M)

VELOCIDAD INICIAL(Μmoles/mg·min)

Eritrocito adulto Eritrocito embrionario1,68 x 10–5 1,05 5,002,50 x 10–5 1,54 6,663,33 x 10–5 1,98 8,005,00 x 10–5 2,86 10,007,00 x 10–5 3,78 11,671,00 x 10–4 5,00 13,331,50 x 10–4 6,67 15,001,67 x 10–4 7,15 15,402,00 x 10–4 8,00 16,00

Determine:

a) Parámetros cinéticos de la enzima en el eritrocito adultob) Parámetros cinéticos de la enzima en el eritrocito embrionarioc) ¿Qué conclusiones puede obtener referente a la identidad de

los dos enzimas?

Ejercicio 5: Se obtuvieron los datos experimentales de la velocidad de una reacción enzimática en ausencia y en presencia de varios inhibidores (A, B, C y D), cuyos resultados se muestran en la siguiente tabla:

[SUSTRATO](mM)

CONTROL+A

(5 m)+B

(20 m)+C

(2 mM)+D

(0,1 mM)0,20 16,67 6,25 5,56 10,00 8,890,25 20,00 7,69 6,67 11,11 10,810,33 24,98 10,00 8,33 12,50 13,780,50 33,33 14,29 11,11 14,29 19,051,00 50,00 25,00 16,67 16,67 30,772,00 66,67 40,00 22,22 18,18 44,442,50 71,40 45,45 23,81 18,52 48,783,33 76,92 52,63 25,64 18,87 54,004,00 80,00 57,14 26,67 19,00 57,145,00 83,33 62,50 27,77 19,23 60,60

Determine:

a) La naturaleza de cada inhibidor (tipo de inhibición)b) El valor de Ki para cada inhibidor

10

Ejercicio 6: La mono-amino-oxidasa mitocondrial de hígado de rata es inhibida por uno de los productos de la reacción, el NH3. Para determinar el efecto del NH3 sobre la reacción se realizaron dos series de experiencias:

a) En una primera serie de experimentos se fijó la concentración de O2 (0,23 mM) y se trabajó variando la concentración de benzilamina en presencia de concentraciones fijas del inhibidor. Los resultados aparecen expuestos en la siguiente tabla, donde las velocidades iniciales de la reacción se expresan en unidades arbitrarias:

BENZILAMINA(mM)

VELOCIDAD INICIAL

NH3

(mM)

0,0 50,0 100,0 150,0 200,0

0,2 0,813 0,627 0,531 0,444 0,3870,3 0,957 0,743 0,637 0,528 0,4620,5 1,093 0,858 0,741 0,627 0,5431,0 1,220 0,966 0,844 0,725 0,6272,0 1,342 1,081 0,926 0,787 0,687

b) En una segunda serie de experiencias, se mantuvo constante la concentración de benzilamina (1,0 mM) y se varió la concentración de O2 en presencia de concentraciones fijas del inhibidor. Los resultados aparecen expuestos en la siguiente tabla, en la que las velocidades iniciales de la reacción siguen expresándose en unidades arbitrarias:

OXÍGENO(mM)

VELOCIDAD INICIAL

NH3

(mM)

0,0 50,0 75,0 100,0 150,0

0,100 1,124 0,962 0,858 0,794 0,6760,136 1,342 1,130 1,000 0,909 0,7780,175 1,538 1,274 1,149 1,026 0,8660,250 1,754 1,480 1,282 1,149 0,9520,300 1,876 1,587 1,351 1,212 1,015

Determine:

a) El valor de los parámetros cinéticos en ambos casos, incluida la Ki del NH3.

b) Tipo de inhibición ejercida por el NH3 sobre ambos sustratos

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

CUESTIONARIO

1. Indique la importancia del estudio de la cinética enzimática.

2. ¿Cuáles son los parámetros cinéticos que caracterizan el estudio de la cinética de una enzima?

3. ¿Qué tipo de tratamiento matemático debe dársele a los datos obtenidos de una cinética enzimática para obtener los parámetros cinéticos?

11

4. Explique cómo durante el estudio de una cinética enzimática, los parámetros cinéticos se ven alterados en presencia de:

a. Inhibidor competitivob. Inhibidor NO competitivoc. Inhibidor Acompetitivo

5. ¿Cuál es el significado del número de recambio (“turnover number”)? ¿Cómo se mide la eficiencia catalítica?

6. Mencione 5 sustancias (fármacos) que actúen como: inhibidores competitivos, no competitivos y acompetitivos.

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFÍA

12

PRÁCTICA No. 4

PRODUCCIÓN DE AMILASAS Y CELULASAS POR

MICROORGANISMOS DEL SUELO

INTRODUCCIÓN.

OBJETIVO (S)

Analizar la actividad de enzimas producidas por los microorganismos del suelo

MARCO TEÓRICO

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS.

1 pza Placa con agar celolosa rojo congo

1 pza Placa con agar almidón

1 pza Hisopo estéril o asa bacteriológica

1 frasco Solución de benzal 100 ml

1 pza esponja

1 pza Mechero o 2 lámparas de alcohol

1 pza Frasco con 90 mL de solución salina estéril

10 gr Muestra de de suelo.

1 balanza

1 Incubadora a 28 ºC

1 frasco Solución de lugol

1 pza Pipeta pasteur

METODOLOGÍA.

A. Preparación de la suspensión:1. Pesar 10 g de muestra y realizar una dilución en 90 mL de solución salina estéril2. Homogenizar la suspensión y dejar sedimentar

B. Aislamiento de microorganismos amilolíticos1. Tomar la suspensión con un hisópo estéril y sembrar por estría masiva en la placa con agar

almidón2. Incubar la placa a 28 ºC durante 48 a 72 hr.3. Inundar con lugol las cajas y contar el número de colonias que presenten una zona clara de

hidrólisis a su alrededor .

C. Aislamiento de microorganismos celulolíticos1. Tomar la suspensión con un hisópo estéril y sembrar por estría masiva en la placa con agar

celulosa rojo congo.2. Incubar la placa a 28 ºC durante 48 a 72 hr.3. Contar el número de colonias que presenten una zona de hidrólisis a su alrededor.


Reporte en la siguiente tabla la presencia (+) o ausencia(-) de los grupos de microorganismos que se detallan.

EQUIPO AMILOLÍTICOS CELULOLÍTICOS1

13

2345678

Registrar la morfología colonial de los microorganismos observados.

Comparar el número de organismos amilolíticos y celulolíticos obtenidos por cada equipo, discuta sus resultados.

CUESTIONARIO

1. Escriba las reacciones enzimáticas realizadas por cada uno de los grupos microbianos aislados, indicando sustratos, enzimas y productos.

2. ¿A que grupo de enzimas pertenecen las estudiadas en esta práctica?3. Investigue la clasificación de las enzimas de acuerdo con la E.C.4. Mencione tres microorganismos productores de amilasa y 3 productores de celulasas5. Explique las aplicaciones industriales o ambientales de las amilasas y las celulasas6. Indique los sitios de corte de las alfa amilasas, beta amilasas, amiloglucosidasas y

pululanasas7. Explique la forma de identificar las colonias productoras de amilasas por tinción con lugol,.

CONCLUSIONES

REFERENCIAS.

14

INTRODUCCION

OBJETIVO (S)

Aplicar los diferentes métodos de extracción para la obtención de una enzima a partir de una fuente vegetal.

MARCO TEÓRICO


10 gr Semillas de gramíneas en germinación1 pza Mortero con pistilo2 pza Vaso de precipitados.1 pza Termostato.1 frasco Solución de Lugol1 frasco Solución de reactivo de Fehling o Tollens o Benedict1 frasco Glicerina pura1 frasco Solución de almidón al 5%1 pza Mechero.5 pza Goteros1 pza Embudo / Papel filtro1 pza Termómetro2 pza Pipetas de 2 y 5 ml5 pza Tubos de ensaye1 pza Placa de porcelana con excavaduras1 pza Baño maría a 45 ºC1 pza Gradilla

METODOLOGÍA

1. Prepare 30 ml de un macerado acuoso con 10 g de semillas de gramíneas germinadas teniendo en cuenta que el agua debe estar caliente (50 ºC). Añada 5 gotas de glicerina para extraer lo más posible los enzimas.

2. Deje reposar de 15 - 20 minutos de 30 - 45 ºC y filtre el extracto.

15

PRÁCTICA No. 5

OBTENCIÓN DE AMILASAS DE SEMILLAS DE GRAMÍNEAS

3. En un tubo de ensayo, introduzca 5 ml de disolución de almidón y de 1 - 2 ml del extracto. A intervalos de 5 minutos, comprobar la degradación del almidón por las amilasas ensayando una muestra del sistema de reacción en una placa con excavaduras con el reactivo de Lugol. Para reconocer la presencia de azúcares reductores (maltosa y glucosa), realizar la reacción con los reactivos de Fehling, Tollens o Benedict de una muestra de 1 - 2 ml del sistema de reacción.


1. Represente a través de una ecuación la acción hidrolítica de las amilasas del almidón (amilosa).Nota : Utilice las estructuras químicas.

1. Clasifique las amilasas de acuerdo con el Sistema Internacional.2. ¿Qué objetivo persigue realizar la reacción con el reactivo de Lugol cada cierto

intervalo de tiempo?3. ¿Qué objetivo persigue realizar al final del experimento la reacción con el reactivo de

Fehling? Represente la ecuación.

CONCLUSIONES

REFERENCIAS

16

INTRODUCCIÓN

OBJETIVO (S)

Obtener una enzima oxidorreductasa a partir de fuentes animales y observar su actividad.

MARCO TEÓRICO

MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS

1 Rata de laboratorio o conejo pequeño

1 frasco Solución de Cloruro de sodio al 0.9 %

1 frasco Solución de Cianuro de potasio al 0.5% y al 0.01%

1 frasco Solución de Lactato de sodio al 1%

1 frasco Solución deAzul de metileno 0.002M

1 frasco Solución de Fosfato dibásico de sodio 0.06M

1 frasco Cloroformo

1 frasco Nujol

5 g Arena lavada

5 pza Tubos de ensaye de 18 x 150 mm

2 pza Pipetas de 2, 5 y 10 ml

1 pza Bureta de 25 ml

3 pza Vasos de precipitados2 pza Mortero con pistilo

1 pza Matraz erlenmeyer de 125 ml

1 pza Baño maría a 37 ºC termostatado

1 pza Centrífuga

1 pza Cronometro

1 pza Termómetro

1 pza Gradilla

1 pza Tijeras

METODOLOGIA

Preparación del sistema Deshidrogenasa Láctica–NAD+

a) Preparación de la coenzima NAD+

17

PRÁCTICA No. 6

OBTENCIÓN DE LACTATO DESHIDROGENASA Y SUS

COFACTORES A PARTIR DE TEJIDOS ANIMALES

1. Matar una rata con éter, abrirla y obtener 4g de fragmentos de músculo de las patas traseras.

2. Cortar el músculo en fragmentos más pequeños y ponerlos en agua a ebullición por 5 min en un matraz Erlenmeyer de 125 ml (en proporción de 6 ml de agua por gramo de músculo)

3. Pasar la preparación a un mortero con un poco de arena (± 1 g) y triturar bien el músculo.

4. Centrifugar a 3000 rpm durante 15 min. Recuperar el sobrenadante y etiquetarlo como “Coenzima NAD+, el precipitado se desecha en el bote de la basura.

b) Preparación de la enzima LDH

1. Colocar 4 g de músculo de las patas traseras en un mortero previamente sumergido en hielo y adicionar cloruro de sodio al 0.9% (en proporción de 8 ml/g de músculo), agregar un poco de arena (± 1 g) y triturar perfectamente.

2. Dejar reposar la mezcla en el mortero por 30 min.3. Centrifugar a 3000 rpm por 15 min. Recuperar el sobrenadante y etiquetarlo como

“Deshidrogenasa Láctica, LDH”. El precipitado se desecha.

c) Determinación de actividad enzimática.

1. Mientras se obtienen los sistemas enzimáticos, preparar las 3 series siguientes en tubos de ensaye etiquetados como se indica a continuación.

NOTA: Trabajar las soluciones de CIANURO DE POTASIO con MUCHA PRECAUCION, ya que es una sustancia altamente peligrosa, no se debe de utilizar pipeta, manipular dicha sustancia con bureta y lavarse PERFECTAMENTE las manos.

Tubo No. 1 2 3 4KCN al 0.5 % (ml) 1.0 1.0 1.0 1.0Lactato al 1% (ml) 1.0 1.0 0.0 1.0Azul de metileno 0.002M (ml) 0.3 0.3 0.3 0.3Agua (ml) 0.0 1.0 1.0 1.0Sobrenadante “Coenzima” (ml) 1.0 0.0 1.0 1.0Sobrenadante “LDH” (ml) 1.0 1.0 1.0 0.0Lectura inicialLectura 15 min.Lectura 30 min.Lectura 60 min.

2. Mezclar bien el contenido de cada tubo y agregar a todos 1.0 ml de Nujol. Incubar en baño maría a 37°C y hacer observaciones a los tiempos indicados anotando en el cuadro los grados de “decoloración” con signos “+” y con “0” la falta de la misma.

NOTA: después de haber agregado el Nujol, NO agitar el contenido del tubo.


1. Escriba los resultados de decoloración en la tabla anterior.

2. Interprete el objetivo de cada tubo y el global del esquema

3. Diga cuales son las funciones de cada ingrediente adicionado.

4. Mencione otros tipos de oxidorreductasas importantes.

5. ¿Qué aplicación industrial podría dársele a las oxidorreductasas?

6. ¿Por qué se debe de manejar con PRECAUCION el cianuro de potasio?

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7. ¿Por qué es importante las condiciones de reacción del experimento?

CONCLUSIONES

REFERENCIAS

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INTRODUCCIÓN

OBJETIVO

Evaluar la efectividad del intercambio iónico como método de inmovilización de enzimas.

MARCO TEÓRICO


Resina catiónica Amberlite

1 frasco Papaína (ablandador de carne) o Mexicaína (extracto)

1 pza Columna de empaquetamiento o Bureta

Fibra de vidrio (pelo de ángel)

1 frasco Solución ácido clorhídrico 0.1 N

1 frasco Solución reguladora de acetatos

Agua destilada

1 frasco Solución de ovo albúmina al 2% (a partir de huevo)

10 pza Tubos de ensaye 15 x 150 mm

1 pza Gradilla

1 pza Espectrofotómetro

1 pza Baño maría.

1 pza Pipetas de 1 y 5 ml.

1 pza Varilla de vidrio

METODOLOGÍA

a) Preparación de la columna de intercambio iónico

1. Lavar con agua destilada la resina de intercambio catiónico2. Colocar en el fondo de la columna una malla de fibra de vidrio3. Empaquetar la resina utilizando como acarreador agua destilada4. Adicionar lentamente (10 min aproximadamente), la solución regenerante de HCl 0.1N5. Enjuagar el exceso de ácido con agua destilada hasta obtener un pH de 4 – 5

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PRÁCTICA No. 7

INMOVILIZACIÓN DE UNA PROTEASA EN RESINAS DE INTERCAMBIO

IÓNICO Y DE ADSORCIÓN

b) Preparación de la proteasa

1. Hacer una solución al 0.01% de mexicaína o papaina (ablandador de carne) en solución reguladora de acetatos.

2. Vaciar la solución de la enzima lentamente (aproximadamente 10 min)3. Enjuagar con solución reguladora de acetatos.

c) Hidrólisis de la albúmina.

1. Adicionar la solución de ovo albúmina al 2% lentamente (aproximadamente 10 min.)2. Ir colectando los eluídos en tubos de ensaye3. Leer la absorbancia de los eluídos en el espectrofotómetro a 280 nm.


1. Graficar tubo eluído contra Absorbancia a 280 nm

CUESTIONARIO

2. Graficar tubo eluído contra Absorbancia a 280 nm

3. ¿Por qué se lee a dicha longitud de onda?

4. ¿Qué tipo de aminoácidos absorben a esa longitud de onda?

5. Explique cual es la función de la solución de ácido clorhídrico 0.1N

6. Explique por que es importante verter siempre con lentitud

7. Explique el mecanismo de reacción llevado a cabo por la enzima

REFERENCIAS

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Manual de Enzimatica

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