Determinacion cuantitativa de la actividad enzimatica del preparado

TRUJILLO-2012

“DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE UN PREPARADO ENZIMÁTICO PURO”

BIOTECNOLOGÍA DE LOS

PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES

PROFESOR: ING. SÁNCHEZ GONZALES, JESÚS ALEXANDER

ALUMNA: MARTÍNEZ SALDAÑA, YURICO ELIZABETH

CICLO: IX

HORARIO: JUEVES 11-1PM


LABORATORIO N°06

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE UN PREPARADO

ENZIMÁTICO PURO

I. INTRODUCCIÓN

Como es bien sabido, las enzimas son proteína. Polímeros de residuos amino acídicos unidos

mediante enlaces peptídicos, que tiene la función de ser catalizadores de las reacciones químicas del

metabolismo celular. La producción de enzimas, de actividades específicas, es seguida por una

purificación y una estandarización del producto. En la formulación del producto se agregan diversos

excipientes (otras proteínas y azúcares, por ejemplo). Por lo que un preparado enzimático comercial

no es 100% puro .De manera de cuantificar la enzima presente en una formulación comercial se

realizan determinaciones de su actividad enzimática y del contenido de proteínas.

II. OBJETIVOS

Desarrollar una curva patrón de calibración

Determinar la actividad enzimática en unidades usc (Unidad Street Close)

III. FUNDAMENTO TEÓRICO

CINÉTICA DE REACCIONES QUÍMICAS

La reacción química tiene dos características de importancia: la posición de equilibrio (estabilidad de la

concentración de productos y reactivos) y la velocidad de reacción (las reacciones tienen por objeto

determinar el mecanismo y la velocidad con que interaccionan las moléculas bajo determinadas

condiciones).

La velocidad de una reacción química puede medirse como la velocidad de formación de uno o más de

su productos o bien la velocidad de utilización de sus reactivos. Intuitivamente podemos suponer que

al aumentar la concentración de los reactivos la probabilidad de interacción de los mismos aumenta

conjuntamente con la velocidad que procede tal reacción. Ambas variables (velocidad de reacción y

concentración de los reactivos) son directamente proporcionales, así que matemáticamente debe

existir un valor constante, de esta manera podemos escribir:


vr = k. [reactivos]n

(Velocidad de reacción) = (constante) . (Concentración de reactivos)n

El valor del exponente n es el orden de la reacción. Así si n = 1, estamos en presencia de una reacción

de primer orden donde la velocidad es proporcional a la reacción de un solo reactivo. vr = k. [A]

Análogamente, cuando n = 2, la velocidad es proporcional al producto de las concentraciones de dos

reactivos o al cuadrado de la concentración de uno solo. Este tipo de reacciones reciben el nombre de

segundo orden. vr = k. [A] [B] = k [A] 2

La importancia de determinar el orden de una reacción química radica en que a partir de ese

parámetro puede obtenerse información sobre el mecanismo molecular en que opera.

VELOCIDAD DE REACCIÓN Y EQUILIBRIO

En estado de equilibrio químico las velocidades de reacciones directa e inversa son exactamente

iguales. Considerando una reacción de primer orden:

k1 [A] = k – 1 [B]

Este principio nos permite llegar fácilmente a una reacción entre las constantes de velocidad y de

equilibrio:

EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE REACCIÓN: ENERGÍA DE ACTIVACIÓN

Las velocidades de reacción son generalmente sensibles a la temperatura. En el caso de las

reacciones biomoleculares, un aumento de 10º C incrementa su velocidad entre 1,5 y 5 veces. Para

explicar este hecho se postuló que al acrecentar la temperatura aumenta la fracción de moléculas

capaces de tener una energía suficiente para alcanzar un “estado activado” que luego se transforme

en producto de la reacción por formación o ruptura de enlaces químicos.

Se admite que las únicas moléculas que reaccionan son aquellas que al chocar llevan consigo una

energía mayor que un cierto valor mínimo. A este valor de energía necesaria se lo denomina energía

de activación y es un factor de suma importancia para determinar la magnitud de la velocidad de

reacción.

“DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE UN PREPARADO ENZIMÁTICO PURO” CATALIZADORES

Una reacción química tendrá lugar si se debe superar el valor de la energía de activación. Una vez vencida esa

barrera el sistema evoluciona de forma tal que llegará al estado final de la reacción. La velocidad de reacción

podría incrementarse de dos maneras: aumentando la concentración del “complejo activado” o eventualmente

disminuyendo la energía de activación. Este último mecanismo es el que se pone de manifiesto cuando se

emplea determinadas sustancias llamadas catalizadores. Estas sustancias aceleran las reacciones químicas

disminuyendo la energía libre de activación, se combinan con los reactivos para producir un estrato de

transición de menor energía que el estado de transición de la reacción no catalizada. Cuando los productos de la

reacción se forman, se regenera el catalizador al estado libre.

ENZIMAS: CATALIZADORES BIOLÓGICOS

Las reacciones químicas en sistemas biológicos raramente ocurren en ausencia de un catalizador.

Estos catalizadores se denominan enzimas y son en su totalidad moléculas de naturaleza proteica

(aunque ha habido estudios acerca de enzimas de naturaleza glucosídica).Es razonable pensar en la

necesidad que tienen los seres vivos de poseer estos catalizadores, ya que las funciones vitales de

cualquier célula serían imposibles de mantener si las reacciones que ocurren en ella fueran

extremadamente lentas.

Además de incrementar la velocidad las enzimas exhiben una elevada especificidad y en algunos

casos pueden ser reguladas por diferentes metabolitos, aumentando y otras veces disminuyendo, de

acuerdo a las necesidades del momento, su actividad.Todas estas propiedades pueden ser cumplidas

por moléculas altamente complejas, que al ser moléculas orgánicas (macromoléculas) comparten

características con las proteínas no enzimáticas y difieren de los catalizadores inorgánicos:

a) Son termolábiles y su actividad depende en ciertos casos del pH del medio.

b) El reconocimiento de la enzima con el reactivo a procesar (denominado sustrato) es altamente

específico.

c) Tienen gran eficiencia, es decir, transforman un gran número de moléculas de sustrato por

unidad de tiempo.

d) Están sujetas a una gran variedad de controles celulares, genéticos y alostéricos.

Como todos los catalizadores las enzimas aceleran notablemente la velocidad de una reacción

química y cumplen con las siguientes características:


Son efectivas en pequeñas cantidades

No sufren modificaciones químicas irreversibles durante la catálisis. Es decir que luego de la

reacción enzimática, las moléculas de enzimas que reaccionaron son indistinguibles de las que

no lo han hecho, (la estructura de la molécula se mantiene, al principio y final de la reacción,

exactamente igual).

No afectan la posición de equilibrio de la reacción que catalizan. El estado inicial y final de la

reacción es el mismo, solo que se llega al equilibrio mucho más rápidamente.

CINÉTICA DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS

Las consideraciones generales de la cinética química pueden aplicarse a las reacciones catalizadas

enzimáticamente, aunque estas últimas tienen la particularidad de mostrar el fenómeno de saturación

por el sustrato.

A una concentración constante de enzima, si vemos el gráfico de la velocidad de la reacción catalizada

enzimáticamente en función de la concentración del sustrato, es evidente que a bajas concentraciones

del mismo la velocidad de formación de producto es proporcional a la concentración del sustrato. A

medida que se aumenta la concentración de sustrato se aprecia una pérdida de la proporcionalidad,

en esta zona la reacción es de orden mixto y finalmente, a altas concentraciones, la velocidad de la

reacción es independiente de esta.Ya se ha dicho que el sustrato se une a la enzima en una región

determinada del mismo llamada sitio activo. El fenómeno de saturación junto con otras evidencias

llevaron a postular la existencia de un complejo enzima – sustrato (E – S) como etapa previa a la

formación de productos.

En 1913 LenorMichelis dedujo la relación entre la velocidad máxima (vm) de una reacción catalizada

enzimáticamente en términos de la formación del complejo E – S. En base a estas consideraciones es

lógico suponer que a altas concentraciones de sustrato, todos los sitios activos de la enzima están

ocupados y por lo tanto la velocidad alcanza un máximo. El modelo propuesto sirve de base para

explicar las propiedades de la mayoría de las enzimas y como se dijo antes asume la existencia de un

complejo E – S como intermediario en la catálisis.

Una enzima E se combina con un sustrato S para formar el complejo E – S, con una constante de

velocidad k1. Este complejo E – S puede seguir dos caminos: a) puede proceder para formar el

“DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE UN PREPARADO ENZIMÁTICO PURO” producto con una constante de velocidad k3; b) el camino alternativo es disociándose, generando

nuevamente E y S con una constante de velocidad k2.

En base al modelo, la velocidad de la reacción catalizada enzimáticamente será:

v = k3 [E – S]

El valor [E – S] no es fácilmente estimable de modo que se necesita una expresión equivalente con

valores conocidos. Mediante desarrollo matemático se ha desarrollado la siguiente ecuación:

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO SOBRE LA VELOCIDAD DE UNA

REACCIÓN CATALIZADA ENZIMÁTICAMENTE. OBTENCIÓN DEL KM Y LA VMAX

Si se mantiene la concentración de la enzima constante y variamos la concentración de substrato se

obtiene una curva hiperbólica como la de la figura (arriba izquierda). Al principio un aumento de la

concentración de substrato produce un aumento rápido de la velocidad de reacción, pero si se sigue

aumentando la concentración de substrato, la velocidad de reacción comienza a disminuir; vemos que

a muy altas concentraciones de substrato se observa que no cambia la velocidad de reacción, se dice

que los centros activos de la enzima se encuentran saturados. La velocidad de reacción que se

obtiene a esa alta concentración de substrato se define como la velocidad máxima (vm) de la reacción

enzimática bajo las condiciones especificadas. La concentración de substrato [S], a la semivelocidad

máxima de reacción (½ v ) se puede determinar de la figura y representa la constante de Michaelis o

km, la cual es una característica para cada enzima. La inversa de km, o 1/ km, mide aproximadamente la

afinidad de la enzima por el substrato. Mientras más pequeño sea el valor de km, mayor será la

afinidad de la enzima por el substrato. Si varias enzimas compiten en el metabolismo por el mismo

substrato, éste será transformado preferentemente por la enzima con mayor afinidad.

Así tendremos:

(Simplificando)

“DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE UN PREPARADO ENZIMÁTICO PURO” Si reordenamos la ecuación tendremos que:

[S] + km = 2 [S] (despejamos) km = [S]

Esto significa que la concentración del sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad es el

valor de km de la enzima.

La expresión de Michelis – Menten puede ser transformada algebraicamente en otras formas, que son

más útiles para la expresión de los datos experimentales. Una de esas formas consiste en tomar los

recíprocos (inversa) de ambos miembros de la ecuación.

Esta expresión conocida con el nombre de ecuación Lineweaver – Burk, corresponde a una recta de

ecuación:

y = a.m + b

Midiendo las velocidades para distintas concentraciones de sustrato y representando gráficamente (al

lado) obtendremos una gráfica del tipo lineal.

FACTORES QUE INFLUYEN EN LA VELOCIDAD DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS

a) Temperatura: Un aumento en la temperatura provoca un aumento de la velocidad de reacción

hasta cierta temperatura óptima, ya que después de aproximadamente 45ºC se comienza a

producir la desnaturalización térmica. Las enzimas de muchos mamíferos tienen una

temperatura óptima de 37ºC, por encima de esa temperatura comienzan a inactivarse y se

destruyen Sin embargo existen especies de bacterias y algas que habitan en fuentes de aguas


termales y en el otro extremo ciertas bacterias árticas tienen temperaturas óptimas cercanas a

0ºC.

b) Efecto Del pH Sobre La Actividad Enzimática: El pH no afecta la actividad enzimática

directamente sino que modifica la concentración de protones. Los protones además de alterar

la estructura de la enzima y el substrato, pueden participar también en la reacción como

substrato o producto. En esos casos, la concentración de protones afecta directamente la

velocidad de la reacción.Cualquier cambio brusco de pH, sabiendo que las enzimas son

proteínas, puede alterar el carácter iónico de los grupos amino y carboxilo en la superficie

proteica, afectando así las propiedades catalíticas de una enzima. A pH alto o bajo se puede

producir la desnaturalización de la enzima y en consecuencia su inactivación.

DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA

Con respecto a la determinación de la actividad de la enzima, debemos recordar que la actividad

enzimática:

Indica el máximo potencial catalítico de una enzima y está dado por la velocidad inicial de la

reacción

La velocidad de reacción se mide, cuantificando la evolución del producto o del sustrato de

reacción en el tiempo, pero este último es más dificultoso ya que se utiliza en exceso y las

variaciones en corto tiempo no son notorias.

Se determina en las mejores condiciones para la enzima (Tº y pH óptimo) y a concentraciones

saturantes de sustrato.

La unidad internacional (UI) utilizada corresponde a la cantidad de enzima que permite catalizar 1µ

mol de sustrato por minuto de reacción a las condiciones antes mencionadas.

La medición de actividad se ve afectada por los siguientes factores:

Denaturación de la enzima (por temperatura)

Reversibilidad de la reacción enzimática.

Inhibición de la enzima (por producto o inhibidor externo)

Desaturación de la enzima (baja concentración de sustrato)

Para evitar los tres primeros factores, la medición se realiza a tiempos cortos; el último factores

evita ala utilizar una concentración saturante de sustrato.

Al evitar tales problemas la velocidad de reacción sólo está condicionada por la cantidad deenzima

utilizada en la reacción.


IV. MATERIALES Y MÉTODOS

A. Materiales y Equipos

Materiales

Pulpa de papaya 20g

(Extracción de amilasa)

Solución yodada.

PEC

HCl 0.1N

Sustrato almidón

Agua destilada

Equipos

Matraces

Pipetas de 1, 2, 5 y 10 ml

Probeta de 200 ml

Tubos de ensayo.

Mortero

Pilón.

Gradillas

Balanza analítica

Baño maría

Centrífuga

Espectrofotómetro.

B. Metodología

Preparación del Preparado Enzimático Puro (PEC)

Pesar 20 gramos de muestra (pulpa de papaya).

Se tritura en el mortero con el pilón.

Al triturado lo homogenizamos al agregar KCl 10 ml a 0.154M a 4ºC.

Disolver bien el triturado y luego filtrar.

El filtrado llevar a centrifugación (4000 rpm x 10 min).

Obtenemos el Preparado enzimático Crudo (PEC).

Determinación de la Actividad Catalítica

Método de Street - Close

Preparar los tubos blanco y problema.

Agregar 2.5 ml de solución de almidón al tubo problema.

Agregar 0.4 ml de agua destilada al tubo problema y 2.9 ml de agua destilada al tubo

blanco.

Agregamos 0.1mL de PEC al tubo blanco y 0.1 ml al tubo problema.


Llevar a incubación 35ºC por 5 minutos, ambos tubos

Se agregará 2.5 ml de HCl 0.1N a los dos tubos.

Se agregará 0.1 ml de solución de iodo a los dos tubos.

Preparación de tubos para la curva de calibración

Preparar los tubos blanco, 1; 2; 3; 4 y 5del mismo modo que el tubo problema

Agregar 0; 0.5; 1.0; 1.5; 2.0; 2.5 ml de solución de almidón (400ppm) en cada uno de

los tubos respectivamente. Menos en el tubo Blanco

Agregar 3.0; 2.5; 2.0; 1.5; 1.0; 0.5 ml de agua destilada a cada uno de los tubos

respectivamente.

Agregar 2.5 ml de HCl 0.1N a cada uno de los tubos respectivamente.

Agregar solcuion iodada 0.1; 0.1; 0.1; 0.1; 0.1; 0.1 a todos los tubos.

Dejar reposar por tiempo de 5 minutos y llevar a medir la observancia a una longitud de

onda de 550 nm en el espectrofotómetro.

Esto se puede ver eb el sgte cuadro:

Cuadro 1. Datos previos a la curva de calibración.

g almidón

0,2 mg 0,4 mg 0,6 mg 0,8 mg 1 mg

COMPONENTES BLANCO MUESTRA

1 MUESTRA

2 MUESTRA

3 MUESTRA

4 MUESTRA

5

Sol. Almidon soluble 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5

H2O destilada 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5

HCL 0,1N 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5

Sol. Yodada 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

V. RESULTADOS Y DISCUSIONES

Tabla 1. Cantidad de almidón y Absorbancia para la obtención de Curva de

Calibración

CANTIDAD DE ALMIDÓN ABSORBANCIA

0 0

0.2 0.322

0.4 0.519

0.6 0.755

0.8 1.018

1 1.281


Figura 1. Cantidad de Almidón y Absorbancia

Tabla 2.Cálculos de las unidades Street Close en tubos Problema y Blanco

TUBO ABSORBANCIA ABSORBANCIA

CORREGIDA

ALMIDÓN

RESIDUAL (mg)

ALMIDÓN

HIDROLIZADO (mg) usc (0,1ml)

usc (100

ml)

B 0.001 0.115 0.072173216 0.927826784 0.046391339

46.3913392

P 0.116 …..

Según Wiseman (1986);la Unidad Amilolítica (UA) es la cantidad de enzima contenida en 100 ml de

muestra, que puede hidrolizar 10 mg de almidón en 30 minutos, en las condiciones de la reacción. En

esta técnica se incuban 10 µl de muestra con 0.25 mg de almidón contenidos en 0.5 ml de solución de

sustrato durante 7 minutos y medio, lo que equivale a incubar 100 ml de muestra con 10.000 mg de

almidón durante 30 minutos. Si todo el almidón fuera hidrolizado, la actividad amilásica de la muestra

sería de 1000 UA/dl. Para obtener las unidades de actividad amilásica, la fracción de almidón digerido se

multiplica por 1000. En nuestro práctica para la detreminacion de la actividad enzimática, utilizamos la

y = 1.247x + 0.025R² = 0.996

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

1.1

1.2

1.3

1.4

0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45 0.5 0.55 0.6 0.65 0.7 0.75 0.8 0.85 0.9 0.95 1 1.05

Ab

sorb

anci

a

Almidón (mg)

“DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE UN PREPARADO ENZIMÁTICO PURO” unidad Street Close (esta unidad no especifica el tipo de enzima solo la cuantifica) lo cual se puede

observar en la Tabla 2.

Según Doran (2998); la curva de de referencia construida con cantidades conocidas de una sustancia

(por ejemplo la albúmina sérica bovina que vimos antes) que se utiliza para determinar la cantidad de

esta sustancia (proteínas) presente en una muestra incógnita. En muchas determinaciones se cumple

una relación proporcional entre la magnitud o intensidad de color que da una reacción y la cantidad del

reactivo que la provoca. Por ejemplo: si la presencia de 10 ug de proteínas en una solución genera la

aparición de un color azul pálido cuando es agregada a una mezcla reactiva, la presencia de 20 ug de

proteína dará lugar a que la solución se torne azul más oscuro y así sucesivamente. En nuestro caso

esto se puede observar en los datos obtenidos en nuestra Tabla 1 la cual ayudó para la obtención de

la curva de calibración en Figura 1, la cual nos dio una recta y un coeficiente de determinación de

99.69% en lo cual vemos que esta relación debe estar dado por la magnitud y la intensidad de color

dado en el espectrofotómetro.

Según VanDer (1975); la Curva de Calibración esta dado con datos reales, los gráficos que se

obtienen no son tan ideales, pero esta situación no es un obstáculo ya que dentro de ciertos valores es

posible trazar la recta más probable que une una serie de puntos, con el uso de los programas de

cálculo de las computadoras. Hay que advertir que una respuesta lineal no se obtiene en todo el rango

de concentraciones posibles sino dentro de un conjunto de valores que dependen de numerosos

factores dependientes del método de medición. Por otra parte, este tipo de curvas no se limita

solamente a la determinación de un elemento o compuesto químico sino que tiene múltiples

aplicaciones. Lo e4xpuesot por el autor se verifica en la figura 1, donde vemos la linealidad de la

línea recta de la cantidad de almidón con la Absorbancia ya que como dice el autor ésta curva está

dada por una serie de factores.

Según VanWeel (1959); la espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las

investigaciones biológicas. El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación

absorbida o transmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que

contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.“Espectro de Absorción”. Cada especie

absorbente, que recibe el nombre de cromógeno, tiene un determinado espectro de absorción. El

espectro de absorción es un gráfico donde se representa en ordenadas la Absorbancia y en abscisas

la longitud de onda. La medida de la cantidad de luz absorbida por una solución es el fundamento de

la espectrofotometría de absorción. Dicho espectro de absorción se nota en la Figura 1, donde vemos

una relación entre la cantidad de absorbancia la cual dependerá de su cantidad de almidón. Y en la

Tabla 2 vemos que la absorbancia corregida (se obtiene disminuyéndole la absorbancia del tubo

“DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE UN PREPARADO ENZIMÁTICO PURO” Blanco)sirve para llevarla a la gráfica y hallar la cantidad de almidón residual que queda en el tubo

problema y en el tubo testigo.

VI. CONCLUSIONES

Se desarrolló la curva patrón de calibración donde el coeficiente de determinación es de

99.69%.

Se llegó a determinar la actividad enzimática en unidades usc (Unidad Street Close), en la

cual la absorbancia corregida se obtiene disminuyéndole la absorbancia del tubo Blanco; a

la vez sirve para llevarla a la gráfica y hallar la cantidad de almidón residual que queda en

el tubo problema y en el tubo testigo.

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

DORAN, P. (1998). “Principios de Ingeniería de los bioprocesos”. Editorial acribia SA. Zaragoza

(España).

WISEMAN, A. (1986). “Principios de Biotecnología”. Editorial ACRIBIA S.A. ZARAGOzA (España).

VANDER M. (1975). The enzymatic hydrolysis of agar by CytophagafIevensLF sp. nov.TThesis,

üniversity of Groningen, Netherlands, 80 pp.

VANWEEL.P. (1959). The effect of special diets on the digestion processes (enzyme production and

resorption) in the african giant snail AchatinafilicaBowdich. 2. vergl. Physiol. 42: 433-448.

ANEXOS

Figura 2. Tubos de ensayo durante la

calibración

Figura 3. Tubos de ensayo durante la

calibración Tubo Blanco y Tubo 1.

Determinacion cuantitativa de la actividad enzimatica del preparado

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