Influencia del almacenamiento de miel de Yateí sobre las ...

Maestrando

Bqco. Ramón Alejandro Martínez

Influencia del almacenamiento de miel de Yateí sobre las propiedades

antimicrobianas y parámetros de calidad

Tesis de Maestría presentada para obtener el título de “Magíster en Tecnología de los Alimentos”

“Este documento es resultado del financiamiento otorgado por el Estado Nacional, por lo tanto

queda sujeto al complimiento de la Ley N° 26.899”.

Directora

Mgter. Amada Beatriz Pucciarelli Román Co-Director

Dr. Luis Brumovsky

Posadas, Misiones 2013

Esta obra está licenciado bajo Licencia Creative Commons (CC) Atribución-NoComercial-

CompartirIgual 4.0 Internacional. https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/

Universidad Nacional de Misiones. Facultad de Ciencias Exactas, Químicas y Naturales. Secretaría de Investigación y Postgrado. Maestría

en Tecnología de los Alimentos.

UNIVERSIDAD NACIONAL DE MISIONES

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS QUIMICAS Y NATURALES

MAESTRÍA EN TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS

INFLUENCIA DEL ALMACENAMIENTO DE MIEL DE YATEI

SOBRE LAS PROPIEDADES ANTIMICROBIANAS Y PARÁMETROS

DE CALIDAD

Tesista: Bqco. Ramón Alejandro Martínez

Director: Mgter.Amada Beatriz Pucciarelli Román

Co-director: Dr. Luis Brumovsky

JUNIO 2013.

Posadas – Misiones- Argentina

Dedicatoria

A mi viejo Ramón, que me enseño sobre el esfuerzo y no le pude decir Gracias!!

A Maria de Itati.

Nosotros aprobamos la tesis de Maestría de Ramón Alejandro Martínez.

________________________________________ ------------------------------

Dr. Oscar Alfredo Garro. Fecha

Evaluador Externo – Universidad Nacional

del Chaco Austral. _________________________________________ ------------------------------ Mgter. Miriam Alicia Garcia Fecha

Evaluador Interno – Facultad de Ciencias Exactas,

Químicas y Naturales. Universidad Nacional de Misiones

_________________________________________ ------------------------------ Dra. Maria Alicia Martos. Fecha

Evaluador Interno – Facultad de Ciencias Exactas,


_________________________________________ ------------------------------ Mgter. Amada Beatriz Pucciarelli Román Fecha

Director de Tesis – Facultad de Ciencias Exactas,


_________________________________________ ------------------------------

Dr. Luis A. Brumovsky Fecha

Co-Director de Tesis – Facultad de Ciencias Exactas,


CALIFICACION: Elaboración de Tesis:……………………

CALIFICACION: Defensa de Tesis…………………………

Agradecimientos

A Rosina, Alejo y Josefina por su acompañamiento a pesar de las horas ausente.

A toda mi familia.

Al CEDIT por haber financiado esta investigación.

Al Laboratorio de Aguas y Alimentos del Ministerio de Salud, al DINCYT y al

Laboratorio de Bromatología de la Municipalidad de Posadas, por haberme

facilitado sus instalaciones para el desarrollo de las tareas analíticas.

Al Laboratorio de Microbiologia “Dr. Fernando Benassi”y su equipo humano por

haber colaborado en el desarrollo del proyecto.

A la Mgter. Amada“Mima” Pucciarelli por la dirección de la Tesis y sobre todo por

su insistencia.

Al Dr. Luis Brumovsky por su aporte en las correcciones del informe.

A todos los que “por las buenas o las malas” me han traído hasta acá.

RESUMEN

Tetragonisca angustula, es una abeja de la subfamilia Meliponidae conocida

tradicionalmente como Yateí. Su miel se diferencia de la miel producida por Apis

mellifera por ser menos viscosa, más ácida, poseer dulzura y aromas particulares,

además, a esta miel se atribuyen cualidades antimicrobianas, por lo que en la provincia

de Misiones aumenta permanentemente el número de productores que la comercializan.

Debido a las características diferenciales que presenta esta miel respecto de la Apis

mellifera es importante conocer su comportamiento en diferentes condiciones de

almacenamiento, a los fines de conservar las características de la miel y asegurar el

producto como inocuo.

El objetivo del trabajo fue determinar la influencia de temperatura, tipo de envase y

tiempo de almacenamiento de la miel de Yateí sobre las propiedades antimicrobianas,

parámetros de calidad microbiana y fisicoquímicos como pH, Hidroximetilfurfural,

contenido de humedad, acidez y contenido de diastasa.

El melado se realizó por escurrimiento natural y con jeringas. La metodología utilizada

para la determinaciones microbiológicas y fisicoquímicas está basada en el Código

Alimentario Argentino (CAA) y en la International Commission on Microbiological

Specifications for Foods (ICMSF). Las propiedades antimicrobianas se evaluaron por

metodología de difusión en agar Mueller Hinton.

El efecto antimicrobiano ha sido variable según las cepas estudiadas del género

Staphylococcus aureus; en tanto, los recuentos microbiológicos hallados resultaron por

sobre los estándares normativos vigentes durante las primeras etapas del proceso de

conservación, especialmente los recuentos de Mohos y levaduras (> a 102 UFC/g). Los

parámetros fisicoquímicos con variaciones más significativas fueron la acidez (to: 42,5

meq acido/kg miel), contenido de humedad (to: 26 %). La temperatura de conservación

es un factor que incide en la calidad de la miel, siendo la temperatura de refrigeración la

más adecuada a los fines de mantener estándares cercanos a los de miel de Apis

mellifera y evitar los efectos de la fermentación característica de este tipo de miel; en

cambio la temperatura ambiente es mejor para mantener el poder antimicrobiano frente

a algunos microorganismos. No se encontró diferencia significativa entre envases de

conservación de plásticos versus vidrio.

ABSTRACT

Tetragonisca angustula is a subfamily Meliponidae bee traditionally known as "Yatei".

ItsYours honey is unlike honey produced by Apis mellifera to be less viscous, more

acidic, and having a particular sweetness and aromas, also antimicrobial qualities are

attributed to this honey attributed to this honey antimicrobial qualities, so that in the

province of Misiones it permanently increases the number of producers in the market.

Due to the different characteristics presented inon this honey of Apis mellifera it is

important to understand its characteristic? their behavior under different storage

conditions, in order to preserve the characteristics of honey and ensure the product as

safe.

The objective was to determine the influence of temperature, type of packaging and

storage time on Yateí honey’s antimicrobial properties, microbial quality and

physicochemical parameters such as pHsuch as pH and physicochemical,

hydroxymethylfurfural (HMF) moisture content, acidity and diastase content .

The syrup wasis made by natural runoff and with syringes. The methodology used for

microbiological and physicochemical determinations are based on the Argentine Food

Code (CAA) and the International Commission on Microbiological Specifications for

Foods (ICMSF). The antimicrobial properties were evaluated by Mueller Hinton agar

diffusion methodology.

The antimicrobial effect was variable according to the strains of Staphylococcus aureus,

meanwhile, microbiological counts were found above regulatory standards in effect

during the early stages of the conservation process, especially mold and yeast counts (>

102 CFU/g). The physicochemical parameters with significant variations were heartburn

(to: 42.5 meq acid/kg honey), and moisture content (to 26 %). The sStorage temperature

is a factor that affects the quality of the honey. The cooling temperature is being most

suitable tofor the purposes of maintaining standards close to those of Apis mellifera

honey and avoid the effects of the fermentation characteristic of this type of honey,

whereas the room temperature is best to maintain antimicrobial power against some

microorganisms. No significant difference was found between plastic containers versus

glass conservation.

TABLA DE CONTENIDOS

LISTA DE FIGURAS…………………………………………… I LISTA DE TABLAS……………………………………………… III CAPITULO I I.- INTRODUCCIÓN……………………………………..……… 1 I.1. La miel……………………………………………………….. 2 I.2. Cadena productiva…………………………………………… 3 I.3. Alcances y definición del problema…………………………. 3 I.4. Objetivos……………………………………………………… 5 I.4.1. Objetivos generales………………………………………… 5 I.4.2. Objetivos específicos……………………………………… 5 I.5. Justificación………………………………………………… 6 CAPITULO II II.-ANTECEDENTES……………………………………………… 7 II.1. Las abejas…………………………………………………… 7 II.2. La miel……………………………………………………… 11 II.2.1. Características fisicoquímicas y microbiológicas…………… 11 II.2.2. Parámetros fisicoquímicos………………………………… 14 II.2.2.1.Humedad ………………………………………………… 16 II.2.2.2.Actividad diastásica……………………………………… 17 II.2.2.3.Acidez…………………………………………………… 17 II.2.2.4. Hidroximetilfurfural (HMF)……………………………… 19 II.2.2.5. pH………………………………………………………… 19 II.2.3. Composición polínica……………………………………… 19 II.2.4. Calidad microbiológica……………………………………… 19 II. 2.5. Poder antimicrobiano……………………………………… 25 II.2.6. Compuestos Activos de la Miel…………………………… 29 II.3. Tipos de colmena Arquitectura del nido……………………… 29 II.4. Sistemas de extracción………………………………………… 34 II.5. Conservación………………………………………………… 35 II.6. Envasado………………………………………………………. 39 CAPITULO III III.1- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL / METODOLOGIA 42 III.1.1.Calidad microbiológica…………………………………… 43 III.1.1.1. Preparación de las diluciones decimales………………… 43 III.1.1.2. Recuento de bacterias aerobias mesófilas totales………… 44 III.1.1.3. Recuento de mohos y levaduras………………………… 46 III.1.2. Propiedades antimicrobianas………………………………… 47 III.1.2.1. Determinación de la capacidad inhibitoria……………… 48 III.1.3. Parámetros fisicoquímicos………………………………… 48 III.1.3.1.pH………………………………………………………… 48

III.1.3.2.Acidez…………………………………………………… 48 III.1.3.3.Hidroximetilfurfural……………………………………… 48 III.1.3.4.Humedad……………………………………………… 49 III.1.3.5.Diastasa…………………………………………………… 49 III.1.4.Análisis Estadístico de los Datos…………………………… 49 III.2- RESULTADOS Y DISCUSIÓN…………………………… 50 III.2.1. Calidad microbiológica……………………………………… 50 III.2.1.1. Recuento de Aerobios Mesófilos Totales……………… 50 III.2.1.2. Recuento de mohos y levaduras………………………… 51 III.2.2. Parámetros fisicoquímicos………………………………… 53 III.2.2.1. Acidez libre ……………………………………………… 53 III.2.2.2. Humedad………………………………………………… 56 III.2.2.3. pH……………………………………………………… 58 III.2.2.4. Diastasa………………………………………………… 60 III.2.2.5. Hidroximetilfurfural (HMF) …………………………… 62 III.2.3.Poder antimicrobiano……………………………………… 64 III.3.-CONCLUSIONES…………………………………………… 70 III.4.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS……………………… 71 CAPITULO IV IV.- TRABAJOS FUTUROS…………………………………… 80 ANEXOS ANEXO Nº 1. Tablas de ANOVA……………………………… 81 ANEXO Nº 2. Datos de mediciones de variables………………… 84

I

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1: Abejas meliponidas con su reina…………………… 8 FIGURA 2: Distribución mundial de los melipónidos ………….. 9 FIGURA 3: Abeja Yatei y piquera con abejas………………… 10 FIGURA 4: Formación de acido gluconico por acción de la glucosa oxidasa……………………………………………………. 18 FIGURA 5: Estructura del nido de meliponas……………………. 31 FIGURA 6: Modelos de cajas para criadero y producción de miel y polen de melipónidos……………………………………………. 32 FIGURA 7: Estructura en caja del criadero y producción de miel y polen……………………………………………………………. 33 FIGURA 8: Sistemas de melado………………………………… 35 FIGURA 9: Figura 9: Diagrama del Flujo de la Producción de Miel……………………………………………………………… 35 FIGURA 10: Mapa de la Provincia de Misiones. Ubicación de Obera……………………………………………………………. 43 FIGURA 11: Diagrama de Flujo de Diluciones seriadas………… 44 FIGURA 12: Diagrama de preparación de placas para el recuento de Bacterias aerobias Mesófilas Totales…………………………… 46 FIGURA 13: Diagrama para el recuento en placa de Mohos y Levaduras……………………………………………………….. 47 FIGURA 14: Variaciones en el recuento de aerobios mesofilos totales en el tiempo según condiciones de almacenamiento……… 50 FIGURA 15: Medias e Intervalo de 95% LSD para Aerobios Mesofilos Totales……………………………………………… 51 FIGURA 16: Variaciones en el recuento de mohos y levaduras en el tiempo según condiciones de almacenamiento………………… 52 FIGURA 17: Medias e Intervalo de 95% LSD para Mohos y Levaduras…………………………………………………………. 53 FIGURA 18: Variación de la acidez en el tiempo según condiciones de almacenamiento…………………………………… 54 FIGURA 19: Medias e Intervalo del 95% LSD para Acidez/tiempo…………………………………………………….. 55 FIGURA 20: Medias e Intervalo del 95% LSD para Acidez/temperatura……………………………………………….. 55 FIGURA 21: Fotografía mieles conservadas a temperatura ambiente..…………………………………………………………. 56 FIGURA 22: Variaciones en el contenido de humedad (%) en el tiempo según condiciones de almacenamiento…………………… 56 FIGURA 23: Medias e Intervalo del 95% LSD para Humedad/tiempo………………………………………………… 57

II

FIGURA 24: Medias e Intervalo del 95% LSD para Humedad/temperatura…………………………………………… 58 FIGURA 25: Variaciones del pH en el tiempo según condiciones de almacenamiento………………………………………………… 59 FIGURA 26: Medias e Intervalo del 95% LSD para pH/tiempo… 60 FIGURA 27: Medias e Intervalo del 95% LSD para pH/temperatura…………………………………………………… 60 FIGURA 28: Variación en la actividad diastásica (ND) en el tiempo según condiciones de almacenamiento…………………… 61 FIGURA 29: Medias e Intervalo del 95% LSD para diastasa/tiempo…………………………………………………… 62 FIGURA 30: Medias e Intervalo del 95% LSD para diastasa/temperatura………………………………………………. 62 FIGURA 31: Variaciones de HMF (mg/kg de miel) en el tiempo según condiciones de almacenamiento…………………………… 63 FIGURA 32: Medias e Intervalo del 95% LSD para HMF/tiempo……………………………………………………… 64 FIGURA 33: Medias e Intervalo del 95% LSD para HMF/temperatura………………………………………………… 64 FIGURA 34: Variación del poder antimicrobiano ante CEPA 2 en el tiempo según condiciones de almacenamiento………………… 65 FIGURA 35: Variación del poder antimicrobiano ante CEPA 3 en el tiempo según condiciones de almacenamiento………………… 66 FIGURA 36: Imágenes de placas con halos de inhibición………… 67 FIGURA 37: Medias e Intervalo del 95% LSD para Halo muestra pura/temperatura de conservacion para CEPA Nº 2. …………… 68 FIGURA 38: Medias e Intervalo del 95% LSD para Halo muestra pura/tiempo (CEPA Nº 2)……………………………………… 68 FIGURA 39: Medias e Intervalo del 95% LSD para Halo muestra pura/tiempo (CEPA Nº 3)……………………………………… 69

III

LISTA DE TABLAS

TABLA 1: Composición de la miel……………………………… 13 TABLA 2: Parámetros fisicoquímicos estándares sugeridos para la miel melipónidos, comparados con estándares oficiales de la Comisión Alimentaria Codex para miel Apis mellifera…………… 14 TABLA 3: Resumen de la composición de mieles de abejas sin aguijón…………………………………………………………….. 15 TABLA 4: Microorganismos informados en mieles…………….. 22 TABLA 5: Niveles de microorganismos informados en mieles. …. 22

CAPITULO I

1

I- INTRODUCCIÓN

Las abejas Yateí (Tetragonisca angustula) son pequeñas, no poseen aguijón, son

sociales, viven en colonias y producen miel en forma similar a la abeja común (Apis

mellifera). Pertenecen a la Super familia Apoidea donde se encuentra la familia Apidae,

que se divide a su vez en 4 subfamilias, donde la subfamilia Apinae alberga a las abejas

del genero Apis, y la subfamilia Meliponinae incluye a los melipónidos como

Tetragonisca angustula (Camargo y Menezes,1992; Michener, 2000)

Las abejas de la subfamilia Apinae presentan escasa diferenciación, en cambio las

pertenecientes a la subfamilia Meliponinae tienen una gran diferenciación conociéndose

cerca de 500 especies de las cuales la gran mayoría se encuentran en América del Sur y

Central. En Argentina se las encuentra en las provincias de Misiones, Chaco, Formosa y

Corrientes (Nogueira-Neto, 1970; Crane, 1992).

La meliponicultura ha existido en América desde tiempos prehispánicos tanto con fines

medicinales como alimentarios. Su desarrollo decreció drásticamente con la

introducción de Apis mellifera dada la alta productividad de miel de la abeja extranjera

que desplazó rápidamente a las abejas nativas. Su desarrollo ha cobrado nuevo impulso

en los últimos tiempos como fuente generadora de recursos económicos y como

promotora de la diversidad biológica, debido al papel que desempeña en la polinización

cruzada, siendo responsables de la fecundación de más del 98 % de los árboles y

arbustos nativos (Heard, 1999).

La meliponicultura tiene una ventaja relativa sobre la apicultura tradicional por el

escaso riesgo que representa el manejo de este tipo de abejas por carecer las mismas de

aguijón y por su buena adecuación a la convivencia en el ambiente humano. A ello se

suma también los buenos precios que se registran en el mercado para la miel de

melipónidos. Además, su desarrollo se ve favorecido por el buen desempeño de los

melipónidos en las tareas de polinización por visitar este tipo de abejas una mayor

variedad de plantas que las pertenecientes al género Apis. Estos factores hacen que la

actividad sea una buena opción al momento de pensar en una alternativa para la

diversificación productiva.

2

I.1- LA MIEL: Características generales de las mieles de Apis y de Yateí.

Propiedades microbiológicas, fisicoquímicas

Las propiedades, características y composición de la miel de Apis mellifera han sido

ampliamente estudiadas y se conocen con gran profundidad, pero esta información es

muy escasa para los melipónidos, sobre todo debido a la gran diferenciación de los

mismos, lo que hace difícil conocer puntualmente y con suficiente peso científico las

características de la miel producida por una especie en particular (Vit y Col., 1994).

Se han caracterizado las mieles de las abejas sin aguijón provenientes de diferentes

especies de melipónidos, existiendo entre ellas grandes variaciones según el parámetro

estudiado pero presentando algunas características en común (Vit y Col., 1998).

La miel de los melipónidos presenta diferencias significativas con la miel de Apis

mellifera fundamentalmente en sus propiedades organolépticas y fisicoquímicas, siendo

características su mayor contenido de humedad y su mayor acidez. (Vit y Col., 1994;

De Almeida, 2002; Souza y Col., 2006). Las normativas y recomendaciones de calidad

de miel, tanto internacionales como regionales han sido desarrolladas tomando como

estándar la miel producida por Apis mellifera y establecen como límite superior para el

contenido de humedad valores que rondan el 20 %, bajo la premisa de que contenidos

de humedad superiores permiten la proliferación microbiológica predisponiendo el

producto a la fermentación, lo que es inaceptable para este tipo de miel. (Codex, 1981;

MERCOSUR, 1994).

Las mieles de los melipónidos presentan contenidos de humedad por sobre este valor

límite siendo característicos valores que rondan entre el 23 y el 30 %, estos valores de

contenido de agua permiten una fermentación característica de la miel de Yateí, que se

origina ya en las vasijas de producción de la miel en la colmena y aumentan la acidez de

la misma, registrándose característicamente valores de 45 a 60 meq/kg de miel,

mientras que los límites establecidos por la normativa se ubican alrededor de 40 meq/kg

de miel ( Vit y Col., 1994; De Almeida , 2002, Souza y Col., 2006)

3

I.2- CADENA PRODUCTIVA: condiciones de envasado, temperatura de

conservación, tipos de envase

El alto contenido de humedad de este tipo de mieles hace que su manipulación y

condiciones de conservación deban ser adecuadamente estudiados, ya que sus

características difieren marcadamente de las de la miel de Apis mellifera., para la cual

se conocen las condiciones más adecuadas y rentables de conservación y

comercialización. El mantenimiento de los alimentos en condiciones adecuadas de

conservación hace que sus propiedades, tanto organolépticas como nutricionales, se

mantengan constantes hasta la llegada al consumidor asegurando así un producto

apetecible y seguro. Además, adecuadas condiciones de conservación evitan también

pérdidas económicas por descomposición del producto y posibles accidentes

alimentarios (Jay, 1992).

El amplio desarrollo que ha tenido la apicultura ha generado para dicha actividad toda

una tecnología productiva que tiene conocimientos técnicos desarrollados desde el

manejo de la abeja hasta la comercialización del producto abarcando las propiedades de

la miel, sus métodos de envasado, su estabilidad en el tiempo, sus condiciones de

conservación y sus sistemas de manufactura a los fines de obtener un producto seguro

para el consumidor.

Todas estas áreas del conocimiento se encuentran con escaso desarrollo con base

científico para la meliponicultura, fruto del abandono en que cayo la actividad frente a

la producción apícola por la limitada capacidad productiva de la abeja, sumado a ello,

las prácticas de manejo tradicional de melipónidos se convierten hoy en inaceptables

por la existencia de nuevas prácticas de manejo de los productos alimenticios (Buenas

Prácticas Agrícolas, Buenas Prácticas de Manufactura) debiendo validarse

científicamente nuevas metodologías de manejo de la abeja y del producto a fin de

adecuarlos a lo estándares internacionales existentes.

I.3- ALCANCES Y DEFINICIÓN DEL PROBLEMA.

Misiones por las características únicas de su ecosistema natural, reflejado en su variada

flora, ha tenido tradicionalmente la presencia de la meliponicultura en las chacras de los

4

colonos a modo de autoproducción o de “hobbie”. Hoy día, la rentabilidad del producto

hace que se haya incrementado enormemente el número de personas interesadas en

desarrollar la actividad con una visión comercial, lo que hace que la provincia de

Misiones pueda constituirse en poco tiempo en productora de una miel de

características diferenciadas, constituyendo la actividad de la meliponicultura una

opción viable para el productor regional en el marco de la existente política de

diversificación productiva.

En la provincia desde el año 2004 y con el apoyo y la promoción de diferentes

estamentos gubernamentales se realizan variados encuentros entre productores de miel

de Yateí y técnicos relacionados con la actividad, con el objetivo de aumentar la

capacitación de los productores en áreas como las Buenas Practicas Apícolas y de

Manufactura para obtener un producto de mayor calidad. En estos encuentros los

técnicos reciben también las inquietudes de los productores en diversas áreas de su

interés entre los que figuran fundamentalmente los temas relacionados con: condiciones

de salubridad en el melado, manejo y envasado de la miel; propiedades organolépticas

de la miel, diferenciación de otras mieles; propiedades fisicoquímicas requeridas para

establecer calidad y adulteración; usos medicinales y nutricionales de la miel de Yateí,

variación de calidad durante almacenamiento; control de calidad y registro en el sistema

alimentario nacional.

El desarrollo de todas estas áreas del conocimiento, necesarias para una producción con

criterio de calidad, precisa de información generada con metodología científica a los

fines de poder validar y generalizar las prácticas utilizadas y encontradas como más

adecuadas. A la fecha, las prácticas de manejo de colmenas, melado, envasado y

conservación del producto son realizadas por cada productor según su saber y su

creencia por no contarse con suficiente conocimiento científico en estas áreas.

Información con dichas características es escasa para la meliponicultura, y por ello se

vuelve de fundamental importancia el desarrollo de conocimientos científicos en esta

temática.

En nuestra provincia hay estudios que abarcan aspectos ecológicos, fito geográficos,

estacionales, que influyen sobre la producción de miel. Se han comenzado también

emprendimientos para determinar las características físico-químicas y microbiológicas

5

de la miel, pero hasta el presente existe escasa información científica acerca del

comportamiento del producto en diferentes condiciones de almacenamiento y con

diferentes tipos de envasado.

El aumento de investigaciones en áreas relacionadas a la meliponicultura es también

necesario a los fines de contar con un bagaje de información respaldatoria para avanzar

en la inclusión de este producto en las normativas regionales.

I.4- OBJETIVOS

I.4.1- OBJETIVOS GENERALES

Determinar la influencia de las condiciones de almacenamiento de la miel de Yateí

sobre las propiedades antimicrobianas y parámetros de calidad microbiana y

fisicoquímicos.

I.4.2- OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

Determinar la influencia de: temperatura, tipo de envase y tiempo de

almacenamiento de la miel sobre:

Propiedades antimicrobianas.

Nivel de contaminación microbiana.

pH

Contenido de Humedad.

Hidroximetilfurfural.

Acidez libre.

Contenido de diastasa.

Determinar la mejor combinación temperatura – tiempo – tipo de envase, que

permita un óptimo almacenamiento de la miel de Yateí, sin que varíe su calidad y

propiedades antimicrobianas.

6

I.5- JUSTIFICACION

Desde el año 2004, los productores de de miel de Yateí de Misiones, solicitan asistencia

y apoyo técnico en los distintos temas relacionados con la cría de melipónidos,

producción y conservación de esta miel, teniendo en consideración las características

diferentes que presenta con respecto a la miel de Apis, y que actualmente la producción

de esta miel, se desarrolla en diferentes modalidades según usos y costumbres propios

de cada productor, existiendo diferentes tipos de colmenas en uso y diferentes métodos

de melado y manejo de la colmena.

El conocimiento del comportamiento de la miel de Yateí durante el almacenamiento es

fundamental para poder avanzar en cualquier intento de comercialización del producto.

Las características diferenciales de la miel de melipónidos respecto de la Apis mellifera

nos estimula a conocer profundamente su comportamiento en diferentes condiciones de

almacenamiento, a los fines de establecer a ciencia cierta las mejores condiciones de

conservación para el mantenimiento de las características de la miel y asegurar el

producto como inocuo.

El conocimiento de la estabilidad de la miel de Yateí, a través de la evaluación de

diferentes tecnologías de conservación constituye también una información necesaria y

fundamental al momento de solicitar la inclusión de esta variedad de miel en las

normativas nacionales y regionales, además de permitir aumentar la vida útil del

producto y reducir costos de los sistemas de conservación.

Los resultados de la investigación brindarán al productor y a los entes de promoción de

esta actividad, importante información, necesaria para asegurar la calidad y seguridad

del producto que llega al consumidor disminuyendo las pérdidas económicas por

alteración.

CAPITULO II

7

II- ANTECEDENTES

II.1- LAS ABEJAS.

Las abejas son insectos que pertenecen a la Super familia Apoidea y a la familia

Apidae, esta se divide a su vez en 4 subfamilias donde la subfamilia Apinae alberga a

las abejas Apis mellifera, y la sub familia Meliponidae (o Meliponinae) incluye a los

melipónidos como Tetragonisca angustula (Godoy y Feversani, 2005).

Existe una extensa discusión acerca de la clasificación y ubicación taxonómica de las

diferentes especies de abejas, sobre todo a nivel de familias, subfamilias, tribus y

géneros y subgéneros. Las abejas de este género se diferencian de las Apis mellifera al

nivel de las subfamilias y se ubican dentro de la subfamilia Meliponinae (Camargo y

Menezes, 1992), renombrada como Meliponini (Michener, 2000). Otra clasificación las

ubica en la subfamilia Apinae, tribu Apini y subtribu Meliponina (Silveira, 2002).

Reino: Animal

Clase: Insecta

Orden: Himenóptera: (abejas, hormigas y avispas)

SUPER FAMILIA APOIDEA----- abejas

Familia APIDAE----- 4 subfamilias ----Apineos

---- Meliponineos.

----Bombineos.

---- Euglossineos.

Dentro de los meliponineos existen innumerable cantidad de especies organizadas en

tribus, como Meliponini, Trigonini, que incluye a Tetragonisca angustula (Moure,

1951).

Las tres primeras subfamilias desarrollan conductas sociales avanzadas. Dentro de los

Apineos la principal especie es la Apis mellifera, introducida cerca del 1830 en el

continente americano. Esta especie debido a diferentes condiciones regionales

desarrolla grupos de individuos originando “razas geográficas”. Así podemos encontrar

la abeja negra o alemana (Apis mellifera mellifera), la abeja amarilla o italiana (Apis

mellifera ligústica), la abeja carniola (Apis mellifera cárnica), la abeja caucásica (Apis

mellifera caucásica), la abeja africana (Apis mellifera adansonii o scutellata). Esta

última ha sido introducida en el continente americano en el año 1956 originando

8

posteriormente a la denominada abeja africanizada (Camargo y Menezes, 1992; Godoy

y Ferversani, 2005).

Las abejas de la sub familia Apinae presentan escasa diferenciación, en cambio las

pertenecientes a la subfamilia Meliponinae tienen una gran diferenciación conociéndose

alrededor de 500 especies distribuidas mayoritariamente en América del Sur y Central,

y en Argentina se las encuentran en las provincias del norte del país como Misiones,

Chaco, Formosa y Corrientes (Crane, 1985).

Las hembras de las 4 subfamilias presentan corbículas, que son pequeñas concavidades

en las patas traseras para transportar polen (Fig.1). Los machos de todas las subfamilias

no poseen aguijón, si lo presentan las hembras excepto en los melipónidos (Heard,

1999)

Figura 1: Abejas melipónidas con su reina

Los melipónidos son abejas que se desarrollan en climas tropicales o subtropicales

templados encontrándoselas en la mayoría de las regiones con tales características, su

adaptación a climas diferentes es muy difícil habiéndose realizado intentos en Europa y

diversos puntos del planeta sin mucho éxito (Fig. 2).

La especie que mejor se adapta a otras condiciones climáticas es Tetragonisca

angustula (Yateí) que adquiere especial importancia por su importante papel en la

polinización al visitar gran número de plantas. Adicionalmente la abeja Yateí es

caracterizada como el melipónido de mejores hábitos higiénicos por el tipo de material

que colecta para la realización del nido. Otros melipónidos utilizan para dicha tarea

incluso excretas de animales lo que deriva en una alta contaminación de los productos

9

(miel, polen, propóleos) con bacterias coliformes y el riesgo asociado de existencia de

microorganismos patógenos (Nogueira-Neto, 1997).

Figura 2: Distribución mundial de los melipónidos .

Estos melipónidos son pequeños, miden un poco más de medio centímetro y tienen el

abdomen dorado. Nidifican en lugares diversos, desde huecos de árboles, hormigueros

abandonados, y en los más variados lugares donde encuentran espacio y seguridad

suficiente para el desarrollo de la colonia (Fig. 3). Posiblemente debido a una conducta

de adaptación, es común observarlas colonizando hábitats urbanos disponibles en las

construcciones civiles (postes, paredes, muros, cajas de luz, armarios, tumbas, etc.). La

entrada al nido, denominada piquera, es un tubo de cera clara, porosa, generalmente

impregnado de resina para defenderse de invasores ocasionales. Algunas centinelas por

lo general permanecen volando alrededor de la piquera custodiándola (Nogueira-Neto,

1997)

10

Figura 3: Abeja Yateí y piquera con abejas

La meliponicultura ha existido en América desde tiempos prehispánicos tanto con fines

medicinales como alimentarios, existen registros del año 1722, de la crianza de

melipónidos por las tribus pre hispánicas (Ximénez, 1967).

Su desarrollo decreció drásticamente con la introducción de Apis mellifera dada la alta

productividad de miel de la abeja extranjera que desplazó rápidamente a las abejas

nativas. Su desarrollo ha cobrado nuevo impulso en los últimos tiempos como fuente

generadora de recursos económicos y como promotora de la diversidad biológica,

debido al papel que desempeña en la polinización cruzada, siendo responsables de la

fecundación de más del 98 % de los árboles y arbustos nativos (Heard, 1999).

La miel de estas abejas es muy aprovechada por los indígenas por ser sumamente

sabrosa y por el uso medicinal que se le da sobre todo a nivel oftalmológico. En nuestro

país no es tan conocida, como en México, donde desde el año 1998 existe registro legal

para la comercialización de sus productos (Perez-Perez y Col., 2007)

La meliponicultura tiene una ventaja relativa sobre la apicultura tradicional por el

escaso riesgo que representa el manejo de este tipo de abejas por carecer las mismas de

aguijón y por su buena adecuación a la convivencia en el ambiente humano (Fonseca y

Col., 2006) A ello se suma también los buenos precios que se registran en el mercado

para la miel de melipónidos. Además, su desarrollo se ve favorecido por el buen

desempeño de los melipónidos en las tareas de polinización por visitar este tipo de

abejas una mayor variedad de plantas que las pertenecientes al género Apis. Estos

11

factores hacen que la actividad sea una buena opción al momento de pensar en una

alternativa para la diversificación productiva.

II.2- LA MIEL

II.2.1.- Características fisicoquímicas y microbiológicas

A lo largo de la historia existen numerosas referencias de la gran importancia y de los

numerosos usos que se ha dado a la miel como producto indispensable y de primera

necesidad. En la cultura maya se la utiliza para hacer licores y vino de miel (aguamiel),

en África se utiliza en fabricación de cerveza (Gentry, 1982). También se le atribuyen

numerosas propiedades medicinales comprobadas en diferentes trabajos científicos que

destacan su poder energizante, laxante, hepatoprotector, antibacteriano y cicatrizante

(Humbel, 2004).

La producción mundial de miel de Apis mellifera ronda las 1.309.656 Tn., China es el

principal productor, seguido de Estados Unidos y Argentina con 90.000 Tn (FAOSTAT

DATABASE, 2004).

La miel es conocida por el hombre desde la prehistoria, utilizando primero colmenas

silvestres y luego desarrollando colmenares. La cría de las abejas en los colmenares fue

introducida inicialmente en la zona mediterránea de Europa. Existen muchas especies

productoras de miel pero a los fines de producción industrial se destinan las especies

pertenecientes al género Apis: mellifera, dorsala, lingustica (Salamanca Grosso y Col.,

2001).

La miel está constituida por el néctar y exudados sacaríneos de las plantas, libado,

modificado y almacenado por las abejas en los colmenares. El néctar es una solución

acuosa azucarada, segregada a nivel de los órganos glandulares de las plantas, que

pueden ser florales o extraflorales (Serrano y Col., 1994a)

Las abejas Apis mellifera extraen el néctar de las flores y lo almacenan en su saco de

miel, depositándola luego en las celdas abiertas, hexagonales, estas son bien ventiladas

y producen una pérdida de agua hasta un 18 – 20 %. Una vez terminado este

acondicionamiento las abejas sellan las celdas con una capa de cera (Montes, 1966). La

miel es esencialmente una solución acuosa concentrada de azúcar invertido, que

contiene además una serie compleja de otros hidratos de carbono, enzimas,

12

aminoácidos, ácidos orgánicos, minerales, substancias aromáticas, granos de polen, etc.

(Belitz y Grosch, 1997)

La recomendación mundial en alimentos es el Codex Alimentarius, que en su norma

destinada a miel, Codex Stan 12-1981 la define según:

“Se entiende por miel la sustancia dulce natural producida por abejas Apis mellifera a

partir del néctar de las plantas o de secreciones de partes vivas de éstas o de excreciones

de insectos succionadores de plantas que quedan sobre partes vivas de las mismas y que

las abejas recogen, transforman y combinan con sustancias específicas propias, y

depositan, deshidratan, almacenan y dejan en el panal para que madure y añeje”.

La tercera parte de esta norma involucra a mieles producidas por otras especies de

abejas.

Regionalmente las características de la miel están definidas a través de las Normas

MERCOSUR, que han sido internalizados y agregadas al Código Alimentario

Argentino en su Artículo 783 (Capitulo X) la que define a la miel como: “ el producto

alimenticio producido por las abejas melíferas a partir del néctar de las flores o de las

secreciones procedentes de partes vivas de las plantas o de excreciones de insectos

succionadores de plantas que quedan sobre partes vivas de plantas, que las abejas

recogen, transforman, combinan con sustancias específicas propias y almacenan y dejan

madurar en las panales de la colmena” .

Las principales características que definen una miel son: el color, el aroma, el flavor y la

composición química.

La composición de la miel es muy variable, dependiendo de la composición del néctar,

las condiciones climáticas y el origen floral; como muestra la Tabla 1 la composición

general de la miel de Apis mellifera es:

Carbohidratos (73-83 %) que constituyen el principal componente de la miel y son

Fructosa (30,9 - 44,3 %), Glucosa (22,9 - 40,8 %), Sacarosa (0,8 - 1,0 %), Maltosa (0,5 -

2,8 %), Isomaltosa (0,5 - 1,8%), Turanosa (0,5 - 1,5%)

Agua: el contenido normal esta entre 14,5 y 18 %, valores supriores pueden producir la

fermentación de la miel.

Constituyentes minoritarios: menos del 1,5 % del peso seco.

Ácidos orgánicos: (0,6 %), acido glucónico (principal), acético, butírico, cítrico,

fórmico, láctico, málico, succínico.

13

Compuestos nitrogenados (0,4 %): Proteínas (0,3 %), aminoácidos (0,05 - 0,1 %),

enzimas (amilasa, glucosaoxidasa)

Minerales: (0,1 %) potasio, fósforo, calcio, sodio, magnesio.

Una composición general podría describirse según: Fructosa (35-45 %), glucosa (30-35

%), agua (17-21 %), cenizas (0,09-0,3 %), prótidos (0,04 -0,2 %), minerales (0,1-0,2 %)

(Benedetti y Pieralli, 1990).

Tabla 1: Composición de la miel

Componentes Valor promedio

Fructosa (%) 38,2

Glucosa (%) 32,0

Sacarosa (%) 1,38

Maltosa (%) 6,8

Otros azucares (%) 3,1

Humedad (%) 17,2

pH 3,91

Acidez libre (mEq/kg) 22,03

Lactona (mEq/kg) 7,11

Acidez total (mEq/kg) 29,12

Cenizas (%) 0,17

Indice de diastasa 20,80

(Adaptado de White 1978).

La menor solubilidad de la glucosa en agua, respecto de la fructosa determina que el

mayor contenido de glucosa de las mieles se asocie a su mayor tendencia a granularse.

(Ojeda De Rodriguez, 2004).

Una característica importante que se aprecia en mieles de melipónidos es la

composición mayoritariamente de fructosa que determina una menor tendencia de estas

a la granulación, sobre todo, teniendo en cuenta la capacidad de la fructosa de aumentar

la solubilidad de la glucosa en la miel (Crane, 1975). En el fenómeno de cristalización

también esta involucrada la relación glucosa/contenido acuoso que al hacerse mayor

acelera los fenómenos de cristalización (White y Col., 1962).

14

II.2.2.- Parámetros fisicoquímicos

El Codex Alimentarius reserva la definición de miel para la producida por Apis

mellifera, otras legislaciones, como el Código Alimentario Argentino, no hacen ninguna

referencia al tipo de abeja productora, pero los parámetros característicos utilizados son

los correspondientes a la miel de Apis mellifera.

La caracterización fisicoquímica de las diferentes mieles generalmente se realiza a partir

de algunos parámetros establecidos en los métodos armonizados de la Comisión

Europea de mieles como ser humedad, cenizas, acidez libre, actividad diastásica,

hidroximetilfurfural, azúcares reductores y otros (Bogdanov y Col., 1997)

Ante esta realidad y en la búsqueda de caracterizar a la miel de melipónidos se han

sugerido patrones propios para la miel de melipónidos considerando diversos géneros

como representativos de los diversos grupos. De esta tarea surgen algunas variantes

respecto a los parámetros utilizados para mieles de Apis mellifera como ser: incrementar

el contenido máximo de agua de 20 a 30 %, disminuir el contenido de azúcares

reductores de 65 a 50 g/100g de miel, incrementar el límite máximo de acidez de 40 a

85 meq/Kg de miel. Sin embargo, se sugiere mantener los límites de cenizas y HMF

según se observa en la Tabla 2. (Vit y Col., 2004).

Tabla 2: Parámetros fisicoquímicos estándares sugeridos para la miel de melipónidos, comparados con estándares oficiales de la Comision Alimentaria Codex para miel de Apis mellifera

Apis mellifera Melipona Scaptotrigona Trigona

Contenido de agua (g/100 g) Max 20,0 Max 30,0 Max 30,0 Max 30,0

Azucares reductores (g/100 g) Min. 65,0 Min 50,0 Min 50,0 Min 50,0

Sacarosa (g/100 g) Max 5,0 Max 6,0 Max 2,0 Max 6,0

Acidez meq /Kg) Max 40,0 Max 70,0 Max 85,0 Max 70,0

Cenizas (g/100 g) Max 0,5 Max 0,5 Max 0,5 Max 0,5

HMF (mg/kg) Max 40,0 Max 40,0 Max 40,0 Max 40,0

Actividad diastasica (ND) Min 8,0 Min 3,0 Min 3,0 Min 7,0 (Adaptado de Vit P.y Col., 2004).

Numerosos estudios encuentran resultados acordes con los parámetros recomendados

por Vit y Col., (2004), así la evaluación de las características de miel de melipónidos

15

(Melipona mandacaia) en Brasil encuentra valores acordes a los recomendados para

parámetros como humedad (28,78 %) y acidez (43,5 meq/kg), destacando la amplia

variabilidad entre las muestras analizadas (Alves y Col., 2005).

Se han realizado diversas recopilaciones de trabajos que reflejan la composición de

mieles de melipónidos. Existen en ellos gran variabilidad en los valores hallados para

los diferentes parámetros debido a las diferentes especies, la variabilidad geográfica y

polínica y metodología analítica. La Tabla 3 muestra datos de la recopilación realizada

por Souza y colaboradores que toman parámetros prioritarios y los comparan con los

establecidos para miel de Apis mellifera (Souza y Col., 2006).

Tabla 3: Resumen de la composición de mieles de abejas sin aguijón

Parametros fisicoquímicos

Nº de Actividad Azucares

Especie muestras pH

Acidez libre diastasica HMF

reductores Sacarosa Humedad

meq/kg (ND) (mg/kg) (g/100 g) (g/100 g) (g/100 g)

Meliponini 152 3,81 44,8 6,7 14,4 66,0 2,3 26,7

Melipona spp. 97 3,82 41,8 3,1 16 69,1 2,2 27,2

otras Meliponini 55 3,80 49,6 16,2 11,9 63,8 2,5 26,0

M. asilvai 11 3,27 41,6 2,4 68,9 4,7 29,5

M. compressipes 15 3,72 36,6 4,5 17,1 70,5 2,5 23,8

M. favosa 20 49,9 1,9 9,1 71,2 1,7 24,8

M. mandacaia 20 3,27 43,5 5,8 74,8 2,9 28,8

T. angustula 39 3,93 49,7 20,5 13,3 63,1 2,3 24,7(Adaptado de Souza y Col., 2006)

En la evaluación de las características fisicoquímicas de la miel de diversas especies de

melipónidos de Guatemala se evidenció una gran variabilidad según el parámetro

estudiado. En la mayoría de los casos los límites se adecuaron a las recomendaciones de

Vit y col. (2004) para la miel de melipónidos. Los valores discordantes fueron hallados

para especies poco estudiadas de melipónidos como Plebeia sp. y G. acapulconis.

(Dardon y Enriquez, 2008). Similares resultados se hallaron en otros estudios realizados

sobre 8 especies de melipónidos, encontrándose también una buena adecuación a los

estándares recomendados por Vit y Col (2004) para los parámetros fisicoquímicos. En

16

los mismos se encuentra para T. angustula valores más altos de acidez a los

recomendados (Enriquez y Dardon, 2006).

Estudios realizados en Brasil sobre mieles de Melipona mandacaia determinaron

tenores de humedad en las mismas del orden del 29 % independientemente de las

humedad ambiental de la zona de captura. La composición en azúcares reductores fue

del orden del 65 al 82 %. (Alves y Col., 2005).

La miel de meliponas posee menor concentración de azucares y cantidades similares de

glucosa y fructosa siendo este factor responsable de su alta higroscopicidad y su

capacidad de no cristalizar. Se encontró también un 3 % de sacarosa asimilable a los

límites establecidos por la normativa de 6 % como máximo. La acidez promedio estuvo

alrededor de 40 mg/kg de miel, limite máximo establecido para mieles de Apis

mellifera. (Alves y Col., 2005).

II.2.2.1.- Humedad

La miel se encuadra tradicionalmente entre los alimentos de humedad intermedia,

aunque el estado del agua en la miel esta sujeto a variaciones que pueden ocurrir

durante el almacenamiento como los fenómenos de cristalización, que producen un

aumento del contenido de agua en las capas superiores (Gomez y Cabezas, 1990). Por

su alta higroscopicidad, la capa superficial de miel tiende a captar agua del medio

ambiente hasta alcanzar un equilibrio (White, 1975; Serrano y Col, 1994b).

Por ello las mieles almacenadas en ambientes húmedos presentan un mayor contenido

acuoso (Sanz y Gradillas, 1995). El contenido de agua de las mieles puede oscilar entre

un 13 y 25 %, la normativa regional vigente establece un máximo de 20 % de humedad

para la miel Apis mellífera (Código Alimentario Argentino, Cap. X)

El contenido de humedad condiciona el color, palatabilidad, sabor y solubilidad de la

miel, pero fundamentalmente predispone a la miel a la colonización microbiana

fundamentalmente fúngica (Finola y Col., 2007).

El mantenimiento de mieles de Apis mellifera en ambientes con humedades relativas

superiores el 60 %, ha demostrado una absorción neta de agua por parte de las mieles

debido a su alta higroscopicidad por su composición en hidratos de carbono (Salamanca

Grosso y Col., 2001).

17

Este parámetro influye decisivamente en la conservación ya que es el medio en el que se

llevarán a cabo la mayoría de las reacciones de transformación y alteración.

La fermentación de las mieles depende de la contaminación inicial, el tiempo y

temperatura de almacenamiento y el contenido de humedad, siendo éste, el factor

principal (Sanz, 1995; White 1975)

Oliveira (2005), encontró que la humedad de las mieles de las diferentes especies de

melipónidos se ubica en el orden de 28,78 +/- 2,73 %. Los valores de azúcares

reductores son similares a los encontrados para la miel Apis, con preponderancia de

glucosa y fructosa. La sacarosa hallada tuvo un valor medio de 2,91 % (Alves y Col.,

2005).

Estudios en la provincia de Misiones hallaron valores de entre 21,5 y 27 % de contenido

acuoso. (Pucciarelli y Col., 2009)

II.2.2.2.-Actividad diastásica

La enzima más importante de la miel es indudablemente la invertasa, encargada de

hidrolizar la sacarosa dando como productos glucosa y fructosa (White 1975).

Estudios señalan tres enzimas de mayor importancia en la miel, la invertasa, la amilasa

o diastasa y la glucosa oxidasa (Huidobro y Simal, 1984), tanto la amilasa como la

invertasa pueden utilizarse como indicadores de estrés o envejecimiento de la miel y

diferentes trabajos indican variaciones en la conveniencia en la utilización de una u otra

de ellas. (White y Kushnir, 1964; Takenaka y Echigo, 1974; Krause y Krause, 1991) La

normativa regional utiliza el índice de diastasa como indicador de envejecimiento de las

mieles (Código Alimentario Argentino, Cap. X)

II.2.2.3.-Acidez

La acidez protege a la miel de la colonización microbiana y contribuye con el flavor

aunque en gran medida es enmascarada por los azúcares. Durante mucho tiempo fue

atribuida al ácido fórmico adicionado por las abejas, aunque hoy se conoce gran

cantidad de ácidos que forman parte de la miel como acético, cítrico, málico, láctico,

oxálico, succínico, fosfórico, glucónico y otros, siendo el glucónico el principal ácido

de la miel (Fig. 4). Estos ácidos en las mieles se forman a partir de la acción enzimática

fermentativa debida a las secreciones glandulares de la abeja (Sanz y Triguero, 1970).

18

.

Figura 4: Formación de acido glucónico por acción de la glucosa oxidasa

Los diferentes orígenes de las mieles y de los ácidos en estas generan una gran

variabilidad en la composición ácida de las mieles (Cherchi y Spaneda, 1994). En la

fracción ácida se pueden distinguir tres componentes: la acidez lactónica, la libre y la

total que es la suma de las anteriores. La acidez lactónica esta constituida básicamente

por las lactonas del ácido glucónico en equilibrio con este a través de la acción de la

enzima glucosaoxidasa que originan ácidos cuando la miel se alcaliniza (White 1978).

La acidez de la miel se relaciona también con el contenido de glucosa de la misma. La

glucosa se transforma por la acción de la enzima D- glucosa oxidasa en ácido glucónico

que constituye entre el 70 y 90 % de los ácidos de la miel. Este proceso de

transformación produce peróxido de hidrogeno importante componente de la acción

antimicrobiana de la miel (De Mera y Angert, 2004; Fangio y Col., 2007).

La acidez hallada para miel de Melipona mandacaia varía de 18,5 a 62,5 mEq/kg de

miel. (Alves y Col., 2005; Alves y Col., 2006).

Estudios realizados por Cherchi y Spaneda mostraron un aumento de la acidez durante

el envejecimiento de la miel por el mantenimiento de la actividad enzimática,

independientemente del método de conservación (Cherchi y Spaneda, 1994).

19

II.2.2.4.- Hidroximetilfurfural (HMF)

El calentamiento y envejecimiento de la miel motiva también la producción de

hidroximetilfurfural por deshidratación de hexosas, este se descompondrá en acido

levulínico y fórmico que aumentarán los niveles de acidez (ICMSF, 2001).

Esta reacción se encuentra favorecida por condiciones acidas de la muestra, de esta

manera, la acidificación del medio acelera la descomposición de hexosas con formación

de HMF. Este comportamiento ha sido descripto por varios autores (Castro Vázquez y

Col., 2008; Ramírez Cervantes y Col., 2000; White, 1964; Takenaka, 1974), y

establece la utilidad de este indicador para evaluar el envejecimiento de las mieles.

II.2.2.5.- pH

El pH de las mieles de melipónidos ha sido evaluado en diversos estudios y se han

hallado valores que se ubican entre 3,16 y 3,48 similares a los hallados en estudios para

Apis melífera, cuyos valores oscilan entre 3 y 4, aunque este parámetro no se halla

incluido entre los establecidos en los lineamientos de calidad para miel de Apis melífera

(Vit y Col., 1994; Barth y Col., 2005; Enriquez y Dardon, 2006; Souza y Col., 2006).

II.2.3.- Composición polínica

El Código Alimentario Argentino establece criterios diferenciales para las mieles según

su composición monofloral o multifloral (Código Alimentario Argentino, Cap. X).

Estudios en Brasil han reportado como los principales géneros de polen encontrados en

las mieles de melipónidos a: Acacia polyphyla, Anadenanthera macrocarpa, Citrus,

Eucalyptus, Mircia Brassicaceae, Mimosa caesalpinifolia, (Almeida, 2002; Barth,

2004, Alves y Col., 2006).

La evaluación de nueve especies de melipónidos en Guatemala determinó una gran

variabilidad de la composición polínica de T. angustula respecto a otras especies de

melipónidos, hallándose 21 especies polínicas en las muestras evaluadas y 18 en las

correspondientes a T. angustula (Dardon yEnriquez, 2008).

II.2.4.- Calidad microbiológica

La caracterización microbiológica de las mieles incluye en la mayor parte de las

normativas vigentes; un recuento total en placa, que suministra un indicador general de

20

la calidad microbiológica de la miel; la determinación de bacterias coliformes, utilizado

como indicador del estado sanitario del producto que puede incluir la búsqueda de

Escherichia coli como fuerte asociación a contaminación fecal. Incluyen también el

recuento de mohos y levaduras útil para determinar el nivel de contaminación y predecir

la vida útil de la miel (Snowdon y Cliver, 1996). Algunas normas pueden incluir la

búsqueda de algunos patógenos, como formas vegetativas de Salmonella, que pueden

sobrevivir en la miel (Tysset y Durand, 1973), o la investigación de bacterias

formadoras de esporas como Bacillus o Clostridium (Snowdon y Cliver, 1996). Desde

el interés industrial podemos ubicar a los microorganismos en tres grupos:

1. Microorganismos hallados comúnmente en las mieles (algunas levaduras y bacterias

formadoras de esporas).

2. Microorganismos que indican calidad sanitaria y comercial (coliformes y levaduras).

3. Microorganismos que bajo ciertas condiciones (germinación, crecimiento y falta de

tratamiento al alimento) pueden causar enfermedades.

Existen dos fuentes principales de contaminación de la miel, las fuentes primarias

involucran el polen, el tracto digestivo de las abejas, el polvo y el néctar. El polen puede

ser la fuente principal de estos microorganismos, incluso sobre el suelo, llegando de esta

manera a través del contacto directo con la abeja y por ella a otros insectos no

contaminados en la colonia. De hecho los microorganismos descriptos en la miel se

condicen ampliamente con los descriptos en las abejas. Del contenido intestinal de las

abejas probablemente lleguen a la miel miembros de la familia de Bacillus. Entre los

mohos el más generalmente hallado es del género Aspergillus spp (Snowdon y Cliver,

1996; Finola y Col., 2007).

El aire y el polvo son importantes fuentes de diversas especies de Bacillus, Clostridium

y Micrococcus

Las fuentes secundarias de contaminación parecen ser las principales responsables de la

contaminación de la miel, entre las que se encuentran, el aire, manipuladores,

contaminación cruzada y equipamientos. Las fuentes secundarias de contaminación

pueden ser adecuadamente controladas a través de las Buenas Prácticas de Manufactura

(Guia de BPA y M, 2003).

El desarrollo de mohos puede darse fundamentalmente en la superficie de los envases,

ciertas experiencias confirman la capacidad de estos microorganismos de sobrevivir

21

pero no desarrollarse en las mieles Altos recuentos de mohos pueden deberse a

contaminaciones recientes de fuentes secundarias sobre las que se produce el

crecimiento para la posterior inoculación (Crane, 1985; Morse y Hooper, 1985; Piana y

Col., 1991). Las levaduras son osmófilas y capaces de mantener la capacidad de

desarrollarse en las condiciones acídicas y de baja actividad acuosa de la miel, y son

responsables de la fermentación de la miel. Esto se ve facilitado por condiciones como

alto contenido acuoso, moderada temperatura de conservación y altos contenidos de

levaduras. Usualmente la fermentación se da en micro ambientes como la superficie de

los envases donde los contenidos acuosos son superiores al promedio de la miel

envasada. Saccharomyces spp., es la principal levadura hallada en mieles. La

concentración de levaduras en las mieles es proporcional al contenido de humedad.

(Tysset y Rautlin de la Roy, 1974; Root, 1983; Rosa y Col., 2003).

Con excepción de la investigación de Clostridium botulinum existe escasa

documentación acerca de la presencia de bacterias en la miel, tanto en cantidad como en

caracterización de los géneros de microorganismos que en ella pueden desarrollarse, a

pesar de sus factores de protección como el alto contenido de azúcares, pH bajo,

actividad antimicrobiana a través de peróxido de hidrógeno, derivados fenólicos,

flavonoides (Midura y Col., 1979; Nakano y Col., 1989; Snowdon y Cliver, 1996;

Dallagnol, 2007).

Algunos de los microorganismos descriptos se observan en la Tabla 4.

Diversos estudios han hallado recuentos totales en placa de hasta 5.000 UFC /g. Como

el género más frecuentemente descripto se encuentran a miembros de los Bacillus, se

han informado también aislamientos de Micrococcus, Pseudomonas y Staphylococcus

spp (Schapovaloff y Col., 2009; Pucciarelli y Col., 2009).

La Tabla 5 muestra diversos informes acerca de los principales microorganismos en

mieles, que describen como la flora predominante a los mohos y las levaduras

22

Tabla 4: Microorganismos informados en mieles.

Bacterias Hongos

Levaduras Mohos

Alcaligenes Ascosphaera Aspergillus Bacilus Debaryomyces Atichia Bacteridium (sic) Hansenula Bettsia alvei Bacterium (sic) Lipomyces Cephalosporium Brevibacterium Nematospora Chaetomium Clostridium Oosporidium Coniothecium Enterobacter Pichia Hormiscium Flavobacterium Rhodotorula Penicillium Klebsiella Saccharomyces Peronsporaceae Micrococcus Schizosaccharomyces Peyronelia Neisseria Schwannniomyces Triposporium Proteus Trichosporan Uredianceae Pseudomonas Torula Ustilaginaceae Xanthomonas Torulopsis Zygosaccharomyces

(Adaptado de Snowdon y Col., 1996)

Tabla 5: Niveles de microorganismos informados en mieles.

Estudio Ensayo

Recuento E. coli Levaduras Mohos y Mohos Levaduras Clostridium

estándar levaduras Osmofilicas Anaerobios

en placa

Nakano y col. (1989) 0-260 0-300 1-132

Piana y col. (1991) 1-55 1-43 1-3500 0.1 - 1

Root (1983) 0.1 - 10 6

Tysset y col (1970) 25-1600 0-2500 0

Tysset y Rousseau (1981) 3-9500 0-2500 0-10500

Datos industriales (1990)* 170-8500 < a 3 < a 10 < a 10

* Coliformes = Menor a 3, Salmonella =0 (Adaptado de Snowdon y col. 1996)

En la evaluación de la capacidad de supervivencia de bacterias Gram negativas en la

miel se encuentra que diversos géneros bacterianos, inoculados a muestras de miel,

sobreviven tan solo unos pocos días incluso en diluciones de miel del 50 %. Diversos

23

informes indican que a la temperatura de 20 ºC la pérdida de viabilidad se da hasta en

40 días mientras que en condiciones de refrigeración a 10 ºC esta supervivencia puede

llegar hasta los 2 años (Tysset y Durand, 1973). En las bacterias formadoras de esporas

las investigaciones desarrolladas indican que no existe disminución en los recuentos

hasta los 100 días de almacenamiento independientemente de las condiciones (Kokubo

y Col., 1984; Nakano y Col., 1989).

En conclusión, mohos y levaduras y bacterias formadoras de esporas son habituales en

la miel en bajos recuentos (Tysset y Rautlin de la Roy, 1974). Las formas vegetativas de

bacterias patógenas no han sido descriptas en miel, pero inoculadas pueden permanecer

viables un tiempo prolongado, sobre todo en condiciones de refrigeración (Snowdon y

Cliver, 1996).

Investigaciones acerca de indicadores microbiológicos en mieles argentinas han

encontrado recuentos de mohos y levaduras del orden de las 10 UFC/g, menores a los

establecidos en la normativa vigente para el MERCOSUR. Se reporta también la

existencia de bacterias sulfito reductoras del género Clostridium spp. en 70 % de las

muestras evaluadas (Finola y Col., 2007).

El Código Alimentario Argentino establece en el Capitulo X, Artículo 783

(RESOLUCION GMC Nº 015/94) los siguientes criterios microbiológicos para miel:

Coliformes totales/ g: (n=5, c=0, m=0)

Salmonella spp.- Shigella spp /25g: (n=10, c=0, m=0)

Hongos y levaduras UFC/g: (n=5, c=2, m=10, M=100)

Donde n: representa el número de muestras a ser analizadas.

c: es el numero de muestras que pueden encontrarse fuera del limite establecido.

m: es el límite superior para calificar a la muestra como aceptable.

M: es el límite superior en los planes de tres categorías para calificar a una

muestra como marginalmente aceptable.

Los mohos y las levaduras osmófilas representan las formas más abundantes y son los

responsables de la fermentación que incrementa la acidez cuando existen elevados

niveles de humedad, mayores al 21 %. (Finola y Col., 2007).

En la miel de Yateí se han hallado recuentos considerables de levaduras que

corresponden a las siguientes especies: Starmerella meliponinarum, Aureobasidium

pullulans, Rhodotorulla spp. Y Zygosaccharomyces bisporus-like. La levadura S.

24

meliponinarium es una especie recientemente descrita aislada a partir de muestras de

abejas adultas, de la miel, del polen, el néctar, etc de Tetragonisca angustula. Se

describe una cercana relación entre el microorganismo y el insecto dada su alta

aparición en diversas muestras de miel, y polen, estimándose una posible función en la

alimentación de estos melipónidos. Las levaduras constituyen una importante fuente de

proteínas y vitaminas para otros insectos, por ello podrían cumplir una función similar

en su asociación con T. angustula (Teixeira y Col., 2003).

No obstante las levaduras Aureobasidium pullulans y Rhodotorulla spp. son entidades

asociadas con plantas y flores en general, y se cree que representan flora transitoria,

transportada por las abejas. El género Zygosaccharomyces es altamente osmotolerante,

Z. rouxii puede crecer sobre substratos azucarados a una actividad del agua igual a 0,62.

Estas levaduras son agentes deteriorantes de alimentos azucarados y se las considera

contaminantes comunes cuya presencia disminuye la calidad del alimento (Rosa y Col.,

2003).

Dentro de las bacterias comúnmente aisladas en las mieles, están las formas esporuladas

de resistencia bacteriana, como las especies de los géneros Bacillus sp. y Clostridium

sp. Las formas vegetativas no suelen encontrarse debido a las condiciones desfavorables

que inhiben su desarrollo. En mieles frescas se pueden encontrar algunas formas

vegetativas y un recuento elevado estaría indicando contaminación reciente (Iurlina y

Fritz, 2005). La evaluación de levaduras en 29 mieles de T. angustula, del estado de

Minas Gerais en Brasil, durante el año 2001, determinó en 18 de ellas la presencia de

Starmerella meliponinarum, además se describe la existencia asociada de diversas

especies del genero Candida a las 16 muestras de mieles de Melipona quadrifasciata.

El recuento de levaduras de las muestras de miel de T. angustula estuvo en el orden de

2,6 x 104 UFC/gr, lo que indica la capacidad del microorganismo de desarrollarse a

expensas de los azucares de la miel. La alta presencia de la asociación de las levaduras

con diversos géneros de melipónidos indicaría una relación mutualista entre ambas

(Rosa y Col., 2003).

En la evaluación microbiológica de 14 muestras de mieles de melipónidos de la familia

de los Trigonineos, que incluye a Tetragonisca angustula, obtenidas de manera estéril,

se hallaron recuentos de mohos y levaduras de hasta un orden de 104 UFC/g. De igual

manera De Almeida-Anacleto halló recuentos del orden de 102 a 104 UFC/g para mieles

25

de meliponineos en Brasil, (De Almeida-Anacleto, 2007; De Almeida Souza y Col.,

2009). Estudios realizados en la provincia de Misiones informan recuentos de aerobios

mesófilos del orden de 104 UFC/g y recuentos de coliformes totales menores a 3 NMP/g

en 40 muestras de miel de Yateí analizadas. Se observo también la presencia de

Clostridium sulfito reductores en un 30 % de las muestras analizadas. Para los mohos y

levaduras se encontraron recuentos promedios del orden de 103 UFC/g. No se detectó en

este trabajo la presencia de E. coli ni de Salmonella spp (Pucciarelli y Col., 2009;

Schapovaloff, 2009).

II. 2.5.- Poder antimicrobiano

La miel tiene una probada capacidad antimicrobiana, la que es conocida desde la

antigüedad y a sido convenientemente documentada desde hace más de un siglo.

Esta capacidad esta mediada por diversos factores, entre ellos podemos nombrar los

intrínsecos como, su pH, contenido de humedad, bajo potencial de oxido-reducción

(debido a los azúcares reductores presentes) y contenido de nutrientes. Además de estos

factores, se han identificado diversos mecanismos de acción asociados a componentes

con capacidad antimicrobiana propia. También es destacable el aporte de la viscosidad

de la miel contra las ondas de convección que podrían diseminar microorganismos y

como barrera a la disolución del oxigeno (De Mera y Angert, 2004).

A estos mecanismos se asocian también algunos factores extrínsecos con marcada

influencia en la capacidad de desarrollo de microorganismos en la miel, como ser:

temperatura y humedad relativa de almacenamiento, y la presencia de gases ambientales

(Jay, 1992). Los mecanismos de actividad antimicrobiana de la miel pueden dividirse

en dos grupos: uno de ellos caracterizado como sensible a la luz y el calor, y originado

por el peróxido de hidrógeno producido por la glucosa oxidasa. El otro grupo

caracterizado como no peroxídico, no es sensible a los factores luz y calor, y está

compuesto por varios factores como la acción de la lisozima, flavonoides, actividad

osmótica, pH bajo y otros con diferentes aportes. Se ha hallado buena correlación entre

la acidez libre y total con la actividad antibacteriana de las mieles de Apis mellifera.

Acorde con otros informes que atribuyen la mayor parte de la actividad no peroxídica a

26

la fracción ácida que además tiene su origen en la abeja (Bogdanov, 1997). El mismo

informe indica diferencias no significativas por el origen floral.

Molan, (1992), ha asociado esta capacidad antimicrobiana fundamentalmente a cuatro

componentes que son: el efecto osmótico, la acidez de la miel, el peróxido de hidrógeno

presente por acción de la glucosa oxidasa y una serie de factores fitoquímicos no

totalmente descriptos. La mayor actividad ha sido asociada a los factores peroxídicos,

pero los no peroxídicos adquieren importancia al utilizarse la miel como terapéutico en

humanos, por la presencia de catalasa en los tejidos (Molan, 1992).

Schepartz y Subers, (1966) identificaron como el principal responsable de la actividad

antimicrobiana de la miel al peróxido de hidrógeno producido por la enzima glucosa

oxidasa de las glándulas hipo faríngeas de las abejas. De similar manera el polen

proveniente de las plantas seria el responsable de los niveles de catalasa en la miel,

aunque su efecto disminuye mucho en el néctar; de esta manera el nivel de compuestos

peroxídicos estaría determinado por los niveles de glucosa oxidasa de la miel. Del

análisis de diferentes compuestos provenientes de la miel (polen, propóleo, cera, miel)

surgen diversas actividades no peroxídicas asociadas principalmente a compuestos

fenólicos (acido cinámico y benzoicos sustituidos y flavonoides). La baja concentración

de estos compuestos en la miel deriva en atribuirle a los mismos escasa actividad

antimicrobiana en la miel comparada con la acividad peroxídica. Destacable es la

posibilidad de la reacción entre el peróxido de hidrógeno y los ácidos benzoicos para

dar peroxiácidos, mucho más estables que el peróxido e inalterables a la acción de la

catalasa. Los ácidos peroxicarboxílicos presentan una actividad antimicrobiana mucho

mayor que el peróxido sobre todo a pH bajo como los encontrados en la miel, es decir

con pH de 3,9 (Roderick, 2000).

Las mieles de melipónidos son así también conocidas amplia y popularmente, desde la

época de los indios guaraníes, por sus propiedades medicinales, esto mismo se repite en

otros países de centro y Sudamérica donde se conoce desde épocas remotas la

utilización de esta miel para el tratamiento de afecciones cutáneas, respiratorias y

oculares (Nogueira-Neto, 1970).

Los estudios realizados en el tema refieren una marcada actividad antimicrobiana, para

la miel de los melipónidos, pero con una gran variabilidad entre estas mieles y las cepas

bacterianas evaluadas.

27

El poder antimicrobiano no es propiedad exclusiva de las mieles sino que otros

compuestos elaborados por las abejas presentan propiedades similares, como por

ejemplo, el propóleos, la cera y la jalea real. Experiencias realizadas sobre propóleos de

melipónidos han encontrado en éstos elevadas actividades antimicrobianas y

antioxidantes. Destacable es que estas capacidades se presentan asociadas a bajas

concentraciones de flavonoides, los que se presentan generalmente como mediadores en

las respuestas inmunomoduladoras y antiinflamatorias (Manrique y Santana, 2008).

En Argentina se han realizado investigaciones sobre muestras de miel de Apis mellifera

frente a Escherichia coli a los fines de evaluar su acción antimicrobiana, encontrándose

gran susceptibilidad pero con marcadas diferencias entre muestras. Al tratarse con

catalasa las muestras, para eliminar el peróxido de hidrogeno presente se evidenció aun

actividad antimicrobiana asociada a factores no peroxídicos y posiblemente relacionada

a componentes del polen. Esto refuerza los datos existentes de una actividad

antimicrobiana polifactorial en las mieles (Fangio y Col., 2007).

Temaru y Col., (2007), han encontrado resultados similares evaluando de manera

similar mieles de diversas especies de melipónidos, frente a diferentes géneros

bacterianos (S. aureus, E. faecalis, E. coli, P. aeruginosa). Los resultados muestran

diferentes niveles de inhibición entre las diversas muestras ensayadas y variaciones

según el microorganismo ensayado. También se encontró un importante poder

antimicrobiano no asociado al peróxido de hidrógeno al tratar las mieles con catalasa

(Temaru y Col., 2007)

Dardon y Enriquez (2008), realizaron estudios sobre diversos géneros de melipónidos

en Guatemala, demostraron un claro efecto antimicrobiano sobre diversas especies

microbianas. En todos los casos se observo una importante variabilidad en el poder

antimicrobiano de la miel estudiada, dependiendo de la especie de abeja productora y

exhibiendo una mayor resistencia para S. typhi y C. albicans. Se identificaron tipos

polínicos correspondientes a la familia Myrtacea, uno de cuyas especies es responsable

de la actividad antimicrobiana de la miel de manuka, aunque su existencia no se

correspondió con la mayores actividades antimicrobianas (Dardon y Enriquez, 2008).

Miorin y Col. (2003), evaluaron la comparación de la actividad antimicrobiana de

mieles y polen de Apis mellifera versus Tetragonisca angustula frente a cepas de S.

aureus, encontrándose buena actividad antimicrobiana de ambas en los dos productos

28

para las cepas estudiadas. También se evaluó mediante HPLC los diferentes compuestos

involucrados en ambos casos identificándose gran cantidad de compuestos fenólicos y

algunos no identificados relacionados con flavonoides y ácidos fenólicos. Los

resultados indican también una mayor actividad antimicrobiana en los propóleos que en

las mieles (Miorin y Col., 2003).

Investigaciones realizadas en nuestra región han encontrado resultados similares para la

variabilidad de la acción de la miel de melipónidos frente a diversos géneros bacterianos

(Dallagnol, 2007; Novak, 2008).

Existen creencias folclóricas acerca de un mayor poder antimicrobiano de la miel de

melipónidos respecto a las abejas importadas del Viejo Mundo. Estudios comparativos

de ambos tipos de mieles no han encontrado diferencias significativas en su poder

antimicrobiano aunque han descrito para la miel de Yateí una alta variabilidad en su

acción según la región de donde provenga la miel y según la cepa a la que se enfrente,

describiendo una mayor sensibilidad de las levaduras respecto de las bacterias

ensayadas (De Mera y Angert, 2004).

La acidez de la miel, así como el pH han sido considerados también como factores

asociados y estudios realizados han hallado en algunos casos mejoría en el poder

antimicrobiano al fermentar las mieles durante cierto periodo de tiempo, aumentando

con ello la acidez de la misma (Bogdanov, 1997; Barth y Col., 2005).

Las células de Salmonella enteritidis, incubadas en diferentes diluciones de miel,

presentan menor adherencia a células epiteliales del tracto gastrointestinal respecto de

controles de células de la bacteria sin dicho tratamiento. Este resultado puede deberse a

diversos factores como ser: inhibición mecánica no específica, alteración de la carga

electrostática externa o la hidrofobicidad de la bacteria (factores considerados

fundamentales para el proceso de adhesión), destrucción de la bacteria por algún factor

involucrado (Alnaqdy y Col., 2005).

Esto se condice con otros informes donde se reporta la utilización de miel para el

tratamiento de otras patologías gastrointestinales infecciosas, como gastritis, duodenitis,

ulceración gástrica (Costa-Neto y Pacheco, 2005).

29

II.2.6.- Compuestos activos de la miel

Diversas condiciones de almacenamiento y tratamiento han sido evaluadas para estudiar

la variación en la capacidad antioxidante de las mieles de T. angustula. En ellas se

evidenció el proceso fermentativo en las mieles mantenidas a temperatura de 30 ºC el

cual no se manifestó en aquellas que fueron conservadas a temperatura de refrigeración

o sometidas a procesos de pasteurización. El proceso fermentativo se asoció a un

aumento de la acidez y una disminución de los contenidos de carbohidratos y presentó

un mayor efecto antioxidante que las mieles no fermentadas. Surge así la visión de

mantener mieles de melipónidos a temperatura ambiente para aumentar propiedades

antioxidantes y conservarlas en refrigeración para mantener sus propiedades

organolépticas (Perez-Perez y Col., 2007).

Los antioxidantes son efectivos en bajas concentraciones y ayudan a inactivar los

radicales libres; por eso se estudia la capacidad antioxidante de los alimentos y de los

medicamentos. La miel es básicamente una solución concentrada de azúcares cuya

actividad antimicrobiana se debe a varios factores: su elevada osmolaridad, la presencia

de peróxido de hidrógeno producido por la enzima glucosa-oxidasa presente en la miel

y diferentes compuestos activos (compuestos fenólicos principalmente) proveniente de

la flora recorrida por las abejas. Su actividad antimicrobiana y antioxidante se debe

entonces a factores dependientes de la producción de peróxido por la glucosa oxidasa de

la miel y factores no peroxídicos, los que aparentemente tendrían gran importancia y

podrían variar ampliamente según los tipos polínicos presentes en la miel. Los

polifenoles participan en el sistema antioxidante de la miel reforzado por la vitamina C

y la catalasa (Molan, 1992; Roderik, 2000).

II.3.- TIPOS DE COLMENA. ARQUITECTURA DEL NIDO

En la naturaleza los nidos de los melipónidos usualmente se ubican en huecos que se

encuentran en el ambiente, como árboles, termiteros, hormigueros abandonados, etc.,

que pueden proporcionarle seguridad a la colmena. Asociadas al ambiente antropizado

las colmenas pueden ubicarse en postes, muros, armarios, cajas, etc. Los materiales

utilizados son cera, resina y barro (Godoy y Ferversani, 2005).

En la estructura del nido puede identificarse la entrada tubular del mismo, denominada

usualmente piquera, elaborada a partir de cera y resina, y que puede ser única o doble,

30

esta es continuada por el túnel de ingreso y que desembocan generalmente cerca de la

zona de cría del nido. Esta zona está formada por las células de cría organizada en

discos horizontales superpuestos, usualmente siete, y separados y sostenidos por

columnas. Cada disco cuenta con alveolos de aproximadamente 1,5 mm de diámetro, el

disco central tiene un diámetro de 60 mm y los discos extremos miden alrededor de 20

mm de diámetro. La cámara de cría se encuentra rodeada por una capa multilaminada de

cera y resina denominada “involucro” cuya función principal es el mantenimiento de la

temperatura necesaria para el desarrollo larval. Si las condiciones de temperatura del

espacio donde se ubica el nido son estables este involucro puede estar ausente (Kerr y

Col., 1996).

Las celdas de cría son ovoides y se conectan usualmente a otras seis celdas sin

compartir necesariamente las paredes (Crane, 1992; Chiari y Col., 2002).

Las abejas de la tribu Meliponini no presentan celdas reales las que si existen en otras

tribus como las Trigonini.

En contacto con las paredes exteriores del nido se halla también capas de cerumen que

realizan el aislamiento de la colonia del medio ambiente.

Fuera de la región de cría se encuentran los potes donde se guarda el alimento de la

colmena, estos están construidos de cera o cerumen y tienen forma ovoide o cilíndrica.

Suelen disponerse de manera semicircular alrededor del área de los más cercanos a ésta

suelen contener polen, y los más alejados miel. Los potes se ubican de manera

desordenada y superpuesta, pudiendo encontrarse también aislados en función del

espacio disponible, (Fig. 5). Pueden encontrarse también depósitos de desechos de

tamaño y composición variable dentro del nido, generalmente son provisorios

(Nogueira-Neto, 1997; Godoy y Ferversani, 2005).

31

Figura 5: Estructura del nido de meliponas

Se han desarrollado “colmenas racionales” diseñadas en base a necesidades de mayor

higiene en la producción y manipulación, además, a la eficiencia térmica de las

colmenas. Existen innumerables modelos de colmenas racionales, por ejemplo modelos

Giuliani, Fritzen, Nogueira Neto, Kerr, Capel etc. La mayoría de ellas llevan a un

diseño con separación interna en dos áreas, una de ellas destinada a la cría, y la otra para

la producción de miel y polen, ambas separadas por un tabique y conectadas por un

orificio; existiendo variaciones respecto a la orientación vertical u horizontal de la

colmena. Para el área de depósito de la colmena se han desarrollado diversos modelos,

incluyendo algunas alzas móviles horizontales, que permiten retirar las vasijas, realizar

la extracción y devolver el alza a su lugar. En todos los casos las colmenas se

construyen de madera dura que garantice resistencia a la intemperie y un adecuado

aislamiento térmico. Las dimensiones de cada área de la colmena deben ser adecuadas

para asegurar la termorregulación de la colmena, (Fig. 6).

32

Figura 6: Modelos de cajas para criadero y producción de miel y polen de melipónidos

(Godoy y Ferversani, 2005).

33

Figura 7: Estructura en caja del criadero y producción de miel y polen

Las características de las colmenas utilizadas deben estar acorde a la zona de

producción. Es destacable la acción de la abeja de sellar las hendiduras existentes en la

colmena (uniones entre los paneles de madera), con cera y resina, para lograr el

aislamiento de la misma del medio ambiente. Las condiciones adecuadas de la colmena

son fundamentales para permitir la supervivencia de la misma y para optimizar la

producción de miel. En la evaluación de diversos modelos de colmena en Brasil se

encontraron resultados que fueron desde la desaparición de la colonia hasta una

producción cercana a los 500 g en seis meses, en ninguno de los modelos evaluados se

alcanzo resultados referidos a una producción de kilogramo de miel en dicho periodo

(Chiari y Col., 2002).

Especial importancia adquiere también la ubicación de la colmena, la misma debe estar

a resguardo de los rayos directos del sol y de los vientos, y debe tener acceso a fuentes

de agua y a una zona de floración importante, lo que le permitirá a la abeja tener acceso

a la fuente de néctar. También es importante que estén sobre el nivel del suelo para

evitar el ataque de posibles plagas rastreras, como hormigas o cucarachas. Se debe tener

en cuenta que el radio de vuelo de los melipónidos varia de 500 a 2.500 metros, según la

especie, mientras que en el caso de abejas Apis, este es cercano a los 5.000 metros,

permitiéndole acceder a fuentes de néctar más lejanas.

La obtención de las colmenas tradicionalmente se hizo recuperándolas directamente del

ambiente natural y trasladándolas incluso en sus habitáculos naturales (troncos) al

ambiente humano. Actualmente existen sistemas de captura de colmenas a través de la

34

oferta de recipientes adecuados para la nidificación, ubicados cerca de colonias ya

existentes y con oferta de alimento, y su posterior traslado. Se utilizan además sistemas

de división de colmenas (trasiego), a partir de los paneles de cría asegurando el traslado

de una reina en cada porción (aprovechando la existencia de más de una reina en cada

colmena) y traspasando también parte de los potes con polen y miel (Godoy y

Ferversani, 2005).

Los individuos en las colonias pueden clasificarse en tres tipos, reinas, hembras y

machos. Las reinas son las encargadas de la postura de los huevos.

Las operarias están encargadas de realizar la totalidad de las tareas de la colmena,

también ponen huevos pero de ese huevo nace siempre un macho, sólo los huevos

fecundados (puestos por la reina) dan origen a hembras.

Los machos o zánganos son básicamente los encargados de fecundar a la reina, al

contrario de lo que sucede en Apis mellifera, estos también se alimentan de flores,

trabajan con cerumen y deshidratan el néctar.

II.4.- SISTEMAS DE EXTRACCIÓN.

Según lo expuesto por productores locales, tradicionalmente se ha utilizado el método

del prensado y del escurrido para la obtención de la miel de los melipónidos. Este

sistema lleva asociada una alta contaminación del producto por todos los componentes

extras existentes en las ánforas.

Esto es corroborado en la comparación de los estándares microbiológicos alcanzados

por mieles obtenidas a través de diferentes sistemas de extracción, donde las muestras

obtenidas por escurrimiento presentaban recuentos de hongos y levaduras muy

superiores a las mieles obtenidas por métodos asépticos (Oliveira, 2005; Souza, 2006,

Pucciarelli; 2009)

El método de extracción se mejora con la utilización de colmenas racionales con

sectorización del área de producción y con la obtención de paneles de vasijas cuya parte

superior pueda eliminarse y obtenerse el producto por inversión de la placa de vasijas.

Esta práctica asocia aún la posibilidad de caída de algún residuo en el producto durante

la inversión.

Las prácticas de mayor calidad higiénica involucran la utilización de las colmenas

racionales asociadas a sistemas de extracción por vacío del producto mediante jeringas

35

o bombas mecánicas, aunque involucran un mayor tiempo de operación (Nogueira-Neto

1997).

Figura 8: Sistemas de melado

II.5.- CONSERVACIÓN

El mantenimiento de las propiedades de los alimentos por periodos de tiempo cada vez

más largos es uno de los mayores desafíos de la industria alimentaria. Para ello se

utilizan diversas herramientas como ser producción primaria, diversos procesos de

producción, variaciones en el envasado y otros.

Figura 9: Diagrama del flujo de la producción de miel

36

La miel no escapa a estas condiciones y dentro de su procesamiento tradicional existen

pasos especialmente destinados a prolongar su vida útil. El primer punto de importancia

se encuentra en el manejo primario de la abeja y la colmena. La zona de manejo de las

colmenas debe encontrarse en zonas libres de polución, ya que la abeja puede trasladar a

la miel por contacto directo todos aquellos contaminantes que existan en el ambiente.

También debe tenerse en cuenta una posible mortandad de abejas por intoxicaciones

agudas con algún contaminante ambiental.

En la etapa de la producción primaria (Fig. 9), se debe tener en cuenta los tiempos de

carencia para la aplicación de posibles tratamientos veterinarios, los sistemas de

alimentación que pueden redundar en contaminación de la miel con adulterantes como

jarabe de maíz de alta fructosa, etc. Así también el uso de compuestos ácidos como

acido fórmico o láctico para el combate de plagas (barroa) determina un aumento de la

acidez de la miel (Detroy, 1979).

En la etapa de procesamiento de la miel adquieren especial importancia las Buenas

Prácticas de Manufactura (BPM) ya que a partir de este punto aparece el factor de la

manipulación del producto. Estas son herramientas que permiten asegurar una adecuada

calidad del producto final, a partir de la evaluación de los posibles peligros asociados al

producto y delinear mecanismos de control de los mismos (Guía de BPA yM, 2003).

En el procesamiento industrial es fundamental evitar las posibles contaminaciones

secundarias del producto. Para ello es fundamental contar con infraestructura edilicia

adecuada y procedimientos de limpieza y desinfección que permitan asegurar una

adecuada higiene.

El proceso para mieles de Apis incluye el desoperculado de las alzas y la extracción por

centrifugación de la miel seguida del filtrado de la misma. Luego esta puede ser

nuevamente centrifugada para eliminar posibles restos de cera. También es factible

someterla a un tratamiento térmico a los fines de facilitar su fluidificación que permite

una mejor manipulación. Así mismo pueden realizarse tratamientos térmicos para la

eliminación de microorganismos patógenos, como la pasteurización (Ramirez Cervantes

y Col., 2000; Shafiur Rahman, 2003).

El tratamiento térmico de las mieles es un factor central para mantener la calidad de las

mismas. Un tratamiento térmico inadecuado redunda en pérdida de calidad del producto

lo cual se ve evidenciado por la disminución de la actividad enzimática de la miel y por

37

aumentos de los niveles de hidroximetilfurfural (HMF), ya que este se produce por

deshidratación fundamentalmente de fructosa en medio ácido (Ramirez Cervantes y

Col., 2000)

El envasado del producto también juega un rol fundamental para el periodo de vida útil

del mismo, así, la Secretaría de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimentos (SAGPyA)

establece los siguientes tiempos de vida útil para la miel según el tipo de envase.

Para envases de vidrio con tapa de rosca: dos años.

Para envases de plástico con tapa de rosca: 1 año.

Para envases de plástico con tapa termosellada: 6 meses.

(Guia de BPA y M, 2003. Secretaría de Agricultura, Ganadería, Pesca y Alimentos.

Gobierno de la República Argentina.)

El envasado de la miel permite disminuir el acceso del oxígeno a la miel y evita los

ciclos de vaporización y condensación de agua, que pueden causar dilución local de

azúcares y posibilitar el desarrollo de microorganismos.

Las condiciones de almacenamiento del producto también tienen gran importancia para

el mantenimiento de sus características. En las mieles es fundamental mantenerlas a

temperaturas inferiores a 20 ºC y con humedades relativas menores al 60 %. El no

cumplimiento de estas premisas redundara en la afectación de la calidad del producto y

la alteración de parámetros como el contenido de humedad, la acidez de la miel y el

contenido de HMF (Detroy, 1979; Crane, 1985). Diversos estudios indican que la

temperatura es el principal factor a controlar para mantener las características de la

miel. Así, el tratamiento de la miel a una temperatura de 55 ºC por diversos tiempos

demuestra que los periodos más prolongados de calentamiento, provocan acciones

nocivas al producto en algunos indicadores como la actividad diastásica, la acidez y el

HMF (Ramirez Cervantes y Col., 2000)

En la evaluación del efecto de diferentes temperaturas de tratamiento térmico sobre

muestras de mieles monoflorales, seguido mediante los niveles de HMF y la actividad

de la enzima invertasa, se observa el inicio de la acción deletérea a partir de los 35 ºC y

esta se va incrementando según se aumenta la temperatura.

Karabournioti y Zervalaki (2001), observaron algún grado de resistencia al efecto

térmico según el tipo de miel monofloral involucrada, y concluyen que la capacidad del

38

HMF es la mejor evaluación sobre el efecto nocivo del tratamiento térmico sobre la

miel por no estar éste presente en el producto fresco.

Diversos tratamientos tecnológicos pueden realizarse sobre las mieles a los fines de

prolongar su tiempo de vida útil, particularmente en el caso de las mieles de

melipónidos dada su alto contenido acuoso.

Da Silva Sodre y Col. (2008), evaluaron el efecto de tratamientos de pasteurización y

deshumidificación respecto de un estándar conservado en heladera para mieles de

melipónidos, y observaron que a través de un panel de análisis sensorial los catadores

no hallaron diferencias significativas para la aceptabilidad de la miel. Solo el parámetro

fluidez fue captado como diferente para las muestras deshumidificadas (Da Silva Sodre

y Col., 2008). Estas metodologías influyen directamente en el contenido de humedad de

las mieles, que es el principal factor de alteración de las mieles de melipónidos (Moraes

y Col., 1989; Fonseca y Col., 2006).

Las propiedades organolépticas de la miel dependen de factores intrínsecos de la misma

como su composición en azúcares y componentes volátiles, pero también de su

procesamiento y condiciones de almacenamiento. Por lo tanto, la calidad de las mieles

disminuye durante el almacenamiento y es particularmente afectada por la temperatura

de almacenamiento, pudiendo afectar parámetros como el HMF la actividad enzimática

y los niveles de acidez.

Castro Vázquez y Col. (2008), evaluaron el efecto del almacenamiento de mieles (Apis)

de citrus durante 12 meses, a diferentes temperaturas y observaron un marcado aumento

del HMF a 40 ºC y disminución de la actividad diastásica. El mismo efecto se evidencio

almacenando la miel a 10 ºC y a 20 ºC pero en mucha menor cuantía. También

observaron un ligero aumento en la acidez y ninguna variación en el contenido de

humedad. Un especial comportamiento se da con los azúcares de la miel, que durante el

almacenamiento, evidenciaron una marcada disminución de los monosacáridos a las tres

temperaturas evaluadas, donde el efecto fue mucho mayor a 40 ºC. Este descenso se ve

justificado en el aumento de los derivados por deshidratación de los monosacáridos,

como los polímeros formados por las reacciones de Maillard; y en la formación de

disacáridos, sobre todo maltosa, cuya concentración se incrementa en gran cantidad

durante el almacenamiento, dada la acción de glucosidasas presentes en la miel y su

acción a pH bajo (Castro Vázquez y Col., 2008).

39

II. 5.- ENVASADO

El envasado tiene como misión fundamental contener y proteger los alimentos, para

ello existen numerosas alternativas de materiales, cada uno con propiedades particulares

y adaptables al tipo de alimento que se busque preservar.

Teniendo en cuenta que el envase ideal no existe, los envases utilizados deben cumplir

con una serie de requisitos para poder ser utilizados:

Toxicidad cero

Visibilidad del producto

Control de gases y humedad

Estabilidad en un amplio rango de temperatura

Precio adecuado

Resistencia mecánica

Cierre adecuado.

De todo esto surge que la elección del envase supone un compromiso entre las diversas

propiedades del envase (Shafiur Rahman, 2003).

Históricamente los dos materiales para la fabricación de envases fueron el metal y el

vidrio. Ambos siguen siendo de gran uso en la actualidad y aplicados a diferentes tipos

de alimentos, el enlatado proporciona gran capacidad de barrera entre el alimento y el

ambiente y se utiliza ampliamente en todos aquellos alimentos que sean biológicamente

estables asociado a un tratamiento térmico. El vidrio es considerado como el envase

ideal para una gran variedad de alimentos dada su inalterabilidad ante la mayoría de las

sustancias, la posibilidad de mantener visible al alimento, su buena resistencia mecánica

y propiedades de barrera, su adaptabilidad a diversos diseños y la posibilidad de ser

reciclado. Tiene como debilidad su fragilidad y el efecto que produzca la luz sobre el

alimento.

En el último siglo se han desarrollado fundamentalmente los materiales plásticos para el

envasado, dada su alta variabilidad según el polímero y la tecnología utilizada sumada a

su menor costo unitario y su posibilidad de ser reciclados. Estos factores hacen que los

polímeros plásticos vayan sustituyendo progresivamente a los materiales tradicionales

de envasado.

La combinación de las diversas variables (monómero, conformación, combinación de

monómeros, etc.) en la síntesis de los polímeros permite lograr diversas propiedades

40

para el envasado (residencia mecánica, propiedades de barrera, transparencia u

opacidad, producción de laminas y Films, etc).

El polipropileno es un polímero que posee forma regular y puede obtenerse de manera

altamente ordenada logrando así una elevada cristalinidad, dureza y resistencia al calor.

Posee excelentes propiedades de barrera anti humedad y frente a los gases ordinarios

permitiendo además la utilización de termo sellado.

En el uso de polímeros adquiere gran importancia la posibilidad de transmisión del

envase al alimento de productos posiblemente tóxicos. Por ello las normativas

alimentaria vigentes establecen rigurosos límites para los materiales utilizados en el

envasado de alimentos (Shafiur Rahman, 2003).

Un estudio indica la importancia del material del envase en los cambios sufridos por el

alimento durante el almacenamiento a 4 ºC, mostrando como material ideal al vidrio y

estableciendo la necesidad de soluciones de compromiso para diferentes polímeros

dependiendo del tiempo de almacenamiento y de las características de la matriz

alimentaria (Saint- Eve y Col., 2008).

Gran importancia tiene el comportamiento del polímero a las diferentes temperaturas

Durante el almacenamiento la miel sufre diferentes procesos, el más característico es la

cristalización producida por su composición en azúcares y evitada a través de

tratamientos térmicos que pueden poner en riesgo otras propiedades de la misma.

La temperatura de almacenamiento tiene claro efecto deletéreo sobre varias propiedades

de la miel, como ser un aumento en la concentración de HMF, aumento en la acidez,

disminución de la actividad diastásica conforme aumenta la temperatura de

almacenamiento hasta aproximadamente 40 ºC y se prolonga el tiempo de conservación.

También se evidencian diferencias notorias en el contenido de compuestos volátiles

relacionados con propiedades sensoriales del producto. El contenido de humedad y el

pH no muestran marcadas diferencias en el almacenamiento en envases de vidrio. La

composición de azúcares se ve también modificada encontrándose una disminución en

la concentración de monosácaridos y un aumento de los disacáridos como la maltosa.

Estas diferencias son menos evidentes a temperaturas cercanas a los 20 ºC (Castro

Vázquez, 2008). Moreira y Col. (2007), evaluaron los cambios en la miel durante el

almacenamiento por 6 meses, en condiciones tropicales de temperatura (35 - 40 ºC),

encontrando modificaciones en la acidez, la actividad diastásica y el contenido de HMF

41

similares a otras referencias. No se hallaron variaciones en el contenido de humedad lo

que indica un buen comportamiento del envase de vidrio utilizado para estas

condiciones (Moreira y Col., 2007).

En contraposición a esto, otros estudios del almacenamiento indican una posible

reversión de disacáridos a monosacáridos en determinadas condiciones, además se

observa la importancia del proceso de cristalización de las mieles en la pérdida de

calidad de las mismas. (Cavia y Col., 2002).

El alto contenido acuoso de las mieles de melipónidos determina la búsqueda de

diferentes estrategias de conservación del producto, así se plantean la utilización de

tratamientos térmicos y la deshumidificación para mejorar la comercialización de las

mismas. En la evaluación sensorial de mieles sometidas a estos tratamientos versus

mieles mantenidas en refrigeración se observó una buena aceptabilidad de las mieles

tratadas, aunque se registraron diferencias en algunos atributos como la viscosidad (Da

Silva Sodre y Col., 2008).

En el almacenamiento en envases de diferentes polímeros, de jugo de frutillas, durante 1

año se observa que envases de PVC y PET presentan pérdidas similares de componentes

aromáticos a los de envases de vidrio (Ducruet y Col., 2001).

CAPITULO III

42

III.1.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL / METODOLOGIA

Para el estudio intensivo de los parámetros microbiológicos, fisicoquímicos y

antimicrobianos bajo diversas condiciones de conservación, las muestras estudiadas

fueron tomadas de una sola colmena y en un solo proceso de melado para tener un único

valor inicial de los parámetros estudiados.

Las muestras, se obtuvieron de una colmena racional sin paneles para las ánforas,

proveniente de la zona suburbana de la localidad de Oberá, ubicada en la zona centro de

la provincia de Misiones (Fig. 10). La colmena “representativa” pertenece a un

productor cuyas mieles obtuvieron, en investigaciones previas, resultados estándares

adecuados de calidad microbiológica.

El melado se llevo a cabo en el mes de octubre de 2008.

El melado se realizó de manera similar a la utilizada en el proceso tradicional de

melado referido por los productores locales, por escurrimiento natural y con jeringas,

evitando la compresión de la colmena. Todo el producto obtenido fue almacenado en

un recipiente estéril para su homogenización.

En el laboratorio, la muestra inicial fue dividida en dos muestras. Cada una fue

fraccionada posteriormente en cantidades iguales de envases estériles, de vidrio y

polipropileno translúcido, con tapas a rosca, colocando idénticas cantidades de la miel

en cada recipiente. La experiencia para ambas muestras fue desarrollada en paralelo y

los recipientes correspondientes a cada muestra, fueron colocadas en las diferentes

condiciones de almacenamiento, esto es, temperatura ambiente y temperatura de

refrigeración (7 - 10 ºC).

La muestra inicial, o sea, la del tiempo 0 (to), se analizo inmediatamente.

Se conservaron los distintos frascos cerrados durante 15, 90, 120 y 180 días. Las

determinaciones a los distintos tiempos de conservación se realizaron por duplicado

En cada caso de evaluó sobre cada muestra:

a) la variación de la calidad de su flora microbiana, por recuento de

microorganismos mesófilos totales y recuento de hongos filamentosos y levaduras.

b) la variación del poder antimicrobiano contra cuatro cepas del género

Staphylococcus.

43

c) pH, el contenido de humedad, la acidez libre, el hidroximetilfurfural (HMF)

y la actividad diastásica.

Figura 10: Mapa de la provincia de Misiones. Ubicación de Oberá

III.1.1 CALIDAD MICROBIOLÓGICA

III.1.1.1.- Preparación de las diluciones decimales:

La preparación de las diluciones decimales tiene por finalidad diluir la flora microbiana

de la muestra, para poder efectuar su posterior recuento microbiológico. Para preparar

las diluciones seriadas, se dispuso de una serie de tubos con tapón, con agua de peptona

al 0,1 % estéril.

Se suspendió un gramo de la miel, adecuadamente homogeneizada, en un tubo con 9

ml de agua de peptona al 0,1 %, obteniéndose así una dilución de 1:10 (10-1). Luego de

homogeneizar adecuadamente se traspasa 1 ml de la solución al tubo siguiente para

obtener la siguiente dilución decimal. El proceso se repite tantas veces como diluciones

decimales se desee obtener (Fig. 11).

Oberá

44

MUESTRA

Se homogeniza

por agitación

Figura 11: Diagrama de Flujo de Diluciones seriadas

III.1.1.2.- Recuento de bacterias aerobias mesófilas totales

Se utilizo la metodología de siembra en masa o profundidad. Se sembró 1 ml de muestra

de cada una de las diluciones preparadas en placas de Petri estériles colocando luego,

12 a 15 ml de medio de cultivo (Agar Plate Count), fundido y previamente enfriado a

46 ºC, a cada placa de Petri inoculada, (Fig. 12). Se taparon las placas y se mezclaron

cuidadosamente el contenido de cada una de la forma siguiente:

a) se imprimen a la placa 5 movimientos de vaivén en una dirección;

b) se hace girar la placa 5 veces en el sentido de las agujas del reloj;

c) se vuelven a imprimir 5 movimientos de vaivén en una dirección normal a la

primera;

d) se hace girar la placa 5 veces en el sentido contrario a las agujas del reloj.

Se dejo solidificar a temperatura ambiente sobre una superficie horizontal. Luego se

incubaron en en la estufa regulada a 35 ± 1 ºC durante 24 a 48 h. Pasado ese tiempo, se

Alícuota de 1 g

+

9 ml SP (dilución 1:10)

Dilución

1:10

Dilución

1:100

Dilución

1:1.000

Dilución

1:10.000

1 ml 1 ml 1 ml Tubos con

9 ml de

SP

45

examinaron las placas de Petri y se realizó el recuento en las placas que contenían entre

30 y 300 colonias en un contador de colonias (Quebec).

Se calculo el número de unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo de muestra

mediante la Ecuación (1):

∑ c N = UFC/g (1)

(n1+0,1 x n2) x d x Vs

Donde:

N = número de unidades formadoras de colonias por gramo de muestra (UFC/g);

∑c = suma de las colonias contadas en las placas de Petri de diferentes diluciones;

n1 = número de placas de Petri con colonias entre 5 y 150 en la primera dilución;

n2 = es el número de placas de Petri con colonias entre 5 y 150 en la segunda

dilución;

d = factor de dilución correspondiente a la primera dilución

Se redondea el resultado final, expresándolo bajo notación científica, con dos cifras

significativas, por ejemplo: 1,5 x 102 UFC/g.

Para el redondeo se tuvo en cuenta las directivas siguientes:

a) Si la tercera cifra significativa es menor que 5, se la anula sin modificar la segunda

cifra significativa.

b) Si la tercera cifra significativa es mayor que 5, se la anula y se aumenta la segunda

cifra significativa en una unidad del mismo orden.

c) Si la tercera cifra significativa es igual a 5, se la anula sin modificar la segunda

cifra significativa si ésta fuese par o se le suma 1 si fuese impar.

46

Figura 12: Diagrama de preparación de placas para el recuento de bacterias aerobias

mesófilas totales

III.1.1.3.- Recuento de mohos y levaduras

Se procedió de idéntica manera que para el recuento de bacterias aerobias mesófilas

totales, utilizando el medio de cultivo (agar – cloranfenicol – extracto de levadura –

glucosa), fundido y previamente enfriado a 46 ºC. Se preparó una placa control, en la

que no se agrega muestra (Fig Nº 13)

Se colocaron las placas sin invertir a 25 ± 1 ºC y se incubaron durante 5 días.

Después de la incubación, se contaron las colonias diferenciando las de levadura de las

de hongos filamentosos según su morfología. La identificación de colonias dudosas se

realizó por observación microscópica.

Para realizar el recuento se seleccionaron las placas de dos diluciones consecutivas que

contengan entre 5 y 150 colonias, se calculó el número promedio de levaduras y

hongos, según la fórmula:

El recuento se realizo utilizando la Ecuación 1, expresando el recuento en UFC/g

Dilución

Dilución 1

1

Medio

Incubar

24 a 48 hs

35 1 C

47

Figura 13: Diagrama para el recuento en placa de Mohos y Levaduras

III.1.2.- PROPIEDADES ANTIMICROBIANAS

La variación de las propiedades antimicrobianas de la miel de Yateí durante su

almacenamiento a distintas temperaturas, se realizó contra 4 cepas del género

Staphylococcus aureus aisladas de diferentes fuentes:

Cepa 1. Staphylococcus aureus aislamiento salvaje de producto cárnico.

Cepa 2: Staphylococcus aureus aislamiento salvaje de alimento lácteo.

Cepa 3: Staphylococcus aureus ATCC25923

Cepa 4: Staphylococcus aureus ATCC 6538.

De todas las cepas se realizo un pool de reserva que se conservó a temperatura de

congelación, previo a las pruebas una muestra del pool se reactivó en placas de agar

BHI, incubadas a 37 ºC por aproximadamente 18 horas para obtener cultivos en fase de

crecimiento logarítmico y ser ensayados en las pruebas de capacidad inhibitoria.

Dilución

Dilución 1

1

Medio

Incubar

5 dias 20-25

º C

48

III.1.2.1.- Determinación de la capacidad inhibitoria

Se utilizó el método de difusión en agar. A partir de las placas de BHI en las que se

reactivaron las cepas de Staphylococcus spp., se realizó una suspensión de las mismas

en solución fisiológica estéril. La suspensión de la cepa se corresponde al patrón

establecido para el 0,5 de Mc Farland, a los fines de obtener un inóculo de

aproximadamente 106 -108 UFC/ml.

Con cada suspensión se estriaron en tres sentidos las placas conteniendo agar Mueller

Hinton, solidificados y secadas a 40 ºC, con un espesor de 4 mm. Una vez realizado el

césped, se practicó hacer los pocillos con sacabocados estéril con orificios de 0,7 mm

de diámetro en el agar.

Se realizaron diluciones de la miel, luego, se inocularon 50 µl de cada una de las

muestras puras y sus diluciones en los pocillos practicados en el agar. Se dejó absorber

la dilución al agar durante 10 minutos, se incubaron las placas invertidas durante 24

horas a 35 +/- 1º C, procediendo luego a medir el diámetro de los halos de inhibición

mediante regla y lupa.

III.1.3.- PARÁMETROS FISICOQUÍMICOS

III.1.3.1.- pH

El pH de las muestras se determinó potenciométricamente utilizando un pHmetro marca

HANNA H99161 y un electrodo FC202D. Previo a cada bach de determinaciones se

procedió a calibrar el equipo con tres estándares de pH 4, 7 y 10.

III.1.3.2.- Acidez:

La acidez de las diferentes muestras de miel se determinó titulométricamente siguiendo

el punto final de manera potenciometrica hasta un pH 8,3 utilizando fenolftaleína como

indicador (PHmetro HANNA H99161 y un electrodo FC202D. Método AOAC 15th.

Ed., 1990, 962.19)

III.1.3.3.- Hidroximetilfurfural:

La determinación de hidroximetilfurfural se basó en el método de White (1969) que

determina la absorbancia a 284 nm de una muestra de miel, en la cual se destruye con

bisulfito de sodio el cromóforo de HMF. La diferencia de absorbancia entre la muestra

49

clarificada (sin bisulfito de sodio) y la de referencia (con bisulfito de sodio), se asemeja

a la banda de absorción del HMF entre 250 y 360 nm, con un máximo a 284 nm

(Método AOAC 15th. Ed., 1990, 980.23)

III.1.3.4.- Humedad:

Método refractométrico. Se determinó el índice de refracción de las muestra de miel

previamente homogeneizada con un refractómetro ABBE a 20 °C y realizando la

transformación a traves de las tablas de Chataway y revisadas por Wedmore (1955).

(método AOAC 15th. Ed., 1990, 969.38 B),

III.1.3.5.- Diastasa:

La determinación se basa en el método de Schade (1958), modificado por White y col.

(1959) y por Hadorn (1961). donde se aprovecha la capacidad de la enzima de hidrolizar

el almidón. La cuantificación se realiza midiendo la absorbancia a 660 nm del complejo

coloreado yodo-almidón .

III.1.4.- Análisis estadístico de los datos

Para el análisis estadístico de la influencia de los diversos factores y su posible

interacción, se utilizo el Análisis de varianza de más de un factor a través del paquete

estadístico del programa Statgraphics Plus 5.1. Statpoint Technologies. Inc. Warrenton

VA.USA. Posteriormente se realizo un test de menor diferencia de medias (LSD) para

la comparación de los factores.

50

III.2- RESULTADOS Y DISCUSIÓN

III.2.1.- CALIDAD MICROBIOLOGICA

III.2.1.1.- Recuento de Aerobios Mesófilos Totales:

Al momento de ser cosechada, los análisis microbiológicos de la muestra analizada

presentaron un recuento de aerobios mesofilos totales de 3,6 x 10 3 ± 4,2 x 102 UFC/g

(Fig. 14), siendo este valor menor al exigido por las normativas europeas para la miel de

Apis melífera. El recuento fue superior a los determinados en otros trabajos para

meliponas y esta diferencia puede radicar en las diferentes modalidades de toma de

muestra ya que en este caso el proceso de melado se realizó de manera similar al

utilizado por los productores y no exclusivamente con jeringas estériles como en otros

trabajos realizados sobre el tema (Dallagnol, 2007; Pucciarelli y Col., 2009;

Schapovaloff, 2009).

Los factores tiempo, temperatura y envase mostraron diferencias significativos en el

recuento de aerobios para un nivel de confianza del 95 % (p < 0,05) (Fig. 15). Se

observó un descenso en los recuentos a los 120 días de almacenamiento en todas las

condiciones ensayadas, y se mantuvo una tendencia descendente a los 180 días de

almacenamiento.

Figura 14: Variaciones en el recuento de aerobios mesofilos totales en el tiempo según condiciones de almacenamiento.

51

Tiempo (dias)

log

UF

C/g

r

0 15 90 120 1801,3

1,8

2,3

2,8

3,3

3,8

4,3

Figura 15: Medias e Intervalo de 95% LSD para aerobios mesofilos totales

III.2.1.2.- Recuento de mohos y levaduras

El recuento de mohos y levaduras fue al momento inicial de 9,5x103 ± 3,6x10 3U FC/g

(Fig. 16 ), valor que supera los estándares de calidad establecidos por la normativa de

M=1x102 UFC/g (Código Alimentario Argentino, Cap. X)

Los recuentos de mohos y levaduras mostraron diferencias significativas para un nivel

de confianza del 95 % sólo para el efecto del tiempo (p<0,05), observándose una

disminución significativa en los recuentos a los 90 días de almacenamiento (Fig. 17).

Cabe destacar que a partir de los 90 días de almacenamiento en adelante, en los envases

ensayados a temperatura ambiente, no se evidenció desarrollo de colonias de mohos y

levaduras en los controles microbiológicos, mientras que en los envases mantenidos en

refrigeración estos microorganismos se mantuvieron viables con tendencias

descendentes.

Este comportamiento puede justificarse en las condiciones ácidas observadas a partir de

este tiempo en la miel conservada a temperatura ambiente, lo que determinaría la

inviabilidad de estos microorganismos. Al mismo tiempo los recuentos de

microorganismos aerobios mesofilos se mantuvieron viables, lo que podría deberse a la

existencia de microorganismos formadores de esporas o de poblaciones aerobias

resistentes a las condiciones acidas de la matriz. En varios trabajos realizados con

mieles de Yateí, se han encontrado presencia de microorganismos esporulados

52

aeróbicos y anaeróbicos como Bacillus spp y Clostridium spp (Snowdon y Cliver, 1996;

Salamanca Grosso y Col., 2001; Iurlina y Fritz., 2005; Dallagnol, 2007; Pucciarelli y

Col., 2009; Schapovaloff. 2009).

Figura 16: Variaciones en el recuento de mohos y levaduras en el tiempo según condiciones de almacenamiento

Se observó también un efecto significativo de la interacción entre el tipo de envase y la

temperatura de conservación (p < 0,05) donde se observa que a temperatura ambiente

hay menor desarrollo en el envase plástico lo que se invierte a temperatura de

refrigeración.

El mantenimiento de la viabilidad de los microorganismos en mieles a temperatura de

refrigeración respecto a las conservadas a temperatura ambiente ha sido referenciado en

diversos trabajos (Tisset y Col., 1973; Kokubo y Col., 1984; Nakano y Col., 1989;

Snowdon y Col., 1996).

En los mismos se evidencia también el mantenimiento de los recuentos de

microorganismos hasta aproximadamente los 100 días de almacenamiento, similar al

tiempo de conservación en el que se observaron disminuciones en ambos recuentos en

el presente trabajo.

53

Tiempo (dias)

log

UF

C/g

r

0 15 90 120 1800

1

2

3

4

5

Figura 17: Medias e Intervalo de 95% LSD para Mohos y Levaduras

III.2.2.- PARAMETROS FISICOQUÍMICOS

III.2.2.1- Acidez libre

La acidez libre de la muestra ensayada fue al momento del melado de 42,5 ± 3,53 meq

acido/ kg de miel (Fig. 18), valor por sobre los estándares establecidos como límite para

la miel en las normativas vigentes (Código Alimentario Argentino, Cap. X), pero

coincidente con los diferentes estudios realizados para mieles de melipónidos (Vit y

Col., 2004; Souza y Col., 2006; Pucciarelli y Col., 2009).

De los factores ensayados el tiempo (p<0,05) y la temperatura (p<0,05) mostraron

efectos significativos para un nivel de significación del 95 % (Fig. 19 y Fig. 20

respectivamente).

También mostraron efecto para el mismo nivel de significación las interacciones entre

el tiempo y la temperatura (p<0,05) y entre el envase y la temperatura (p<0,05).

El tipo de envase utilizado no mostró efectos significativos para un nivel de

significación del 95 %.

A los 15 días de almacenamiento la acidez de la muestra aumentó en todas las

condiciones ensayadas, alcanzando valores cercanos a los 50 meq/kg miel para las

muestras conservadas en refrigeración, mientras que la acidez para las muestras

conservadas a temperatura ambiente alcanzó valores cercanos a 120 meq/kg de miel.

54

Figura 18: Variación de la acidez en el tiempo según condiciones de almacenamiento

La producción de ácidos de las mieles esta dada por la acción enzimática de la glucosa

oxidasa y por los procesos fermentativos desarrollados por los microorganismos

presentes en la matriz. La temperatura de refrigeración permite reducir la velocidad de

ambos fenómenos y de esta manera obtener en las muestras aumentos acotados de los

niveles de acidez. En este punto las muestras conservadas a temperatura ambiente

mostraban claras señales de fermentación como producción de espuma y gas.

Sanz y Gradillas (1995) y White (1975), describieron que la fermentación de las mieles

depende de la contaminación inicial, el tiempo y temperatura de almacenamiento y el

contenido de humedad, siendo éste, el factor principal.

La miel ensayada en este trabajo mostró niveles de humedad cercanos al 26 %, valor

superior a lo referenciado como límite de contenido de humedad para la inhibición de la

fermentación (20 %) y que figura en la normativa nacional (CAA).

La humedad alta de la muestra asociada a la carga microbiológica alta y al efecto de la

temperatura, justifican el desarrollo de la fermentación y el aumento de la acidez en las

muestras conservadas a temperatura ambiente (Fig. 21).

En los controles posteriores se observó el mantenimiento de la acidez en las muestras

conservadas en refrigeración y aumentos en las muestras conservadas a temperatura

ambiente llegando a valores cercanos a los 200 meq/kg de miel a los 180 días de

almacenamiento.

55

Tiempo (dias)

Aci

dez

(mE

q /

Kg)

0 15 90 120 1800

30

60

90

120

150

Figura 19: Medias e Intervalo del 95% LSD para Acidez/tiempo

Aci

dez

(mE

q / K

g)

Ambiente Refrigeracion59

79

99

119

139

159

Figura 20: Medias e Intervalo del 95% LSD para Acidez/temperatura

56

Figura 21: Fotografía mieles conservadas a temperatura ambiente

III.2.2.2.- Humedad

Las mieles de melipónidos tienen la característica de presentar humedades mayores a

las correspondientes a mieles de Apis mellifera. Al momento del melado, la muestra

analizada presento un contenido de humedad de 26 ± 0,11 % (Fig. 22), muy superior al

20 % autorizado por las normativas vigentes para miel. (Código Alimentario Argentino,

Cap. X).

Figura 22: Variaciones en el contenido de humedad (%) en el tiempo según condiciones de almacenamiento.

De los factores ensayados el tiempo (p<0,05) y la temperatura (p<0,05) mostraron

efectos significativos para un nivel de significación del 95 % (Fig. 23 y Fig. 24

respectivamente).

Se observó un efecto de la interacciones entre el tiempo y la temperatura (p<0,05) para

el mismo nivel de significación.

57

El tipo de envase utilizado no mostró efectos significativos para un nivel de

significación del 95 %.

El alto contenido de humedad es concordante con informes previos para mieles de

melipónidos (Vit y Col., 2004; Souza y Col., 2006; Pucciarelli y Col., 2009).

Para el caso de las mieles conservadas a temperatura ambiente se observó un aumento

de los contenidos de humedad hacia los 90 días de almacenamiento que descendió

posteriormente. Este comportamiento no se verificó en las muestras conservadas en

refrigeración. Estos resultados pueden deberse a la variabilidad de las condiciones de

Tiempo (dias)

Hum

edad

(%

)

0 15 90 120 18025,9

26

26,1

26,2

26,3

26,4

26,5

Figura 23: Medias e intervalo del 95% LSD para humedad/tiempo

temperatura y humedad a las que se sometieron a las muestras conservadas a

“temperatura ambiente”. Estudios realizados con mieles de Apis mellifera han

encontrado que al exponer las mismas a humedades ambientes superiores al 60 % se

evidencia la absorción de agua por parte de la miel coincidiendo con los resultados

encontrados (Salamanca Grosso y Col., 2001).

Estos resultados concuerdan con experiencias que indican que las mieles de

melipónidos sometidas a condiciones de humedad ambiente del 40 % y temperaturas

cercanas a los 30 ºC, menores a 60 %, muestran un descenso neto en sus contenidos de

humedad (Moraes y Col., 1989; Fonseca y Col. , 2006).

Comparando exclusivamente los contenidos de humedad iníciales y a los 180 días de

almacenamiento se encuentra que el único factor con efecto significativo para un nivel

58

de significación del 95 % es el tiempo (p<0,05), eliminándose el efecto de la

temperatura.

Cabe destacar que pese a que el análisis estadístico muestra diferencias significativas en

las variaciones de humedad estas son solo de entre un 2 y un 3 % en el transcurso de

tiempo estudiado.

Se observa finalmente un aumento neto de humedad en todas las condiciones ensayadas,

que puede verse sustentado en varios factores como ser la liberación de moléculas de

agua en reacciones dadas en la miel, aunque este efecto es teóricamente considerado

como despreciable, además de una posible transferencia de humedad del ambiente a la

miel a través del cierre defectuoso de los frascos con tapa a rosca.

Hum

edad

(%

)

Ambiente Refrigeracion25,9

26

26,1

26,2

26,3

26,4

Figura 24: Medias e intervalo del 95% LSD para humedad/temperatura

III.2.2.3.- pH

El pH registrado en la muestra al momento de la cosecha fue de 4,02 ± 0,02 similar a

los valores registrados para mieles de Apis. Estos valores han sido informados por

estudios previos (Vit y Col., 2004; Souza y Col., 2006; Pucciarelli y Col., 2009).

A los 15 días de almacenamiento se observó que este valor del pH sufrió un descenso

significativo en todas las condiciones ensayadas (Figura 25). Este comportamiento

concuerda con el aumento de la acidez libre observado en el mismo periodo de tiempo.

59

Figura 25: Variaciones del pH en el tiempo según condiciones de almacenamiento

En los controles posteriores el pH de las muestras de miel mostró valores mas bajos,

sobre todo en las muestras conservadas a temperatura ambiente, este efecto es

concordante con el aumento de la acidez libre de las mieles conservadas a temperatura

ambiente que mostraron claros signos de fermentación.

Para las condiciones evaluadas el tiempo y la temperatura (Fig. 26 y Fig.27) mostraron

efectos para un nivel de significación del 95 %. (p< 0,05), se observó también un efecto

significativo para la interacción tiempo-temperatura. (p<0,05)

60

pH


3,5

3,6

3,7

3,8

3,9

Tiempo (dias)

pH

0 15 90 120 1803,4

3,6

3,8

4

4,2

4,4

Figura 26: Medias e intervalo del 95% LSD para pH/tiempo

Figura 27: Medias e intervalo del 95% LSD para pH/temperatura

III.2.2.4. Diastasa

La muestra analizada al tiempo inicial registro una actividad diastásica de Nro. de

diastasa 42,7 ± 1,08, valor superior al mínimo exigido por la normativa vigente, el

mismo es de 8 en la escala de Gothe, esta unidad es coincidente con el numero de

diastasa (Código Alimentario Argentino, Cap. X).

61

A los 15 días de almacenamiento se observó en todas las condiciones ensayadas un

descenso en la actividad enzimática, siendo más pronunciada en las muestras

conservadas a temperatura ambiente (Fig. 28).

Figura 28: Variación en la actividad diastásica (ND) en el tiempo según condiciones de

almacenamiento

En los controles posteriores de las muestras conservadas a temperatura ambiente se

observó la desaparición total de la actividad enzimática. Este fenómeno es compatible

con la modificación del pH de las muestras que determina cambios en la estructura

enzimática produciendo la pérdida de la actividad.

La disminución de la actividad diastásica fue mucho menor en las muestras conservadas

en refrigeración, dado que las modificaciones de las propiedades de estas mieles fueron

mucho menores. A pesar de ello la actividad enzimática presentó un comportamiento

decreciente hasta los 180 días de almacenamiento, pero adecuándose en todo momento

a lo establecido por las normativas vigentes. Estos resultados coinciden con diferentes

informes (Castro Vázquez y Col., 2008; Ramírez Cervantes y Col., 2000; White, 1964;

Takenaka, 1974).

Para las condiciones evaluadas el tiempo y la temperatura (Fig. 29 y Fig. 30), mostraron

diferencias para un nivel de significación del 95 %. (p< 0,05), se observó también un

efecto significativo para la interacción tiempo-temperatura (p<0,05).

62

Tiempo (dias)

Nº

dias

tasa

0 15 90 120 1800

10

20

30

40

50

Figura 29: Medias e intervalo del 95 % LSD para Nº diastasa/tiempo

Nº

dias

tasa

Ambiente Refrigeracion14

18

22

26

30

34

38

Figura 30: Medias e intervalo del 95% LSD para diastasa/temperatura

III.2.2.5.- Hidroximetilfurfural (HMF)

Al momento del melado la muestra ensayada mostró un valor de 3,72 ± 2,09 mg/kg,

muy inferior a los valores exigidos por la normativa vigente que establece un límite de

40 mg/kg de miel. (Código Alimentario Argentino, Cap. X). Todas las condiciones

ensayadas mostraron tendencias ascendentes para el HMF hasta los 180 días de

almacenamiento (Fig. 31), sin superar los límites normativos.

63

Figura 31: Variaciones de HMF (mg/kg de miel) en el tiempo según condiciones de almacenamiento

Los aumentos fueron superiores en las muestras conservadas a temperatura ambiente, lo

que es justificable dadas las condiciones ácidas de dichas muestras lo que favorece la

formación de furfurales a partir de los azúcares. Al desarrollarse las experiencias

durante el verano la temperatura ambiente superior a 30 ºC incide también en el

aceleramiento de las reacciones de formación. Este aumento ha sido descripto por

varios autores (Castro Vázquez y Col., 2008; Ramírez Cervantes y Col., 2000; White,

1964; Takenaka, 1974), y establece la utilidad de este indicador para evaluar el

envejecimiento de las mieles.

Para las condiciones evaluadas el tiempo y la temperatura (Fig. 32 y Fig. 33), mostraron

efectos para un nivel de significación del 95 % (p< 0,05), se observó también un efecto

significativo para la interacción tiempo-temperatura. (p<0,05).

64

Tiempo (dias)

HM

F (

mg/

Kg)

0 15 90 120 1800

4

8

12

16

20

Figura 32: Medias e intervalo del 95% LSD para HMF/tiempo

HM

F (

mg/

Kg)


7,7

8,7

9,7

10,7

11,7

Figura 33: Medias e intervalo del 95% LSD para HMF/temperatura

III.2.3.-PODER ANTIMICROBIANO

La evaluación del poder antimicrobiano de la miel frente a diversas cepas de

Staphylococcus aureus mostró comportamientos variables. El aislamiento de cepas

salvajes de productos cárnicos, y la cepa ATCC 6538 no mostraron sensibilidad a la

acción de la miel al momento del melado ni en ninguna de las condiciones ensayadas.

65

El aislamiento salvaje de producto lácteo (CEPA 2) y la cepa ATCC 25923 (CEPA 3),

mostraron sensibilidad variable según se observan en las Figuras 34 y 35

respectivamente.

Figura 34: Variación del poder antimicrobiano ante CEPA 2 en el tiempo según

condiciones de almacenamiento

Al momento del melado, ambas cepas mostraron frente a la muestra pura de miel halos

de inhibición de aproximadamente 13 mm y diámetros menores según la dilución

evaluada (Fig. 36)

66

Figura 35: Variación del poder antimicrobiano ante CEPA 3 en el tiempo según condiciones de almacenamiento.

Esta variabilidad de la sensibilidad de las diferentes cepas a la acción de la miel ha sido

documentada en diversos trabajos (Novak, 2008; Dallagnol, 2007; Miorin y Col., 2003).

La temperatura de almacenamiento produjo diferencias significativas en el poder

antimicrobiano de la miel solo frente a la CEPA2 para un nivel de significación del 95

% (p< 0,05) (Fig. 37).

67

Para las condiciones ensayadas el tiempo fue el único factor que tuvo incidencia en el

poder antimicrobiano para un nivel de significación del 95 % (p< 0,05) frente a ambas

cepas sensibles (Fig. 38 y 39).

A los 15 días de almacenamiento se observó un aumento de la capacidad inhibitoria de

las mieles frente a las dos cepas sensibles, para todas las condiciones de

almacenamiento. Este aumento de las propiedades antimicrobianas puede asociarse a la

aparición de factores antimicrobianos que tengan relación con la disminución del pH y

el aumento de la acidez de la miel según han sido descriptos por varios investigadores

(Perez-Perez y Col., 2007; Manrique y Col., 2008; Roderick, 2000; Bogdanov, 1997;

Molan, 1992).

Figura 36: Imágenes de placas con halos de inhibición.

En los controles posteriores se observó un constante y rápido descenso de las

propiedades antimicrobianas en todas las condiciones ensayadas. Las muestras

conservadas en refrigeración presentaron escasos efectos inhibitorios ante las cepas

ensayadas a partir de los 90 días de almacenamiento, mientras que las muestras

almacenadas a temperatura ambiente mantuvieron su poder por un periodo mayor.

El mantenimiento del poder antimicrobiano en las muestras conservadas a temperatura

ambiente refuerza la posición de la existencia de factores asociados a la fermentación de

la miel que aportan al poder antimicrobiano de las mieles.

68

Hal

o m

uest

ra p

ura

(mm

)


8,6

9,6

10,6

11,6

12,6

Figura 37: Medias e intervalo del 95 % LSD para halo muestra pura/temperatura de

conservación para CEPA 2.

Tiempo (dias)

Hal

o m

uest

ra p

ura

(mm

)

0 15 90 120 180-1

4

9

14

19

24

29

Figura 38: Medias e intervalo del 95 % LSD para halo muestra pura/tiempo

(CEPA 2)

69

Medias y 95,0 Porcentajes Intervalos LSD

tiempo

halo

mue

stra

pur

a

0 15 90 120 180-2

3

8

13

18

23

28

Figura 39: Medias e intervalo del 95 % LSD para halo muestra pura/tiempo

(CEPA 3)

70

III.3.-CONCLUSIONES

Los envases ensayados no mostraron diferencias para ninguno de los

parámetros evaluados para un nivel de significación del 95 % hasta los 180 días de

almacenamiento.

La mejor condición para el mantenimiento de las propiedades de la miel

de Yateí es la refrigeración de la misma.

La miel de Yateí muestra su mayor capacidad inhibitoria a los 15 días de

almacenamiento y con la utilización del producto puro, independientemente de las

condiciones de temperatura. La conservación a temperatura ambiente permite mantener

las propiedades antimicrobianas por un periodo mayor de tiempo.

La sensibilidad de los microorganismos a la miel de Yateí muestra un

comportamiento variable según la cepa evaluada.

A fin de minimizar la contaminación del producto y reducir los recuentos

microbianos es necesario mejorar el diseño de las colmenas y las metodologías de

melado.

La utilización de estándares de calidad basados en miel de Apis mellifera

determinan la imposibilidad, de las mieles de melipónidos, de cumplir con la normativa

vigente en parámetros caracteristicos como acidez libre y contenido de humedad. Es

necesario adoptar recomendaciones internacionales para estándares en miel de

melipónidos a fin de poder incluir este producto diferenciado en la normativa nacional y

del Mercosur.

71

III.4.- Referencias Bibliográficas

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stingless bee honeys characterized by multivariate análisis of physicochemical

properties. En: Apidologie. 29, p. 377-389.

White, J. (1975). Composition of honey. En: Crane, E (ed.) Honey A

Comprehensive survey, Heinemann Edition; London, p 157-239.

White, J. (1978).En: Advances in Food Research. 24, p.287-374.

White, J.; Riethof, M.; Subers, M.; Kushnir, H. (1962). Composition of

American honeys. En: Techn. Bull. U.S. Dept. Agric. 1261.I

White, J.; Kushnir, I.; Subors, M. (1964). En: Food Technol, 18, p.555.

Ximénez, F. (1967). Historia Natural del Reino de Guatemala. Editorial "José de

Pineda Ibarra". Guatemala. p.351 .

CAPITULO IV

80

IV- Trabajos Futuros

En base a los resultados hallados es importante continuar con la

evaluación de las variaciones de las propiedades de la miel de Yateí

durante el almacenamiento, fundamentalmente en las primeras etapas del

proceso donde se han evidenciado los cambios más significativos

Es elemental evaluar la aplicabilidad de procesos tecnológicos como la

pasteurización y la deshumidificación, y estandarizar los mismos, para

lograr la estabilidad del producto a temperatura ambiente y permitir su

comercialización de manera similar a la miel de Apis.

Para optimizar las propiedades antimicrobianas es necesario estudiar su

acción frente a microorganismos puntuales y con un objetivo claro de

aplicabilidad del producto, ya que esta propiedad presenta amplia

variabilidad según la cepa y la miel ensayadas.

Es necesario estudiar diferentes modelos de colmenas y técnicas de

melado a fin de relacionar la aplicabilidad de buenas prácticas de

manufactura para obtener un producto en mejores condiciones sanitarias.

81

ANEXO Nro 1. TABLAS DE ANOVA

Tabla de Anova para aerobios mesófilos Análisis de la Varianza paralog UFC - Sumas de Cuadrados de Tipo III--------------------------------------------------------------------------------Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado Medio Cociente-F P-Valor--------------------------------------------------------------------------------EFECTOS PRINCIPALES A:envase 1,18734 1 1,18734 8,37 0,0080 B:temperatura 0,674141 1 0,674141 4,75 0,0393 C:tiempo 25,3123 4 6,32808 44,59 0,0000

INTERACCIONES AB 0,0983181 1 0,0983181 0,69 0,4134 AC 1,05035 4 0,262587 1,85 0,1521 BC 0,323197 4 0,0807992 0,57 0,6873

RESIDUOS 3,40588 24 0,141912--------------------------------------------------------------------------------TOTAL (CORREGIDO) 32,0515 39--------------------------------------------------------------------------------Los cocientes F están basados en el error cuadrático medio residual.

Tabla de Anova para recuento de mohos Análisis de la Varianza paraUFC hongos - Sumas de Cuadrados de Tipo III--------------------------------------------------------------------------------Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado Medio Cociente-F P-Valor--------------------------------------------------------------------------------EFECTOS PRINCIPALES A:envase 368832,0 1 368832,0 0,21 0,6501 B:temperatura 541260,0 1 541260,0 0,31 0,5830 C:tiempo 8,06977E8 4 2,01744E8 115,44 0,0000

INTERACCIONES AB 2,05617E6 1 2,05617E6 1,18 0,2888 AC 278753,0 4 69688,3 0,04 0,9968 BC 2,1473E6 4 536825,0 0,31 0,8703

RESIDUOS 4,19415E7 24 1,74756E6--------------------------------------------------------------------------------TOTAL (CORREGIDO) 8,5431E8 39--------------------------------------------------------------------------------Los cocientes F están basados en el error cuadrático medio residual.

Tabla de Anova para acidez Análisis de la Varianza paraacidez - Sumas de Cuadrados de Tipo III--------------------------------------------------------------------------------Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado Medio Cociente-F P-Valor--------------------------------------------------------------------------------EFECTOS PRINCIPALES A:envase 68,45 1 68,45 1,03 0,3139 B:temperatura 154089,0 1 154089,0 2318,99 0,0000 C:tiempo 102913,0 4 25728,3 387,20 0,0000



82

Tabla de Anova para HMF Análisis de la Varianza paraHMF - Sumas de Cuadrados de Tipo III--------------------------------------------------------------------------------Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado Medio Cociente-F P-Valor--------------------------------------------------------------------------------EFECTOS PRINCIPALES A:Envase 1,0534 1 1,0534 0,10 0,7578 B:Temperatura 186,111 1 186,111 16,95 0,0001 C:Tiempo 1615,52 4 403,881 36,78 0,0000



Tabla de Anova para humedad Análisis de la Varianza parahumedad - Sumas de Cuadrados de Tipo III--------------------------------------------------------------------------------Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado Medio Cociente-F P-Valor--------------------------------------------------------------------------------EFECTOS PRINCIPALES A:envase 0,0588613 1 0,0588613 1,05 0,3096 B:temperatura 1,82106 1 1,82106 32,45 0,0000 C:tiempo 1,74451 4 0,436127 7,77 0,0000



Tabla de Anova para pH Análisis de la Varianza parapH - Sumas de Cuadrados de Tipo III--------------------------------------------------------------------------------Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado Medio Cociente-F P-Valor--------------------------------------------------------------------------------EFECTOS PRINCIPALES A:envase 0,0535613 1 0,0535613 2,64 0,1092 B:temperatura 1,64451 1 1,64451 81,04 0,0000 C:tiempo 3,42103 4 0,855258 42,15 0,0000



83

Tabla de Anova para diastasa Análisis de la Varianza paradiastasa - Sumas de Cuadrados de Tipo III--------------------------------------------------------------------------------Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado Medio Cociente-F P-Valor--------------------------------------------------------------------------------EFECTOS PRINCIPALES A:envase 25,6625 1 25,6625 3,30 0,0739 B:temperatura 9645,05 1 9645,05 1241,17 0,0000 C:tiempo 10885,1 4 2721,29 350,19 0,0000



Tabla de Anova para poder antimicrobiano ante Cepa 2 Análisis de la Varianza parahalo muestra pura - Sumas de Cuadrados de Tipo III--------------------------------------------------------------------------------Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado Medio Cociente-F P-Valor--------------------------------------------------------------------------------EFECTOS PRINCIPALES A:temperatura 63,0125 1 63,0125 560,11 0,0000 B:tiempo 1629,45 4 407,363 3621,00 0,0000 C:envase 0,0125 1 0,0125 0,11 0,7556



Tabla de Anova para poder antimicrobiano ante Cepa 3 Análisis de la Varianza parahalo muestra pura - Sumas de Cuadrados de Tipo III--------------------------------------------------------------------------------Fuente Suma de cuadrados GL Cuadrado Medio Cociente-F P-Valor--------------------------------------------------------------------------------EFECTOS PRINCIPALES A:envase 11,1751 1 11,1751 3,10 0,1531 B:temperatura 16,1101 1 16,1101 4,47 0,1020 C:tiempo 1378,05 4 344,512 95,59 0,0003



84

ANEXO Nro 2. DATOS DE MEDICIONES DE VARIABLES

2.a. Datos para acidez

tiempo temperatura envase acidez

0 Ambiente Vidrio 42,5




0 Ambiente Plastico 42,5




0 Refrigeracion Vidrio 42,5




0 Refrigeracion Plastico 42,5





15 Ambiente Vidrio 115




15 Ambiente Plastico 120



15 Refrigeracion Vidrio 55




15 Refrigeracion Plastico 60












85









































86

2.b. Datos para HMF

Tiempo Temperatura Envase HMF










































87








































88

2.c. Datos para humedad

tiempo temperatura envase humedad









































89









































90

2.d. Datos para actividad diastásica

tiempo temperatura envase diastasa










































91








































92

2.e. Datos de pH

tiempo temperatura envase pH










































93








































94

2.f. Datos para recuento de mesófilos aerobios

tiempo temperatura envase log UFC









































95

2.g. Datos para recuento de mohos y levaduras

tiempo temperatura envase log UFC









































96

2.h. Datos para poder antimicrobiano frente a Cepa 2

tiempo temperatura envase halo muestra pura





















97

2.h.Datos para poder antimicrobiano frente a Cepa 3

tiempo temperatura envase halo muestra pura





















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