FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

EXTRACCIÓN DE ADN, ARN Y PROTEÍNAS: EL PASADO Y EL

PRESENTE CURSO: BIOQUÍMICA II

DOCENTE: Q.F. Minaya Galarreta, Angélica.

INTEGRANTES: Apaza Gonzales, Pamela

Fernández Lugo, Ana Cecilia

Huamán Benites, angie

Miguel Buendía, Rosaura

Pozo Cuya, Mireya

Uribe Pinta, Elizabeth

Vargas Inga, Damel

INTRODUCCIÓN

La extracción de ADN, ARN y proteínas, es el método más fundamental utilizado en la biología molecular.

En el pasado el proceso de extracción y purificación consume tiempo, mano de obra y su rendimiento es limitado.

Pueden ser aislados de cualquier material biológico, tales como tejidos vivos o conservados, células, partículas de virus u otras muestras.

Actualmente existen muchos métodos especializados que pueden ser utilizados para extraer biomoléculas puras.

Estos métodos permiten un alto rendimiento de la muestra y la velocidad, exactitud y fiabilidad de la prueba es máxima; y reduce la contaminación cruzada.

ÁCIDOS NUCLEICOS

Los ácidos nucleicos almacenan la información genética de los organismos vivos y son los responsables de la transmisión hereditaria. Gran parte del desarrollo físico de un organismo a lo largo de su vida esta programado en estas moléculas.Las proteínas que elaboraran sus células y las funciones que realizaran están todas registradas en esta cinta molecular. Existen dos tipos: el ADN y el ARN.

EL ADN

Hay 2 cadenas helicoidales de polinucleótidos enrolladas a lo largo de un eje común.

Estas cadenas permanecen unidas por puentes de hidrogeno entre los pares de bases.

Es una macromolécula muy larga , filamentosa y formada por desoxirribonucleótidos, cada uno de ellos compuesto por una base nitrogenada, un azúcar desoxirribosa y un grupo fosfato.

EL ARN

El ARN tiene una sola hebra.

La pentosa de los nucleótidos constituyentes es ribosa.

Sus cuatro bases son: A, G, C, U.

Es la molécula que dirige las etapas intermedias de la síntesis proteica.

TIPOS DE ARNARNm: Actúa como molde y transporta la información para la síntesis proteína.

ARNr: Recibe la información genética. Traduce las proteínas. Se ubica en el ribosoma, organela donde se sintetiza las proteínas.

ARNt: transporta los aminoácidos hacia los ribosomas para la síntesis proteica.

EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

HISTORIA

1869

• Dr Friedrich Miescher realizó la primera extracción de ADN.

• Esperaba solucionar los principios fundamentales de la vida, para determinar la composición química de las células.

• Utilizó los leucocitos obtenidos de la pus recogidos en vendajes quirúrgicos y obtuvo mediante sus pruebas precipitado crudo de ADN.

MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

MÉTODOSCONVENCIONALES

Tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo

Extracción alcalina

Método de Extracción CTAB

Centrifugación en gradiente de bromuro de etidio-cloruro de cesio.

Purificación de ARN Poli (A) por cromatografía de celulosa de oligo

(dT).

PROTEÍNAS

Las proteínas desempeñan un papel fundamental para la vida y son las biomoléculas más versátiles y más diversas. Son imprescindibles para el crecimiento del organismo. Realizan una enorme cantidad de funciones diferentes.

EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS

HISTORIA

Siglo

XVIII

• Antonio Fourcroy estableció propiedades comunes para todas las sustancias Albuminoides.

1893

• El químico holandés Gerhardus Johannes Mulder realizó la primera descripción de PROTEÍNA.

• Sus estudios en la composición mostró presencia de C, H, O, N. El azufre y fósforo estaban presentes en algunas sustancias animales.

1940

• Edwin Cohn realizó técnicas de purificación de proteínas durante la Segunda Guerra Mundial.

• Fue responsable de purificación de la sangre y desarrolla un método para fraccionar el plasma obteniendo albúmina para uso clínico y está fue utilizada por primera vez para tratar el schock en las víctimas del ataque a Pearl Harbor.

MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE PROTEÍNAS

Cromatografía de

intercambio iónico.Cromatografí

a de filtración en gel.

Cromatografía de afinidad.Electroforesis

en gel.Southwestern Blotting o immunoblotti

ng.

OTROS MÉTODOS DE EXTRACCIÓN

EXTRACCIÓN DE BIOMOLÉCULAS

ALL IN ONE

SISTEMA DE EXTRACCIÓN AUTOMATIZADO

TERMINOLOGÍA

• Es un proceso por el cual átomos, iones o moléculas son atrapadas o retenidas en la superficie de un material.

ADSORCIÓN:

• Es una sustancia que desorganiza la estructura tridimensional en macromoléculas tales que proteínas, ADN o ARN y las desnaturaliza.

AGENTE CAOTRÓPICO:

• Es una sal de amonio cuaternario

CTAB (BROMURO DE HEXADECILTRIMETILAMONIO):

• Es la rotura de la membrana celular.

LISIS CELULAR:

TERMINOLOGÍA

MICROPISTILOS EPPI PARA TUBOS DE

ENSAYO:

• Para homogeneizar células y tejidos en una escala de medición Eppendorf® para tubos de ensayo de 1,5 ml / 2,0 ml (adaptación exacta).

PELLET O PELET

• Es una denominación utilizada para referirse a pequeñas porciones de material aglomerado o comprimido.

SDS O NADS (DODECILSULFATO

SÓDICO O LAURILSULFATO

SÓDICO)

• Es un compuesto tensoactivo iónico

TUBOS EPENDORF

• Es un tubo de microcentrífuga de forma de un pequeño contenedor cilíndrico de plástico, con un fondo cónico y una tapa unida al cuerpo del tubo para evitar su desprendimiento.

EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOSPOR MÉTODOS CONVENCIONALES

LOS PASOS GENERALES PARA LA EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ADN

• EXTRACCIÓN:

– Lisis de las células que contienen a los AN

– Inactivación de nucleasas –Clarificación: separación de los

AN de los restos celulares

• PURIFICACIÓN: – De otros AN no deseados – De Lípidos, carbohidratos – De sales y otros compuestos orgánicos

El procedimiento ideal de lisis celular debe tener la fuerza necesaria para romper el material de inicio (células o tejido) y la delicadez requerida para preservar las moléculas de interés (ADN o ARN).

LISIS CELULAR

MÉTODOS DE FRAGMENTACIÓN Y LISIS PARA LA EXTRACCIÓN DE ACIDOS NUCLÉICOS

MÉTODOS MECÁNICOS

- MOLIENDA MANUAL EN MORTERO

- CONGELACIÓN/DESCONGELACIÓN

- ULTRASONIDO

MÉTODOS NO MECÁNICOS

- AGENTES QUÍMICOSDetergentes: CTAB , SDS

ENZIMÁTICOS

- Proteasas: lisozimaGluconasas peptidasas- ARNasa

CARACTERÍSTICAS Y FUNCIONES DE LOS REACTIVOS EMPLEADOS EN LA EXTRACCIÓN DE ADN

MÉTODOS CONVENCIONALES

Fundamento del método: Extracción de ácidos nucleicos utilizando una solución del agente caotrópico de Tiocianato de Guanidino que genera lisis celular y degradación de proteínas con la liberación de los ácidos nucleicos.Posteriormente el uso de solventes orgánicos fenol- cloroformo que permiten su separación de restos de proteínas, lípidos y la posterior precipitación de los ácidos nucléicos usando etanol o isopropanol.

1.- EXTRACCIÓN CON TIOCIANATO DE GUANIDINO – FENOL –

CLOROFORMO (MÉTODO DE CHOMCZYNSKI):

EXTRACCIÓN DE ADN CON SOLUCIÓN DE CHONCZYNSKIMuest

ra vegeta

l PULVERIZAR EN EL

MORTERO

SOLUCIÓN DE TIOCIANATO DE GUANIDINO A pH

BÁSICO < 11

- LISIS DE MEM. CELULAR Y NUCLEAR

- DEGRADACIÓN DE PROTEÍNAS E INACTIVACIÓN DE ENDONUCLEASAS.

FASE SÓLIDARESTOS DE ALTO PESO MOLECULAR

FASE ACUOSA ADN , RESTOS DE PROTEÍNAS Y LIPIDOS

FENOL CLOROFORMO

ADN SUSPENSIÓ

NPROTEÍNA

S Y LÍPIDOS DISUELTO

S

CENTRIFUGA

CENTRIFUGA

ALCOHOL ETÍLICO PURO

ADN EN FORMA DE

FILAMENTOS

CENTRIFUGA

PELLET DE ADN

EXTRACCIÓN DE ARN CON SOLUCIÓN DE CHONCZYNSKI

Homogenizado de muestra vegetal

pulveriza previamente y conservada en

nitrógeno líquido a

-196°C

SOLUCIÓN DE TIOCIANATO DE GUANIDINO A pH

REDUCIDO - ACETATO DE SODIO – FENOL - CLOROFORMO

FASE ACUOSA

ARN TOTAL

FASE ORGÁNICA

ADN, PROTEÍNAS Y LIPIDOS DISUELTOS

CENTRIFUGACIÓN A 4°C

ALCOHOL ISOPROPÍLICO

PELLET DE ARN TOTAL

FASE ACUOSA

ARN TOTAL

2.- EXTRACCIÓN DE ADN PLASMÍDICO POR LISIS ALCALINA

Fundamento del método: Se basa en las diferencias

en la desnaturalización y renaturalización del ADN plasmídico y el ADN cromosómico al aplicar NaOH en presencia de un detergente fuertemente aniónico como el Dodesilsulfato de Sodio (SDS) y Acetato de potasio.

Se usa principalmente para extracción de ADN plasmídico de E. coli.

Detergente SDS

+ NaOH

-Lisis celular -Desnaturaliza

Proteínas ADN cromosómico

ADN plasmídico

-ADN plasmídico se mantiene en solución

-Precipitación: ADN cromosómico. proteínas .

Acetato de

potasio

CENTRIFUGAMOS

EXTRACCIÓN DE ADN PLASMÍDICO POR LISIS ALCALINA

Crecimiento de Cultivo bacteriano de E. coli

Cosecha de cultivo

bacterianopH

FUERTEMENTE ALCALINO DEL

MEDIOpH NEUTRO DEL MEDIO

3.- MÉTODO DE EXTRACCIÓN CTAB

Fundamento del método:Las células vegetales pueden lisarse con el detergente iónico bromuro de cetiltrimetil amonio (CTAB), que forma un complejo insoluble con los ácidos nucleicos en medio hiposalino. De ese modo, los polisacáridos, los compuestos fenólicos y los demás contaminantes permanecen en el sobrenadante y pueden eliminarse por lavado.

- Elaborado por Murray y Thompson en 1980.

- Adecuado para extraer y purificar ADN de vegetales y especialmente indicado para eliminar los polisacáridos y los compuestos polifenólicos que dañarían al ADN.

PASOS:

1.- Se debe moler la muestra después de congelación con Nitrógeno líquido

2.- Suspender la muestra en solución tampón de extracción, que contiene EDTA, Tris-HCl y CTAB.

4.- Incrementando la concentración salina

3.-Centrifugo, elimino el sobrenadante y lavo.

5.-Añado etanol y ARNasa

ADN puro

EL CTAB CAPTURA LOS LÍPIDOS QUE INTEGRAN LA MEMBRANA CELULAR Y NUCLEAR

EL CTAB EN MEDIO HIPOSALINO FORMA UN COMPLEJO INSOLUBLE CON LOS ÁCIDOS NUCLEICOS.

DIAGRAMA DEL MÉTODO DE EXTRACCIÓN CTAB

4.- CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE BrEt - CsCl

- Técnica usada para la Mini preparación de ADN plasmídico .

- Requiere de cultivo bacterial a gran escala.

- Separa ADN plasmídico superenrrollado del ADN plasmídico circular que está en estado relajado, concentrándolos por centrifugación en una gradiente de Bromuro de Etidio –Cloruro de Cesio (BrEt – CsCl.)

Superenrrolado: Covalentemente cerrado y muy empacado.

DNA circular. DNA que no se ha empacado.

• Fundamento del método: El BrEt ingresa y se

intercala en la cadena de ADN disminuyendo su densidad, pero lo hace en mayor cantidad en el ADN plasmídico en estado relajado que en el ADN plasmídico superenrrollado.

pudiéndose separar por centrifugación en el gradiente de densidad de CsCl.

CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE BrEt - CsCl

GRADIENTES DE CLORURO DE CESIO+ BROMURO DE ETIDIO

EL ADN SE SEDIMENTA FORMANDO UNA CAPA EN LA POSICIÓN DEL TUBO EN LA CUAL LA DENSIDAD DE LA SOLUCIÓN DE CsCl ES IGUAL A LA DEL ADN.

CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE BrEt - CsCl

CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE BrEt - CsCl

GRADIENTE DE DENSIDAD DE CsCl sin BrEt

GRADIENTE DE DENSIDAD DE CsCl y BrEt

GRADIENTE DE CENTRIFUGACIÓN CON BrEt - CsCl

4. PURIFICACIÓN DEL ARN POLI(A) POR CROMATOGRAFIA DE CELULOSA DE OLIGO (DT)

En células eucarióticas, el mARN difiere de otras especies de ARN, en que contiene en su extremo 3', una extensión relativamente grande de 200 a 300 residuos de adenina, en una secuencia conocida como poli A+.Cromatografía de afinidad

Permite separar el conjunto de los mRNA celulares de otros ácidos nucleicos, puesto que los mRNAs quedarán retenidos en la columna, merced a la hibridación que va a producirse entre sus colas de poli A (en el extremo 3) y los oligómeros de poli-T que contiene la resina cromatográfica.

Mediante purificación de poli(A)-ARN: hay ARNm con una cola de poliadeninas, mas de 100, llamada poli(A), estos ARN se pueden aislar por cromatografía en columna de celulosa de oligo dT celulosa. La cola poli(A) hibridará con la cadena oligo dT, fijándose en la columna. Después de lavar los ARN no fijados el ARNpoli(A) se eluye y se precipita con alcohol etílico frío.

Existen 2 métodos utilizados para la purificación de ARN poli(A)

Cromatografía de lote

Cromatografía en columnas de

oligo (dT)

La cromatografía en columnas es usada normalmente para la purificación de grandes cantidades de ARN Poli (A) no radiactivo aislado de células mamíferas.

trabaja con ARN mamífero en pocas cantidades de muestras que pueden ser radiactivos o no

EXTRACCIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO EN FASE SÓLIDA

Logra una purificación rápida y eficiente comparada con los métodos convencionales.

Los sistemas de Fase Sólida absorberán los ácidos nucleicos en el proceso de extracción dependiendo del pH y contenido de sales del buffer.

El proceso de absorción está basado en los

siguientes principios

y mecanismos de exclusión por

afinidad y tamaño.

La interacción de los puentes de hidrógeno con una matriz hidrofílica bajo condiciones caotrópicas

Intercambio iónico bajo condiciones acuosas por medio de un intercambio aniónico

La purificación en Fase Sólida es normalmente efectuada por el uso de una columna giratoria operada bajo fuerzas centrífugas.

Matrices de sílica

Partículas de vidrio

Tierra de diatomeas

Transportadores de intercambio aniónico

TIPOS soporte sólido (fase estacionaria).

PASOS DE FASE SÓLIDA

lisis celular, adsorción de ácidos nucleicos, lavado y

elución.

Tiras de 8 columnas

Placa de 96 columnas

Pasos en el proceso de extracción en fase

sólida

• Acondicionar la columna para la adsorción de la muestra

Puede ser hecho utilizando un buffer a un pH particular para convertir la superficie o grupos funcionales sobre el sólido dentro de una forma química particular• Luego la muestra la cual ha sido

degradada por el uso de buffer de lisis es aplicada sobre la columna

• El ácido nucleico deseado absorberá a la columna con la ayuda de pH elevado y concentración de sales de la solución enlazante

PASOS PARA LA EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA

1. se acondiciona la columna para la absorción de la muestra. Esto puede ser hecho usando un tampón a un pH definido 2. Luego, convierte la superficie o grupos funcionales en el solido es decir en una forma particular de química3. El ácido nucleico deseado se absorberá a la columna con la ayuda de un alto pH y concentración de sal de la solución enlazadora.

4. La muestra que fue degradada mediante el uso de solución amortiguadora se aplica a la columna

5. Luego los ácidos nucleicos se eluyen con un tampón de máxima salinidad

6. se precipita con isopropanol para lavar y eliminar todos los restos de impurezas

7. finalmente, se reconstituye el ADN de elevada pureza en un tampón de baja salinidad para su posterior utilización o almacenamiento

La matriz de silica hidratada

la cual fue preparada por

reflujo de óxido de silicio en

hidróxido de sodio o

hidróxido de potasio en una

proporción molar de

aproximadamente 2: 1

respectivamente a 10: 1 por

al menos cerca de 48 horas

habían sido introducidas en

la purificación del ADN. El

ADN se enlaza a la matriz

inorgánica y es liberada en

agua caliente.

PURIFICACIÓN EN LAS MATRICES DE SÍLICA

El principio de está

basada en la elevada

afinidad de las cadenas

de ADN cargadas

negativamente con

respecto a las

partículas de sílica

cargadas

positivamente.

PURIFICACIÓN EN LAS MATRICES DE SÍLICA

El sodio juega un rol como un catión enlazante o puente que atrae el oxígeno cargado negativamente en los fosfatos de las cadenas de ácidos nucleicos.

DNA eluye de la sílica en

agua

DNA se une a la sílica

en NaI

PARTÍCULAS DE VIDRIO

Gel de agarosa involucrado en el uso de sales caotrópicas facilitan el enlazamiento de ADN a vidrio común de sílice.

La absorción de ácido nucleico es el sustrato de vidrio ocurre debido al mecanismo y principio similar al de la absorción de cromatografía de adsorción.

Esta invención ha descubierto que una mezcla de gel sílice y partículas de vidrio puede ser usada para separar ácido nucleico de otras sustancias en la presencia de soluciones de sales caotrópicas.

TIERRA DE DIATOMEAS(DIATOMITA)

Es una roca sedimentaria silícea formada por micro-fósiles de diatomeas, algas marinas unicelulares que secretan un esqueleto silíceo llamado frústula.

• Baja densidad.• Alta porosidad.• Dureza .• Capacidad abrasiva

suave.• Conductividad

térmica muy baja.• Alta resistencia a

la temperatura.• Capacidad muy alta

para absorber líquidos.

PROPIEDADES

PRINCIPALES USOS

Porosidad y Poder Absorbente

Purificación de ADN

Filtro-ayuda

DIATOMITA

La diatomita puede ser utilizado para la retirada del DNA en presencia del agente caotrópico altamente concentrado tal como el ioduro de sodio, guanidinium hydrochloride y guanidinium thiocyanate.

DIATOMITA

Quitan el DNA trenzada doble pero no el ARN o

las proteínas.

La diatomita resultante enlazada con el ADN es luego lavado con un tampón que contiene alcohol.

Este es luego dejado de lado y el ADN es eluído en un tampón bajo en sal o en agua destilada.

La diatomita tiene contenido de sílice hasta en un 94%. Ha sido usado para filtración y en

cromatografías.

PURIFICACIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO BASADO EN

PARTÍCULAS MAGNÉTICAS

La separación magnética es una manera simple y eficiente el cual es utilizado actualmente en la purificación de ácido nucleicos.

Se utilizan transportado

res magnéticos.

PreparadosA partir de biopolímero

s.

Polímeros sintético

Vidrio poroso

Basado en materiales magnéticos inorgánicos

Materiales con una

gran área superficial ,

son preferidos para ser

usados en la

adherencia de ácidos nucleicos.

ÓXIDO DE HIERRO

Óxido de hierro (II, III) u óxido ferroso

férrico (Fe3O4).

Magnetita

Los momentos magnéticos de los distintos cationes

de hierro del sistema se encuentran fuertemente acoplados.

Esta moléculas van actuar como un

imán.

Purificación de ácido nucleico basado en partículas magnéticas

Purificación de ácidos

nucleicos en base

a:microesferas

magnéticas .

Uso de perlas magnéticas implica

cuya superficie tiene una carga que se puede cambiar

basándose en el pH o tampón. A pH bajo,

están cargados positivamente, atrayendo a las

moléculas de ADN con carga negativa y permitiendo que las

proteínas y los contaminantes que se

elimina mediante lavado.

El ácido nucleico es luego eluído

de las partículas

magnéticas con un

tampón de elución.

MATERIAL DE INTERCAMBIO ANIONÍCO

El ejemplo mas popular que se utiliza en el principio del intercambio iónico es « Resina de intercambio iónico».

Se basa

En la interacción entre grupos cargados positivamente de la celulosa de dietilaminoetilo ( superficie de la resina) y fosfatos cargados negativamente del ADN .

Una resina de intercambio iónico puede considerarse como una estructura de cadenas hidrocarbonadas.

Estas cadenas se encuentran unidas transversalmente formando una matriz tridimensional que proporciona rigidez a la resina y entrecruzamiento que determina la estructura porosa interna de la misma.

TIPOS DE EXTRACCIO

N DE PROTEINAS

Cromatografía de

intercambio iónico

Cromatografía de

filtración en gel

Cromatografía de

afinidad

Electroforesis en gel

1) Solubilizar a la proteína y

separarla

Proteínas extracelulares Seroalbúmina

Proteínas citoplasmáticas

Liberarse de la célula.(lisis

celular)

Lisis celularTécnica Principio Ejemplos

Digestión enzimática Daños en paredes celulares

Lisozimas/ bacterias

Método químico Detergentes o agentescaotrópicos

SDS, CTAB, tiocianatode guanidina

Método físico Choque osmótico solución tampón

Comparación de las envolturas celulares bacterianas. Arriba: Bacteria Gram-positiva. 1-membrana citoplasmática, 2-peptidoglicano, 3-fosfolípidos, 4-proteínas, 5-ácido liproteico.Abajo: Bacteria Gram-negativa. 1-membrana citoplasmática (membrana interna), 2-espacio periplasmático, 3-membrana externa, 4-fosfolípidos, 5-peptidoglicano, 6-lipoproteína, 7-proteínas, 8-lipopolisacáridos, 9-porinas

2°) Eliminar restos

celulares

Mediante centrifugación

CROMATOGRAFIA

2 fases

Móvil (Liquido o

gas)

Estacionaria(Papel o gel

Aspectos históricos de la cromatografía

La técnica de cromatografía aparece en 1850. -El químico F.F.Runge, que trabajaba con tintas, descubre que los cationes orgánicos se podían separar por migración cuando se colocaba una solución que los contenía sobre un material poroso, como papel.

En 1906 el botánico ruso Tswett utilizó la cromatografía de columna para separar extractos vegetales coloreados.

Por primera vez se utiliza el nombre de cromatografía.

En 1930 Lederer consigue separar los colorantes de la yema de huevo

Los químicos Khun, Kamer y Ruzucca desarrollan la cromatografía en el campo de la química orgánica e inorgánica.

Obtienen el premio Nóbel por sus trabajos en 1937, 1938, 1939 respectivamente.

Aspectos históricos de la cromatografía

A partir de 1940 los métodos cromatográficos adquieren extensión mundial.

En 1940 Tiselius divide los métodos cromatográficos en cromatografía por análisis frontal, desarrollo por elusión y desarrollo por desplazamiento, obtuvo el premio Nóbel por sus trabajos en 1948.

Para el mismo tiempo la cromatografía comienza a aplicarse en el campo de la bioquímica.

Martin consigue separar algunos aminoácidos acetilados

Cromatografía de

Filtración en Gel

Fase fija

Formada por polímeros biológicos

o sintéticos

Polímeros forma de pequeñas bolitas.Diámetro 10-250 µm.

Estos se hinchan con una disolución de tampón acuosa y se introducen en una

columna

Fase móvil

Tampón en el cual, la mezcla de proteínas se

encuentra disuelta

AgarosaDextrano

poliacrilamida

Cromatografía de Filtración en Gel o Cromatografía de exclusión

Cromatografía de intercambio iónico

• Sustancias ionizables:• DEAE

=DIETILAMINOETIL• CM = CARBOXIMETIL• Tienen carga (+)

fase estacion

aria

• Proteínas con carga (-) se unen al CM y quedan retenidas.

• Las proteínas neutras y las que tienen carga (+) eluyen libremente.

• Usar tampón con elevada concentración de NaCl

Fase móvil

Cromatografía de intercambio iónico

FASE ESTACIONARIA

Las proteínas cargadas negativamente se unen a la fase estacionaria

Las proteínas cargadas positivamente eluyen

Fase estacionaria

CROMATOGRAFIA POR AFINIDAD

Ofrece la mayor especificidad y selectividad para el aislamiento y

purificación de biomoléculas

En esta técnica la molécula que se une específicamente a la proteína se conoce con el nombre de ligando mientras que otras pasan por la columna

Las proteínas deseada se eluye de la columna mediante una solución que contiene una alta concentración de la forma soluble del Ligando.

La unión entre el ligando y moléculas diana de las proteínas debe ser reversible para permitir que las proteínas deban eliminarse en una forma activa

Después de eliminar los contaminantes, el ligando acoplado debe conservar su afinidad de unión específica para las proteínas diana

TIPOS DE LIGANDO

MOLÉCULAS DIANA

Enzima Análogo de sustrato, inhibidor, cofactor

Anticuerpo Antígeno, virus

Lectina Polisacárido, glicoproteína, receptor de superficie celular,célula

ácido nucleico

Secuencia de bases complementaria, histonas, nucleico polimerasa de ácido, la proteína de unión de ácido nucleico

hormonas y vitamina

Receptor, proteína portadora

El glutatión Glutatión-S-transferasa o proteínas de fusión GST

Los iones metálicos

Poli (su) proteínas de fusión, proteínas nativas con histidina, cisteína y residuos / triptófano en sus superficies

Existen numerosas variaciones de esta técnica en función del equipo utilizado, soporte y condiciones físico-químicas en las cuales se va a llevar a cabo la separación:

Electroforesis capilar

Electroforesis en gel de poliacrilamida

Isoelectroenfoque

Electroforesis en gel de agarosa.

Electroforesis en papel.

Electroforesis bidimensional

Los soportes de elección para la electroforesis de proteínas son los geles de poliacrilamida (PAGE, polyacrilamide gel electrophoresis) debido a su buena resolución y gran versatilidad.

ELECTROFORESIS EN GELEs uno de los métodos más utilizados para la purificación, análisis y caracterización de proteínas según su relación tamaño a carga eléctrica en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada.

usándose como base una matriz gelatinosa, ya sea de agarosa o poliacrilamida

Es químicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rápida .

Es un gel transparentes con estabilidad , insolubles en agua, y que permiten buena visualización de las bandas durante tiempo prolongado

Tiene un amplio rango de pHs, temperatura y fuerza iónica.

POLIACRILAMIDA

se mezcla acrilamida en diferentes proporciones , con el agente entrecruzante N,N’ metilen bis acrilamida

Además tiene la ventaja de que variando la concentración de polímeros, se puede modificar de manera controlada el tamaño del poro

COMO OBTENGO LA POLIACRILAMIDA

La electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida puede llevarse a cabo en condiciones nativas (ND-PAGE) o desnaturalizantes (SDS-PAGE).

Las diferencias entre uno y otro son :

ND-PAGE las proteínas mantienen su estructura tridimensional y las diferentes cadenas polipeptídicas pueden permanecer unidas, separándose no sólo en función de su carga eléctrica, sino también según su tamaño y forma

SDS-PAGE cuando las proteínas se solubilizan en presencia del detergente aniónico SDS , éste se une a las proteínas, rompiendo interacciones hidrofóbicas y desnaturalizándolas. Las proteínas desnaturalizadas de la muestra adoptarán una estructura en forma de bastoncillo con una serie de moléculas de SDS cargadas negativamente a lo largo de la cadena polipeptídica. Las proteinas se separan en base a su masa molecular

Se siembra la muestra (ADN, ARN o proteínas) en un gel que es sometido a una corriente eléctrica. Las moléculas se mueven a través del gel impulsadas por dicha corriente. Esta técnica permite separar moléculas de acuerdo a su tamaño y carga ya que las más pequeñas (o aquellas con mayor carga) se mueven con mayor velocidad. El gráfico muestra bandas de distinto ancho, correspondientes a distinta cantidad y tamaño de la muestra de proteínas.

Marcadores de peso molecular:

Mezcla de diferentes proteínas preteñidasde las que conocemos el peso molecular.

Por comparación podemos averiguar el PM aparente de nuestra proteína

SOUTHWESTERN BLOT O IMMUNOBLOTTING

Es un método utilizado en BIOLOGÍA MOLECULAR;

El método lleva el nombre de su inventor, el británico biólogo Edward Southern .

Fue descrito por primera vez en 1981.

Muchas de las proteínas enlazadas por ADN en la célula deben ser Aisladas

individualmente y caracterizadas para definir la función del gen.

Northern blot

Es una técnica de

detección de

moléculas de ácido

ribonucleico (ARN)

de una secuencia

dada dentro de una

mezcla compleja.

Western blot o inmunoblotmétodo que se utiliza para aislar, identificar y caracterizar proteínas de unión a ADN

Southern blot

Es un proceso que se

utiliza para el análisis

del ADN.

2. Las proteinas separadas son transferidas en un filtro de membrana de nitrocelulosa difluoruro de polivinilideno

SOUTHWESTERN BLOT O IMMUNOBLOTING

1. Se separan las proteinas mediante electroforesisen gel de poliacrilamida sodio dodecilsulfato

3. Las proteinas unidas a la menbrana se incuban luego con sondas de oligonucleotidos de secuencia especifica de ADN para las proteínas absorbidas y analizarlas

ELECTROFORESISSe separan las proteínas o los ácidos nucleicos en un gel de electroforesis

TRANSFERENCIA (BLOTTING)Se transfieren las bandas de proteínas o de ácidos nucleicos desde el gel hacia una membrana de nitrocelulosa (flechas azules) para que puedan reaccionar con la sonda radioactiva.Se añaden Anticuerpos radiactivos contra una proteína o sondas radioactivas de ácidos nucleicos (con secuencia conocida). Se espera a que reaccionen (A). Se coloca la membrana de nitrocelulosa sobre una placa fotográfica y se revela (B).

Extracción de biomoleculas

All-In-OnePara la extraccion de acidos nucleicos

se siguieron los pasos de Chomczynski

y Sacchi (1987).

Este método involucra la lisis celular

con isotiocianato de guanidinio y fenol

en una solución de una fase.

El homogeneización de la

muestra: Permite la

disgregación de la

estructura celular para

facilitar la salida de los

ácidos nucleicos. Esto con

la utilización de SDS.

Este método implica la lisis

de la célula en presencia de

agentes desnaturantes

fuertes de proteínas

(isotiocianato de guanidinio y

fenol) en una solución

monofásica.

FASE ACUOSA: ARN

FASE ORGANICA: ADN Y PROTEINAS

Extracción Fenol-Cloroformo: ADN y/o ARN

MUESTRA + Fenol equilibrado:Cloroformo (1:1)desproteiniza e inhibe nucleasas

El ADN y las proteinas pueden ser aislada de la fase orgánica por precipitación con etanol o isopropanol .ARN precipito a partir de la fase acuosa con isopropanol.

PH: reducido

Sistema de extracción automaticaEs un Sistema de instrumentación muy grande,

complejo y costoso, diseñado para un alto

volumen de procesamiento de muestras.

El hecho de automatizar el proceso de

extracción de ácidos nucleicos es beneficioso

para una serie de razones:

Reduce el tiempo de trabajo.

Disminuye los costos laborales.

Aumenta la seguridad de los trabajadores

Aumenta la reproducibilidad calidad de los

resultados.

Sobre todo minimiza el riesgo de

contaminación cruzada.

MagNA Pure LC 2.0

sistema de manipulación de partícula paramagnética para procesar la muestra y proporcionar un rendimiento constante y pureza ya que no hay detectable contaminación cruzada , entre las muestras

El proceso de extracción completo dura unos 20 minutos desde el comienzo hasta el final

SE DAN POR TRES PASOS SENCILLOS

Añadir la muestra líquida al cartucho del reactivo.

Oprimir el botón de Inicio. El ADN es eluído en un tampón de elución al final del proceso

Colocar el cartucho del reactivo dentro de la máquina.

1

3

2

Magna pure Pequeño tamaño basado en el uso de partículas magnéticas.El ácido nucleico obtenido es altamente puroAusencia de contaminación cruzada mediante filtros Hepa.Descontaminación por rayos uv Demora Máximo de 30 minutosEs posible trabajar con un amplio rango de muestras (sangre total, suero, plasma, tejidos, células en cultivo, etc.),

Roche Applied Science trabaja en el desarrollo de sistemas de alta tecnología para aplicación en Genómica y Proteómica

MagNA Pure LC 2.0

Permite hasta 32 aislamientos de ácidos nucleicos (DNA, RNA, , mrna y ácidos nucleicos totales)Muestras (tejidos, sangre, suero, células periféricas mononucleadas, células blancas, tejidos vegetalesRealiza labores de pre-pcr en distintos formatos

Unidad inicio

Unidad de elución y post-elución

Unidad procesamiento

1

3

2

Posibles Orientaciones Futuras

La automatización ha ayudado en el aumento

del rendimiento y mejora la fiabilidad del

proceso

Por lo tanto las estaciones de trabajo robótico para extracción

de ácidos nucleicos deben cumplir con una verdadera ¨Walk-away¨ , automatización, lo que significa

un proceso totalmente automatizado

un sistema portátil de extracción , ofrece varias ventajas , tales como la mano de obra reducida,

reducción de los residuos y aumento de la velocidad

conclusiones

• Las técnicas generales de purificación y extracción de

ácidos nucleicos; tanto los métodos convencionales como

los métodos modernizados gracias al desarrollo de la

tecnología; como es el sistema automatizado; permiten a

los investigadores y científicos a adquirir mejores

resultados y es esencial en una gran cantidad de

aplicaciones bioquímicas como son: relaciones de

parentesco, para detectar enfermedades hereditarias, para

conocer los genes de una persona, clonación, etc.Automatización de ácido nucleico , este proceso de extracción es potencialmente beneficioso para un número de razones entre ellas , para reducir el tiempo detrabajo , reducir la manos de obra , costos , aumento de seguridad de los trabajadores y al mismo tiempo proporciona oportunidad en la reproducibilidad y la calidad de aumentar los resultados