Artículo traducido

TEMA: El mecanismo de acción de membranas inducida en la reparación ósea

AUTORES: Olli-Matti Aho, BM, Petri Lehenkari, MD, PhD, Jukka Ristiniemi, MD, PhD, Siri Lehtonen, PhD, Juha Risteli, MD, PhD, and Hannu-Ville Leskel¨a, MD, PhD

Antecedentes: La inducción de tejido de granulación de cuerpo extraño es una modalidad terapéutica relativamente nueva en la reparación ósea. El método de reconstrucción de huesos, tiene dos etapas, conocido como la técnica de Masquelet, que combina la inducción de un tejido de granulación ósea membrana y la posterior un autoinjerto como una técnica de dos fases que permite la reconstrucción de grandes defectos óseos.Habida cuenta de su ya bien caracterizado osteogénesis mejorar las capacidades de los animales, se realizó esta traslación estudio para investigar estas membranas en pacientes

Métodos: Catorce pacientes con fracturas complicadas y defectos de los huesos fueron seleccionados al azar para este estudio y se realizó biopsia de muestras de membranas de cuerpo extraño inducidas que se recogieron en diferentes puntos de tiempo durante los procedimientos quirúrgicos programados.Las membranas fueron co-cultivadas con células mesenquimales del estroma, y la diferenciación en el linaje osteoblástico se evaluó mediante la medición de actividad de la fosfatasa alcalina, propéptido aminoterminal de procolágeno de tipo I la producción (PINP), y la concentración de CA21. Las características histológicas se evaluaron con análisis de imagen inversa cuantitativa la transcripción reacción en cadena de la polimerasa se utilizó para medir el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), interleucina-6 (IL-6), y-I Tipo de expresión de colágeno.

Resultados: Las membranas inducidos se caracterizan histológicamente por tejido fibroso vascularizado de madurado. La vascularización fue mayor en las muestras de un mes de edad, y se redujo a <60% en muestras de tres meses de edad. En muestras de un mes de edad las membranas tenían la más alta expresión de VEGF, IL-6, y Col-1, mientras que las membranas de dos meses de edad expresaron <40% de los niveles de las membranas de un mes de edad. La actividad específica de la fosfatasa alcalina, la producción de PINP, y CA21 concentración se incrementó en co-cultivos cuando una muestra de membrana estaba presente. En las culturas de membranas de un mes de edad, la producción de PINP fue más de dos veces y CA21 de deposición era cuatro veces mayor que en cultivos de las membranas de dos meses de edad.

Conclusiones: Las inducción de membranas tienen capacidades de mejorar osteogénesis. Estas capacidades, sin embargo, parecen a disminuir con el tiempo. Especulamos que el tiempo óptimo para realizar la cirugía de la segunda etapa puede ser dentro de un mes después de la implantación de material extraño.

Relevancia clínica: El método de reconstrucción ósea de dos etapas es una técnica fácilmente adaptable para la reparación de defectos grandes de hueso. Profundizar en la comprensión de la biología de la membrana y la maduración, en los seres humanos puede ayudar a optimizar los procedimientos actuales y mejorar su tasa de éxito global.

El tratamiento de grandes defectos óseos es un reto, y no hay consenso sobre el método de tratamiento óptimo.

Defectos limitados o pequeños por lo general pueden ser tratados con el método tradicional de autoinjertos de hueso, mientras que los defectos superiores a 4 a 5 cm son más propensos a tener complicaciones. La transferencia de un hueso vascularizado y un método basado en la migración progresiva de un segmento de hueso son dos de las técnicas más utilizadas en la tratamiento de grandes defectos óseos. Un método más novedoso, desarrollado por Masquelet , utiliza un cuerpo extraño y que haya capacidades regenerativas.

La formación de tejido de granulación es una parte esencial de la curación de los tejidos blandos y también se puede observar mientras esté presente el cuerpo extraño. Se inicia la reacción de cuerpo extraño por una lesión en los tejidos blandos vascularizados. La lesión siempre inicia con una fase de inflamación aguda, que puede conducir a la regeneración de tejidos y la maduración del tejido de granulación en la fibrosis densa, hueso u otro tejido mesenquimal.

En condiciones desfavorables, se puede desarrollar inflamación crónica y puede influir el proceso de maduración del tejido, el tamaño, la calidad y la duración de la reacción inflamatoria que puede ser modificado con optimización de las condiciones del tejido por desbridamiento de todo el tejido muerto y la infección, mediante la selección adecuada de los biomateriales, y por suficiente vascularización.

Tanto la inflamación aguda y los procesos inflamatorios transitorios en la formación de tejido de granulación se caracterizan por una gran presencia de macrófagos , infiltración de macrófagos y fibroblastos.

La formación de capilares y la neovascularización también son características clave del tejido de granulación en maduración. La granulación, originalmente se forma a partir de la matriz extracelular, componentes de la matriz, como precursor de los tejidos, que con el tiempo se transforma en una membrana de tejido conectivo neovascularizado. Eventualmente, el tejido de granulación encapsula el material extraño y más tarde una cápsula madura fibrosa se forma en la etapa final de la inflamación.

Este tejido de granulación de cuerpo extraño inducida es una herramienta útil terapéutica para la cirugía reconstructiva y ha sido aplicada a la reconstrucción de defectos de hueso grande. Además, la inducción de la membrana de tejido de granulación puede, en procedimientos como la reparación de los nervios, ayuda a evitar que el práctico la formación de tejido de granulación no funcional o fibrótico.

Cuando se induce la membrana específica, el cirujano puede evitar que se de un proceso rápido de fibrosis que generalmente llena el espacio e impide la regeneración del tejido nervioso.

El uso de membranas de granulación inducidas en tejido en la reconstrucción ósea se basa en una técnica de dos etapas de la cirugía. En la primera etapa, un antibiótico espaciador de cemento se inserta en el defecto óseo. En el segunda etapa, por lo general lleva a cabo uno o dos meses más tarde, el espaciador se sustituye con autoinjerto óseo esponjoso.

El espaciador de cemento induce la formación de una cápsula fibrosa a través de la clásica reacción de cuerpo extraño y libera antibióticos localmente, lo que contribuye a la erradicación de un posible infección. La cápsula se utiliza más tarde para (1) confinar el área del defecto, (2) apoyar el autoinjerto implantado, y (3) proporcionar al injerto neo vascularización. El tiempo total necesario óseo para sanar el defecto varía de acuerdo con el defecto, ubicación y complicaciones y factores clínicos, tales como la vascularización.

Por ejemplo, el tiempo para la curación de las fracturas de tibia ha oscilado veinte a setenta y nueve semanas. La medida del defecto del hueso, sin embargo, no parece afectar al tiempo necesario para la curación.

Las membranas tienen una rica vascularización y alta producción de factores de crecimiento, y que pueden poseer la capacidad de diferenciar células mesenquimales de médula ósea células del estroma.

También se ha descrito, y los autores de un estudio informó que la máxima expresión de la proteína morfogenética ósea (BMP-2) se encontró en las membranas que eran de cuatro semanas de edad.

Estas células madre llamado de granulación-derivadas de tejido expresaron las características de ambas células pluripotentes embrionarias y las células madre adultas. Otro estudio en animales identificó de unión central factor alfa 1 (Cbfa1)-positivas las células en la membrana inducida, lo que podría indicar que la membrana puede funcionar como un depósito de células osteoprogenitora. Estos hallazgos no tienen han confirmado en humanos.

Como la técnica de membrana inducida se está utilizando más ampliamente y más a menudo, es esencial obtener información sobre este proceso en los seres humanos, en quienes el proceso de curación difiere de los vertebrados más pequeños de muchas maneras, tales como un tiempo prolongado y un diferente proceso de curación de inflamación. Un estudio anterior de conejos sugirió que la membrana inducida alcanza la mayor actividad bioquímica en términos de la regeneración ósea a las cuatro semanas después del separador de implantación.

Este sugeriría, si se confirma en los tejidos humanos, que la segunda etapa de la técnica de dos etapas de la cirugía debe llevarse a cabo antes de lo que se pensaba anteriormente. El objetivo de la observación actual del estudio fue evaluar las características bioquímicas e histológicas

Los datos de membranas inducida fueron recogidos por humanos durante dos etapas la cirugía también llevamos a cabo una serie de experimentos de cultivo celular in vitro el uso de células mesenquimales del estroma y las muestras de membranas para evaluar el efecto de la membrana inducida en diferenciación con células estromales mesenquimales en células óseas.

Radiografías que muestran un tratamiento para un defecto óseo grande, con la técnica de dos etapas de injerto óseo. Figura 1-A un espaciador de cemento impregnado de antibiótico estabilizado con fijación interna después de la resección ósea. Figura 1-B Cuatro semanas más tarde, el espaciador se retiró y la cavidad de tejido de granulación se llenó con autoinjerto óseo esponjoso. Figura 1-C Hueso recién formado dos meses después de injerto óseo.

Materiales y Métodos

El Comité Ético del Hospital del Distrito Norte Ostrobotnia aprobó el protocolo de estudio para la recopilación y el uso de las células humanas y tejidos.

Pacientes y membranas inducida

En nuestro hospital, los pacientes con grandes defectos óseos segmentarios se tratan con de dos etapas de cirugía. Catorce pacientes fueron seleccionados al azar para el estudio (TablaI).

TABLA I Características de los pacientes

Paciente Edad (años)

sexo Ubicación del defecto óseo

LONGITUD DEL DEFECTO ÓSEO (mm)

Duración del antibiótico en el lugar

22 Masculino Tibia distal 45 7.510 Masculino Femoral distal 20 177 Femenino Tibia proximal 22 1.565 Masculino Tibia distal 0 2259 Masculino Tibia distal 30 1.526 Masculino Tibia distal 29 2

27 Masculino Tibia medial 23 158 Masculino Tibia mediañ 47 343 Masculino Tibia distal 31 165 Femenino Femoral distal 63 285 Femenino Femoral distal 32 172 Femenino Femoral proximal 0 3338 Masculino Tibial distal 43 217 Masculino Femoral distal y

tibial proximal39 5

Además, las muestras de membrana de control se obtuvieron de la superficie de material de osteosíntesis de tres pacientes. En la segunda etapa de la cirugía, fueron retirados perlas de cemento de antibióticos y un injerto autógeno de hueso esponjoso se aplicó al defecto óseo. Después de la eliminación del espaciador, los extremos del hueso se desbridaron, pero las otras partes alrededor de la membrana de cuerpo extraño e conservan los granos.

Para el estudio, la membrana se cosechó tanto de los extremos del hueso y el cuerpo de las membranas inducidas. Las muestras de tejido subcutáneo se tomaron como controles para experimentos de cultivo celular.

Inmediatamente después de la cosecha, las membranas se dividieron por los diferentes tratamientos:

Formalina se utilizó para el análisis histológico, el nitrógeno líquido se utilizó para el análisis de reacción en cadena de la polimerasa, y las membranas frescas se lavaron en solución tamponada con fosfato salino (PBS) para las piezas culture. Membrane (4. 4 mm) y muestras de tejidos subcutáneos eran cultivadas con células del estroma mesenquimal , como se describe a continuación

Cultivos de Células estromales mesenquimales humanas

Se extrae médula ósea humana de los pacientes que fueron operados de osteoartrosis de cadera y que fueron seleccionados al azar para este estudio. 

La médula ósea se obtiene a partir de la diáfisis femoral proximal durante la operación, y las células mesenquimales del estroma se mantuvieron en cultivo como se ha descrito previamente.

Brevemente, las células mesenquimales del estroma de las muestras de médula ósea se pueden adjuntar a los frascos de cultivo. 

Después de dos días, las células no unidas se lavaron de distancia y las células de los matraces se cultivaron durante una a dos semanas hasta casi confluencia. 

Las células estromales mesenquimales se cultivaron en un-MEM (medio esencial mínimo; GIBCO, Paisley, Reino Unido), suplementado con 10% de FBS inactivado por calor (suero bovino fetal) (Autogen Bioclear, Wiltshire, Reino Unido), 20mMHEPES (GIBCO), 100 U / ml de penicilina, 0,1 mg / ml de estreptomicina (Gibco), y 2 mm de L-glutamina (Gibco) a 37 ° C en 5% de CO2 y 95% de aire. 

Las células estromales mesenquimales humanas se separaron con el uso de solución de tripsina-EDTA (GIBCO).

Las células se contaron a continuación y se sembraron a una densidad de 5 · 103 con una muestra de membrana (4 · 4 mm) en placas de veinticuatro pocillos. 

 Las células utilizadas en este estudio fueron de la primera o la segunda pasaje, y el lote de suero en todos los cultivos de células de la misma. 

Los medios de cultivo se cambian dos veces por semana. Después se eliminaron las membranas  a partir del cultivo, la diferenciación osteoblástica se evaluó sobre la base de la actividad de la fosfatasa alcalina en los lisados celulares después de tres semanas de cultivo. 

La formación de hueso se evaluó después de tres semanas mediante la evaluación de la producción de propéptido aminoterminal de procolágeno de tipo I (PINP) y la cuantificación de la deposición de calcio después de cinco semanas. 

El medio de osteosíntesis que induce utilizar por separado contenía el medio anterior se describe con dexamethasone 0,1, 10 mM de b-glicerofosfato de sodio, y 0,05 mM de ácido ascórbico 2-fosfato (Sigma-Aldrich, St Louis, Missouri). 

Actividad específica de la fosfatasa alcalina 

La actividad específica de fosfatasa alcalina se determinó a partir de células estromales mesenquimales después de un período de cultivo de tres semanas con o sin membranas. 

Las muestras se extrajeron en un tampón de ensayo que contiene 50 mM de Tris-HCl, 0,1% de Triton X-100, y 0,9% de NaCl (pH 7,6), y el lisado se congeló. 

Muestras de lisados fueron luego descongelados, y la actividad enzimática se determinó por duplicado con el uso de 0,1 M 4-p-nitrofenil fosfato (Sigma-Aldrich) como sustrato. 

Se leyó la absorbancia a 405 nm en un lector de placas (Victor2; PerkinElmer Life Sciences / Wallac Oy, Turku, Finlandia). El contenido total de proteínas de las células estromales mesenquimales cultivadas se determinó por BIO-RAD Protein Assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, California). 

Las actividades enzimáticas se normalizaron con la concentración de proteína y se expresaron como absorbancia por miligramo de proteína.

PINP La cantidad de síntesis de procolágeno de tipo I se cuantificó a partir del medio de cultivo. 

La concentración de PINP se midió en duplicados con el uso de un radio inmuno-ensayo comercialmente disponible (Orion Diagnostica, Espoo, Finlandia). 

El ensayo se realizó en la saturación secuencial, y que utiliza alícuotas duplicado de 100 ml de 01:20 o 01:50 medio de cultivo diluido. 

Cuantificación de calcio 

Para la cuantificación de calcio, los cultivos se detuvieron a las cinco semanas y se eliminaron las membranas cocultivadas. 

Los pocillos se lavaron tres veces con CA21 y MG21 libre de PBS y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente en HCl 0,6 M para disolver el calcio depositado. 

La determinación de calcio se basa en la reacción de calcio con o-cresolftaleína complexona de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania).  La reacción colorimétrica se leyó a 570 nm en un lector de placas (Victor2).

Método tricrómico de Masson y tinción hematoxilina y eosina y análisis de imágenes de vascularidad

Las muestras de membrana se lavaron en PBS y se fijaron en formol e incrustados parafina, y se seccionaron. Secciones de 8 mm se tiñeron con el método tricrómico de Masson. Algunas muestras de membrana también se tiñeron con hematoxilina y eosina para los propósitos de formación de imágenes.

La cuantificación posterior de la zona de vascularización proporcional se realizó con un sistema de análisis de imagen digital (MCIDM51; Imaging Research, Canadá).

La vascularización proporcional se cuantificó mediante la selección de cinco áreas representativas de tamaño similar de cada membrana y contando el área proporcional promedio de tejido vascular en contraste con membrana estroma.

Extracción de ARN y la transcripción inversa cuantitativa. Análisis en reacción en cadena de la polimerasa (RT-qPCR)

Piezas de membranas se congelaron inmediatamente después de la recolección y se almacenaron en nitrógeno líquido hasta que se utilizaron para el análisis de ARN.

Doscientos a 600 mg de membrana congelada se pulverizó con una mano de mortero y se homogeneizó en reactivo TRIzol (Invitrogen).

RNA se aisló de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y los RNAwas aisladas purificadas aún más por el RNeasy Kit de limpieza MinElute (Qiagen, Valencia, California), después de lo cual la cantidad de RNAwas mide espectrofotométricamente.

Un microgramo de ARN se utiliza para la síntesis de cDNA con el kit de síntesis de la cadena First Revert Aid (Fermentas, filial de Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts) utilizando oligo-dT como cebador.

Un microlitro del producto de cDNA se utilizó para la RT-qPCR con la técnica SYBER Green (iQ SYBR Green; Bio-Rad Laboratories) mediante la cuantificación del producto en cada ciclo de una manera en tiempo real.

La cantidad del producto se controló durante cuarenta ciclos, después de lo cual la especificidad del producto se confirmó por la curva de fusión y en algunos casos mediante la visualización de los productos con electroforesis en gel de agarosa.

La expresión de la deshidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH) se estudió mediante el uso de secuencias de los cebadores 59-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-39 y

59-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3 como temperatura de recocido.

Las secuencias de cebadores eran 59-GGTTT CGACT TCAGCTTCCT G-39 y 59-TCACCAGTCTCCATGTTGCA-G-39 para el tipo I de colágeno (Col-1), 59-GGGCAGAATCATCACGAAGTG-39 y 59-ATTGGATGGCAGTAGCTGCG-39 para el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), y 59-GGTACATCCTCGACGGCATCT 39 y 59-GTGCCTCTTTGCTGCTTTCAC-39 para la interleucina-6 (IL-6).

La expresión de cada compuesto se relaciona con GAPDHexpression mediante el uso de la DDCT method19 considerando GAPDHas un gen de mantenimiento y la comparación de la expresión con una muestra de control seleccionado.

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó con el paquete estadístico para las Ciencias Sociales (SPSS) versión 13.0 (Chicago, Illinois).

La prueba de la t de Student se utilizó para comparar dos medias. Los datos múltiples de comparación ha sido estudiada con el análisis de varianza de una vía seguido de comparaciones post hoc (prueba de la t de dos colas). Los gráficos fueron creados con el software de Origen 6.0 (OriginLab, Northampton, Massachusetts).

Fuente de financiación

La Fundación Finnish Medical y Ostrobotnia y financiación fue utilizado del Distrito Hospitalario del Norte para gastos de laboratorio y el salario. Además, se recibió financiación para el sueldo del autor correspondiente (O.-MA) en el Programa de Doctorado Nacional de Trastornos musculoesqueléticos y Biomateriales (TBDP) la escuela de posgrado.

Una subvención personal para el autor correspondiente fue concedida por la Fundación Finnish Medical. Ninguno de los patrocinadores del estudio tuvo ningún papel en la recopilación o análisis de datos, en la escritura manuscrita, o la publicación de manuscrito.

Resultados

La inducción de la membrana de tejido fibroso y la diferencia con el tejido óseo tricrómico de Masson y hematoxilina y eosina mostraron alguna reacción de cuerpo extraño con macrófagos y células gigantes de cuerpo extraño con separadores de cemento.

Membrana inducida incluye tejido vascular primitivo recién formada y tiene la capacidad de diferenciarse hacia tejido calcificado por osificación endocondral. También pudimos ver el tejido óseo recién formado por hueso laminar maduro, incluso, en las membranas inducidas. Considerando que el tejido de granulación era característico de las membranas más jóvenes,el tejido fibroso más uniforme dominó el patrón histológico en muestras mayores (Fig. 2).

Figura 2

Secciones histológicas representativas de membranas inducidas teñidas con tinción tricrómica de Masson y hematoxilina y eosina (aumento original 100).

Figura 2-A Un tejido de granulación a partir de una membrana de un mes de edad. Algunas células gigantes de cuerpo extraño se pueden ver (flecha). Figura 2-B tejido del vaso recién formado (flechas) a partir de una membrana de 1,5 meses de edad. Figura 2-C tejido fibroso maduro de una membrana de veintidós meses de edad. Sólo se ven unos pocos vasos sanguíneos (flechas). Figura 2-D osificación endocondral en las membranas inducidas (las flechas indican el cartílago). Figura 2-E tejido óseo recién formado puede ser visto (flecha indica hueso laminar). Figura 2-F-Cuerpo extraño de células gigantes (flecha) en una membrana de un mes de edad, teñidas con hematoxilina y eosina.

La vascularidad de la membrana inducida disminuye durante el envejecimiento. El análisis histológico de las membranas mostró una diferencia clara entre las membranas jóvenes y mayores.

A las cuatro semanas, las membranas aparecieron ricamente vascularizado por numerosos pequeños capilares y las venas más grandes.

Con el tiempo, la tasa de disminución de la vascularización.

Ya a los tres meses, las membranas que tenían un mes de edad tenían vascularización <60% (Figs. 3-A, 3-C y 3-D).

Figura 3

El efecto de edad sobre la membrana inducida y la vascularización de la membrana con factores de crecimiento secretados.

Figura 3-A Un área proporcional de vascularización en las membranas cosechadas de diferentes edades. Los resultados se normalizaron con los valores de un mes para mayor claridad. Figura 3-B ARNm se investigó con la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción (PCR),Factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), interleucina-6 (IL-6), y los resultados de colágeno (Col1) de tipo I se determinaron para las membranas de diferentes edades, y los valores se normalizaron frente a la media de las muestras de un mes.Figura 3-C Una membrana de un mes.Figura 3-D Una membrana de cinco meses. Las muestras fueron teñidas con tricrómico de Masson. Las flechas indican los vasos sanguíneos

Además, la RT-qPCR mostró disminución significativamente la producción de VEGF, IL-6, y Col-1 después de un mes:las membranas de dos meses de edad, expresó <40% de los niveles de las membranas de un mes de edad.

En este estudio, se utilizó un modelo previamente descrito de la diferenciación de células estromales mesenquimales en osteoblastos y la medición de su actividad como células formadoras de hueso.

Las células estromales mesenquimales humanas pueden ser inducidos in vitro para diferenciarse en osteoblastos maduros por los glucocorticoides, B-glicerofosfato, y ascorbato.

A la edad de cuatro semanas, las membranas cosechadas indujeron significativamente tanto la actividad de la fosfatasa alcalina específica y la concentración de calcio en cultivos de células mesenquimales del estroma.

En las culturas osteo-inducidas, tanto la actividad fosfatasa alcalina específica y la concentración de calcio de las células mesenquimales del estroma fueron inducidos de manera significativa (Figs. 4-A y 4-B).

Figura 4

Figs. 4-A y 4-B Influencias de la membrana inducida sobre la formación ósea de las células estromales mesenquimales humanas cultivadas (MSC).

 Las células se cultivaron durante tres semanas para determinar la fosfatasa alcalina específica (ALP) actividad (Fig. 4-A) y durante cinco semanas para los ensayos de cuantificación de calcio (Fig. 4-B). Figs. 4-C y 4-D La influencia de los sitios de recolección (músculo, médula ósea, y el hueso esponjoso de las membranas inducidos en las células estromales mesenquimales humanas cultivadas. Las células mesenquimales del estroma y las membranas se cultivaron sin medio de inducción de osteosíntesis (OS), tal como se describe en Materiales y Métodos.

Células estromales mesenquimales se cultivaron durante tres semanas para la medición de propéptido aminoterminal de procolágeno de tipo I la producción (PINP) (fig. 4-C) y durante cinco semanas para el calcio cuantificación (figura 4-D). Figs. 4-E y 4-F El efecto de la edad de membrana inducida en las células mesenquimales del estroma.

Las células mesenquimales del estroma y las membranas se cultivaron sin medio de inducción de osteosíntesis, tal como se describe en Materiales y Métodos.

Producción PINP (fig. 4-E) se midió y se realizó la cuantificación de calcio (fig. 4-F). La existencia de las células mesenquimales del estroma, tejido subcutáneo de control (Hipodermis), membrana, y / o medio de osteosíntesis inducida en el ensayo de cultivo celular se indican con (1) o (2). Cada barra representa la media y desviación estándar (I bar). * p <0,05, ** p <0,01, y *** p <0,001

Influencia de la recolección del sitio de membranas inducida en células estromales mesenquimales cultivadas Humanos

En la segunda etapa del tratamiento, las membranas cosechadas fueron recogidos en las diferentes áreas del sitio de la operación.

Las membranas de los sitios de la médula ósea y el hueso esponjoso fueron significativamente mejores osteoinducidas en la membrana en el sitio del músculo tal como se mide por la producción de PINP.

La formación de hueso medido por el contenido de calcio no cambió significativamente entre las membranas en diferentes sitios (Figs. 4-C y 4-D).

Efecto del tiempo de la segunda etapa de la cirugía de la membrana inducida y co cultivadas de células estromales mesenquimales humanas

Se estudió si el punto de la segunda etapa de la operación de tiempo influyó en la actividad y osteoinduccción de membrana en cultivos de células estromales mesenquimales humanas.

Se cosecharon las membranas después de un mes y dos meses, y los co-cultivadas con células estromales mesenquimales.

Curiosamente, cuando las membranas se cosecharon a un mes después de un espaciador de cemento se introdujo en el defecto óseo, las membranas espontáneamente indujeron la diferenciación de células mesenquimales del estroma y la activación como se ha demostrado por la medición de

Síntesis de PINP y cuantificación de calcio.

En contraste, las membranas cosechadas después de dos meses no aumentó la diferenciación de células mesenquimales del estroma y la activación. Niveles PINP eran más de dos veces y CA21 de deposición fue cuatro veces mayor en las membranas de un mes de edad (Figs. 4-E y 4-F).

Discusión

El tratamiento de grandes defectos óseos en general sigue siendo un tema de debate. La técnica de reconstrucción ósea de dos etapas es un nuevo método que ha demostrado ser exitoso para la reconstrucción de un gran defecto.

 En este estudio, se investigó las características histológicas y bioquímicas de las membranas inducidas utilizadas en esta técnica. Estudios anteriores han demostrado que las membranas de cuerpo extraño inducidas contienen bien de tejido fibroso vascularizado que se conserva sobre todo durante el seguimiento.

En contraste, nuestros resultados demostraron que, en las membranas humanas, la superficie proporcional de tejido vascular disminuye claramente después del separador ha estado en vigor durante dos meses. A los dos meses, la membrana está compuesta de tejido fibroso más maduro con abundante colágeno y un menor número de vasos sanguíneos. Tres a seis meses después de la implantación espaciador, la membrana madura tiene términos de densidad de la matriz extracelular en composición final.

Hemos observado algunos osificación intramembranosa e incluso la formación de cartílago en algunas muestras. Por lo que sabemos, esta no se ha descrito anteriormente, pero la reacción cuerpo extraño en los seres humanos parece producir tejido multipotente mucofibroso inmaduro que incluso tiene algunas similitudes con el tejido mesodérmico embriogénico.

En estudios previos, esta membrana ha sido descrita como capaz de producir y que contiene las células estromales mesenquimales indiferenciadas. No esperábamos este resultado y no tratamos de obtener y aislar células multipotentes mesenquimales del estroma de las membranas, pero nuestra observación alienta a hacerlo en el futuro.

La expresión de VEGF en las membranas disminuye drásticamente después de un mes. Este hallazgo está de acuerdo con la disminución observada en la vascularización de las membranas de envejecimiento. Un patrón decreciente de manera más constante de la expresión de VEGF fue encontrado en conejos mediante Pelissier . Para obtener una visión más profunda de las primeras etapas de desarrollo de membranas de cuerpo extraño inducida y las primeras etapas de la maduración, se midió colágeno tipo I e IL-6

en las membranas de diferentes edades. Los patrones de expresión fueron igualmente más alta en las muestras anteriores y muy pequeños en las membranas que eran más de dos meses de edad. Esta transición es probablemente causado por la amortiguación general de la inflamación local y el proceso de maduración en el inducido membrana. Las membranas de cuerpo extraño inducidas de animales afectan directamente a las células madre y causan que sean susceptibles a la diferenciación en el linaje osteoblástico in vitro.

Los co-cultivos en nuestro estudio indican que este efecto está presente en el tejido humano también. Se utilizó mediciones cuantitativas de Ca 2 y PINP para evaluar la diferenciación in vitro de células madre en el linaje osteoblástico y resultados obtenidos concluyentes de ambos de estos compuestos:diferenciación osteoblástica se aumentó en gran medida cuando la muestra de una membrana estaba presente en el cultivo.

El efecto era considerablemente mayor cuando se utilizó un medio de aumento de la osteogénesis.

En co-cultivos con membranas de uno y dos meses de edad, la edad de la membrana afectada en gran medida la tasa de la diferenciación de células madre. Las membranas de dos meses de edad, tenían sólo una fracción de la actividad que se ve en las muestras de un mes de antigüedad.

Cuando se recogieron muestras de membrana, hemos prestado especial atención a la ubicación de la membrana en relación con el tejido circundante para determinar los efectos sobre la membrana de desarrollo y las características. No hemos encontrado diferencias concluyentes en el análisis histológico.

Sin embargo, las membranas que se desarrollan adyacentes a médula ósea poseen la mayor capacidad para estimular la osteogénesis. La correlación clínica para este sigue siendo inexistente y es difícil de estudiar de manera concluyente. Parece que el tejido circundante induce la capacidad de dirigir el proceso de reparación que tiene la membrana para favorecer la formación del mesénquima circundante de tejido óseo en este caso.

Las fracturas que conducen a defectos óseos, que requieren medios más complejos de tratamiento, son poco frecuentes.

En un estudio prospectivo realizado en Escocia, estos casos representaron sólo el 0,4% de todos los pacientes ingresados en el hospital debido a una fractura.

Por lo tanto, nuestra muestra se limitó a un muy selecto grupo de pacientes. El tamaño de la muestra de tejido también se limitó a no comprometer el tratamiento. Esto deteriora nuestra capacidad verdaderamente para lograr una serie representativa de la muestra deseada para el tiempo de tratamiento. Las limitaciones en el material de la muestra y la estructura del tejido en sí causó otro problema en estudiar, especialmente cuando se utiliza la RT-qPCR, y por lo tanto no sirvió para medir todas las variables que se desee. Para un estudio más exhaustivo, se necesita muchas más muestras materiales de tejido . A pesar de estas limitaciones, creemos que no había

material suficiente para nosotros llegar a las conclusiones que aquí se presenta. Esta idea es apoyada por el hecho de que la mayoría de nuestras observaciones están respaldadas por un trabajo experimental anterior.

Nuestros resultados indican que la actividad biológica de las membranas es un reactivo de gran alcance que no debe pasarse por alto en la cirugía ósea. Nuestros hallazgos sugieren que la membrana tiene un efecto osteoinductivo local y proporciona al área de defecto óseo una rica vascularización y neocirculación.

Lo capacidad de la membrana al pasar el tiempo, disminuye rápidamente y bastante ya que alcanza una forma más madura. Podemos concluir que las membranas del cuerpo extraño inducidas pueden alcanzar su mayor actividad biológica antes del mes, transcurrido después de la implantación de cuerpo extraño.