PRACTICA 2

Departamento de Biologa MolecularPRACTICAS DE GENETICA HUMANA

Curso 2007-2008Profesora responsable: Mara Victoria MendiolaAlumno:

Grupo:

Las Prcticas de Gentica Humana son de realizacin obligatoria para todos los alumnos de la asignatura. Se controlar la asistencia y se corregir el cuaderno de prcticas. Por otra parte, los contenidos tericos de estas prcticas sern tambin material de los exmenes tericos de Junio y Septiembre.

Se realizar un total de seis prcticas que tendrn una duracin de 5 das, con el siguiente plan de trabajo:Da 1. Prctica 1.

Da 2. Prctica 2.

Da 3. Fin Prctica 2, Prctica 3 y Prctica 4.

Da 4. Prctica 5 (1 parte).Da 5.

Prctica 5 (2 parte) y Prctica 6.Indice

Prctica 1. El cariotipo humano............................................

p 2Prctica 2. Transformacin bacteriana....................................p 7Prctica 3. Estudio de rboles genealgicos...........................p 10Prctica 4.Herencia polignica............................................

p 18Prctica 5. Anlisis de polimorfismos....................................p 23Prctica 6. Gentica de poblaciones....................................p 31PRACTICA 1

EL CARIOTIPO HUMANO

Cariotipo normal y de individuos con alteraciones cromosmicas

Objetivo y material

El objetivo de esta prctica es el estudio del cariotipo humano. Se pretende que el alumno aprenda a elaborar cariogramas y a distinguir el cariotipo normal de cariotipos que reflejan alteraciones cromosmicas, obtenidos de individuos que presenten diferentes sndromes.

Para ello se utilizar un programa de ordenador en el que se muestran los cromosomas metafsicos teidos pertenecientes a diversos individuos. El alumno deber ordenar el cariograma y determinar si existen anomalas cromosmicas en cada individuo.

Introduccin

El cariotipo es el complemento cromosmico particular de un individuo y viene definido por el nmero y morfologa de los cromosomas en la metafase mittica. En la especie humana la dotacin cromosmica es de 2n = 46 (22 pares de autosomas y un par de cromosomas sexuales). Utilizando tcnicas de tincin estndar los cromosomas aparecen uniformemente teidos en metafase y se clasifican en 7 grupos de la A a la G atendiendo a su longitud relativa y a la posicin del centrmero que define su morfologa. Los autosomas se numeran del 1 al 22 ordenados por tamaos decrecientes y por la posicin del centrmero. Los cromosomas sexuales X e Y constituyen un par aparte, independientemente del resto (por su tamao, el cromosoma X se incluira en el grupo C, y el Y, en el grupo G). De esta forma el cariotipo humano queda constituido as:

GrupoPares cromosmicosCaractersticas

A1, 2 y 3Cr. muy grandes casi metacntricos (1 y 3 metacntricos, pero 2 submetacntrico)

B4 y 5Cr. grandes y submetacntricos, con dos brazos muy diferentes en tamao

C6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12Cr. medianos submetacntricosD13, 14 y 15Cr. medianos acrocntricos con satlites

E16, 17 y 18Cr. pequeos, metacntrico el 16 y submetacntricos 17, 18

F19 y 20Cr. pequeos y metacntricos

G21 y 22Cr. pequeos y acrocntricos, con satlites.

X, Y

El cr. X es parecido al 6. El Y, al grupo G, pero sin satlites.

(Todos los cromosomas autosmicos estn ordenados en orden decreciente de tamao, excepto el cromosoma 21 que ahora se sabe que es ms pequeo que el 22)

Sin embargo, atendiendo solamente a estos parmetros no es posible identificar inequvocamente cada par de cromosomas. Para ello es necesario utilizar diferentes tcnicas de bandeo cromosmico. Los distintos patrones de bandas que se consiguen son constantes y especficos de cada tcnica y determinan la distribucin de regiones cromosmicas que se revelan positiva o negativamente segn el mtodo utilizado.

Clasificacin de los cromosomas

Citogentica clnica

En 1956, Tijo y Levan determinaran el complemento cromosmico diploide del hombre (2n = 46). En 1959 Lejeune describi la primera cromosomopata o enfermedad originada por una alteracin cromosmica, el sndrome de Down producido por una trisoma del cromosoma 21. Desde entonces, la Citogentica Humana ha ido desarrollndose como una ciencia mdica.

Hay dos tipos fundamentales de cromosomopatas:

- Variaciones cromosmicas estructurales: afectan a la estructura del cromosoma en cuanto a la ordenacin lineal de los genes. Aqu se incluyen deleciones, duplicaciones, inversiones y translocaciones.- Variaciones cromosmicas numricas: afectan al nmero de cromosomas. Incluyen las poliploidas (triploida: 3n; tetraploida: 4n) y los diversos tipos de aneuploida (trisomas: 2n+1; monosomas: 2n-1).

Por otra parte, las anomalas cromosmicas pueden afectar a los autosomas o a los cromosomas sexuales.

Las alteraciones cromosmicas ms frecuentes en humanos son:

Anomalas autosmicas:

Sndrome de Down, por trisoma del cromosoma 21, translocacin 21/21 o translocacin 14/21.

Sndrome de Patau, por trisoma del par 13.

Sndrome de Edwards, por trisoma del par 18.

Sndrome Cri du Chat, por delecin parcial del brazo corto del cromosoma 5 (5p).

Sndrome de DiGeorge, por delecin parcial del brazo largo del cromosoma 22 (22q11).

Cromosoma Filadelfia, formado por una translocacin entre los cromosomas 9 y 22.

Anomalas de los cromosomas sexuales:

Sndrome de Klinefelter, por una constitucin XXY, XXXY, XXXXY.

Sndrome XYY, cromosoma Y extra en varones.

Sndrome de Turner, constitucin X0.

Sndrome XXX, cromosoma X extra en mujeres.

Actualmente se ha llegado a profundizar bastante en el conocimiento del cariotipo humano y se sabe que es relativamente frecuente la aparicin de anomalas cromosmicas. Por ejemplo, cerca de un 25% de los abortos ocurridos antes de la octava semana de gestacin tienen cariotipos anormales y un 0,5% de los recin nacidos presentan aneuploidas.

Estas alteraciones no slo pueden producir anomalas en el propio individuo portador sino que, por tratarse de anomalas genticas, pueden transmitirse a la descendencia en el caso de que afecten a las clulas germinales. La deteccin anticipada de anomalas cromosmicas permite dictaminar las posibilidades de que la descendencia de una pareja portadora de una de ellas pueda presentarla o no. Para ello es preciso conocer el cariotipo de cada progenitor, lo que permite emitir un diagnstico de su posible descendencia, con lo que el individuo ser consciente de sus posibilidades.

El estudio del cariotipo tiene tambin su aplicacin en el diagnstico prenatal. Es posible determinar la constitucin cromosmica del feto antes de su nacimiento pudiendo as observarse si presenta alguna anomala cromosmica detectable. Hoy en da, el diagnstico prenatal se practica a posteriori del inicio de la gestacin y los resultados positivos suelen plantear conflictos ticos y emocionales. Si bien, en muchos casos este tipo de diagnstico es el nico posible, como cuando la anomala cromosmica se produce en las clulas germinales de uno de los progenitores.

Protocolo

En la pantalla se presentarn los cromosomas desordenados sobre la plantilla donde hay que ordenar el cariograma. Pinchando con el ratn y arrastrndolos, se irn colocando sobre la casilla correspondiente. Habr que ordenarlos por parejas segn su tamao, la posicin del centrmero y las bandas, teniendo en cuenta las siguientes reglas:

- pinchando en align all, todos los cromosomas se colocarn en posicin vertical, facilitando su ordenacin.

- el brazo largo de cada cromosoma se sita hacia abajo. Para dar la vuelta a un cromosoma, pinchar dos veces sobre el mismo.

- los autosomas se disponen en orden decreciente de tamaos mientras que los cromosomas sexuales deben ir por separado.

- hay en total 5 cariotipos distintos (5 muestras o samples). Se recomienda empezar por la primera y hacer como mnimo las muestras 1, 2 y 3.

Siguiendo estas instrucciones generales, proceder de la siguiente manera:

1. Contar los cromosomas y apuntar el nmero.

2. Buscar y colocar los cromosomas ms pequeos y acrocntricos que corresponden al grupo G y, cuando est presente, al cromosoma Y que ser el ms largo de los anteriores. En total sern 5 si es XY o 4 si es XX.

3. Buscar otros 6 cromosomas acrocntricos pero ms grandes que los

anteriores y que constituyen el grupo D. Colocarlos emparejados.

4. Buscar los 4 cromosomas ms pequeos que nos quedan, que son

metacntricos. Colocarlos en el grupo F.

5. Buscar los cromosomas del grupo E que son 6, algo mayores que los F. Dos de las

parejas, la 17 y 18, son submetacntricos y la 16 metacntricos.

6. Buscar los 6 cromosomas del grupo A. Son los mayores. Los pares 1 y 3 son

metacntricos (el 1 mayor que el 3) y el 2 submetacntrico.

7. Buscar los 4 cromosomas del grupo B que son los submetacntricos de mayor tamao.

8. Buscar los 14 cromosomas del grupo C. Encontraremos ms de 14 cromosomas, ya que el cromosoma X es idntico a los que constituyen el par 12. Para diferenciarlo hay que recurrir al estudio de las bandas lo mismo que, en general, para numerar las parejas dentro de cada grupo.

En el caso de que haya ms de 46 cromosomas, buscar a qu grupo pertenece el

sobrante, colocarlo all y sealar el sndrome a que da lugar esta anomala. En caso de que el nmero de cromosomas sea inferior a 46 sealar el cromosoma que falta as como el sndrome a que da lugar esta anomala.

Si el nmero de cromosomas es de 46, estudiar cada cromosoma para comprobar si hay algn tipo de alteracin estructural (deleciones, translocaciones...).

Cuando hayamos terminado, pinchando en Verify el programa nos indicar si los cromosomas estn colocados correctamente. Sobre los que no aparezca la marca roja, es que estn mal colocados. A veces simplemente hay que colocar bien el cromosoma dentro de su casilla, si no no se detecta.

Por ltimo, hay que hacer el diagnstico del cariotipo obtenido. Pinchando en diagnosis saldrn varias opciones; se elegir la que se estime oportuna, y el programa nos dir si hemos acertado. Si el diagnstico no es correcto, vuelve a observar el cariograma detenidamente. Si lo es, puedes pasar a la siguiente muestra.

Preguntas de la prctica:1.- Qu caractersticas permiten diferenciar, en general, unos cromosomas de otros?

2.- Qu clulas del organismo llevan el cariotipo diploide completo?

3.- Qu mecanismos cromosmicos producen anomalas del cariotipo humano?

4.- Se manifiestan siempre las alteraciones cromosmicas en el fenotipo del individuo que las transmite? Explica tu respuesta.

Respuestas:PRACTICA 2

TRANSFORMACION BACTERIANA

Objetivo y material

Familiarizar al alumno con tcnicas de biologa molecular de uso general tanto en estudios de gentica bsica como en aplicaciones tecnolgicas. Se observar la adquisicin de resistencia al antibitico Ampicilina de una cepa de Escherichia coli inicialmente sensible al antibitico.

Introduccin

La transformacin es un proceso por el cual las clulas captan ADN libre presente en el medio. Es un fenmeno que ocurre de forma natural en muchas bacterias, pero la eficacia con que ocurre vara enormemente de unas especies a otras. Para que ocurra la transformacin, la bacteria tiene que encontrarse en el llamado estado de competencia, que ocurre en determinadas condiciones fisiolgicas; en este estado, la bacteria presenta alteraciones en su pared y membrana celulares, que permiten la entrada de cidos nucleicos en la clula.

En el laboratorio se ha conseguido poner a punto tcnicas que inducen el estado de competencia en bacterias que no lo presentan de forma natural, como es el caso de E. coli. Estas tcnicas se basan en diversos tratamientos qumicos o fsicos que producen poros en la pared, lo que permite una transformacin bastante eficiente. Algunos de estos mtodos son la electroporacin, consistente en inducir la competencia mediante la aplicacin de un pulso elctrico muy breve e intenso, o tratamientos qumicos con sustancias como el cloruro clcico o el TSB. Hay que tener en cuenta sin embargo que tras estos tratamientos no todas las clulas del cultivo se hacen competentes.

La transformacin en el laboratorio es una tcnica rutinaria de enorme utilidad, que nos permite introducir prcticamente cualquier plsmido en su forma circular superenrollada en casi cualquier tipo de bacteria. El mtodo que se describe a continuacin es, por su simplicidad, uno de los ms utilizados para transformar E. coli. Para detectar la transformacin, el ADN introducido llevar un marcador seleccionable.

Materiales

La bacteria a transformar ser una estirpe de E. coli de uso comn en el laboratorio, que se denomina DH5(. Estas bacterias son sensibles al antibitico Ampicilina, es decir, no son capaces de crecer en un medio de cultivo que contenga dicho antibitico.

El ADN que introduciremos en estas bacterias ser un plsmido, denominado pUC18, que contiene un gen cuyo producto confiere resistencia al antibitico Ampicilina.

Como medio de cultivo lquido utilizaremos LB (10 g/l triptona, 5 g/l extracto de levadura, y 5 g/l de ClNa), un medio rico en nutrientes en el que las bacterias se multiplican con rapidez. El medio de cultivo slido ser LA (LB con agar al 1.5%). Tanto LB como LA se tendrn ya preparados y esterilizados, pero el medio slido habr que repartirlo en placas de Petri y aadir en su caso el antibitico para conseguir un medio selectivo para los transformantes.

Para la induccin de la competencia y posterior transformacin usaremos el medio TSB, que contiene, aparte de los componentes del LB, lo siguiente: 10% PEG, 5% DMSO, 10mM MgCl2, 10 mM MgSO4. Tambin se utilizar TSB suplementado con 20mM de glucosa.

Protocolo

Durante todo el proceso, y para evitar la contaminacin del cultivo bacteriano, habr que trabajar en condiciones de esterilidad.

Da 0

1.Inocular las bacterias en 10 ml de LB e incubar a 37C con agitacin toda la noche.

Da 1

1.Dilur 1/10 el cultivo bacteriano (1 ml del cultivo en 10 ml de medio de cultivo LB fresco)

2.Incubar una hora a 37C con agitacin.

3.Durante el tiempo de incubacin, aprovecharemos para comprobar que la estufa est a 37C y descongelar reactivos. Tambin prepararemos el medio slido. El bote de LA ya preparado, esterilizado y solidificado, lo introduciremos en el microondas para que se funda. Despus se deja enfriar hasta unos 50C (que se pueda coger el bote sin quemarse) y se aade, en su caso, el antibitico Ampicilina. Utilizaremos un stock de Ampicilina disuelta en agua destilada y estril a una concentracin de 100 mg/ml. Queremos alcanzar una concentracin final de antibitico en el medio de cultivo de 100 (g/ml. Se mezcla suavemente y se vierte sobre placas de Petri (unos 25 ml por placa). Se deja sobre una superficie plana hasta que solidifique. Todo esto se debe realizar en condiciones de esterilidad.

4.Medir la D.O. (densidad ptica, o absorbancia) a 600 nm de 1ml del cultivo. Queremos que las bacterias se encuentren en fase exponencial, por lo que la D.O. debe estar entre 0.3 y 0.9. Una D.O. de 0.5 se corresponde aproximadamente con una concentracin de 108 bacterias/ml.

5. Centrifugar las clulas, 10 minutos a 4000 rpm. Mientras se centrifuga, coger hielo picado de la mquina para el paso siguiente.

6.Tirar el sobrenadante. Resuspender el precipitado de bacterias en 1/10 del volumen inicial (1ml) de TSB fro y dejar en hielo 10 minutos. Durante este tiempo, las bacterias van adquiriendo el estado de competencia.

7.Poner dos tubos eppendorf estriles en hielo. Marcarlos como A y B. Poner en cada uno 100 (l de clulas.

8.Al tubo A, aadirle 2 (l (0,5 (g) del ADN plasmdico.

9.Incubar 5 minutos ms en hielo.

10.Sacar los tubos del hielo. Aadir a cada uno 900 (l de TSB con glucosa.

11.Incubar 15 minutos a 37C para dar tiempo a que se expresen los genes recin introducidos en la clula.

12.Sembrar 100 (l de cada tubo en una placa de LB+ampicilina. Sembrar tambin 100 (l en una placa de LB sin antibitico.

13.Dejar las placas en la estufa de 37C hasta el da siguiente.

Da 2

1.Observar el crecimiento en las placas. Contar las colonias que hayan crecido en las placas de LB+Ampicilina. Una incubacin excesivamente larga de estas placas, o un nmero muy elevado de colonias, podran dar lugar a la aparicin de "colonias satlite" de pequeo tamao alrededor de las colonias grandes; estas pequeas colonias no se contabilizan, pues no representan bacterias que hayan adquirido el gen de resistencia, sino ms bien bacterias que consiguen crecer gracias a que las bacterias resistentes degradan el antibitico a su alrededor.

Preguntas de la prctica

1.Calcular el nmero de transformantes por (g de ADN aadido, con la frmula: (n de colonias / (g ADN aadidos) x10 (porque hemos sembrado slo la dcima parte de la transformacin)

2.Calcular la frecuencia de transformacin utilizando la frmula

n transformantes / (g ADN

Frec. transf = ________________________

n clulas totales

Para calcular el nmero de clulas habr que partir de la D.O. del cultivo inicial y de ah calcular, primero, cuntas clulas haba en el cultivo de partida, y segundo, cuntas en el tubo A.

3.En la placa de LB+Ampicilina sembrada con 100 (l del tubo B no debera haber colonias. Sabras explicar por qu? Para qu se realiza este control?

4.Describe qu observas en la placa de LB sin Ampicilina, y explcalo.

Respuestas

PRACTICA 3

ESTUDIO GENEALOGICO EN GENETICA HUMANA

Objetivo y material

El objetivo de esta prctica es que el alumno aprenda a confeccionar y esquematizar rboles genealgicos; a determinar, en la medida de los posible, el genotipo de los individuos que lo componen, y a conocer la transmisin de algunos caracteres sencillos y de fcil observacin.

El material biolgico de esta prctica sern los propios alumnos y sus familiares para la observacin de algunos caracteres genticos. Con sus datos se elaborarn las genealogas.

Introduccin

El hombre presenta ciertas caractersticas especiales que lo califican como un material difcil para el estudio gentico. De hecho, estas caractersticas son:

1. Hay una gran diversidad gentica de individuos, y tambin la estructura gentica de las poblaciones humanas vara continuamente debido a las migraciones, la mezcla de razas, etc.

2. Por motivos ticos y morales no se practican cruzamientos experimentales, de los que por otra parte no se obtendra gran informacin, ya que:

a) de cada parto suele nacer un solo individuo

b) las gestaciones son largas

c) entre una generacin y la siguiente transcurre mucho tiempo

d) el tamao de las familias es pequeo.

En cambio, otros organismos que se utilizan frecuentemente en la investigacin gentica presentan caractersticas mucho ms ventajosas. Por ejemplo en los ratones, ocurre una generacin cada dos meses y los descendientes de cada pareja pueden contarse por decenas. En Drosophila, la generacin dura 20 das y se cuentan los descendientes por centenares.

As, en estos organismos y otros de caractersticas similares, los cruzamientos experimentales constituyen uno de los mejores mtodos para el conocimiento de los caracteres hereditarios.

Por lo tanto, la gentica humana tiene que recurrir para su desarrollo a mtodos indirectos tales como el uso de pedigrs o rboles genealgicos, anlisis de poblaciones, etc.

A pesar de todas estas dificultades, desde principios de siglo y mediante el uso de tcnicas genealgicas, se ha ido acumulando el conocimiento de nuevos caracteres determinados genticamente y de los genes que los controlan, hasta llegar a varios millares. Posteriormente, las tcnicas citogenticas y moleculares han permitido identificar nuevos genes y determinar su localizacin cromosmica.

Protocolo

La prctica en s consiste, en primer lugar, en el reconocimiento de las variaciones fenotpicas para cada uno de los caracteres monognicos que se describen a continuacin, de donde el alumno deducir su genotipo en cada caso. Los datos se tomarn en una hoja como la que se indica al final de esta prctica. Se usar una hoja de datos para cada persona.

Descripcin de los caracteres

1) Disposicin del lbulo de la oreja. Lbulo separado de la mejilla o pegado lateralmente a la mejilla.

2) Lnea frontal del pelo. Puede ser continua o tener un saliente frontal en el centro denominado "pico de viuda". Obviamente las personas calvas no se pueden contabilizar.

3) Capacidad de enrollar la lengua. Ser o no capaces de enrollar la lengua en forma de U fuera de la boca.

4) Pigmentacin del iris. Ojos azules frente a ojos ms oscuros, sean stos verdes o marrones. Lo que se compara es la ausencia total o no de pigmentacin en la superficie del ojo. En ausencia de sta, se observa la lmina interna azul del iris, y los ojos sern totalmente azules. La presencia de pigmento en las capas superiores del iris enmascara en mayor o menor grado el color azul del fondo. Otros genes determinan el color exacto y su intensidad para ojos verdes, marrones, etc., pero en esto no nos fijaremos.

5) Hiperextensibilidad del dedo pulgar. Capacidad o incapacidad de doblar hacia atrs la ltima falange del pulgar en un ngulo de casi 90 respecto a la anterior ("dedo del autoestopista"). Esta capacidad puede manifestarse slo en una de las manos, y la expresividad del rasgo es variable.

6) Dedo meique doblado. El meique puede estar recto, o bien con la ltima falange doblada hacia el dedo anular. Se colocan ambas manos relajadas sobre una mesa y se observa si los dedos estn paralelos o si los meiques se doblan hacia dentro.

7) Longitud relativa del dedo ndice. Dedo ndice ms o menos largo que el anular. Se realiza la observacin como en el caso anterior. Se trata de un carcter de expresin influenciada por el sexo.

8) Hoyuelos faciales a ambos lados de la boca. Presencia o ausencia de hoyuelos en las mejillas.

9) Presencia de pelo en las segundas falanges de los dedos. Aunque slo haya algo de pelo en alguna de las diez falanges, se considera como fenotipo positivo.

10) Dedo gordo del pie corto. El dedo gordo del pie puede ser ms corto o ms largo que el ndice adyacente.

11) Capacidad de detectar la feniltiocarbamida (PTC). Hay individuos que detectan un sabor amargo y otras que no notan nada. Introducir primero en la boca el papel control, ensalivar, y sacar de la boca. Introducir a continuacin el papel impregnado en PTC y ensalivar.

Una vez realizada la observacin, proceder de la siguiente manera:

1. Tomar los datos del fenotipo propio

2. Anotar todos los fenotipos en el lugar correspondiente de la hoja de datos.

3. Tomar los datos de tantos parientes (padres, hermanos, abuelos, tos) como sea posible.

4. Anotar los datos de cada persona en una hoja de datos diferente.

5. Confeccionar el rbol genealgico indicando el fenotipo de cada persona para, al menos, dos de los caracteres analizados.

6. Determinar si es posible el tipo de herencia de los caracteres analizados.

7. En base al tipo de herencia, nombrar los alelos adjudicados a cada carcter en la hoja de datos, usando una letra distinta para cada carcter, en maysculas/minsculas para dominante/recesivo.

8. Por ltimo, indicar cuando sea posible los genotipos de todos los miembros para cada carcter.

Como ejemplo de rbol genealgico se seguir un esquema como el que se indica a continuacin:

I

1

2

3

4

II

123456

789

III

12345

En la genealoga se indica el orden de las generaciones con nmero romano. La primera generacin (I) corresponde a la primera persona de la que se posean datos, por ejemplo la de los abuelos del alumno; la segunda (II) correspondera a la de los padres y tos, y la tercera (III), a la generacin del alumno.

Los varones se representan con cuadrados, las mujeres con crculos, y por rombos los individuos de los que no se conocen los datos (II.9). Las parejas se unen por una lnea horizontal. Los descendientes se disponen bajo una lnea horizontal desde la que parte una lnea vertical por individuo, excepto en el caso de mellizos (III.4 y 5) o gemelos fraternos (II.4 y 5), que se indican por lneas convergentes (ver figura). Los individuos que muestran el fenotipo en estudio se indican rellenando el smbolo.

HOJA DE DATOS 1_____________________________________________________________________________

Parentesco

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Fenotipo

Fenotipo

Lbulo de la oreja..... separado..... unidoDedo autoestopista..... presente..... ausentePico de viuda

..... presente.... ausenteLongitud del ndice..... corto..... largoLengua en U

..... capaz..... incapazDedo meique

..... curvado..... rectoPigmentacin del iris.... presente..... ausenteHoyuelos faciales.... presentes... ausentesPelo en 2 falanges.... presente..... ausenteDedo gordo del pie..... corto..... largoDeteccin PTC: . SI

. NO_____________________________________________________________________________

HOJA DE DATOS 2

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Parentesco

_____________________________________________________________________________

Fenotipo

Fenotipo

Lbulo de la oreja..... separado..... unidoDedo autoestopista..... presente..... ausentePico de viuda

..... presente.... ausenteLongitud del ndice..... corto..... largo

Lengua en U

..... capaz..... incapazDedo meique

..... curvado..... rectoPigmentacin del iris.... presente..... ausenteHoyuelos faciales.... presentes... ausentesPelo en 2 falanges.... presente..... ausenteDedo gordo del pie..... corto..... largoDeteccin PTC: . SI

. NO_____________________________________________________________________________

HOJA DE DATOS 3

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Parentesco

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Fenotipo

Fenotipo

Lbulo de la oreja..... separado..... unidoDedo autoestopista..... presente..... ausentePico de viuda

..... presente.... ausenteLongitud del ndice..... corto..... largo

Lengua en U

..... capaz..... incapazDedo meique

..... curvado..... rectoPigmentacin del iris.... presente..... ausenteHoyuelos faciales.... presentes... ausentesPelo en 2 falanges.... presente..... ausenteDedo gordo del pie..... corto..... largoDeteccin PTC: . SI

. NO_____________________________________________________________________________HOJA DE DATOS 4_____________________________________________________________________________

Parentesco

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Fenotipo

Fenotipo

Lbulo de la oreja..... separado..... unidoDedo autoestopista..... presente..... ausentePico de viuda

..... presente.... ausenteLongitud del ndice..... corto..... largo

Lengua en U

..... capaz..... incapazDedo meique

..... curvado..... rectoPigmentacin del iris.... presente..... ausenteHoyuelos faciales.... presentes... ausentesPelo en 2 falanges.... presente..... ausenteDedo gordo del pie..... corto..... largoDeteccin PTC: . SI

. NO_____________________________________________________________________________

HOJA DE DATOS 5

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Parentesco

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Fenotipo

Fenotipo

Lbulo de la oreja..... separado..... unidoDedo autoestopista..... presente..... ausentePico de viuda

..... presente.... ausenteLongitud del ndice..... corto..... largo

Lengua en U

..... capaz..... incapazDedo meique

..... curvado..... rectoPigmentacin del iris.... presente..... ausenteHoyuelos faciales.... presentes... ausentesPelo en 2 falanges.... presente..... ausenteDedo gordo del pie..... corto..... largoDeteccin PTC: . SI

. NO_____________________________________________________________________________

HOJA DE DATOS 6

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Parentesco

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Fenotipo

Fenotipo

Lbulo de la oreja..... separado..... unidoDedo autoestopista..... presente..... ausentePico de viuda

..... presente.... ausenteLongitud del ndice..... corto..... largo

Lengua en U

..... capaz..... incapazDedo meique

..... curvado..... rectoPigmentacin del iris.... presente..... ausenteHoyuelos faciales.... presentes... ausentesPelo en 2 falanges.... presente..... ausenteDedo gordo del pie..... corto..... largoDeteccin PTC: . SI

. NO_____________________________________________________________________________

HOJA DE DATOS 7_____________________________________________________________________________

Parentesco

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Fenotipo

Fenotipo

Lbulo de la oreja..... separado..... unidoDedo autoestopista..... presente..... ausentePico de viuda

..... presente.... ausenteLongitud del ndice..... corto..... largo

Lengua en U

..... capaz..... incapazDedo meique

..... curvado..... rectoPigmentacin del iris.... presente..... ausenteHoyuelos faciales.... presentes... ausentesPelo en 2 falanges.... presente..... ausenteDedo gordo del pie..... corto..... largoDeteccin PTC: . SI

. NO_____________________________________________________________________________

HOJA DE DATOS 8

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Parentesco

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Fenotipo

Fenotipo

Lbulo de la oreja..... separado..... unidoDedo autoestopista..... presente..... ausentePico de viuda

..... presente.... ausenteLongitud del ndice..... corto..... largo

Lengua en U

..... capaz..... incapazDedo meique

..... curvado..... rectoPigmentacin del iris.... presente..... ausenteHoyuelos faciales.... presentes... ausentesPelo en 2 falanges.... presente..... ausenteDedo gordo del pie..... corto..... largoDeteccin PTC: . SI

. NO_____________________________________________________________________________

HOJA DE DATOS 9

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Parentesco

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Fenotipo

Fenotipo

Lbulo de la oreja..... separado..... unidoDedo autoestopista..... presente..... ausentePico de viuda

..... presente.... ausenteLongitud del ndice..... corto..... largo

Lengua en U

..... capaz..... incapazDedo meique

..... curvado..... rectoPigmentacin del iris.... presente..... ausenteHoyuelos faciales.... presentes... ausentesPelo en 2 falanges.... presente..... ausenteDedo gordo del pie..... corto..... largoDeteccin PTC: . SI

. NO_____________________________________________________________________________

HOJA DE DATOS 10_____________________________________________________________________________

Parentesco

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Fenotipo

Fenotipo

Lbulo de la oreja..... separado..... unidoDedo autoestopista..... presente..... ausentePico de viuda

..... presente.... ausenteLongitud del ndice..... corto..... largo

Lengua en U

..... capaz..... incapazDedo meique

..... curvado..... rectoPigmentacin del iris.... presente..... ausenteHoyuelos faciales.... presentes... ausentesPelo en 2 falanges.... presente..... ausenteDedo gordo del pie..... corto..... largoDeteccin PTC: . SI

. NO_____________________________________________________________________________

HOJA DE DATOS 11

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Parentesco

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Fenotipo

Fenotipo

Lbulo de la oreja..... separado..... unidoDedo autoestopista..... presente..... ausentePico de viuda

..... presente.... ausenteLongitud del ndice..... corto..... largo

Lengua en U

..... capaz..... incapazDedo meique

..... curvado..... rectoPigmentacin del iris.... presente..... ausenteHoyuelos faciales.... presentes... ausentesPelo en 2 falanges.... presente..... ausenteDedo gordo del pie..... corto..... largoDeteccin PTC: . SI

. NO_____________________________________________________________________________

HOJA DE DATOS 12

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Parentesco

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Fenotipo

Fenotipo

Lbulo de la oreja..... separado..... unidoDedo autoestopista..... presente..... ausentePico de viuda

..... presente.... ausenteLongitud del ndice..... corto..... largo

Lengua en U

..... capaz..... incapazDedo meique

..... curvado..... rectoPigmentacin del iris.... presente..... ausenteHoyuelos faciales.... presentes... ausentesPelo en 2 falanges.... presente..... ausenteDedo gordo del pie..... corto..... largoDeteccin PTC: . SI

. NO_____________________________________________________________________________ARBOLES GENEALOGICOS

PRACTICA 4

ESTUDIO DE LA HERENCIA POLIGNICA

Recuento de las lneas de las huellas dactilares

Objetivo y material1.- Recogida de un juego completo de huellas dactilares propias.

2.- Clasificar las huellas de acuerdo a su morfologa.

3.- Determinar el recuento total de lneas (TRC) de un juego completo de huellas.

4.- Construr un histograma de la distribucin de frecuencias con los datos obtenidos del grupo de prcticas.

5.- Discutir las caractersticas de la herencia polignica y el por qu de su difcil anlisis.

Introduccin

La herencia polignica no se puede analizar empleando pedigres ni estudiando los cromosomas (de no ser que se estudie una aberracin cromosmica en concreto). Un rasgo polignico es el fenotipo resultante de la accin de dos o ms genes. Estos tienen unas caractersticas comunes:

1.- los rasgos se cuantifican midindose,

2.-los rasgos son controlados por 2 o ms genes resultando en un efecto aditivo,

3.- los rasgos son controlados por efecto de alelos mltiples,

4.- los fenotipos de los rasgos polignicos y multifactoriales varan de expresin

por efecto de los factores ambientales.

Existen numerosos ejemplos de este tipo de herencia por ejemplo la estatura, el peso, la inteligencia, el color de la piel, etc.

Demostrar y estudiar la herencia de los rasgos polignicos no es fcil. El ejemplo que a continuacin te proponemos estudiar explorar cmo los rasgos de la herencia de las huellas dactilares son modelos de herencia polignicas. Recogeris las huellas dactilares vuestras y prepararis un perfil de las mismas.

En 1890, Francis Galton sugiri que las huellas dactilares seran una buena manera de identificacin para humanos. Durante los ltimos aos de hecho, tanto los dibujos de las huellas dactilares (de las manos y pies) y de las huellas de las palmas de las manos y pies han sido de gran inters para numerosos estudios especializados. Un ejemplo de su utilidad es el estudio de la huella del recin nacido para el diagnstico precoz de anormalidades cromosmicas.

La herencia de las huellas dactilares, al igual que los dems caracteres de herencia polignica, tambin se ve influda por factores ambientales aunque, debido a la precocidad y rapidez del desarrollo de stas, el fenotipo no cambiar tras el nacimiento. Las huellas dactilares se pueden detectar a partir de la 6 semana de desarrollo fetal, llegando a su mayor desarrollo hacia la semana 12-13. Posteriormente regresarn hasta adquirir la morfologa final que ya no se ver alterada durante el restante desarrollo prenatal y postnatal.

ARCOS

LAZOS ESPIRALES

Clasificacin de las huellas

Los patrones de los dibujos de las huellas se pueden clasificas en tres grupos principalmente: arcos, lazos y espirales. El arco es el patrn ms simple y menos frecuente. En las huellas donde aparecen lazos, las lneas aparecen en tres direcciones, encontrndose en un punto intermedio (el trirradio) con ngulos de unos 120 grados. En el centro del punto de encuentro se forma un tringulo. Los lazos pueden denominarse radiales o cubitales, dependiendo de hacia dnde estn inclinados; por ejemplo, un dedo meique presentar un lazo radial si su trirradio se abre hacia el pulgar de su misma mano. Un lazo cubital ser aquel que del pulgar se abra hacia el meique de la misma mano. El patrn espiral presenta dos trirradios (formndose dos tringulos). Las frecuencias de estros tres patrones en la poblacin son de 5,0% para el arco, 5,4% para el lazo radial, 63,5% para el lazo cubital, y 26,1% para el espiral.

Estudio de las huellas dactilares: recuento de las lneas

El objetivo de este estudio ser el estudio del total de las lneas de la huella (en ingls: total ridge count o TRC). Holt en 1968 determin que para varones la media es de 145 y para mujeres de 126.

Las lneas se han de contar desde el triradio al centro de la huella (ver la lnea blanca de las imgenes de las huellas de arriba), es decir, las huellas que presentan el patrn del arco tienen un recuento de cero (no hay triradio). En los espirales el recuento ha de efectuarse desde cada triradio al centro de la huella. Una vez contadas todas las lneas de todas las huella por persona se sumarn para obtener el TRC. A continuacin se examinar cmo el TRC apoya el modelo de herencia polignica.

Caractersticas de algunos sndromes comunes:

- Trisoma 21: dedos con lazos cubitales generalmente, lazos radiales en dedos 4 y 5.

- Trisoma 18: lneas poco desarrolladas, gran frecuencia de arcos (media de 7-8 con al menos un arco). En los pulgares sin arcos, con lazos radiales, recuentos TRC bajos.

- Sndrome de Turner (45,X): alto recuento TRC sin aumento de espirales.

Relacin entre la media de TRC y el nmero de cromosomas X e Y

45, X

165

47, XYY

103

46, XY145

48, XXYY

88

46, XX126

48, XYYY

83

47, XXY114

49, XXXXX

17

Recogida de datos individuales

(pegar aqu la cinta adhesiva con las huellas en cada casilla)

pulgar derecho (I)

ndice derecho (II)corazn dcho (III)anular derecho (VI)meique dcho(V)

pulgar izquierdo (I)

ndice izquierdo (II)corazn izdo (III)anular izdo (IV)meique izdo (V)

mano derecha

pulgar

ndicecoraznanularmeique

patrn obtenido:____________________________________________________________

recuento

parcial:____________________________________________________________

recuento total =

mano dcha_____________

mano izquierda

pulgar

ndicecoraznanularmeique

patrn obtenido:____________________________________________________________

recuento

parcial:____________________________________________________________

recuento total =

mano izda_____________

Recuento total dos manos:

TRC= ___________

Recogida de datos del grupo de prcticasestudiantesexo

V/M TRClazos*espirales*arcos*

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

% del total:

media del TRC:

media TRC mujeres:

media TRC varones:

________

________

________

__________________

(*) poner el nmero de dedos

Preguntas de la prctica:

1.- Cul es la media TRC para la clase? Existen diferencias en las TRC medias para los varones y mujeres?

2.- Cul puede ser la causa de esta diferencia? Razona tu respuesta.

3.- Compara tu TRC con la media total y con la de tu sexo.

4.- Resume y razona los resultados obtenidos en el histograma.

5.- De haber recogido datos de una poblacin mucho mayor crees que el grfico presentara otro aspecto? Razona tu respuesta.

Respuestas:

PRACTICA 5

ESTUDIO DE POLIMORFISMOS

Anlisis del grupo sanguneo y de un VNTR

Objetivo y material

1.- Anlisis de un polimorfismo fenotpico: determinacin del grupo sanguneo.

2.- Anlisis de un polimorfismo silencioso de ADN tipo VNTR.

3.- Evaluar la utilidad de ambos para diversas aplicaciones mdicas y legales.

En ambos casos, el material de partida ser la sangre de los propios alumnos, y en su caso, muestras de sangre de familiares de stos, previamente recogidas.

Introduccin

Los polimorfismos son el reflejo de la diversidad gentica de la especie. Se dice que existe un polimorfismo en un determinado locus cuando hay ms de un alelo presente en la poblacin con una frecuencia superior al 1%. Aunque un individuo slo puede presentar como mximo dos alelos distintos para un locus, un estudio poblacional puede revelar la presencia de mltiples alelos para ese locus, especialmente en ciertos loci que son altamente polimrficos.

Una pequea proporcin de los polimorfismos en el ADN dar lugar a diferencias a nivel de los aminocidos codificados, produciendo por tanto un polimorfismo de protenas. Pero la mayora de los polimorfismos en las secuencias de ADN ocurren en ADN no codificante, y no tienen por tanto efecto fenotpico (se denominan silenciosos). La causa de que la mayor parte de polimorfismos sean silenciosos es, por una parte, que la gran mayora del genoma humano consiste en ADN no codificante; y por otra, que este ADN est sometido a menores presiones selectivas.

El anlisis de polimorfismos en el ADN se aplica a estudios poblacionales y al estudio de la evolucin del genoma humano. Otra aplicacin que ha cobrado gran importancia consiste en detectar polimorfismos asociados a ciertas patologas, lo que permite en muchos casos localizar el gen responsable, y permite tambin a veces realizar el diagnstico de la enfermedad. Por ltimo, el estudio de polimorfismos tiene un creciente inters en el mbito de la Medicina Legal; el anlisis gentico de la diversidad humana permite resolver ciertos problemas judiciales, utilizando la "huella del ADN" a modo de huellas dactilares. El anlisis conjunto de varios polimorfismos (tanto fenotpicos como silenciosos) permite identificar individuos con unos mrgenes de error despreciables. Por otra parte, la ventaja sobre otros sistemas de identificacin, como las huellas dactilares, es que se trata de caracteres genticos que se heredan de manera mendeliana. Esto permite su uso en pruebas de paternidad.

En esta prctica abordaremos el estudio de polimorfismos humanos de dos maneras muy distintas. En primer lugar se estudiar el polimorfismo del locus AB0 que determina el grupo sanguneo. Puesto que es ste un polimorfismo fenotpico, y adems la penetrancia es del 100%, el anlisis se har directamente sobre el producto gnico. En segundo lugar estudiaremos un polimorfismo de ADN silencioso. Para ello amplificaremos por PCR una regin de ADN genmico que incluye un VNTR. Finalmente analizaremos los datos obtenidos por todo el grupo.

Prctica 5a -Anlisis de un polimorfismo fenotpico: el grupo sanguneo AB0.

Objetivo y material

El objetivo de esta primera parte de la prctica es analizar un polimorfismo evidente fenotpicamente, como es el de los grupos sanguneos. Se pretende dar a conocer la base gentica de los grupos sanguneos ms importantes. Se determinarn los grupos sanguneos de cada alumno mediante la extraccin de unas gotas de sangre por puncin del cuarto dedo de una mano con una lanceta estril. La determinacin del grupo sanguneo se realizar mediante reacciones de aglutinacin con anticuerpos especficos. Estos datos se analizarn respecto a los fenotipos parentales y se emplearn en estudios posteriores.

Introduccin

La sangre de cada persona es tan caracterstica que puede servir como medio de identificacin casi tan preciso como las huellas dactilares. Slo los gemelos idnticos poseen caractersticas sanguneas iguales. Por otra parte, la herencia de los caracteres sanguneos est tan bien definida que puede seguirse con facilidad. Adems, la expresin de estos caracteres, en general, no est influda por el ambiente; por lo que puede decirse que su penetrancia es del 100%. Por todo ello, la fenotipacin de individuos en base a la determinacin de los grupos sanguneos es particularmente conveniente en los estudios genticos en poblaciones humanas. Tambin existen importantes implicaciones en medicina, como: la prctica de las transfusiones sanguneas, la relativamente frecuente aparicin de enfermedades hemolticas en fetos y recin nacidos, las aplicaciones mdico-legales y su conexin con otros genes cuya repercusin ms inmediata puede estar en los transplantes de rganos.

Sistema AB0

El primer sistema descubierto, en 1900, fue el AB0, por ser la principal causa de la incompatibilidad entre las sangres de distintos individuos en las transfusiones de sangre. Dicha incompatibilidad se basa en una reaccin de carcter inmunolgico altamente especfica, consistente en la unin qumica de antgenos extraos contenidos en los eritrocitos del donante y las aglutininas o anticuerpos especficos presentes en el plasma sanguneo del receptor.

El grupo sanguneo AB0 lo determina un locus situado en el extremo del brazo largo del cromosoma 9. Constituye un caso de alelismo mltiple basado en la existencia de tres alelos:

IA que da lugar a la produccin de antgenos A.

IB que da lugar a la produccin de antgenos B.

i que determina no produccin de antgenos.

Los alelos IA e IB son codominantes, y el alelo i es recesivo frente a ambos. Estas caractersticas determinan la existencia de cuatro fenotipos. El sistema AB0 puede resumirse en el siguiente cuadro:

FenotiposGenotiposAntgenos en los eritrocitosAnticuerpos en suero

AIAIA IAi Aanti-B

BIBIB IBi Banti-A

0ii ningunoanti-A y anti-B

ABIAIB A y Bninguno

Las personas que poseen en sus eritrocitos un tipo de antgeno carecen del anticuerpo respectivo, pero este ltimo est presente en el suero de las personas que carecen de dicho antgeno. Por lo tanto, en una transfusin se producir reaccin de aglutinacin antgeno-anticuerpo o no segn los casos, tal como se indica en el siguiente cuadro:

Origen del suero (receptor)Origen de los eritrocitos (donante)ABAB0

A-+-+

B+--+

AB++-+

0----

Sistema MN

En 1927 se descubri el sistema MN, mediante experimentos con conejos. Los grupos MN dependen de un par de alelos codominantes M y N, responsables de tres genotipos: MM, MN y NN y sus respectivos fenotipos M, MN y N. Este sistema es de escasa importancia en la transfusin sangunea o en la incompatibilidad materno fetal. Su significacin principal en la gentica mdica deriva del hecho de que sus frecuencias relativas y su herencia codominante los hacen especialmente tiles para resolver problemas de identificacin, paternidad etc.

Sistema Rhesus

Un tercer sistema de antgenos de superficie de los eritrocitos es el sistema Rhesus descubierto por Landsteiner, Wienes y Levine en 1940. En un primer anlisis y para simplificar se consideran dos grupos en este sistema:

- Rh+, individuos que poseen antgenos Rh.

- Rh-, indviduos que no poseen antgenos Rh.

Los anticuerpos anti-Rh no son anticuerpos naturales, no existen normalmente en la sangre, pero aparecen en individuos Rh- que han recibido antgenos Rh como consecuencia de una transfusin de un donante Rh+ o despus de un embarazo. La madre Rh- se sensibiliza por los eritrocitos Rh+ del primer hijo, produciendo anticuerpos anti-Rh. El segundo embarazo de un nio Rh+ produce un aumento masivo de anticuerpos, que pasan a travs de la placenta y aglutinan los glbulos rojos del nio.

Este sistema revel la explicacin de una enfermedad hemoltica que se produce en el recin nacido, la eritroblastosis fetal, adems de las reacciones de aglutinacin que ocurran en transfusiones de sangre entre personas del mismo tipo respecto al sistema AB0.

Las bases genticas del sistema Rh son complejas, al estar constituido por un gran nmero de antgenos eritrocitarios distintos. Este sistema est codificado por tres loci muy prximos entre s (C, D, E y sus recesivos respectivos c, d, y e) en el brazo corto del cromosoma 1. Cada uno de los alelos produce un antgeno y los anticuerpos correspondientes aparecen para todos menos para el d.

El alelo D, es de un inters primordial al ser el responsable de la codificacin del antgeno D que es muy antignico y provoca la sensibilizacin. Es por esto que para fines prcticos las personas se consideran Rh+ si poseen el antgeno D y Rh- si carecen del antgeno D segn la siguiente tabla:

GenotipoAntgenoRh

DDD+

DdD+

dd--

Posteriormente se han descrito otros grupos sanguneos tales como los sistemas Kell, Diego, Kidd, P de herencia autosmica y el Xg ligado al cromosoma X. Estos sistemas no son de gran importancia en las reacciones de aglutinacin postransfusin pero pueden ser utilizados como marcadores genticos tiles para la exclusin de posible paternidad, determinacin del grado de histocompatibilidad etc.

Protocolo

Sistema AB0

La determinacin de grupos del sistema AB0 se efecta enfrentando los hemates problema con antisueros de especificidad conocida: anti-A, anti-B y anti A,B (grupo 0). La aglutinacin o no aglutinacin de los hemates ensayados frente a cada uno de los antisueros es indicativa de la presencia o ausencia de los correspondientes antgenos en los mismos.

1.- Dividir un porta en cuadrados. Rotular las divisiones: anti-A, anti-B y anti-AB.

2.- Con una lanceta estril realizar una puncin en el cuarto dedo de una mano.

3.- Depositar en cada cuadrado una gota muy pequea de la sangre a ensayar.

4.- Aadir 1 gota de cada antisuero en su respectivo cuadrado.

5.- Mezclar bien la sangre con el reactivo empleando palillos distintos para cada ensayo.

6.- Mover la placa lentamente por rotacin a temperatura ambiente. Examinar macroscpicamente la aparicin de aglutinacin a los 2 minutos.

Sistema Rh (anti-D)

La presencia del antgeno D se determina enfrentando los hemates problema, en un medio proteico alto, con suero anti-D. La aglutinacin o no aglutinacin de los hemates ensayados es indicativa de la presencia o ausencia del correspondiente antgeno en los mismos.

1.- Depositar una gota de suero anti-D sobre un porta rotulado.

2.- Sobre otro porta depositar una gota de Autocontrol Rh-hr CROMATEST.

3.- Aadir a cada porta 2 gotas de sangre de un tamao aproximado a la gota de suero en l depositada.

4.- Con palillos distintos mezclar reactivo y sangre de forma que cubran una extensin de unos 2 cm cuadrados.

5.- Colocar los portas sobre la lmpara visualizadora precalentada (45).

6.- Mover la lmpara lentamente con movimientos pendulares durante 2 minutos, observando macroscpicamente la aparicin de cualquier signo de aglutinacin .

Lectura

Reaccin negativa: ausencia de aglutinacin al cabo de los 2 minutos.

Reaccin positiva: aglutinacin visible a los dos minutos y ausencia de aglutinacin con el autocontrol. La reaccin positiva indicar cul es el antgeno presente en los eritrocitos (por ej. si sale aglutinacin en la casilla A el grupo sanguneo ser A).

Si los hemates presentasen aglutinacin en el Autocontrol, dar el resultado como no vlido.

Preguntas:

1.-Anotar los resultados obtenidos y deducir el genotipo genotipos posibles.

2.-Por qu se tiene en cuenta el grupo sanguneo de las series AB0 y Rh en las transfusiones y no la serie MN?

3.-Por qu el antgeno D define bsicamente al grupo Rh?

4.-Por qu el anlisis de los grupos sanguneos slo sirve en algunos casos para exclur la paternidad y no para asignarla?

5.-En qu casos la eritroblastosis fetal puede manifestarse en el primer embarazo asumiendo incompatibilidad Rh?

Respuestas:

Prctica 5b - Anlisis de un polimorfismo de ADN silencioso tipo VNTR.

Objetivo y material

En esta segunda parte de la prctica analizaremos las variaciones existentes entre los individuos a nivel de un locus genmico no codificante, es decir, un polimorfismo silencioso. Partiendo de sangre de los propios alumnos (y de muestras recogidas previamente de parientes de stos, en su caso), amplificaremos por PCR la regin de ADN a estudiar y compararemos los resultados de cada individuo. De este modo se espera observar la utilidad de este tipo de polimorfismos tanto para la identificacin de individuos como para estudiar su transmisin, bien con fines mdicos o legales.

Introduccin

El anlisis de polimorfismos en el ADN se ha convertido en una tcnica de enorme utilidad en Medicina, por lo que el nmero de polimorfismos silenciosos que se conocen en el genoma humano no deja de crecer. Los polimorfismos se determinan en base a su deteccin mediante tcnicas de biologa molecular, bien porque las variaciones en la secuencia de ADN crean o destruyen dianas para enzimas de restriccin (los llamados RFLPs), o porque implican un cambio en la longitud de ADN (inserciones o deleciones).

De especial inters en nuestro caso es el ADN repetitivo en tndem, como el ADN minisatlite y microsatlite, consistente en un nmero variable de copias en tndem de una corta secuencia de ADN (VNTR, "variable number of tandem repeats"). Los individuos nos diferenciamos por el nmero de repeticiones que presentamos en cada locus, nmero adems que transmitiremos a la descendencia de manera mendeliana.

El polimorfismo que analizaremos en esta prctica es el que se localiza en el locus D1S80, en el extremo distal del cromosoma 1p. Este locus contiene un VNTR. La secuencia que se repite en tndem tiene una longitud de 16 bp, y el nmero de repeticiones en cada alelo vara entre 14 y 41. La regin VNTR est flanqueada por secuencias de ADN muy conservadas, lo que permite utilizar unos cebadores complementarios a dichas secuencias para realizar una reaccin de PCR que nos amplifique dicha regin. El tamao de la regin amplificada depender del nmero de repeticiones, de modo que cada alelo podr distinguirse por su tamao. Esto se observar sometiendo el producto amplificado por PCR a una electroforesis en gel de agarosa y tiendo el ADN con bromuro de etidio.

Se han encontrado hasta la fecha 29 alelos distintos en este locus, lo que permite un poder de discriminacin de entre 0.95 y 0.98. Se trata pues de un polimorfismo que se incluye habitualmente en los anlisis con fines forenses. Sin embargo, para distinguir todos los alelos (que se pueden diferenciar unos de otros en tan solo 16 bp de longitud) se requieren tcnicas sofisticadas de electroforesis. En la presente prctica realizaremos una electroforesis de menor resolucin, lo que no nos permitir distinguir todos los alelos con exactitud, pero s observar la aparicin de los dos alelos de cada individuo y la diversidad existente en la poblacin.

El anlisis se realizar sobre el ADN de los propios alumnos. El ADN ser obtenido de una mnima cantidad de sangre, para mostrar cmo pueden obtenerse muestras analizables a partir de restos como una mancha de sangre en la escena de un crimen. A partir de esa muestra, se seguir un sencillo protocolo que bsicamente rompe las clulas y utiliza una resina que elimina todo lo que pudiera interferir con la amplificacin posterior del ADN, que permanece en el sobrenadante. A continuacin, ese sobrenadante con el ADN se aade a una mezcla de reaccin con los elementos necesarios para amplificar por PCR la regin genmica que queremos estudiar. Esto pondr de manifiesto la enorme fuerza de la tcnica, que permite obtener cantidades de ADN visibles en una electroforesis partiendo de pocos nanogramos de ADN total.

Al final de la prctica se analizarn los resultados conjuntos y se discutirn sus aplicaciones.

Protocolo

Puesto que la tcnica de PCR es muy sensible a la contaminacin con cualquier otro ADN, durante todo el proceso tendremos especial cuidado en tocar todo con pinzas o guantes y no poner en contacto muestras distintas.

Da 1

a) obtencin del ADN genmico total

1. - Utilizando un punzn estril, pinchar el dedo anular hasta que sangre. Con una pipeta, recoger cuidadosamente la sangre; con 5 l es suficiente, si sale ms, mejor. Pasarla a un tubo eppendorf.

2. - Aadir 1 ml de agua destilada. Mezclar bien, invirtiendo el tubo varias veces.

3. Centrifugar 1 minuto en la microcentrfuga. Recoger el sobrenadante con una pipeta y desechar. ATENCION: el precipitado apenas ser visible. Hay que recoger con una pipeta de 1 ml aproximadamente 960 l del sobrenadante, sin tocar ni remover el fondo del tubo.

4. Aadir 100 l de resina InstaGene. La resina estar en agitacin constante y cogeremos el volumen indicado utilizando una punta de boca ancha (azul). Mezclar.

5. Incubar a 56C 15 minutos.

6. Agitar el tubo en vortex a mxima potencia durante 10 segundos.

7. Incubar en bao hirviendo durante 8 minutos.

8. - Repetir la agitacin en vortex otros 10 segundos.

9. Centrifugar 2 minutos.

10.- Recoger 20 l del sobrenandate con cuidado de no coger la resina, que queda al fondo del tubo. Los pasaremos a otro tubo eppendorf de 0.2 ml en hielo que contiene 30 (l de la mezcla de PCR.

b) amplificacin de la regin de ADN que contiene el polimorfismo

1. - Tendremos en un tubo en hielo: 20 (l del sobrenadante con el ADN, y 30 (l de mezcla de PCR. La mezcla de PCR contiene todo lo necesario para la amplificacin de la regin concreta del genoma que queremos estudiar, excepto el enzima:

- cebadores especficos que se unirn a ambos lados de la regin VNTR.

- tampn, magnesio y sal adecuados para que funcione la polimerasa.

- deoxinucletidos (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), precursores del ADN de nueva sntesis.

2. - Aadir al tubo 0,5 l de la termopolimerasa, el enzima que llevar a cabo la sntesis del ADN a partir de los cebadores y tomando como molde el ADN del alumno.

3. - Meter la muestra en el termociclador debidamente programado para realizar 29 ciclos de desnaturalizacin del ADN (95C), renaturalizacin para que se unan los cebadores (65C), y polimerizacin del nuevo ADN (72C).

Da 2

1. - Recoger los tubos con las muestras amplificadas.

2. - Preparar un gel de agarosa al 1.5% en tampn TBE con bromuro de etidio. NOTA: el bromuro de etidio es un potente mutgeno. Manipular en todo momento con guantes.

3. - cargar en el gel 15-25 (l de la muestra con 3-5 (l de tampn de carga. Inclur en otros pocillos del mismo gel los controles de tamao adecuados.

4. - Realizar la electroforesis a 120V durante 90 minutos.

5. - Llevar el gel al transiluminador y obtener la imagen de los fragmentos de ADN.

6. - Analizar los datos obtenidos por todo el grupo.

Preguntas:

1. Analiza la imagen obtenida tras la electroforesis. Qu refleja el distinto tamao de las bandas de ADN que se observan en cada muestra?

2. Por qu se ven dos bandas? Si hay alguna muestra donde slo se vea una, explcalo.

3. En base a las diferencias observadas, comentar la utilidad de este polimorfismo para la identificacin de individuos, y sus aplicaciones mdicas y legales.

Respuestas:

PRACTICA 6

GENTICA DE POBLACIONESAplicacin de la ley de Hardy-Weinberg en la gentica de los grupos sanguneos (alelos mltiples)

Objetivo y material

1.- Calcular las frecuencias de los fenotipos de grupos sanguneos obtenidos en la prctica.

2.- Calcular las frecuencias allicas y genotpicas basndose en la ley de Hardy-Weinberg.

3.- Determinar si la poblacin est o no en equilibrio, y por qu.

El material utilizado sern los resultados obtenidos en la prctica 5(a).

Introduccin

G.H. Hardy y W. Weinberg definieron los principios bsicos de la herencia polignica y demostraron que en poblaciones en equilibrio las frecuencias (p y q) de los diferentes alelos de un gen (A y a respectivamente) permanecen constantes generacin tras generacin, siempre y cuando no se produzcan fenmenos de mutacin, seleccin, deriva gentica, migracin o deriva meitica. En el caso de dos alelos (A y a) si p es igual a la frecuencia del alelo A, y q la frecuencia del alelo a; entonces:

p + q = 1

(o lo que es lo mismo en porcentajes: el % p + el % q = 100%)

En poblaciones donde la fecundacin ocurre de forma aleatoria, las frecuencias para los distintos genotipos sern:

(espermatozoide)

p (A)(espermatozoide)

q (a)

(vulo) p (A)p2 (AA)pq (Aa)

(vulo) q (a)qp (aA)q2 (aa)

Es decir, que la distribucin de los genotipos de la generacin ser:

p2 + q2 + 2pq = 1

Esta frmula tambin se puede usar para calcular las frecuencias de los alelos A o a en la poblacin. En el caso de los grupos sanguneos AB0 existen 3 alelos del locus de la isoaglutinina (I). En este sistema A y B son codominantes, y ambos son dominantes respectos a 0. Este sistema tiene seis combinaciones genotpicas posibles: AA, A0, BB, B0, AB, 00.

Los individuos homocigticos AA y heterocigticos A0 son fenotpicamente iguales, lo mismo que los individuos BB y B0. Esto dar lugar a 4 combinaciones fenotpicas conocidas como A, B, AB y 0. La Ley de Hardy-Weinberg tambin se puede emplear en este caso para los tres alelos:

p (A) + q (B) + r (0) = 1

y las combinaciones genotpicas pueden calcularse por la siguiente ecuacin:

p2 (AA) + q2 (BB) + 2pq (AB) + 2qr (B0) + 2pr (A0) + r2 (00) = 1La ley de Hardy-Weinberg se cumplir slo en poblaciones que se encuentren en equilibrio. Uno de los requisitos para que esto ocurra es que el tamao de la poblacin sea suficientemente grande. Nosotros vamos a considerar al grupo de prcticas como una poblacin, y partiendo de los datos fenotpicos que hemos recogido para el grupo sanguneo AB0, calcularemos las frecuencias allicas suponiendo equilibrio Hardy-Weinberg. Sin embargo, lo ms probable es que el grupo de prcticas no represente una poblacin en equilibrio, dado su limitado tamao. Tras calcular las frecuencias allicas, estimaremos las frecuencias genotpicas y fenotpicas esperadas y cotejaremos esos datos con los obtenidos. Si no concuerdan, se puede deducir que la poblacin grupo de prcticas no est en equilibrio Hardy-Weinberg. Se comparar esta situacin con otros datos provenientes de poblaciones de mayor tamao que s estn en equilibrio.

Recogida de datos del grupo de prcticas (fenotipos sanguneos)

fenotipo

sanguneoantgenos presentes en eritrocitosAnticuerpos presentados en la sangre genotipos posibles n de estudiantes del tipo% del total del grupo prcticasfrecuencia fenotpica que representa

A

B

AB

O

Preguntas de la prctica:

1.- Calcular las frecuencias de los alelos A (p), B (q) y 0 (r) empleando la Ley de Hardy-Weinberg.

2.- Calcular las frecuencias genotpicas y fenotpicas esperadas, y compararlas con los datos obtenidos.

3.- Discutir si la poblacin est o no en equilibrio H-W, y por qu.Respuestas:

Y

X

12

11

10

9

8

5

4

3

2

21

22

20

19

18

17

16

15

14

13

6

7

1

B

C

D

E

F

G

A

Crs.

sexuales

116

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