El mecanismo molecular que subyace en el potencial hepatoprotector de Moringa oleifera extracto de hojas contra el acetaminofeno hepatotoxicidad inducida en ratones

Reflejos•El mecanismo molecular de la hepato-protección por MO hojas se examinó extracto.

•MO extracto de manera efectiva inhibió CYP 450 enzimas nivel en APAP intoxicado ratones.

•También regulados hasta NRF-2 / sistema y enzimas antioxidantes hepáticos elevados están.

• Ellos efectivamente modulan el nivel de citoquinas hígado y frenan la inflamación hepática.

•Así, los ratones MO tratadas mostraron la arquitectura hepática bien preservada.

AbstractoMoringa oleifera (MO) es ubicuo en la naturaleza con un alto valor nutricional y medicinal. Numerosos estudios han informado de su notable actividad contra una serie de complicaciones clínicas, como hepatotoxicidad, pero no hubo informes significativos sobre su mecanismo de acción hepato-protectora. En este estudio, hemos evaluado y ha establecido el mecanismo molecular subyacente de la actividad hepatoprotectora del extracto de hojas de MO contra hepatotoxicidad inducida por el acetaminofeno. A continuación, se analizó el impacto de las diferentes dosis de extracto de hojas de MO en CYP 450 isoenzimas, sistema antioxidante NRF-2 / sus enzimas y citoquinas inflamatorias en el tejido del hígado de los ratones Balb / c tratados con alta dosis de APAP. El extracto de hojas de MO dependiente de la dosis se redujo el nivel de CYP 450 isoenzimas y también regulada hasta el sistema antioxidante NRF-2 y niveles debidamente elevados de las enzimas antioxidantes en el hígado. Además de su efecto modulador sobre los Niveles citoquinas suprime activamente la inflamación y exhibió un tejido hepático bastante conservado.

Palabras clave Enzima antioxidante ; Elemento de respuesta antioxidante (ARE) ; El citocromo P450 2E1 / 1A2 / 2A6 ;

Las citoquinas inflamatorias ; factor relacionado-2 factor de eritroide Nuclear 2 (Nrf2)

abreviaturas MO , Moringa oleifera ; APAP , acetaminofeno ; GSH , glutatión ; Nrf2 , factor nuclear eritroide 2 factor de 2 relacionado ; CYP 450 , citocromo P450 ; NAPQI , N-acetil-p-benzoquinoneimina ; ARE , elemento de respuesta antioxidante ; Nqo1 , NAD (P) H: quinona oxidorreductasa 1 ; Ho-1 , hemo oxigenasa-1 ; GCL M , cisteína ligasa subunidades modificadoras gamma-glutamato ; GSTA2 , glutatión S-transferasa alfa 2 ; HMGB1 , caja de alta movilidad de grupo 1 ; TLR , los receptores tipo toll

1. IntroducciónEl acetaminofeno (APAP) sobredosis es la principal causa mundial de la insuficiencia hepática aguda y hepatotoxicidad inducida por fármacos ( Fontana, 2008 ). APAP tiene un perfil de seguridad excelente en la dosis terapéutica y provoca hepatotoxicidad en sobredosis, ya sea debido al abuso de drogas / terapia combinatoria ( FDA, 2014 ). La idea de un mecanismo molecular APAP representa que en dosis terapéutica normal, la mayoría del fármaco se glucuronizado o sulfatado y después se excreta a través de la bilis. Una cantidad menor del fármaco se convierte en metabolito tóxico que también se desintoxica fácilmente por conjugación con el glutatión (GSH) ( Nelson, 1990 ). En caso de sobredosis APAP, la mayoría del fármaco es convertido por el citocromo P450 (CYP 450) enzimas para el metabolito tóxico reactivo, N-acetil- p -benzoquinoneimine (NAPQI), que agota nivel GSH y de forma covalente se une a las otras proteínas celulares e inducir la muerte de los hepatocitos provocando así las señales inflamatorias que se extienden más allá del insulto y da como resultado la muerte celular necrótica / insuficiencia hepática aguda ( Dahlin y otros, 1984  y  James et al, 2003 ) ( Fig. 1A ). Ha sido bien documentado que las múltiples formas de CYP 450 enzimas, incluyendo CYP1A2, CYP2E1, CYP2A6 han sido identificadas como las enzimas que metabolizan APAP. Entre ellos CYP2E1 y CYP1A2 se informaron como las principales enzimas implicadas en la bioactivación APAP en los seres humanos y roedores, después de más de la dosis ( Shayiq et al, 1999 , Yang et al, 2014  y  Yao et al, 2015 ). Del mismo modo, CYP2A6 también fue demostrado estar involucrados en la oxidación de APAP, a su metabolito principal no tóxico (3-OH-APAP) y metabolito tóxico secundario

(NAPQI), donde se observó la tasa de formación de 3-OH-APAP a ser de 3 veces más rápido que NAPQI, por lo tanto representa indicativo el importante papel de CYP2A6 en APAP sobredosis ( Chen et al, 1998  y  Kalsi et al, 2011 ). Factor de transcripción Por otro lado, como un mecanismo de protección mediada la tensión factor nuclear eritroide 2 factor relacionado 2 (Nrf2) se une al elemento de respuesta antioxidante (ARE) y activa la transcripción de reguladas por genes diana tales como NAD (P) H : quinona oxidorreductasa 1 (Nqo1), hemeoxygenase-1 (HO-1), las subunidades de modificadores de cisteína ligasa gamma-glutamato (GCLM), glutatión S-transferasa alfa 2 (GSTA2), y por lo tanto ejerce una influencia en varias etapas que incluyen ROS de lavado, homeostasis del GSH, el estrés del sistema antioxidante, y metabolitos vías de flujo de salida ( Aleksunes y Manautou, 2007 ). Actualmente, el tratamiento más eficaz para la sobredosis de acetaminofén es la N-acetilcisteína (NAC), un precursor de GSH ( Kanter, 2006 ). NAC repone nivel de glutatión y mejora la recuperación hepática. Sin embargo, NAC necesita ser determinado dentro de 12 a 24 horas de la ingestión APAP, indicando de este modo las limitaciones de tiempo después de su aplicación. Por otra parte, la inversión del nivel de GSH también podría no ser suficiente para detener el progreso de la hepatotoxicidad inducida por APAP (Dawson et al, 1989 , Delanty, Fitzgerald, 1996  y  Goldring y otros, 2004 ). Esto lleva a los médicos / industrias farmacéuticas en la exploración para una terapia segura y eficaz alternativa frente a la toxicidad APAP.

Fig. 1. Panel A: fases clave de hepatotoxicidad inducida APAP: elevación de la actividad de las enzimas del citocromo p450 conducen a la configuración del metabolito tóxico reactiva (NAPQI), GSH y el agotamiento antioxidante, la unión de los excedentes NAPQI con las otras proteínas celulares, alteración de la función de los orgánulos celulares covalente, conducen a la muerte celular necrótica, provocado la inflamación, el desequilibrio del nivel de ROS / RNS, elevado estrés oxidativo, la activación de la NRF-2 / ARE sistema. Grupo B : Los principales componentes bioactivos de Moringa oleifera hojas, sosteniendo altas propiedades terapéuticas que supuestamente actúan contra la hepatotoxicidad inducida APAP.Figura opciones

Moringa oleifera Lam es un conocido especie ampliamente distribuida de la familia Moringaceae, y tiene un alto valor nutricional y una notable variedad de propiedades terapéuticas. MO hojas se han notificado a ser una rica fuente de micro y macronutrientes, alimentando de este modo tanto animal como humana como un excelente complemento nutritivo ( Siddhuraju & Becker, 2003 ). Hojas MO se han utilizado duradera como fuente medicinal tradicional y empleadas para el tratamiento de muchas enfermedades, por lo tanto acuñado como "el árbol de milagro." Está enriquecido con muchos compuestos bioactivos tales como kaempferol, ramnetina, quercitina, ácido clorogénico, rutina, apigenina ( Ezuruike, Prieto, 2014  y Karthivashan et al, 2013 ) ( Fig. 1B ). A continuación, las hojas se han estudiado por sus diversas propiedades terapéuticas, tales como antimicrobianos, anti-inflamatorios, anti-cáncer, efectos anti-diabéticos ( Anwar et al, 2007  y  Coppin et al, 2013 ) y recientemente ha sido evaluada por sus efectos hepatoprotector ( Das et al, 2012  y Sharifudin et al, 2012 ). Sin embargo, la mayor parte de los estudios mencionados se han centrado en la evaluación de su eficacia, pero no a su mecanismo de acción a nivel molecular. Así, en este estudio se investigó el efecto terapéutico de MO se va contra la hepatotoxicidad inducida APAP mediante la exploración de su efecto modulador sobre las enzimas del citocromo P450, NRF-2 / ARE sistema, enzimas antioxidantes y citoquinas inflamatorias estableciendo así el mecanismo de acción subyacente en su nivel molecular. Esto mejoraría e iluminar el conocimiento sobre el desarrollo de las hojas MO / sus candidatos bioactivos en el campo de la investigación clínica / translacional.

2. Materiales y métodos2.1. Productos químicos y reactivos

El acetaminofén, la silimarina, leche en polvo descremada se adquirieron de Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.). Los anticuerpos primarios contra CYP2E1, CYP1A2, β-actina y HRP-conjugado con anticuerpos secundarios apropiados se obtuvieron de Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX, EE.UU.) y anti-CYP2A6 se obtuvo de Abcam (Cambridge, MA, EE.UU.). reactivos de detección de transferencia Western ECL (kits) y membrana de PVDF eran de Pierce Biotechnology, Inc. (Rockford, IL, EE.UU.) y GE Healthcare Life Sciences (Pittsburgh, PA, EE.UU.), respectivamente. Todos los kits de marcadores de la función hepática y kits de ensayo de enzimas antioxidantes se compraron de Roche Diagnostics (Mannheim, Baden-Wurttemberg, Alemania) y la I + D (Minneapolis, MN, EE.UU.), respectivamente. tampón HEPES se obtuvo de Nacalai Tesque (Nakagyo-ku, Kyoto, Japón). reactivo Trizol y SsoAdvanced universal SYBR Green Supermix se obtuvieron de Life Technologies (Carlsbad, CA, EE.UU.) y Bio-Rad (Hercules, CA, USA), respectivamente. Los cebadores específicos de genes se obtuvieron a partir AIT Biotech (Parque de las Ciencias, Singapur). Todos los demás

productos químicos y reactivos utilizados se obtuvieron de Sigma a menos que se indique lo contrario.

2.2. Las hojas de la cosecha y la extracción

MO hojas se recogieron de Jardín-2, Universidad Putra Malasia y se han confirmado lo mismo con la muestra de vales (SK 1561-08) que ha sido depositado en la unidad de IBS Herbario. Las hojas se lavaron, se secaron al aire a temperatura ambiente (24 ° C) durante 12 h y luego se secó en estufa a 45 ° C durante 2 días consecutivos, tierra usando un mezclador y se almacena en un recipiente hermético para más procesos.Se preparó extracto hidro-etanólica (etanol: agua destilada, 90:10 [90%]), seguido de maceración de M. oleifera hojas de polvo en una botella aspiradora durante 3 días a temperatura ambiente con agitación continua. El residuo se filtró y se condensó utilizando un evaporador rotatorio a 40 ° C. El restante se liofilizó, se pesó y se almacenó a -20 ° C para su posterior análisis ( Karthivashan et al., 2013 ).

2.3. animales de experimentación y diseño

Los ratones Balb / c macho, 10-12 semanas de edad (25-30 g) se aclimataron durante 1 semana en una casa de animales (26 ± 2 ° C) con 12 h programa de iluminación diaria. Fueron alimentados con excrementos de roedores estándar y se proporcionó agua ad libitum . Todos los experimentos con animales se realizaron con la aprobación (UPM / CICUAL / PUA-17/2013) y las directrices del IACUC (Institucional Cuidado de Animales y el empleo) directrices éticas estándar, Facultad de Medicina y Ciencias de la Salud, Universidad Putra Malasia, Malasia.En el día 8, después de la aclimatación, los ratones fueron separados al azar en cinco grupos, con seis animales por grupo (n = 6). Grupos 2, 3, 4 y 5 recibieron una dosis tóxica de APAP (400 mg / kg de peso corporal por disolución en solución salina caliente) seguido de la administración de solución salina, la silimarina (100 mg / kg de peso corporal), MO deja extractos (100 mg / kg y 200 mg / kg de peso corporal), respectivamente, una hora después de la administración de la dosis letal de APAP. Grupo 1 se le administró solución salina, tanto para las sesiones. Dado que la administración de APAP, los ratones se mantuvieron en ayunas durante 24 h para inducir toxicidad y se sacrificaron usando éter dietílico. Las muestras de sangre se obtuvieron rápidamente por punción cardíaca y el suero se preparó y se almacenan en -20 ° C. Se recogió el hígado, se congelaron inmediatamente y se almacena a -80 ° C, y una parte de ellos se fijaron en formalina al 10%.

2.4. Los análisis bioquímicos séricos

Los marcadores de la función hepática, incluyendo la aspartato aminotransferasa (AST), alanina aminotransferasa (ALT) y gamma-

glutamil transpeptidasa (GGT) en los niveles en suero se midieron mediante kits comerciales de Roche Diagnostics acuerdo con los protocolos del fabricante.

2.5. histología hepática

El lóbulo medio del hígado de cada grupo se retiraron y se fijaron en 10% de formalina y embebidos en parafina, cortado en 5 micras de grosor y se tiñeron con hematoxilina y eosina. Necrosis se puntuó de 0 a 3 cuando está presente en 0, 0-25, 25-50, o 50% y por encima del campo, respectivamente. Al menos tres campos por sección se examinaron bajo 4 de ampliación y los datos se expresan como las puntuaciones medias por grupo experimental. Otras modificaciones patológicas tales como la inflamación, núcleos picnóticos y la congestión sinusoidal, también se observaron y notificados. Los cambios patológicos en los tejidos del hígado se examinaron y fotografiaron usando un microscopio Olympus (BX-51; Olympus, Tokio, Japón).

2.6. Medición del estrés oxidativo hepático y marcadores inflamatorios

El tejido de hígado congelado se descongeló y se homogeneizó con solución salina enfriada en hielo y se centrifugó, y los sobrenadantes se ensayaron de acuerdo con las instrucciones del kit. kits Biovision de investigación (Milpitas, CA, EE.UU.) se utilizaron para cuantificar la actividad de la peroxidasa lipídica sobre la base de la formación de aductos de MDA-TBA y la actividad de las enzimas antioxidantes del Cayman Chemical Company (Ann Arbor, MI, EE.UU.) para la SOD, CAT y GPx. Los niveles de hígado pro-inflamatorias (TNF-α, IL-1β, IL-6) y citocinas antiinflamatorias (IL-10) en los homogeneizados de tejido hepático se determinaron utilizando kits de ELISA disponibles en el mercado, de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes I + D.

2.7. La cuantificación de proteínas y Western Blot

Los tejidos del hígado congelados se descongelaron y se homogeneizaron en tampón HEPES 20 mM, 10 s dos veces usando un homogeneizador de mano Ruptor Tissue (Qiagen, Venlo, LI, Países Bajos). Además los homogeneizados se centrifugan a 14.000  g durante 15 min a 4 ° C y se determinó la concentración de proteínas utilizando Pierce 660-nm kit de ensayo de proteínas (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EE.UU.). 30 g de proteína lisados se realizaron en 10% SDS-PAGE y se transfirieron por electroforesis a una membrana de PVDF (GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA, EE.UU.). Las membranas se bloquearon a continuación durante 1 h usando 5% de leche desnatada en polvo (Sigma-Aldrich) en PBS y se sondaron durante la noche con anticuerpos primarios dirigidos contra CYP2E1 (1: 1000), CYP1A2 (1: 2000), CYP2A6 (1: 1000) y el servicio de limpieza proteína β-actina (1: 2000) a 4 ° C, seguido de la incubación con peroxidasa de rábano (HRP)

conjugado con anticuerpos anti-conejo o anti-ratón de 1 h a temperatura ambiente. Las señales se detectaron por reactivos de detección ECL que fueron escaneados con el analizador ChemiDoc Sistema MP ™ bio-formación de imágenes (Bio-Rad) y las densidades ópticas relativas se cuantificaron utilizando el software Image-J. Todos los grupos de tratamiento se cuantificaron en relación con el grupo de control, como el estándar (con el valor de 1,0) y se transportan como expresión veces en relación.

2.8. Extracción de ARN total y el análisis RT-PCR cuantitativa

ARN total fue extraído a partir de ratones hígado recogidos de diferentes grupos usando el reactivo Trizol (Life Technologies) según las instrucciones del fabricante. La concentración y pureza del ARN extraído se midieron por BioSpectrometer (Eppendorf, Hamburgo, Alemania), y el ADNc se sintetizó posteriormente de 1 g de ARN total usando la alta capacidad de cDNA Synthesis Kit con cebadores aleatorios (Life Technologies). La transcripción inversa se llevó a cabo de acuerdo con el siguiente protocolo: 25 ° C durante 10 min, 37 ° C durante 60 min y 85 ° C durante 5 min.

Cuantitativa en tiempo real PCR se llevó a cabo utilizando cebadores específicos del gen (AIT Biotech, Singapur) y SsoAdvanced universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Todos los cebadores utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 1 -PCR en tiempo real se realizó utilizando el CFX 96 Real-Time Sistema de Detección de PCR (Bio-Rad) con los siguientes pasos:. 95 ° C durante 2 min, 40 ciclos de 95 ° C durante 10 s, 60ºC durante 45 s y adquisición de señal fluorescente. La especificidad de la PCR en tiempo real fue confirmada por electroforesis en gel de agarosa (dirigido PCR tamaño del producto) y derretir análisis de la curva (pico de fusión único). La curva de fusión se realizó inmediatamente después de la finalización de PCR en tiempo real con el incremento gradual de la temperatura desde 70 ° C a 95 ° C; cada incremento se mantuvo durante 5 s, seguido de adquisición de señal fluorescente. Tres repeticiones biológica de cada grupo y 3 repeticiones técnica para cada muestra de hígado se realizaron en PCR en tiempo real.

Tabla 1.Las secuencias de cebadores usados en la cuantitativa en tiempo real PCR para el análisis de la expresión génica.

Gene

secuencia de cebador (5'-3 ') PCR tamaño del producto (pb)Adelante Marcha atrás

NRF-2 AGGACATGGAGCAAGTTTGG

TTCTTTTTCCAGCGAGGAGA 176

NQO1 GGTAGCGGCTCCATGTACTC

CATCCTTCCAGGATCTGCAT 173

Gene

secuencia de cebador (5'-3 ') PCR tamaño del producto (pb)Adelante Marcha atrás

HO-1 CACAGATGGCGTCACTTCGTC

GTGAGGACCCACTGGAGGAG 130

GCLM AATCAGCCCCGATTTAGTCAGG

CCAGCTGTGCAACTCCAAGGAC

197

GSTA2

CGCCACCAAATATGACCTCT CCTGTTGCCCACAAGGTAGT 232

β-actina

TCCTTCCTGGGCATGGAG AGGAGGAGCAATGATCTTGATCTT

207

opciones de la tablaCurva estándar para cada gen ( Tabla 1 ) se generó para asegurar la eficiencia de la PCR optimizada del ensayo. La expresión de los genes diana en el grupo de los grupos de tratamiento y de control se normalizó el uso de la casa de mantenimiento de genes β-actina y el pliegue del cambio en la expresión de cada gen diana se calculó por el 3.0 del software CFX Manager (Bio-Rad) utilizando la eficacia -Corregido método.

2.9. análisis estadístico

Los resultados se expresan como media ± SEM. El análisis estadístico se realizó mediante el uso de una prueba t de Student independiente, el análisis de la varianza (ANOVA) con la prueba de Tukey post hoc según el caso. Un P -valor inferior a 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.

3. resultados3.1. MO deja hepatotoxicidad inducida por el extracto de atenuar APAP en ratones

Después de la administración de acetaminofeno, los ratones habían demostrado niveles elevados significativos de AST, ALT y GGT que indican el deterioro de las funciones del hígado y la incidencia de hepatotoxicidad ( Fig. 2A-C ). Esto se representa claramente en las fotografías histológicas de acetaminofeno ratones intoxicados con hepatocitos del hígado grave daño necrótico alrededor de la zona perivenular y la congestión sinusoidal ( fig. 3B 1 ). Sin embargo, el tratamiento de ratones con extracto MO tiene significativamente ( P  <  0,05) redujo el nivel de AST, ALT y GGT en comparación con los grupos que no se trataron con MO y se encontró que la disminución es dependiente de la dosis. Entre las diferentes dosis, los ratones tratados con la dosis más alta de MO extracto de hojas (200 mg / kg de peso corporal) exhibió significativa ( P  <  disminución 0,05) de la AST en suero, niveles de ALT y GGT y próxima a los efectos de la silimarina tratada (control positivo ) grupo. De conformidad, las fotografías histológicas de MO ratones tratados hígado a una dosis de 100 mg / kg de peso corporal

muestran un grado de reducción de área necrótica y declinó infracción ( Fig. 3C 1 ). Sin embargo, a una dosis mayor de 200 mg / kg de peso corporal ( Fig. 3D 1 ), MO conserva la arquitectura de hepatocitos centrolobulillar como iguales que el control positivo ( Fig. 3E 1 ) grupo y se parece mucho al grupo de tratamiento simulado ( Fig. 3A 1 ) . Posteriormente, la puntuación histología muestra un área reducida de manera significativa necrótica en MO (200 mg / kg de peso corporal) los ratones tratados en comparación con los ratones de APAP solamente administrados ( Fig. 3F 1 ). Estos resultados representan la forma indicativa papel hepatoprotector de hojas MO.

Fig. 2. Moringa oleifera hojas se deterioraron el efecto de la hepatotoxicidad inducida APAP. (A-C) representa el nivel de los marcadores bioquímicos séricos - AST, ALT y GGT. Western blot de los niveles de CYP2E1, CYP2A6 y CYP1A2 a partir de los homogeneizados de hígado de tratar; Moringa oleifera extracto de hojas [100 mg / kg y 200 mg / kg] y la silimarina tratados APAP ratones intoxicados. (A 1 ) Las masas moleculares aparentes indicadas de CYP2E1, CYP2A6 y CYP1A2 y β-actina (control interno) fueron de 64, 49, 54 y 43 kDa, respectivamente. (B 2 ) Su expresión veces en relación También se demostró. Los resultados son la media ± SEM de seis ratones. * P <0,05 comparado con el grupo control, $, #, ¥ P <0,05 comparado con el grupo administrado APAP.Figura opciones

Fig. 3. (A 1 -E 1 ) fotomicrografías representativas (20 ×) y (a 2 -E 2 ) fotomicrografías representativas (40 ×) de H & E-manchado secciones de hígado de ratones Balb / c que fueron: A 1, A 2 - sin tratar muestra Normal arquitectura histológica de la vena central (CV), la tríada portal (PT), sinusoide normal de la sangre (S), hepatocitos (H), el núcleo (N); B 1, B 2 - APAP administrado que muestra necrosis perivenular (PN) con infiltración inflamatoria (líneas de largo de puntos) asociado con la congestión sinusoidal (SC), núcleos picnóticos (PK),-de regenerativo (flecha) y cromatinas condensados con hepatocitos agrandados (diamante ) se observaron; C 1, C 2 - tratado con Moringa oleifera extracto de hojas de 100 mg / kg mostrando pocos núcleos picnóticos (PK), hepatocitos-de regenerativa (flecha), infiltración inflamatoria (líneas largas de puntos), congestión sinusoidal moderada (SC) y los hepatocitos binucleares regenerativas (flecha de puntos);D 1, D 2 - tratado con Moringa oleifera extracto de hojas de 200 mg / kg que muestra la arquitectura lóbulo hepático justo, hepatocitos más binucleares (flecha de puntos) en su fase regenerativa con el cambio hepática limitada incluyendo núcleos picnóticos (PK) y la congestión sinusoidal escasa; E 1, E 2 , - silimarina tratado mostrando conserva la estructura lóbulo hepático, hepatocitos maduros y hepatocitos binucleares mitótico (BN); F 1 - La puntuación de necrosis histología de los grupos mencionados anteriormente también se obtuvieron. Los valores se expresan como la media ± SEM de n = 6 ratones en cada grupo. * P <0,05 comparado con el grupo control, $, #, ¥ P <0,05 comparado con el grupo administrado APAP.Figura opciones

3.2. MO extracto de hojas suprime la actividad del citocromo P450 en ratones indujo APAP hepatotóxicos

Para examinar el impacto del extracto de hojas de MO en fase I (CYP 450) enzimas, los cambios en las expresiones de nivel de proteína de CYP2E1, CYP2A6 y se obtuvieron CYP1A2 y ejemplifican en la Fig. 2A 1 y la expresión relativa pliegue de proteínas de los grupos tratados se compararon con el grupo de control como punto de referencia (valor de 1,0) y se muestran en la Fig. 2B 2 . En coherencia con los resultados de los biomarcadores séricos elevados, APAP hígados de ratones

intoxicados mostraron alta expresión de todas las tres isoformas CYP 450 y así explican su importante papel en la regulación de la hepatotoxicidad inducida APAP.De la Fig. 2B 2 , estaba claro que los hígados de ratones tratados mostraron extractos MO reducción dependiente de la dosis en la expresión de CYP2E1, CYP2A6 y CYP1A2. A la dosis de 100 mg / kg de peso corporal, grupo tratado MO exhibió menor de una supresión pliegue de todas las isoformas, mientras que a una dosis mayor de 200 mg / kg de peso corporal, grupo tratado MO exhibió mayor que 2 a 4 veces mayor de supresión todas las isoformas en comparación con APAP intoxicados ratones. Así, los resultados indican la naturaleza del CYP 450 inhibidor del extracto de hojas de MO.La silimarina (control positivo) grupo tratado también exhibió aproximadamente 2-4 veces la supresión de todas las isoformas, en comparación con ratones intoxicados APAP. Así, el extracto de hojas de MO suprime de manera efectiva la actividad del CYP450 en dosis más alta y exhibe una actividad similar a la del grupo de control positivo.

3.3. MO extracto de hojas mejora la expresión hepática de genes que regulan y restaurar su estado antioxidante, en APAP inducida ratones hepatotóxicos

La influencia del extracto de hojas de MO en el nivel de enzimas antioxidantes en los hígados de APAP administrado y se evaluó los ratones tratados MO. Las actividades de MDA, SOD, CAT y GP X en los tejidos del hígado de ratones administrados APAP se muestran en la Fig. 4A-D . Los ratones administrados con APAP mostró una elevación significativa en el nivel de MDA con 1,20 ± 0,12 nmol / mg de tejido en comparación con el grupo control, que es 0,95 ± 0,19 nmol / mg de tejido, mientras que, MO (200 mg / kg de peso corporal) y silimarina grupos tratados mostraron una disminución significativa (P <0,05) en el nivel de MDA con los valores que van alrededor de 0,98 ± 0,13 nmol / mg de tejido. Los hígados obtenidos de los ratones intoxicados con APAP mostraron disminución significativa en la SOD (54,70 ± 3,01 U / mg), CAT (66,67 ± 1,91 nmol / min / mg de proteína) y GP X (3,39 ± 2,09 nmol / min / mg de proteína ) en comparación con grupos de control que muestra los valores de 66,33 ± 7,02 U / mg, 84,93 ± 3,41 y 5,09 ± 2,41 nmol / min / mg de proteína, respectivamente (P <0,05). Por el contrario, la SOD, CAT y GP X actividades de los grupos tratados con el extracto de hojas de MO se han incrementado de forma dependiente de dosis como se muestra en la figura. 4B-D . A la dosis más alta (200 mg / kg de peso corporal), MO deja valores de extracto exhibido de 106,16 ± 7,01 U / mg, 77,47 ± 9,20 y 9,33 ± 3,20 nmol / min / mg de proteína de GP SOD, CAT y X actividades respectivamente, que fueron significativamente (P <0,05) más alta que la APAP intoxicado ratones hígado. La silimarina (control positivo) mostraron grupo tratado con SOD y GP X actividad de 89,50 ± 5,01 U / mg y 6,79 ± 4,01 nmol / min / mg de proteína, respectivamente. Sin embargo, a partir

de la Fig. 4B y D , estaba claro que el extracto de hojas de MO notablemente superado el nivel de SOD y GP Xactividad contra el grupo tratado silimarina. Estos resultados indican que los extractos de hojas de MO restaurar eficazmente el estado antioxidante de APAP ratones intoxicados hígado.

Fig. 4. Efecto dependiente de la dosis de Moringa oleifera (MO) extracto de hojas contra APAP ratones intoxicados hígado: [A] la actividad de la peroxidación lipídica (MDA); los niveles de enzimas antioxidantes endógenos ([B] -SOD, [C] -CAT y [D] -GPx). E - Efectos de Moringa oleifera (MO) extracto de hojas en la expresión de genes hepáticas relacionadas con genes antioxidantes mediadas NRF-2 en la hepatotoxicidad inducida por paracetamol en ratones hígado. La expresión de los genes diana se normalizó a ß-actina y el grupo tratado con

APAP que sirvió como se muestra control para la comparación como la media ± SEM; * P <0,05 en comparación con el grupo control, $, #, ¥ P <0,05 comparado con el grupo APAP.Figura opciones

Para investigar el mecanismo molecular implicado en los efectos antioxidantes del extracto de hojas de MO en el APAP ratones intoxicados hígado, la expresión de genes de las enzimas antioxidantes NRF-2, NQO1, HO-1, GCLM, Gsta2 fueron evaluados por QRT-PCR. Los resultados en la Fig. 4E mostró que los hígados de ratones tratados con una dosis mayor de MO extracto de hojas significativamente (P <0.05) expresa la expresión génica elevada de NQO1, HO-1, Gsta2, GCLM más o menos de cuatro a seis aproximadamente ocho veces los aumentos de plegado y NRF-2 en comparación con APAP intoxicado hígados de ratones. Como se preveía el efecto incremental de la MO extracto de hojas fue dosis dependiente. Así, estos resultados representan indicativo, que MO extracto de hojas eficazmente restaura el estado antioxidante en el hígado a través de la activación de la vía Nrf2-SE de señalización y por lo tanto frena la gravedad del daño hepático inducido por APAP.

3.4. MO extracto de hojas modula citoquinas pro / anti-inflamatorias y revela el papel hepatoprotector contra APAP inducida ratones hepatotóxicos

Más conocimiento sobre el mecanismo de acción de MO extracto de hojas contra los ratones intoxicado APAP se llevó a cabo mediante la evaluación de su impacto en la alteración de las citoquinas inflamatorias de nivel Fig. 5A-D y mediante la obtención de fotomicrografías histológicas de los cambios asociados en los tejidos del hígado ( Fig. 3A 2 -E 2 ). Los ratones APAP administrados mostraron una disminución significativa (P <0,05) Aumento en el nivel de citoquinas proinflamatorias TNF-a, IL-1, IL-6 con los valores de 451,25 ± 33,57, 299,27 ± 7,18, 347,21 ± 55,42 ng / mg de proteínas, respectivamente, y la supresión en el nivel de citoquina antiinflamatoria IL-10 con el valor de 58,49 ± 4,32 ng / mg. Esto se observa claramente en las fotomicrografías de histología ( Fig. 3B 2 ) con congestión sinusoidal (SC), necrosis perivenular y la inflamación, núcleos picnóticos (PK), los hepatocitos-de regenerativa. Por el contrario, MO deja dosis dependiente extracto modula el nivel de los marcadores inflamatorios.Grupo Precisamente, a la dosis de 200 mg / kg de peso corporal, MO tratada significativamente (P <0,05) suprimió el nivel de TNF-α, IL-1β, IL-6 con los valores de 324,16 ± 103,47, 84,27 ± 11,85, 187,51 ± 52,51 ng / mg de proteína, respectivamente, y mejorado el nivel de IL-10 con el valor de 151,98 ± 40,29 ng / mg de proteína. De la Fig.5A-D , estaba claro que el grupo tratado MO superó los efectos de la silimarina (control positivo) grupo tratado, que mostraba el nivel de TNF-α, IL-1β, IL-6 con los valores de 274.58 ± 33.57, 97.88 ± 32.12 , 198,72 ± 45,67 ng / mg de proteína, respectivamente, y el nivel de citoquina antiinflamatoria IL-10 con un valor de 114,36 ± 36,17 ng / mg de proteína. De acuerdo, las microfotografías de MO (200 mg / kg de peso corporal) tratadas y silimarina (control positivo) hígados de los ratones

tratados, mostraron una arquitectura histológica bien conservada de la vena central (CV), sinusoides sanguíneos normales y hepatocitos más binucleares en su regenerativa se observaron fase.

Fig. 5. Efecto modulador de Moringa oleifera (MO) extracto de hojas contra APAP intoxicado hígado citoquinas inflamatorias - [A] de TNF-α; [B] IL-1β; [C] IL-6; [D] IL-10. Los resultados se muestran como la media ± SEM; * P <0,05 en comparación con el grupo control, $, #, ¥ P <0,05 comparado con el grupo PCM.Figura opciones

4. DiscusiónHepatotoxicidad inducida APAP es la principal causa de insuficiencia hepática aguda inducida por fármacos (ALF), incluso en los países desarrollados. El antídoto actualmente existente, N-acetil cisteína es eficaz cuando son tratados en una fase temprana (limitación de tiempo), ya que restaura el agotamiento de GSH, un marcador clave inicial de toxicidad APAP. Sin embargo, el mecanismo molecular de APAP hepatotoxicidad implica varios otros marcadores clave, a través del cual la complicación puede limitarse eficazmente. Nuestro estudio anterior ha demostrado que la MO extracto de hojas de APAP hepatotoxicidad inducida aliviado con éxito a través de su naturaleza anti-oxidante y restauración de nivel de GSH ( Fakurazi et al, 2008  y  Sharifudin et al, 2012 ), y también informó de los compuestos bioactivos responsables de su actividad antioxidante enriquecido ( Karthivashan et al, 2015  y Karthivashan et al, 2013 ). Hasta la fecha, no existen informes definitivas sobre el mecanismo molecular de MO extracto de hojas contra APAP hepatotoxicidad. Por lo tanto, este estudio pretende demostrar la actividad hepatoprotectora del extracto de hojas de MO contra la toxicidad

inducida por la APAP, y para explicar el mecanismo molecular subyacente de la acción responsable de sus efectos. En este estudio, la administración de una dosis letal de APAP a ratones evidentemente inducidas daño hepático que fue confirmada a través de elevada expresión de CYP 450 enzimas, el agotamiento de los antioxidantes endógenos, el estrés oxidativo, la inflamación mediada y necrosis hepática. Para declarar el deterioro inducido por APAP, el nivel de los marcadores bioquímicos del suero tales como las aminotransferasas (AST y ALT) y gamma-glutamil transferasa (GGT) se analizó. El elevado nivel de AST / ALT y GGT se produce debido a los daños del citoplasma / mitocondria y el aumento de la permeabilidad de la membrana de los hepatocitos, que indica un deterioro grave del hígado ( Ozer, Ratner, Shaw, Bailey, y Schomaker de 2008 ). De acuerdo, los grupos de ratones intoxicados APAP exhibieron elevado nivel de suero de AST / ALT y GGT. Los resultados de los ratones MO tratado indicaron que MO extracto de hojas de forma efectiva y dependiente de la dosis disminuye la gravedad de los daños del hígado inducida por APAP, que se evidencia por los bajos niveles de AST, ALT y GGT en el suero de MO ratones tratados, lo que indica reducida daño hepático. Ha sido bien documentado que las enzimas del citocromo P450 son las enzimas más predominantes que metabolizan fármacos en el hígado y están implicadas en la biotransformación oxidativa de acetaminofeno a reactivo metabolito tóxico (NAPQI), que se formó en abundancia durante APAP sobredosis ( Aleksunes, Manautou de 2007  y  Lynch , Precio, 2007 ). Entre las diversas isoformas de las enzimas P450, CYP2E1 y CYP1A2 (en APAP dosis tóxica), y CYP2A6 (en APAP dosis aguda tóxico) son las principales isoenzimas que intervienen en bio-activación de APAP y la posterior producción de radicales libres ( Chen et al, 1998 , Tonge et al, 1998  y  Zaher et al, 1998 ). Informes recientes del estudio revelaron la actividad contención de flavonoides, como la apigenina, kaempferol y quercetina, contra el mecanismo de CYP450 inhibiendo el transporte de drogas a través de polipéptido hepática orgánica transportador de aniones (OATP) ( Mandery et al, 2010  y  Priyadarsini, Nagini de 2012) . De conformidad, los datos de este estudio demostraron que el flavonoide constituyentes enriquecido de MO hojas, eficazmente y dependiente de la dosis disminuyó los niveles de proteína de todas las tres isoformas de las enzimas CYP450 supuestamente mediante la inhibición de la actividad de transporte de OATPs hepáticas, con lo que subjetivamente la disminución de la formación de NAPQI y relativamente reducir NAPQI mediada por el estrés oxidativo.Para analizar la producción de ROS intracelular, niveles y actividades de las enzimas antioxidantes peroxidación lipídica (MDA) (SOD, CAT, GPx y GST) se midieron.Durante APAP sobredosis, se produce un desequilibrio entre las formaciones de especies reactivas de oxígeno (ROS) y su mecanismo de barrido a través del sistema antioxidante endógeno ( Kalyanaraman, 2013 ). Esto hace que el estrés oxidativo ambiente y se somete a la formación de daño celular mediada por radicales peroxilo,

que además se reorganice a través de un proceso de ciclación de endoperóxidos, y produce malondialdehído (MDA) como el producto final ( Yin, Xu, y Porter, 2011 ). En este estudio se observó que los ratones intoxicados APAP mejoradas significativamente la peroxidación lipídica y agota las enzimas antioxidantes endógenos en el hígado. Sin embargo ratones MO tratadas eficazmente restauraron las enzimas antioxidantes endógenos mejorando de este modo el mecanismo de eliminación contra las especies de oxígeno reactivas (ROS), que se observó claramente como en el agotamiento de los niveles de MDA en el hígado de ratones tratados.Para ampliar aún más la investigación a nivel molecular en el sistema antioxidante endógeno, se evaluó la modulación de la expresión genética de los genes antioxidantes a través del sistema NRF-2 / ARE. Activado NRF-2 por la disociación de Kelch-como la proteína epiclorhidrina-asociado 1 (Keap1), se transloca al núcleo y se une al elemento de respuesta antioxidante (ARE) en la región promotora y transcribe una gran batería de genes antioxidantes ( Gum, Cho, 2013  y  Lee, Pan, 2013 ).Informes de los estudios llevados a cabo han demostrado el hecho de que NRF-2 mediada por la regulación de genes participa efectivamente en la actividad hepatoprotectora contra acetaminofeno. Acción resistiva de ratones nulos KEAP1 y la responsabilidad de los ratones nulos Nrf2 a hepatotoxicidad acetaminofeno, evidentemente, demostraron el papel fundamental de los genes mediadas por Nrf2 en hepatoprotección ( Klaassen, Reisman 2010  y  Reisman y otros, 2009 ). Nuestros resultados indican que los ratones tratados aumentaron MO eficazmente la expresión NRF-2 y contrarrestan la toxicidad APAP por la activación de la expresión del gen diana antioxidante aguas abajo. Esto se observó claramente como en el hígado extirpado de APAP tratados ratones que muestra disminuyeron GCLM, GSTa2, NQO1 y HO-1 de expresión, que fue significativamente mayor en los extractos de hoja MO ratones administrados. Recientemente se ha informado de que los flavonoides como la quercetina, kaempferol de la baya de forma sinérgica activan la vía Nrf2-SE señalización y exhiben estrés actividad anti-oxidante ( Sierra et al., 2014 ). De acuerdo, los flavonoides, como la apigenina, kaempferol y quercetina presente en MO extracto de hojas están supuestamente implicados en la inducción de resistencia sinérgica de APAP hepatotoxicidad en ratones mediante la activación de la NRF-2-SE vía de desintoxicación y reduciendo el efecto perjudicial de ROS por lo tanto .A pesar de que estaba bien establecido que la hepatotoxicidad inducida por sobredosis de APAP fue iniciada por la formación de NAPQI, los últimos informes de los estudios sugieren fuertemente el papel de las respuestas inflamatorias en la progresión de la lesión hepática ( Liu et al, 2004  y  Liu et al, 2006 ). Modulación de la producción de citoquinas inflamatorias juega un papel fundamental en el potencial terapéutico para el tratamiento de la progresión del daño hepático ( Jaeschke, 2005  y Song et al, 2014 ). Los NAPQI mediada hepatocitos necróticos liberan diversos (húmedos) moléculas patrón molecular daños asociados,

tales como caja de alta movilidad de grupo 1 (HMGB1), que se une a los receptores de tipo Toll (TLR) en los macrófagos y activa la infiltración de células inmunes, provocando así la liberación de citoquinas pro-inflamatorias tales como TNF-α, IL-1β, IL-6 ( Schwabe, Seki, y Brenner, 2006 ), que están involucrados en la infiltración hepática masiva de leucocitos que de este modo inducir ambiente inflamatorio estéril que además exagerar el daño hepático. Un estudio reciente informó Bazhen decocción exhibió actividad antiinflamatoria eficaz basada en sus actividades inhibidoras contra la expresión de citocinas pro-inflamatorias tales como TNF-α, IL-1β, IL-6 en ratones intoxicado APAP (Song et al., 2014 ) . De conformidad, los resultados de nuestro estudio mostraron elevado nivel de TNF-α, IL-1β, IL-6 en los ratones administrados APAP, que ha sido suprimida significativamente por el extracto de hojas de MO. Sin embargo, para neutralizar este efecto deterioro, las citoquinas anti-inflamatorias tales como IL-10 también fueron producidos por las células de Kupffer en el sitio de la inflamación hepática. Bourdi et al. (2002) informaron que los ratones IL-10 knockout habían aumentado transcritos de ARNm de las citoquinas pro-inflamatorias (TNF-a, IL-1β) que presenta de este modo la toxicidad elevado al acetaminofeno en comparación con el tipo salvaje. Consistentemente, nuestro resultado indica supresión significativa de la IL-10 de citoquinas en ratones intoxicados APAP, que ha sido eficazmente restaurada por MO hojas de dosis de extracto de forma dependiente. Así MO extracto de hojas modula significativamente la expresión pro y citoquinas anti-inflamatorias, protegiendo así la exacerbación mediada inflamatoria de daño hepático en APAP intoxicado ratones. El mecanismo de acción general de MO extracto de hojas de APAP en contra vía de hepatotoxicidad inducida ha sido claramente dilucidado en la Fig. 6 .

Fig. 6. 

Mecanismo de acción de MO extracto de hojas de APAP en contra vía de hepatotoxicidad inducida: Los componentes activos de extracto de hojas de MO con éxito inhibir la actividad del CYP 450 reduciendo de esta manera la formación de NAPQI (metabolito tóxico); exhibiendo efecto perjudicial contra el estrés oxidativo por NRF-2 / SE elevación de los niveles de enzimas antioxidantes endógenas mediada; la inhibición de la cascada inflamatoria extensa por la modulación eficaz de citoquinas inflamatorias. Estas acciones, evidentemente proyectan MO extracto de hojas como agente hepatoprotector éxito.Figura opciones

5. ConclusiónEn resumen, hemos establecido de manera concluyente que el extracto de hojas de MO, enriquecida con componentes bioactivos, efectivamente protege el hígado de APAP intoxicación través de la supresión de 450 CYP isoenzimas y decremento de la producción NAPQI supone; regulación de Nrf2 / ARE sistema de elevación de las enzimas antioxidantes mediada nivel para el combate contra el medio ambiente ROS;y la modulación de las citoquinas inflamatorias que impiden de este modo la más exacerbación de daño hepático-necrótico. Estos resultados, evidentemente, sugieren que la MO extracto de hojas puede estar implicado como un antídoto eficaz contra APAP intoxicación, ya que obstaculiza / suprime / modula varios biomarcadores clave involucrados en la vía de hepatotoxicidad APAP que implicaban a varios puntos de tiempo después de la administración de APAP, que perdura como una limitación de corriente antídoto existente (NAC). Además MO extracto de hojas puede también ser co-administrado como suplemento con los fármacos que inducen hepatotoxicidad, que se mantiene como un obstáculo importante para muchas industrias farmacéuticas para limpiar a través de las evaluaciones clínicas. Por lo tanto, aún más extensa investigación traslacional sobre los componentes activos del extracto de hojas de MO abre el camino para el surgimiento de un antídoto eficaz contra la APAP hepatotoxicidad.