Regulacion Enzimatica y Mecanismos de 1

Tipos de curvas de saturacin de una enzima por su sustrato120

100

cooperatividad positiva cintica de Michaelis Menten

v (U/mg prot)

80

60

40

cooperatividad negativa

20

0 0 2 4 6 8 10

[S] (mM)Rosario A. Muoz-Clares

Cooperatividad entre los sitios activos Enzimas con cooperatividad positiva La unin del sustrato es cada vez ms fcil a medida que la enzima se satura ms y ms. Dependencia de velocidad inicial vs [S] sigmoidal.

Enzimas con cooperatividad negativa La unin del sustrato es cada vez ms difcil a medida que la enzima se satura ms y ms. Dependencia de velocidad inicial vs [S] hiperblica aparente.

Rosario A. Muoz-Clares

Cooperatividad positiva entre los sitios alostricos

La unin del efector alostrico (inhibidor o activador) es cada vez ms fcil a medida que la enzima se satura ms y ms por eeste ligando. Dependencia sigmoidal de la velocidad inicial vs la concentracin del efector alostrico.


Curvas de saturacin sigmoidal por inhibidores y activadores

8

[S] = constante [E] = constante

10

cooperatividad positiva

8

v (U/mg prot.)

no cooperatividad4

v(U/mg prot)

6

6

sin cooperatividad

cooperatividad positiva2

4

[S] = constante [E] = constante

2

0 0 1 2 3 4

0 0 1 2 3 4 5

[Inhibidor] (mM)

[Activador] (mM)


ENZIMAS ALOSTRICAS CON COOPERATIVIDAD POSITIVA DE UNIN

Son enzimas oligomricas que poseen varios sitios activos y varios sitios alostricos y exhiben una cintica de saturacin por sus sustratos y/o efectores alostricos de tipo sigmoidal, resultado de una unin cooperativa de estos ligandos.


IMPORTANCIA FISIOLGICA DE LAS ENZIMAS ALOSTRICAS CON COOPERATIVIDAD POSITIVA DE UNIN Pueden ser reguladas por compuestos no anlogos del sustrato (retroinhibicin y retroactivacin). Permiten amplificar cambios pequeos en la concentracin de sus ligandos, tanto del sustrato como de los inhibidores o activadores, respondiendo con cambios grandes en la velocidad de la reaccin catalizada.


IMPORTANCIA FISIOLGICA DE LAS ENZIMAS ALOSTRICAS CON COOPERATIVIDAD NEGATIVA DE UNIN

Permiten amortiguar cambios grandes en la concentracin de ligandos, respondiendo con cambios pequeos en la velocidad de la reaccin catalizada.


Valores del cociente [S]90 / [S]10 Enzimas que siguen cintica Michaeliana [S]90/[S]10 = 81 Enzimas con cooperatividad positiva de unin [S]90/[S]10 < 81 Enzimas con cooperatividad negativa de unin [S]90/[S]10 > 81

Estos valores son igualmente vlidos para la saturacin por activadores o inhibidoresRosario A. Muoz-Clares

Saturacin sigmoidal por el sustrato(cooperatividad positiva)


ECUACIN DE HILL

Vmax [S]nH v =nH S0.5

+

nH [S]


Parmetros cinticos de la ecuacin de Hill

Vmax = velocidad lmite a la que tiende la reaccin cuando toda la enzima est saturada por el sustrato. S0.5 = concentracin de sustrato a la que se alcanza la mitad de la Vmax, es decir, el 50% de saturacin de la enzima por el sustrato (no confundir con Km que es un parmetro que slo existe cuando la cintica de saturacin es Michaeliana). nH = nmero de Hill, que indica el tipo y el grado de cooperatividad en la unin del ligando.Rosario A. Muoz-Clares

Valores del nmero de Hill (nH)

nH > 1 nH = 1 nH < 1

cooperatividad positiva no cooperatividad cooperatividad negativa


Significado del nmero de Hill (nH)En la cooperatividad positiva Si se conoce el nmero de sitios de unin que posee la protena para el ligando, indica el grado de cooperatividad que existe entre los sitios para unirlo. El mximo valor que puede alcanzar nH es igual al nmero de sitios de unin que posee la enzima.

En la cooperatividad negativa Indica el grado de cooperatividad entre los sitios para unir al ligando.


TRANSFORMACIN LINEAL DE LA ECUACIN DE HILL

log

v (Vmax - v)

= nHlog[S] nHlogS0.5


Transformacin lineal de la ecuacin de Hill2

Log(v/(Vmax-v))

1

0

-1

-2

nH es la pendiente de la recta logS0.5 es la abscisa en el origen (cuando el eje y vale cero)

-3

LogS0.5

Log[S]Rosario A. Muoz-Clares

Mecanismos de regulacin enzimtica

Regulacin de la cantidad de la enzima

Regulacin de la actividad de la enzima


Mecanismos de regulacin de la cantidad de las enzimas Regulacin transcripcional Sntesis de RNAm Maduracin y vida media del RNAm

Regulacin traduccional Sntesis de la protena

Regulacin postraduccional Degradacin de la protenaRosario A. Muoz-Clares

REGULACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA Regulacin por molculas o iones Sustratos, productos, cofactores inhibidores, activadores, pH

Regulacin por modificacin qumica: Irreversible Zimgenos

Reversible Adicin de un grupo qumico Oxidacin-reduccin de cistenas

Regulacin por localizacin intracelular IsoenzimasRosario A. Muoz-Clares

Regulacin de la actividad de la enzima por proteolisis limitada Consiste en la hidrlisis de uno o pocos enlaces peptdicos especficos en la molcula precursora. Produce formas activas a partir de precursores inactivos (zimgenos). Requiere una proteasa especfica. Ejemplos de enzimas as reguladas: Proteasas digestivas Proteasas en la ruta de coagulacin de la sangre Proteasas en la ruta de muerte celular programada (apoptosis)


ZIMGENOS Formas inactivas de enzimas que son convertidas a las formas activas por proteolisis en sitios especficos. En general son enzimas proteolticas que de sintetizarse activas produciran daos a la clula. Se activan una vez fuera de la clula que las produce (caso de las enzimas proteolticas digestivas o las que desencadenan la cascada para la coagulacin de la sangre) o cuando deben llevar a la muerte celular (caso de las caspasas en apoptosis).


FORMACIN DE QUIMOTRIPSINA

Modificacin qumica reversible por adicin de un grupoRequiere: Molcula donadora que aporte el grupo que modifica a la enzima. Enzima que catalice la reaccin de modificacin. Enzima que catalice la reaccin de prdida de la modificacin.Rosario A. Muoz-Clares

Modificacin qumica reversible por fosforilacin

Modificaciones qumicas reversibles

Modificacin qumica reversible por oxidacin-reduccin de cistenas vecinasOxidantesSH SH (O2, H202, radicales libres, etc) S S

Reductores(DTT, 2-mercaptoetanol, glutatin, tiorredoxina, etc)

Cistenas vecinas

Disulfuro


ISOENZIMAS

Protenas que en un organismo catalizan la misma reaccin pero estn codificadas por genes diferentes. Difieren en sus propiedades cinticas. Se expresan diferencialmente en diferentes tejidos, organelos o estados fisiolgicos o patolgicos.


DEPENDENCIA DE LA CONSTANTE DE VELOCIDAD DE LA TEMPERATURAS

k P

v = k [S] = k [X] Keq = [X] / [S] [X] = Keq [S] G = -RT ln Keq Keq = e- G /RT v = k Keq [S] = k e- G /RT [S]

k = k e- G /RTRosario A. Muoz-Clares

DETERMINACIN DE LA ENERGIA DE ACTIVACIN

k = k e- G /RT Lnk = Lnk - G/RTGraficar Lnk vs. 1/T Pendiente = - G/REn el caso de las reacciones catalizadas graficar Lnkcat o LnVmaxRosario A. Muoz-Clares

DETERMINACIN DE LA ENERGIA DE ACTIVACIN4.0 3.8 3.6 3.4

LnVmax

3.2 3.0 2.8 2.6 2.4 2.2 2.0 1.8 3.15 3.20 3.25 3.30 3.35 3.40

m = -Ea / R

3.45

3.50

3.55

1/T (K-1)Rosario A. Muoz-Clares

Determinar en cunto tiene una enzima que disminuir la energa de activacin de la reaccin no catalizada para incrementar esta velocidad 106 veces sin modificar ni la concentracin de sustratos ni la temperatura, 25 oC, a la que se lleva a cabo la reaccin. Discuta sus resultados. vc/vnc = 106 vc/vnc = kc / knc kc = k e- Gc /RT knc = k e- Gnc /RT vc/vnc = e (-Gc + Gnc)/ RT Ln106 = (Gnc - Gc) / RT Gnc - Gc = Ln106 RT Gnc - Gc = 13.8 x 1.987 cal K -1 mol-1 x 298.15 K = 8.175 cal mol-1 LA ENERGIA DE~ DOS PUENTES DE H!!!Rosario A. Muoz-Clares

Mecanismos de catlisis enzimtica

DISMINUCIN DE LA ENERGA DE ACTIVACIN DE LA REACCIN CATALIZADA CON RESPECTO A LA NO CATALIZADA


Mecanismos de las enzimas para disminuir la energa de activacin de la reaccin catalizada Disminuir la entropa de activacin mediante efectos de proximidad, orientacin e inmovilizacin de los reactivos. Estabilizar el estado de transicin. Desestabilizar el complejo enzima-sustrato. Incrementar el nmero de pasos de la reaccin, cada uno de ellos con una menor energa de activacin que el(los) paso(s) de la reaccin no catalizada.Rosario A. Muoz-Clares

EFECTOS DE INMOVILACIN


ANTICUERPOS CATALTICOS

Los anticuerpos obtenidos frente a un compuesto anlogo del estado de transicin de una reaccin catalizan esta reaccin al unirse al estado de transicin ms que al sustrato de la reaccin.


Tipos de catlisis enzimtica

CATLISIS CIDO-BSICA CATLISIS ELECTROSTTICA CATLISIS COVALENTE CATLISIS POR IONES METLICOS


Catlisis cido-bsica La catlisis cida general consiste en la transferencia de un protn desde un residuo de la enzima, que se comporta como un cido de Bronsted, al sustrato o intermediarios de la reaccin, disminuyndose as la energa libre del estado de transicin. La catlisis bsica general consiste en la transferencia de un protn desde el sustrato o intermediarios de la reaccin a un residuo de la enzima, que se comporta como una base de Bronsted, disminuyndose as la energa libre del estado de transicin. Si se dan ambos tipos de catlisis se tiene una catlisis cidobsica concertada.Rosario A. Muoz-Clares

Catlisis electrosttica La enzima estabiliza intermediarios o estados de transicin de la reaccin por neutralizacin de cargas gracias a la disposicin espacial en el sitio activo de residuos con carga opuesta. En otros casos la distribucin de cargas en el sitio activo sirve para guiar a sustratos cargados o polares a sus sitios de unin.


Catlisis covalente La enzima forma transitoriamente un enlace covalente con el sustrato. La catlisis covalente consiste en tres pasos sucesivos: Ataque nucleoflico de la enzima sobre el sustrato (formacin del enlace covalente). Toma de electrones por el catalizador u otro sustrato (formacin del producto). Separacin del producto de la enzima (ruptura del enlace covalente, generalmente por hidrlisis).


Pasos en la hidrlisis de un enlace peptdico por la quimiotripsina1. Activacin del grupo hidroxilo de la serina cataltica por abstraccin de un H+ que pasa a la histidina cataltica. La carga positiva deslocalizada del imidazol es neutralizada por la carga negativa del asprtico cataltico. 2. Unin especfica de la regin de la cadena polipeptdica que contiene el enlace que va a ser hidrolizado (un enlace en el que el carbonilo sea aportado por un residuo de aminocido aromtico). 3. Ataque nucleoflico de un in de la serina del sitio activo sobre el carbono del carbonilo del enlace peptdico que se va romper y formacin de un enlace covalente del sustrato con la enzima. En este intermediario el carbono del enlace peptdico pasa de ser trigonal (planar) a tetradrico.Rosario A. Muoz-Clares

Pasos en la hidrlisis de un enlace peptdico por la quimiotripsina4. Ruptura del enlace peptdico: El carbono del enlace peptdico pasa de ser tetradrico a trigonal (planar). Se libera un fragmento de la cadena polipeptdica que recibe un protn de la histidina cataltica para formar el grupo amino terminal de este fragmento saliente. Queda el otro fragmento de la cadena polipeptdica an unido covalentemente a la enzima. 5. Activacin de una molcula de agua por abstraccin de un H+ que pasa a la histidina cataltica. La carga positiva deslocalizada del imidazol es neutralizada por la carga negativa del asprtico cataltico.


Pasos en la hidrlisis de un enlace peptdico por la quimiotripsina

6. Ataque nucleoflico del in hidroxilo sobre el carbono del carbonilo formndose de nuevo un intermediario tetradrico. 7. Ruptura del enlace que este carbono formaba con la serina cataltica: El carbono pasa de nuevo a planar (doble enlace con el oxgeno). La histidina cataltica cede un protn a la serina facilitando la liberacin del otro fragmento de la cadena polipeptdicacon su grupo carboxilo terminal libre. La enzima regresa a su estado inicial.


Estabilizacin del intermediario tetradrico en la hidrlisis de un enlace peptdico por la quimotripsina Ocurre por el movimiento que sufre la regin del sustrato unida al sitio activo cuando el carbono del enlace peptdico que va a romperse pasa de planar a tetradrico. El oxgeno ocupa entonces una posicin que le permite formar dos nuevos puentes de hidrgeno con residuos de aminocidos del sitio activo. Un tercer puente de hidrgeno se forma entre un NH de la cadena polipeptdica que va a romperse y un CO de la cadena polipptidica de la enzima. La estabilizacin de este intermediario por estos tres puentes de hidrgeno es un factor muy importante en la catlisis de esta enzima. La diferencia de actividad entre el quimotripsingeno y la quimotripsina se debe a que la conformacin del sitio activo en el primero no permite la formacin de estos puentes de hidrgeno con el intermediario tetradrico.Rosario A. Muoz-Clares

Funciones de los iones metlicos en la catlisis enzimtica Mediar reacciones de xido-reduccin. Hacer de puente entre sustratos o coenzimas y el sitio activo. Neutralizar cargas negativas de los intermediarios o estados de transicin. Promover la catlisis nucleoflica mediante la ionizacin del agua.Rosario A. Muoz-Clares

Funciones de los iones metlicos en la catlisis enzimtica Mediar reacciones de xido-reduccin Transferencia de electrones


Funciones de los iones metlicos en la catlisis enzimtica Hacer de puente entre sustratos o coenzimas y el sitio activo Algunos compuestos necesitan formar un complejo con un metal, generalmente Mg2+, para as poder unirse al sitio activo de la enzima. Ejemplo de ellos son los nucletidos ATP y ADP que forman complejos con Mg2+ muy estables. El verdadero sustrato de las reacciones en las que participan no es el nucletido libre sino el complejo nucletido- Mg2+.


Funciones de los iones metlicos en la catlisis enzimtica

Neutralizar cargas negativas en intermediarios o estados de transicin. Aunque los sustratos de la reaccin sean neutros, durante el transcurso de la reaccin pueden surgir intermediarios o estados de transicin con cargas negativas que son estabilizados por un ion metlico, generalmente Mg2+, facilitando de esta forma el avance de la reaccin hacia el producto.


Funciones de los iones metlicos en la catlisis enzimtica Promover la catlisis nucleoflica mediante la ionizacin del agua. El ion hidroxilo es un buen agente nucleoflico pero su concentracin en un medio acuoso a pH neutro es muy baja. Ciertos metales, muy frecuentemente Zn2+, que son grupos prostticos del sitio activo de algunas enzimas estn coordinados a una molcula de agua y de esta forma aumentan notablemente su acidez, permitiendo as que el agua est como ion hidroxilo a pH neutro. La funcin de este metal es por ello incrementar la concentracin de iones hidroxilo en el sitio activo de la enzima que usa a este ion como agente nucleoflico en la catlisis. Ejemplos: anhidrasa carbnica, carboxilasa C.Rosario A. Muoz-Clares

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